JPH03221837A - 検体測定方法及び検体測定装置 - Google Patents
検体測定方法及び検体測定装置Info
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- JPH03221837A JPH03221837A JP2016551A JP1655190A JPH03221837A JP H03221837 A JPH03221837 A JP H03221837A JP 2016551 A JP2016551 A JP 2016551A JP 1655190 A JP1655190 A JP 1655190A JP H03221837 A JPH03221837 A JP H03221837A
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- light
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はサンプル中の個々の検体に光を照射し、散乱光
や蛍光等の光学的測定を行なうことで検体の解析や抗原
抗体反応の測定等を行なう検体検査方法及び装置に関す
る。
や蛍光等の光学的測定を行なうことで検体の解析や抗原
抗体反応の測定等を行なう検体検査方法及び装置に関す
る。
［従来の技術］
従来の検体検査装置の一例としてフローサイトメータが
知られている。これはザンブル液中の血球細胞等の検体
を蛍光標識し、これら検体を光ビームが照射される被検
部に１個ずつ流して、その結果被検部から発生ずる散乱
光や蛍光等を波長選別することでこれらのパラメータを
個々の検体毎に測光し、多数の検体に関する測定パラメ
ータの統計的傾向から検体の解析を行なうものである。
知られている。これはザンブル液中の血球細胞等の検体
を蛍光標識し、これら検体を光ビームが照射される被検
部に１個ずつ流して、その結果被検部から発生ずる散乱
光や蛍光等を波長選別することでこれらのパラメータを
個々の検体毎に測光し、多数の検体に関する測定パラメ
ータの統計的傾向から検体の解析を行なうものである。
これにより細胞のＤＩｔＡ解析や表面抗原の探索などが
可能となる。
可能となる。
［発明が解決しようとする課題］
ところが一般に、蛍光標識検体に光照射を行なうと、標
識蛍光色素が励起されて発生する目的蛍光たけてはなく
、検体細胞が自ら有する自家蛍光、更じはゴ尖等の浮遊
物や流体そのものが有する自家蛍光も同時に発生してし
まう。この自家蛍光は広い波長領域に渡って発生するた
め、標識蛍光色素から発する目的蛍光と同一の波長領域
の自家蛍光は光学的に波長選別することができず、目的
蛍光に自家蛍光が雑光として混入した蛍光強度を測光し
てしまうことになる。
識蛍光色素が励起されて発生する目的蛍光たけてはなく
、検体細胞が自ら有する自家蛍光、更じはゴ尖等の浮遊
物や流体そのものが有する自家蛍光も同時に発生してし
まう。この自家蛍光は広い波長領域に渡って発生するた
め、標識蛍光色素から発する目的蛍光と同一の波長領域
の自家蛍光は光学的に波長選別することができず、目的
蛍光に自家蛍光が雑光として混入した蛍光強度を測光し
てしまうことになる。
又、光源に単波長のレーザ光源ではなく、マルチ発振レ
ーザ光源や白色光等を用いた場合：これらの照射光に含
まれる目的蛍光と同一の波長領域の散乱光が雑光となっ
て目的蛍光の測光値に混入してしまう畏れもある。
ーザ光源や白色光等を用いた場合：これらの照射光に含
まれる目的蛍光と同一の波長領域の散乱光が雑光となっ
て目的蛍光の測光値に混入してしまう畏れもある。
すなわち従来の装置では蛍光測光強度に雑光が誤差とな
って含まれ、得られる蛍光測定値のＳ／Ｎ比が悪くなっ
てしまう問題点を有していた。
って含まれ、得られる蛍光測定値のＳ／Ｎ比が悪くなっ
てしまう問題点を有していた。
本発明は以上の課題を解決すべくなされたもので、雑光
の影響を受けることなく純粋に目的とする蛍光の強度を
検出することのできる方法及び装置の提供を目的とする
。
の影響を受けることなく純粋に目的とする蛍光の強度を
検出することのできる方法及び装置の提供を目的とする
。
［課題を解決するための手段コ
上述の課題を解決するための本発明は、サンプル中の検
体を蛍光標識する工程と、前記サンプル中の個々の検体
に光照射する工程と、前記光照射時より所定時間の後に
蛍光を測光する工程とを有することを特徴とする検体測
定方法、 並びに照射位置に光を照射する手段と、蛍光標識された
個々の検体を前記照射位置に順次通過させる手段と、前
記照射位置よりも下流の所定位置から発する蛍光を測光
する手段とを有することを特徴とする検体測定装置であ
る。
体を蛍光標識する工程と、前記サンプル中の個々の検体
に光照射する工程と、前記光照射時より所定時間の後に
蛍光を測光する工程とを有することを特徴とする検体測
定方法、 並びに照射位置に光を照射する手段と、蛍光標識された
個々の検体を前記照射位置に順次通過させる手段と、前
記照射位置よりも下流の所定位置から発する蛍光を測光
する手段とを有することを特徴とする検体測定装置であ
る。
［実施例］
以下、本発明の実施例を図面を用いて詳細に説明する。
第１図及び第２図は本発明の実施例の光学配置を示す。
適切な反応時間及び濃度に調整され更に蛍光試薬で標識
処理された血液やラテックス浮遊液等のサンプル液と、
生理食塩水や蒸留水等のシース液が用意され、不図示の
加圧機構によりこれら液体か加圧されてフローセル３に
導かれ、シースフロー原理によってフローセル３内でサ
ンプル液がシース液に包まれて細い流れに収斂されてフ
ローセル３内の流通部を通過する。この時、サンプル液
に含まれる検体である個々の細胞やラテックス等の被検
粒子は分離されて１粒或いは１塊ずつ紙面上方から下方
に向は手順状流れる。この被検粒子の流れに対して、レ
ーザ光源１（本実施例においては波長３００ｎｍの紫外
レーザ）から出射されたレーザ光が、母線方向が各々流
通部方向、流通部方向と直交した２枚のシリンドリカル
レンズからなる結像光学系２によって任意の楕円形状に
収斂され照射される。被検粒子に照射される光ビームの
形状は、一般には流れに対して直交する方向に長径を有
する楕円形状であることが好ましい。これは個々の被検
粒子の流れの位置が流体中で若干変動しても、被検粒子
に均一の強度で光ビームか照射されるようにするためで
ある。
処理された血液やラテックス浮遊液等のサンプル液と、
生理食塩水や蒸留水等のシース液が用意され、不図示の
加圧機構によりこれら液体か加圧されてフローセル３に
導かれ、シースフロー原理によってフローセル３内でサ
ンプル液がシース液に包まれて細い流れに収斂されてフ
ローセル３内の流通部を通過する。この時、サンプル液
に含まれる検体である個々の細胞やラテックス等の被検
粒子は分離されて１粒或いは１塊ずつ紙面上方から下方
に向は手順状流れる。この被検粒子の流れに対して、レ
ーザ光源１（本実施例においては波長３００ｎｍの紫外
レーザ）から出射されたレーザ光が、母線方向が各々流
通部方向、流通部方向と直交した２枚のシリンドリカル
レンズからなる結像光学系２によって任意の楕円形状に
収斂され照射される。被検粒子に照射される光ビームの
形状は、一般には流れに対して直交する方向に長径を有
する楕円形状であることが好ましい。これは個々の被検
粒子の流れの位置が流体中で若干変動しても、被検粒子
に均一の強度で光ビームか照射されるようにするためで
ある。
被検粒子に光ビームが照射されると散乱光が生しる。発
生ずる散乱光の内、光路前方方向に発する前方散乱光は
集光レンズ６、アパーチャア、光検出器８によって測光
される。アパーチャアの開口部は光照射位置４と共役に
配置され、照射位置４からの光のみが光検出器８に導か
れるようになっている。照射された強力な光ビームが直
接光検出器８に入射するのを防ぐため、光路中葉光レン
ズ６の手前には光吸収性の微小なストッパ５が設けられ
、照射光源からの直接光、及び被検粒子を光透過した透
過光を除去するようになっている。これにより光照射位
置４から散乱された光のみを測光することができる。な
お、この構成では前方散乱光と共に蛍光も合わせた光強
度を測光することになるが、一般に前方散乱光強度に較
べて蛍光強度は極めて微弱であるので問題はない。勿論
、光検出器８の手前に散乱光波長を選択的に透過するバ
ンドパスフィルタを配置するようにしても良い。
生ずる散乱光の内、光路前方方向に発する前方散乱光は
集光レンズ６、アパーチャア、光検出器８によって測光
される。アパーチャアの開口部は光照射位置４と共役に
配置され、照射位置４からの光のみが光検出器８に導か
れるようになっている。照射された強力な光ビームが直
接光検出器８に入射するのを防ぐため、光路中葉光レン
ズ６の手前には光吸収性の微小なストッパ５が設けられ
、照射光源からの直接光、及び被検粒子を光透過した透
過光を除去するようになっている。これにより光照射位
置４から散乱された光のみを測光することができる。な
お、この構成では前方散乱光と共に蛍光も合わせた光強
度を測光することになるが、一般に前方散乱光強度に較
べて蛍光強度は極めて微弱であるので問題はない。勿論
、光検出器８の手前に散乱光波長を選択的に透過するバ
ンドパスフィルタを配置するようにしても良い。
また前記散乱光の内、レーザ光軸及び被検粒子の流れに
それぞれ直交する側方方向に発する光は集光レンズ９て
集光される。集光された光はダイクロイックくラー１０
で反射され、散乱光の波長即ちレーザ光の波長（３００
ｎｍ付近）を選択的に透過させるバンドパスフィルタ１
１、集光レンズ１３、アパーチャ１５を経て光検出器１
７にて側方散乱光が測光される。アパーチャ１５は図の
ように光軸中心に開口部１５ａが設けられ、該開口部１
５ａは光照射位置４と共役関係になっており、光照射位
置４から発する散乱光のみが光検出器１７にて検出され
るようになっている。
それぞれ直交する側方方向に発する光は集光レンズ９て
集光される。集光された光はダイクロイックくラー１０
で反射され、散乱光の波長即ちレーザ光の波長（３００
ｎｍ付近）を選択的に透過させるバンドパスフィルタ１
１、集光レンズ１３、アパーチャ１５を経て光検出器１
７にて側方散乱光が測光される。アパーチャ１５は図の
ように光軸中心に開口部１５ａが設けられ、該開口部１
５ａは光照射位置４と共役関係になっており、光照射位
置４から発する散乱光のみが光検出器１７にて検出され
るようになっている。
また被検粒子から散乱光と共に発生する蛍光寿命の長い
蛍光を測光するため、集光レンズ９によって集光され、
ダイクロイック亙う−１０を通過した蛍光は、蛍光波長
用（６１０ｎｍ付近）のバンドパスフィルタ１２で波長
選択され、集光レンズ１４、アパーチャ１６、光検出器
１８の組によって特定の波長の蛍光が検出される。アパ
ーチャ１６は図のように中心よりもやや上方に開口部１
６ａが設けられている。すなわち該開口部１６ａは光照
射位置４よりもやや下流位置と共役になっており、光照
射位置４よりも下流の非照射位置からの特定波長の蛍光
のみを光検出器１８に導くようになっている。すなわち
散乱光を測光する光検出器１７と蛍光を測光する光検出
器１８には同時には光は入射せず、時間をおいて時系列
に各光検出器の出力パルスが得られるような構成となっ
ている。
蛍光を測光するため、集光レンズ９によって集光され、
ダイクロイック亙う−１０を通過した蛍光は、蛍光波長
用（６１０ｎｍ付近）のバンドパスフィルタ１２で波長
選択され、集光レンズ１４、アパーチャ１６、光検出器
１８の組によって特定の波長の蛍光が検出される。アパ
ーチャ１６は図のように中心よりもやや上方に開口部１
６ａが設けられている。すなわち該開口部１６ａは光照
射位置４よりもやや下流位置と共役になっており、光照
射位置４よりも下流の非照射位置からの特定波長の蛍光
のみを光検出器１８に導くようになっている。すなわち
散乱光を測光する光検出器１７と蛍光を測光する光検出
器１８には同時には光は入射せず、時間をおいて時系列
に各光検出器の出力パルスが得られるような構成となっ
ている。
前記光検出器８．１７．１８の信号は、第３図に示すよ
うな信号処理部において処理される。前記光検出器８の
前方散乱光出力はパルス状の電気信号として、トリガ回
路２１とアナログ処理回路２２に人力される。また光検
出器１７の側方散乱光出力及び光検出器１８の蛍光出力
はそれぞれアナログ処理回路２３及び２４に入力される
。各アナログ処理回路においては信号パルスのピーク値
や積分値が検出される。トリガ回路２１に入力された前
方散乱光信号がある一定レベルを越えると、すなわち光
照劇位置に被検粒子がさしかかると、それに伴ってトリ
ガ信号がある一定の期間発生し、その信号はアナログ処
理回路２２とアナログ処理回路２３に人力される。各ア
ナログ処理回路にはサンプルホールド機能があり、トリ
ガ信号か発生している期間たけ入力信号が処理されるよ
うになっている。また前記トリガ回路２１からのトリガ
信号は蛍光用）・リガ発生回路２５に人力され、該蛍光
用トリガ発生回路２５はトリガ信号を時間ｔ１からｔ２
の間だけ発生させ、その信号をアナログ処理回路２４に
人力される。これにより粒子が光照射位置４を通過１ノ
た後ｔ、からｔ２までの間、蛍光用光検出器１８の信号
をサンプリングすることができる。各アナログ処理回路
２２．２３．２４の出力はＡ／Ｄ変換回路２６にてデジ
タル値に変換され、それぞれ前方散乱信号、側方散乱信
号、蛍光信号としてメモリ２７に：格納される。
うな信号処理部において処理される。前記光検出器８の
前方散乱光出力はパルス状の電気信号として、トリガ回
路２１とアナログ処理回路２２に人力される。また光検
出器１７の側方散乱光出力及び光検出器１８の蛍光出力
はそれぞれアナログ処理回路２３及び２４に入力される
。各アナログ処理回路においては信号パルスのピーク値
や積分値が検出される。トリガ回路２１に入力された前
方散乱光信号がある一定レベルを越えると、すなわち光
照劇位置に被検粒子がさしかかると、それに伴ってトリ
ガ信号がある一定の期間発生し、その信号はアナログ処
理回路２２とアナログ処理回路２３に人力される。各ア
ナログ処理回路にはサンプルホールド機能があり、トリ
ガ信号か発生している期間たけ入力信号が処理されるよ
うになっている。また前記トリガ回路２１からのトリガ
信号は蛍光用）・リガ発生回路２５に人力され、該蛍光
用トリガ発生回路２５はトリガ信号を時間ｔ１からｔ２
の間だけ発生させ、その信号をアナログ処理回路２４に
人力される。これにより粒子が光照射位置４を通過１ノ
た後ｔ、からｔ２までの間、蛍光用光検出器１８の信号
をサンプリングすることができる。各アナログ処理回路
２２．２３．２４の出力はＡ／Ｄ変換回路２６にてデジ
タル値に変換され、それぞれ前方散乱信号、側方散乱信
号、蛍光信号としてメモリ２７に：格納される。
以上のようにして多数の検体に関して得られメモリ２７
に記憶される測定パラメータに基づいて、演算回路２８
において検体解析の演算がなされ、その結果はＣＲＴや
プリンタ等の出力部２９に出力さ和る。
に記憶される測定パラメータに基づいて、演算回路２８
において検体解析の演算がなされ、その結果はＣＲＴや
プリンタ等の出力部２９に出力さ和る。
次に第４図を用いて本発明の測定原理について説明する
。本発明では使用する蛍光色素は蛍光寿命が通常の自家
蛍光等よりも長いものを採用する。第４図は光照射によ
り励起された蛍光の寿命曲線を示すグラフである。横軸
は経過時間で、被検部において被検粒子が光照射された
瞬間を時刻Ｏとする。又、縦軸は発生ずる蛍光量である
。図中、曲線１９は一般的に使用される蛍光色素、ある
いは細胞やゴくが自ら有する自家蛍光によるもので、励
起されてから蛍光発生強度が０になるまでの蛍光寿命は
、およそ１００ｎｓｅｃ程度である。これに対して曲線
２０は本発明において使用する通常よりも寿命の長い蛍
光色素の寿命カーブであり、例としてＥｕ３＋キ１ノー
ト物質を蛍光色素として使用したものである。この場合
の蛍光寿命は１０００ｎ’ｓｅｃ以上である。なおこの
蛍光寿命曲線は蛍光を励起するレーザ光強度が一定であ
ればほぼ同形状の曲線となる。
。本発明では使用する蛍光色素は蛍光寿命が通常の自家
蛍光等よりも長いものを採用する。第４図は光照射によ
り励起された蛍光の寿命曲線を示すグラフである。横軸
は経過時間で、被検部において被検粒子が光照射された
瞬間を時刻Ｏとする。又、縦軸は発生ずる蛍光量である
。図中、曲線１９は一般的に使用される蛍光色素、ある
いは細胞やゴくが自ら有する自家蛍光によるもので、励
起されてから蛍光発生強度が０になるまでの蛍光寿命は
、およそ１００ｎｓｅｃ程度である。これに対して曲線
２０は本発明において使用する通常よりも寿命の長い蛍
光色素の寿命カーブであり、例としてＥｕ３＋キ１ノー
ト物質を蛍光色素として使用したものである。この場合
の蛍光寿命は１０００ｎ’ｓｅｃ以上である。なおこの
蛍光寿命曲線は蛍光を励起するレーザ光強度が一定であ
ればほぼ同形状の曲線となる。
時刻Ｏの瞬間に粒子が光照射されたとして、散乱光の発
生は瞬時に終了し、蛍光寿命の短い通常の蛍光や、細胞
やゴ主が自ら発する自家蛍光も時間ｔ１までには蛍光発
生量がＯになる。第５図に示すアパーチャ１６の開口部
１６ａは、光スポットが当たる光照射位置４よりも若干
下流の非照射位置と共役に配置されており、この部分か
らの光のみを光検出器に導くようになっている。換言す
れば粒子の流れ速度が一定と考えると第４図の時間ｔ、
からｔ２までの間の斜線部分の光だけを測光するように
なっている。第４図から明らかなように、ｔ、からｔ２
の間は蛍光寿命の長いＥ ｕ ”キレート物質の蛍光の
みが発生するので、目的蛍光以外の雑光である自家蛍光
や他の蛍光色素からの光、あるいは散乱光の混入の影響
を受けずに純粋に目的蛍光強度を測定することができる
。
生は瞬時に終了し、蛍光寿命の短い通常の蛍光や、細胞
やゴ主が自ら発する自家蛍光も時間ｔ１までには蛍光発
生量がＯになる。第５図に示すアパーチャ１６の開口部
１６ａは、光スポットが当たる光照射位置４よりも若干
下流の非照射位置と共役に配置されており、この部分か
らの光のみを光検出器に導くようになっている。換言す
れば粒子の流れ速度が一定と考えると第４図の時間ｔ、
からｔ２までの間の斜線部分の光だけを測光するように
なっている。第４図から明らかなように、ｔ、からｔ２
の間は蛍光寿命の長いＥ ｕ ”キレート物質の蛍光の
みが発生するので、目的蛍光以外の雑光である自家蛍光
や他の蛍光色素からの光、あるいは散乱光の混入の影響
を受けずに純粋に目的蛍光強度を測定することができる
。
なお七〇からｔ２の間で測光する蛍光強度はピーク値で
は無いが、蛍光寿命曲線は蛍光を励起するレーザ光強度
が一定であれはほぼ同形状の曲線であり、ピーク出力に
比例した値が得られるため特Ｃ問題とならない。必要で
あればこの曲線の形状と時間１．．１２に基づいて測光
出力に補正係数を与えることでピーク出力を予測するこ
ともできる。この補正は光検出器１８で測光する際に検
出レベル変更器を設けても行なうようにしても良いし、
−旦メモリ２７に記憶された測定値を基に演算処理を行
なって補正するようにしても良い。
は無いが、蛍光寿命曲線は蛍光を励起するレーザ光強度
が一定であれはほぼ同形状の曲線であり、ピーク出力に
比例した値が得られるため特Ｃ問題とならない。必要で
あればこの曲線の形状と時間１．．１２に基づいて測光
出力に補正係数を与えることでピーク出力を予測するこ
ともできる。この補正は光検出器１８で測光する際に検
出レベル変更器を設けても行なうようにしても良いし、
−旦メモリ２７に記憶された測定値を基に演算処理を行
なって補正するようにしても良い。
上記装置による測定の一例として、所定期間以上の長い
蛍光寿命を有する蛍光色素としてＥ ｕ ”キレート物
質を用いて血球細胞の表面抗原を検査するための試薬の
調整法、及びこの試薬を用いた測定の手順を以下に示す
。
蛍光寿命を有する蛍光色素としてＥ ｕ ”キレート物
質を用いて血球細胞の表面抗原を検査するための試薬の
調整法、及びこの試薬を用いた測定の手順を以下に示す
。
Ｅｕ３＋キレートは３００ｎｍ付近の波長の光で励起さ
れ、６１０ｎｍ付近の波長の赤色蛍光を長時間発生する
性質を有する。まず細胞表面の目的とする表面抗原と特
異的に結合するモノクローナ１ ル抗体を用意してこれをビオチン化し、またストレプト
アビジンにＥｕ”″キレートをラベルし、これらビオチ
ンとストレプトアビジンを結合させることにより、Ｅｕ
”キレートを標識化したモノクローナル抗体試薬を得る
ことができる。そしてこの試薬を適度濃度に希釈された
血液サンプルと混合して一定時間反応させて細胞染色を
行ない、この反応サンプル液を上記装置で測定すること
で、得られるＥｕ’＋キレートの蛍光強度から細胞の表
面抗原の定性的あるいは定量的測定を行なうことができ
る。
れ、６１０ｎｍ付近の波長の赤色蛍光を長時間発生する
性質を有する。まず細胞表面の目的とする表面抗原と特
異的に結合するモノクローナ１ ル抗体を用意してこれをビオチン化し、またストレプト
アビジンにＥｕ”″キレートをラベルし、これらビオチ
ンとストレプトアビジンを結合させることにより、Ｅｕ
”キレートを標識化したモノクローナル抗体試薬を得る
ことができる。そしてこの試薬を適度濃度に希釈された
血液サンプルと混合して一定時間反応させて細胞染色を
行ない、この反応サンプル液を上記装置で測定すること
で、得られるＥｕ’＋キレートの蛍光強度から細胞の表
面抗原の定性的あるいは定量的測定を行なうことができ
る。
次に、少ない光検出器でより多くのパラメータを得るこ
とのできる本発明の別の実施例を説明する。構成は先の
第２図のものと類似するため第２図を流用して説明する
。
とのできる本発明の別の実施例を説明する。構成は先の
第２図のものと類似するため第２図を流用して説明する
。
本実施例では第２図のバンドパスフィルタ１２を省略し
、又、アパーチャ１６の代わりに、第６図のような複数
の開口部を有するアパーチャ３０を配置した構成とする
。第６図において遮光性のアパーチャ３０の中心部及び
その近傍には２つの ２ 開口部３０ａ、３’Ｏｂが設けられている。各開口部３
０ａ、’３０ｂにはそれぞれバンドパスフィルタ３１．
３２が取付けられている。なお、複数種の蛍光色素を同
時に励起させるために、必要であればマルチ発振レーザ
光源を用いても良い。
、又、アパーチャ１６の代わりに、第６図のような複数
の開口部を有するアパーチャ３０を配置した構成とする
。第６図において遮光性のアパーチャ３０の中心部及び
その近傍には２つの ２ 開口部３０ａ、３’Ｏｂが設けられている。各開口部３
０ａ、’３０ｂにはそれぞれバンドパスフィルタ３１．
３２が取付けられている。なお、複数種の蛍光色素を同
時に励起させるために、必要であればマルチ発振レーザ
光源を用いても良い。
仮に被検粒子が蛍光寿命の長い例えばＥｕ’″″キレー
ト等の赤色蛍光色素、及び通常の蛍光寿命の緑色蛍光色
素の２種類の蛍光で標識されるものとすると、アパーチ
ャ３０の各バントパスフィルタ３１．３２の特性は、そ
れぞれ緑色蛍光、赤色蛍光を選択的に透過させる特性を
有するものを選択する。このような構成において、被検
粒子が光照射位置を通過する毎に光検出器１８には赤色
蛍光、緑色蛍光がそれぞれ選択的に時系列に入射するこ
とになり、１個の光検出器で２つの異なる蛍光が測定で
きる。この時、発光寿命の長いＥｕ”キレートによる赤
色蛍光は通常の蛍光が発生しない時間範囲ｔ１〜ｔ２で
測定されるため、雑光の混入を全く受けることなく正確
な測定値が得られる。
ト等の赤色蛍光色素、及び通常の蛍光寿命の緑色蛍光色
素の２種類の蛍光で標識されるものとすると、アパーチ
ャ３０の各バントパスフィルタ３１．３２の特性は、そ
れぞれ緑色蛍光、赤色蛍光を選択的に透過させる特性を
有するものを選択する。このような構成において、被検
粒子が光照射位置を通過する毎に光検出器１８には赤色
蛍光、緑色蛍光がそれぞれ選択的に時系列に入射するこ
とになり、１個の光検出器で２つの異なる蛍光が測定で
きる。この時、発光寿命の長いＥｕ”キレートによる赤
色蛍光は通常の蛍光が発生しない時間範囲ｔ１〜ｔ２で
測定されるため、雑光の混入を全く受けることなく正確
な測定値が得られる。
なおバンドパスフィルタ３１の特性を散乱光波長を選択
的に透過させるものにすれば、同一の光検出器１８で側
方散乱光強度と蛍光強度の２つの異なるパラメータが得
られるため、光検出器１７の光学系は不要となる。この
場合、散乱光と蛍光は強度差が大きいため、光検出器１
８にはダイナ主ツクｌノンジの広いものを使用するか、
あるいはバンドパスフィルタ３１に光減衰度の高いもの
を使用することが好ましい。
的に透過させるものにすれば、同一の光検出器１８で側
方散乱光強度と蛍光強度の２つの異なるパラメータが得
られるため、光検出器１７の光学系は不要となる。この
場合、散乱光と蛍光は強度差が大きいため、光検出器１
８にはダイナ主ツクｌノンジの広いものを使用するか、
あるいはバンドパスフィルタ３１に光減衰度の高いもの
を使用することが好ましい。
このように本実施例においては先の実施例と同様、時間
の遅れを利用して測定された蛍光強度は雑光の影響が全
く無い精度の高いものであり、更には光検出器以上の種
類の測定パラメータを得ることができるため、装置の小
型化・低コスト化に貢献する。
の遅れを利用して測定された蛍光強度は雑光の影響が全
く無い精度の高いものであり、更には光検出器以上の種
類の測定パラメータを得ることができるため、装置の小
型化・低コスト化に貢献する。
なお、以上の実施例において光検出器の数やアパーチャ
の開口の数は２つには限らず、更に数を増やすことで更
に多くのパラメータを得るようにしても良い。この場合
、蛍光寿命の長い蛍光を複数種用意し、これらを同時に
被検粒子に標識して、雑光の発生の後にこれらの蛍光を
波長選択して個別に検出することで、雑光の影響を受け
ない複数パラメータの蛍光強度を一度の測定で得ること
ができる。
の開口の数は２つには限らず、更に数を増やすことで更
に多くのパラメータを得るようにしても良い。この場合
、蛍光寿命の長い蛍光を複数種用意し、これらを同時に
被検粒子に標識して、雑光の発生の後にこれらの蛍光を
波長選択して個別に検出することで、雑光の影響を受け
ない複数パラメータの蛍光強度を一度の測定で得ること
ができる。
［発明の効果］
以上本発明によれば、雑光の影響を受のることなく、よ
り正確に蛍光強度の測定を行なうことができる。これに
より精度の高い検体測定を行なうことができる。
り正確に蛍光強度の測定を行なうことができる。これに
より精度の高い検体測定を行なうことができる。
第１図、第２図は本発明の実施例の装置の構成図、
第３図は実施例の装置の信号処理部のブロック第５図は
アパーチャの形状と測定時間との関係であり、図中の主
な符号は、 １・・・・レーザ光源、 ５ ２・・・・結像光学系、 ３・・・・フローセル、 ４・・・・光照劇位置、 ８．１７．１８・・・・光検出器、 １０・・・・ダイクロイックミラー １１．１２・・・・バンドパスフィルタ、７．１５．１
６．３０・・・・アパーチャ、１５ａ、１６ａ、３’Ｏ
ａ、３０ｂ−アパーチャ開口部、 ３１．３２・・・・バンドパスフィルタ、躬 う 閃 １ 蔀 ％ 履 τ１ ２ 吋閣
アパーチャの形状と測定時間との関係であり、図中の主
な符号は、 １・・・・レーザ光源、 ５ ２・・・・結像光学系、 ３・・・・フローセル、 ４・・・・光照劇位置、 ８．１７．１８・・・・光検出器、 １０・・・・ダイクロイックミラー １１．１２・・・・バンドパスフィルタ、７．１５．１
６．３０・・・・アパーチャ、１５ａ、１６ａ、３’Ｏ
ａ、３０ｂ−アパーチャ開口部、 ３１．３２・・・・バンドパスフィルタ、躬 う 閃 １ 蔀 ％ 履 τ１ ２ 吋閣
Claims (5)
- （１）サンプル中の検体を蛍光標識する工程と、 前記サンプル中の個々の検体に光照射する工程と、 前記光照射時より所定時間の後に検体からの蛍光を測光
する工程と、 を有することを特徴とする検体測定方法。 - （２）照射位置に光を照射する手段と、 蛍光標識された個々の検体を前記照射位置に順次通過さ
せる手段と、 前記照射位置よりも下流の所定位置の検体からの蛍光を
測光する手段と、 を有することを特徴とする検体測定装置。 - （３）前記標識する蛍光色素は、検体自らが有する自家
蛍光以上の蛍光寿命を有する請求項（１）又は（２）記
載の検体測定方法又は検体測定装置。 - （４）前記照射位置の検体からの光を測光する手段を有
する請求項（２）記載の検体測定装置。 - （５）前記蛍光の測光強度を蛍光の寿命曲線に基づいて
補正する手段を有する請求項（２）記載の検体測定装置
。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016551A JP2749928B2 (ja) | 1990-01-26 | 1990-01-26 | 検体測定方法及び検体測定装置 |
| DE69118429T DE69118429T2 (de) | 1990-01-26 | 1991-01-22 | Verfahren zur Messung einer Spezies unter Verwendung von Fluoreszenzlicht |
| EP91100755A EP0448931B1 (en) | 1990-01-26 | 1991-01-22 | Method for measuring a specimen by the use of fluorescence light |
| US08/055,759 US5480775A (en) | 1990-01-26 | 1993-05-03 | Method for measuring a specimen by the use of fluorescent light |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016551A JP2749928B2 (ja) | 1990-01-26 | 1990-01-26 | 検体測定方法及び検体測定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03221837A true JPH03221837A (ja) | 1991-09-30 |
| JP2749928B2 JP2749928B2 (ja) | 1998-05-13 |
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ID=11919416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016551A Expired - Fee Related JP2749928B2 (ja) | 1990-01-26 | 1990-01-26 | 検体測定方法及び検体測定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2749928B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002296170A (ja) * | 2001-03-29 | 2002-10-09 | Sysmex Corp | フローサイトメータ |
| JP2006098202A (ja) * | 2004-09-29 | 2006-04-13 | Fuji Photo Film Co Ltd | 蛍光画像補正方法および装置ならびにプログラム |
| GB2429058B (en) * | 2004-03-06 | 2008-12-03 | Michael Trainer | Method and apparatus for determining the size and shape of particles |
| WO2009098868A1 (ja) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd. | 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 |
| US8634072B2 (en) | 2004-03-06 | 2014-01-21 | Michael Trainer | Methods and apparatus for determining characteristics of particles |
| JP2024531945A (ja) * | 2021-08-11 | 2024-09-03 | センチネル モニタリング システムズ インコーポレイテッド | 適合された区別を有するフローサイトメトリのシステム及び方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS59174742A (ja) * | 1983-03-25 | 1984-10-03 | Agency Of Ind Science & Technol | 微小粒子を区分又は選別する方法及びその装置 |
| JPS60252245A (ja) * | 1984-05-30 | 1985-12-12 | Hitachi Ltd | 細胞分析装置およびこれを用いた細胞分離装置 |
| JPS6394136A (ja) * | 1986-10-08 | 1988-04-25 | Hitachi Ltd | 蛍光分析方法及び装置 |
-
1990
- 1990-01-26 JP JP2016551A patent/JP2749928B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| US8049185B2 (en) | 2008-02-07 | 2011-11-01 | Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd. | Fluorescence detection device and fluorescence detection method |
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| US12474251B2 (en) | 2021-08-11 | 2025-11-18 | Sentinel Monitoring Systems, Inc. | Systems and methods for flow cytometry with tailored discrimination |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2749928B2 (ja) | 1998-05-13 |
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|---|---|---|---|
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