JPH03224488A - ＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明はＨｐｔ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼをコードする組換えＤＮＡ、並びに組換えＤＮ
Ａからのこれら酵素の製造に関する。

制限エンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する種類
の酵素である。制限エンドヌクレアーゼを精製して他の
混在細菌成分を除去すると、実験室内でＤＮＡ分子を正
確な断片に分断するために使用できる。この性質により
ＤＮＡ分子を単一的に同定し、構成遺伝子に分けること
ができる。制限エンドヌクレアーゼは近年の遺伝子研究
になくてはならない道具であることは明かである。制限
エンドヌクレアーゼは遺伝子工学や分析を実施するため
の生化学的「はさみ」である。

制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子に沿ってヌクレオ
チドの特定配列（「認識配列」）を認識し、それと結合
することにより作用する。制限エンドヌクレアーゼは一
度結合すると配列内または配列の一端の分子を切断する
。制限エンドヌクレアーゼによって認識配列は異なる。

今日までに調査された数百種の細菌から１００以上の異
なる制限エンドヌクレアーゼが同定されている。

一種の細菌が有する制限エンドヌクレアーゼは通常はん
の僅かな数に過ぎない。エンドヌクレアーゼは由来する
細菌から命名する。従って、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｉ　
　ａｅｇ７ｐｔｉｕｓは例えば３つの異なる制限エンド
ヌクレアーゼを合成し、これらはＨａｅｌ。

Ｈｉｅｌｌ及びＨｌｅｌｌｌと命名されている。これら
の酵素は各々配列（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）　、ＰｕＧ
ＣＧＣＰＹ及びＧＧＣＣを認識し、切断する。−方、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｒ７１３
は配列ＧＡＡＴＴＣを認識する酵素ＥｃｏＲ１のみを合
成する。

理論に拘束されることを望むわけではないが、実際に制
限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の増殖を保護する役割
を果たしていると考えられる。制限エンドヌクレアーゼ
があるために細菌はウィルスやプラスミドのような外来
ＤＮＡ分子の感染に抵抗することができ、これがなけれ
ば破壊されるか寄生されてしまう。制限エンドヌクレア
ーゼは感染したＤＮＡ分子に結合し、認識配列がある毎
に切断することによって耐性を付与する。その結果のＤ
ＮＡ分子の分解により感染遺伝子の多くは不活性化され
、エクソヌクレアーゼによるその後の分解に対するＤＮ
Ａの感受性が増す。

細菌の防御系の第二の成分は修飾メチラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼを補足し、細菌が
自分自身のＤＮＡを保護し、外来の感染ＤＮＡから識別
しうる手段を提供している。

修飾メチラーゼは対応の制限エンドヌクレアーゼと同じ
ヌクレオチド認識配列を認識し、これに結合するが、Ｄ
ＮＡを破壊する代わりに、メチル基を添加して配列内の
１つ以上のヌクレオチドを化学的に修飾する。メチル化
された認識配列には制限エンドヌクレアーゼは結合せず
、切断もしない。

細菌細胞のＤＮＡは修飾メチラーゼ活性で常に完全に修
飾されており、そのため内因性制限エンドヌクレアーゼ
の存在に対しては全く感受性がない。

未修飾の従って完全に外来のＤＮＡのみが制限エンドヌ
クレアーゼの認識と攻撃に感受性を持つ。

遺伝子工学技術の進歩により、現在では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードする蛋白質や酵素を従
来の精製法より大量に製造することができる。制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵となるも
のは、１Ｇ’〜１Ｇ−４程変の低頻度でクローンが発生
する場合に複雑な「ライブラリー」すなわち「ショット
ガン」法で得たクローン群内でこのようなりローンを同
定する簡単で信頼のおける方法を開発することである。

所望ではない大部分のクローンは破壊され、所望の少量
のクローンが生存するような選択的方法が好ましい。

第１！型の制限−修飾系はより高頻度にクローン化され
ている。第一のクローン化した系は制限エンドヌクレア
ーゼクローンを同定し、選択する手段としてバクテリオ
ファージ感染を使用していた（Ｈｂａｌｌ：　Ｍａｎｎ
　　ら、　　Ｇｅｎｅ　３：９７−１１２．　　（１９
７８）ＥｃｏＲＩＩ：ＫｏＢｋｈ　　ら、　　Ｍｏ１ｅ
ｃ、　　Ｇｅｎ、　　Ｇｅｎｅｊ　　１７８ニア１７−
７１９、　（１９８０）；　　Ｐｓｌｌ：　Ｗｉｌｄｅ
ｒら、　　Ｐ＋ｏｅ、　　Ｎａｐ、　　＾ｃｇｄＳｃｉ
、　ＵＳ＾ｙａ：　１５０３−１５０７．　　（１９８
１））　、細菌中に制限−修飾系が存在すると細菌はバ
クテリオファージ感染に対して耐性となり、そのため、
原則的にはクローン化した制限−修飾遺伝子を有する細
胞はファージに露出したライブラリーから生存細胞とし
て選択的に単離できる。しかし、この方法にはほんの限
られた価値しかないことが判明した。

特に、クローン化した制限−修飾遺伝子は選択的に生存
する充分なファージ耐性を常に示すのではないことが明
かとなった。

もう一つのクローニング法は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
クローニングプラスミドへのプラスミド担持物（ｐｌａ
ｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）　　として最初に特性化された
転移系を使用している（ＥｃｏＲＶ：　Ｂｏｕｇｕｅｌ
ｅ＋ｅｊら、　　Ｎｕｃｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ
、　　１２：　　３６５９−３６７６、　　（１９８４
）・　ＰａｅＲ７ＧｉＢｅｔｔｓ及び　Ｂｒｏｏｋｓ、
　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ　　＾ｃａｄ、　　５ｅＵ
ＳＡ　８０：　４Ｇ２−４０６．　　（１９８３）；　
Ｔｈｅ＋１ａａｌｔ及びＲｏ７Ｇｅｎｅ　　１９：　　
３５５−３５９．　　（１９８２）；　　Ｐｖｕｌｌ：
　　Ｂｌｕｍｅｎｌｈｘら、　　］、Ｂｇｃ＋ｅｒｉｏ
１．　１６４：　　５０１−５０９．　　（１９８５）
）。

第三の方法であり、多くの系のクローン化に使用されて
いる方法は活性メチラーゼ遺伝子の選択を含んでいる（
例えば、１９８６年９月３日発行の欧州特許第１９３．
４１３号及びＢｓｕＲＩ：　Ｋ１５ｓ　らＮｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１３：６４０３−６４２
１．　（１９８５）参照）。

制限遺伝子と修飾遺伝子は密接に関連する傾向にあるた
め、両遺伝子を含有するクローンは１つの遺伝子につい
ての選択により単離できることが多い。メチル化活性に
ついて選択すると完全な制限−修飾系が常に得られるわ
けではなく、その代わりにメチラーゼ遺伝子のみが得ら
れることもある（Ｂ＋ｐＲＩ：Ｓ＋ｏｍｏｌａｎ７ｉら
、Ｇｅｎｅ　ｌＯ：２１９−２２５．　（１９ｇ０）Ｂ
ｃａｌ：　　Ｉ！ｎｕｌａｉｊｉｓら、　　Ｇｅｎｅ　
２０：１９７−２０４．　　（１９８２）ＢｓｕＲｌ：
　Ｋ１５ｓ及びＢａ１ｄａｕｔ　　Ｇｅｎｅ　２１：　
１１１−１１９（１９８３）　ｌ及び１Ｊｓｐｌ：　Ｗ
ｉｌｄｅｒ　ら、　　１．　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ１
２５８・１２３５−１２４１．　　（１９８３））。制
限−修飾系のクロニングの概説としては例えばＬｕｎｎ
ｅｎ　ら、　　Ｇｅｎｅ７４：　２５−３２　（１９８
８）及びＷｉｌｓｏｎ　Ｇ、Ｇ、　　Ｇｅｎｅ　７４２
８１−２８５　（１９８８）　を参照されたい。

制限−修飾遺伝子のクローニングの大きな障害は、修飾
によって既に保護されているわけではない宿主にエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メ
チラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを同時に
一つのクローンに導入するときには、エンドヌクレアー
ゼが宿主ＤＮＡを切断する機会を得る前にメチラーゼが
宿主ＤＮＡを保護するように修飾しなければならない。

従って、最初にメチラーゼ遺伝子次にエンドヌクレアー
ゼ遺伝子と順にクローニングすることのみが可能な場合
もある。制限−修飾系のクローニングのもう一つの障害
は、大腸菌株の中にはシトシンまたはアデニン修飾に不
利な作用を持つものがあること、すなわち、メチル化シ
トシン含有ＤＮＡ　　（Ｒａｌｅｉｇｂ　　及び　Ｗｉ
ｌｓｏｏ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ、５ｃｉＵＳ
Ａ　８３：９０７０−９０７４．　（１９８６））及び
メチル化アデニン含有１）　ＮＡ　（ＨｅＮｍａｎ及び
Ｍｏｄｅｌ、　　１．　　Ｂ１ｅｔ１９６：３２４３−
３２５０．　（１９８７）；　Ｒａｌｅｉｇｈ、　Ｔ＋
ｉｍｘ＋ｃｈｉ及びＲｅｙｅｌ、　Ｇｅｎｅｔｉｅ３１
２２：　２７９−２９６．　（１９８９））を破壊する
系を有しているものがあるとの発見である。シトシン特
異性またはアデニン特異性のメチラーゼ遺伝子はそれ自
身のみでも対応のエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒にも
これらの株には容易にクローニングすることはできない
。この問題を避けるためには、これらの系を欠く大腸菌
変異株（Ｍｃ＋＾　及び１ＪｃｒＢ　　またはＭｒｒ　
　）を使用することが必要である。

精製した制限エンドヌクレアーゼそして少し程度は落ち
るが修飾メチラーゼは実験室中でＤＮＡを特性化し、再
配列させるための有用な手段であるため、これらの酵素
を大量に合成する組換えＤＮＡ法で細菌株を得ることは
工業的に意味のあることである。このような菌株は、精
製を簡略化し、同時に工業的有用量を製造する手段も提
供するため有用であろう。

口発明の概要］　本発明は、パラインフルエンザ園）！
ｔｅｍｏｐｈｉｌｕｔ　ｐａ「ｘｉｎｆｌｕｅｎｘａｃ
　（ＮＥＢ株＃１２７、このサンプルは受託番号１５３
９１３としてＡＴＣＣに寄託した）由来の）Ｉｐａ　Ｉ
制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子を含
有する入手可能な組換えＤ　Ｎ　Ａ、　、並びに組換え
ＤＮＡからのこれら酵素の製法に関する。本発明は、Ｄ
ＮＡ配列ＧＧＴ’　ＡＡＣを認識し、第二の５’　　Ｔ
と第一の５’　　Ａの間に矢印で示したように切断する
酵素である制限エンドヌクレアーゼＨｐａ　ｌを発現す
る形質転換した宿主にも係る。Ｈｉｎｅｓ、　］、Ｌ、
、　　Ｃｈｘｕｎｃｅ７．　Ｔ、Ｒ，及び　＾ｇａ＋ｗ
ａｌ、　　　Ｋ、Ｌ、、　　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ
　　ＥｎＢｍｏｌｏｇｙ、　　　６５１５３−１６３．
　（１９６０）を参照のこと。また、これらの開示内容
は参考として本明細書に含むものとする。

ｔｌｐａ　Ｉをクローニングする好適な方法は、バライ
ンフルエンザ菌由来のＤＮＡを含有する充分量のライブ
ラリーを作成し；適当な制限エンドヌクレアーゼすなわ
ちメチル化されていない時には認識配列を切断する酵素
と共にライブラリーＤＮＡをインキュベートすることに
より対応のメチラーゼを発現するクローンを選出し；そ
して制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートする
ことにより切断されなかった組換えＤＮＡで宿主を再度
形質転換し、得られた形質転換体を生存細胞の中の陽性
クローンについてスクリーニングすることからなる。

［発明の詳細な説明コ 本発明は制限［１ｐａ　ｌエンドヌクレアーゼ及び修飾
メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、並びにこのよう
な組換えＤＮＡから産生される酵素に関する。

Ｈｐａ　ｌ制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を好ましく
クローニングし、発現させる本明細書に記載の方法は第
１図に示すが、次のステップを含んでいる： １、）Ｉｐａｌ　メチラーゼのクローニングＡ、ライブ
ラリーの作成 Ａ　−１、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの
ヘモフィリス属増殖用標準プロトコールに従ってパライ
ンフルエンザ園を増殖させ、細胞を溶解し、Ｂ＋ｏｏｋ
＋らＮｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１
７：９７９−９９７．　　（１９Ｎ）に記載の方法でゲ
ノムＤＮＡを精製する。これは実施例に詳細に述べる。

Ａ−２，制限エンドヌクレアーゼ：　［１ｉｎｄ　ｌ１
ｌＥｃｏＲＩ、ＪＩ　ＩＩ、　ＢａｍＨｌ及びＣ１ａ　
ｌでゲノムＤＮＡを完全に消化する。

Ａ−３，これら制限酵素断片を、クローニングベクター
、理想的には、Ｈｐａ　１部位を１．２または３つとク
ローニング部位を有するもの例えばｐＢｌｌ）Ｉｔ、　
２（ＡＴＣＣ６７９０２）またはｐＢＩＩＨＩ．　２Ｋ
ｌ　またはｐＡｃＹｃ１７７　（ＡＴＣＣ３７０３１）
の対応のクローニング部位に連結しくすなわち、例えば
Ｂｉｎｄ　ＩＩＩにより生成したフラグメントはＨｉｎ
ｄ　Ｉｌｌクローニング部位に連結する）、混合物を使
用して適切な宿主細胞例えばｍｒｒ　　である大腸菌Ｒ
ＲＩまたはｍｒｒ及び／またはＭｃ　ｒＡ　　である他
の任意の大腸菌株を形質転換する。

Ａ−４，形質転換した混合物を形質転換した細胞用に選
択的な地例えば抗生物質アビシリン、テトラサイクリン
またはクロラムフェニコール上にブレーティングする。

インキュベージラン後、形質転換したコロニーを一つの
培養物、細胞ライブラリー中に集める。

Ａ−５，細胞ライブラリーから組換えプラスミドを完全
に精製しプラスミドライブラリーを作成する。

Ｂ、ライブラリーの選択及びスクリーニングＢ−１、Ｗ
ａｔｔｏｎら（上記）に記載と同様の方法により、パラ
インフルエンザ菌から調製したＨｐａＩ制限エンドヌク
レアーゼを使用してプラスミドライブラリーをｉｎ　ｖ
Ｎｒｏで完全に消化する。Ｈｐｘメチラーゼクローンの
相対頻度が増すにつれ、Ｈｐｇ　ｌ消化は未修飾のメチ
ラーゼ非含有クローンを段階的に破壊する。

Ｂ−２９選択したＤＮＡを大腸菌ＲＲＩのような適当な
宿主に形質転換して戻し、選択培地にブレーティングす
ることによって形質転換体を回収する。コロニーを採り
、そのＤＮＡをＨｐｌ　１修飾遺伝子の存在について分
析する。それ等が有するプラスミドを精製し、Ｈｐａ　
Ｉ制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして消
化に耐性であるかを決定する。全細胞ＤＮＡ　（染色体
及びプラスミド）も精製し、Ｈｐｘ　Ｉ制限エンドヌク
レアーゼと共にインキュベートする。Ｈｌｌｌ　Ｉ修飾
遺伝子を含有するクローンのＤＮＡは完全に修飾されて
いるべきであり、プラスミドＤＮＡ及び全ＤＮＡの両者
は実質的に消化に耐性であるべきである。Ｃ１Ｈｐａ　
！エンドヌクレアーゼ蛋白質の製造、ＨｐａＩエンドヌ
クレアーゼの蛋白質配列決定、エンドヌクレアーゼの位
置のマツピング Ｃ−１，ＨｐａＩルミｌ制限エンドヌクレアーゼａ１制
限遺伝子及び修飾遺伝子を含有するパラインフルエンザ
菌から製造する。高栄養培地中、培養器内で細胞を繁殖
させる。遠心分離により細胞を集める。細胞をガリンミ
ルで破壊してＨｐａ　ｌ制限エンドヌクレアーゼ活性を
有する粗製細胞抽出物を作成する。Ｈｐａ　ｌ制限エン
ドヌクレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を標準の
イオン交換及びアフィニティークロマトグラフィー手法
で精製する。

Ｃ−２゜そのように精製したエンドヌクレアーゼはＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であり、分子
量３０．　ＯＮダルトン、比活性はλＤＮＡに滴定して
約２５０．０００単位／ｍｇ蛋白質である。

Ｃ−３，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｔｅｍｉ　４７
ＯＡ　ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｏｃｅｒ　　（Ｂ＋ｏ
ｏｋｔ　　ら　、　　　Ｎｕｃｌ　ｃｉｃ　　Ａｃ１ｄ
ｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１７：９７９−９９７．　　ｊ
１９８９））を使用してエンドヌクレアーゼのアミノ末
端配列を得て、蛋白質配列を基にＤＮＡオリゴヌクレオ
チドプローブを作成する。

Ｃ−４，プローブを使用してメチラーゼクローン上の及
びパラインフルエンザ菌ゲノムに対してのエンドヌクレ
アーゼの位置をマツピングする。

１１、ＨｐａＩ制限−修飾系のクローニングＡ、ライブ
ラリーの作成 Ａ−１，Ｉ　（Ａ−１）に記載のように調製したパライ
ンフルエンザ菌ゲノムＤＮＡをＫｐｎｌ制御１エンドヌ
クレアーゼのような制限エンドヌクレアーゼで完全に消
化する。

Ａ−２，得られたＫｐｎ　Ｉ断片を、理想的には１．２
または３個のＨｐｓ　１部位と１つのＫｐｎ　ｌクロー
ニング部位を持つクローニングベクター例えばｐＢＩＩ
Ｉ（＋、　２Ｋｌの　Ｋｐｎ　ｌクローニング部位に連
結し、混合物を使用して大腸菌ＲＲＩ細胞のような適当
な宿主を形質転換する。

Ａ−３，形質転換した混合物を、抗生物質アンピシリン
、ストレプトマイシンまたはクロラムフェニコールのよ
うな形質転換細胞に選択的な培地上にブレーティングす
る。インキュベートした後、形質転換したコロニーを一
つの培養物、細胞ライブラリーに集める。

Ａ−４１組換えプラスミドを細胞ライブラリーから完全
に精製してプラスミドライブラリーを作成する。

Ｂ、ライブラリーの選択とスクリーニングＢ　−１、Ｗ
ａｌｓｏｎら（上記）に記載と同様の方法により、パラ
インフルエンザ菌から調製したＨｐａＩ制限エンドヌク
レアーゼを使用してプラスミドライブラリーを完全に消
化する。Ｉ（ｐａ　ｌメチラーゼクローンの相対頻度の
増加に応じて、Ｈａｐｌ消化は未修飾のメチラーゼ非含
有クローンを特異的に破壊する。

Ｂ−２２選択したＤＮＡを大腸菌ＲＲＩのような適当な
宿主に形質転換して戻し、選択培地にブレーティングす
ることによって形質転換体を回収する。コロニーを採り
、そのＤＮＡをＨｐａ　ｌ修飾遺伝子の存在について分
析する。それ等が有するプラスミドを精製し、ＩＮ　Ｉ
制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートシて消化
に耐性であるかを決定する。全細胞ＤＮＡ　（染色体及
びプラスミド〕　も精製し、）Ｉｐａｌルミｌ制限エン
ドヌクレアーゼインキュベートする。Ｈｐａ　ｌ修飾遺
伝子を含有するクローンのＤＮＡは完全に修飾されてい
るべきであり、プラスミドＤＮＡ及び全ＤＮＡの両者は
実質的に消化に耐性であるべきである。

Ｂ−３，ｆｌｐａｌｌルミｌメチラーゼ有することが判
明しているクローンの粗製抽出物を調製し、ｔｌｐａ　
ｌ制限エンドヌクレアーゼ活性について粗製抽出物をア
ッセイすることによって、ＨｐａＩルミｌ制限エンドヌ
クレアーゼするクローンを同定する。粗製細胞抽出物中
のＨｐａ　Ｉ活性のレベルを測定する。

Ｃ，Ｈｐａ　ｌ制限−修飾クローンの制限マツピング及
び欠損サブクローンの調製 Ｃ−１，８ｐａｌ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチ
ラーゼを含有することが同定されているクローン上でい
くつかの制限エンドヌクレアーゼ部位をマツピングし、
欠損サブクローニングとプローブとしてＤＮＡオリゴマ
ーを使用するササンハイプリダイゼーションによるマツ
ピングにより遺伝子の位置を決定した。

Ｃ−２，より多（のＨｌｌｌ　ｌエンドヌクレアーゼを
産生ずるクローンを作る試みの中で種々のサブクローン
を作成する。

Ｃ−３，８ｐａｌ制限エンドヌクレアーゼはＨｐａＩ制
限及び修飾遺伝子を含有する細胞から産生される。細胞
を、アンピンリン含有の高栄養培地中、培養器内で細胞
を増殖させる。遠心分離により細胞を採集する。細胞を
超音波処理で破壊してＨｐａ１ルミ１制限エンドヌクレ
アーゼ有する粗製細胞抽出物を作成する。ｆｌｐａ　ｌ
制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物
を標準のイオン交換及びアフィニティークロマトグラフ
ィー手法で精製する。

Ｃ−４，そのように精製したエンドヌクレアーゼはＳＯ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であり、分子
量３０，０００ダルトン、比活性はλＤＮＡに滴定して
約２５０，０００単位／ｍｇ蛋白質であることが判った
。

上記に概説したステップは本発明の好適な実施法を現わ
したものであり、公知の手法により上記方法を変化し得
ることは当業者には明かであろう。

以下の実施例は現在のところ実施するに好ましい実施態
様を説明している。本実施例は説明のためのものであり
、添付の特許請求の範囲に示すものは除き本発明が実施
例に限定されないことは理解されよう。

［実施例］ Ｈｐａ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニン
グ １、ｔｌｐｘｌ　メチラーゼのクローニングＡ、ライブ
ラリーの作成 Ａ−４，ゲノムＤＮＡの精製：約５ｇのパラインフルエ
ンザ菌細胞を解凍し、コーニングプラスティック管（５
０ｍｌ）中の　０．１Ｍ　　トリス−ＨＣ１（ｐｌ＋７
．１）、０．１Ｍ　　ＥＤＴＡ　（２５１）中に再懸濁
させた。上記バッファ３５１中リゾチーム６０ｍｇの溶
液を２本の５０ｍ［プラスチック管に分け、等量（１５
ｍｌ）の細胞懸濁液を容管に加えた。溶液を３７℃で１
５分間インキュベートした。２０％保存溶液からＳＤＳ
を加え、ＳＤＳの最終濃度が１％となるように調整した
。プロティナーゼＫ（２０ｍｇ／口１保存溶液）２００
μｍを加え、３７℃で１時間インキュベートした。溶液
はこの時点で粘性となり拡散したが、透明ではなかった
。管（各１ｍ１）に１０％Ｓ　Ｄ　Ｓ／８％サルコシル
２゜を加え、５５℃に２時間加熱した。サンプルは粘性
のままであったが、全体的には透明ではなかった。サン
プルをＴＥ　（１０ｍＭトリス−ＨＣ１゜ｐＨ７，１，
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）（２１）に対して１６時間透析し
た。透析液は１回替えた。透析後、等量のＴ　Ｅ　（ｐ
Ｈ８，０）を加えてＣｓＣ１勾配用の溶液（９８ｍｌ）
を調製し、これを２つに分けて、各々にＣｓ　ＣＩ　０
５０ｇ及び５ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム１ｍｌを加えた
。２０本の管をＴｉ７０ローター４４、０ＧＯｒｐｍで
４８時間回転させた。バンドを取り出し、Ｃ３Ｃ１−水
一飽和イツブロバノールで抽出した。溶液を前記と同じ
バッファ（４１）に対して透析し、次いで、フェノール
及びクロロホルムで（各１回）抽出した。この溶液を再
度透析してフェノールを除去し、次ぎに電気泳動にかけ
た。

Ａ−２，限定消化：精製したＤＮＡを旧ｃｄ　ＩＩＩ。

ＥｃｏＲｌ、　　Ｂａｍ１　ｌ、　　Ｂｇｌ　Ｉｆ及び
Ｃｌａ　Ｉで切断し次のように完全消化した＝１０ｍＭ
トリス（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１１１００
ｍＭ　　ＮａＣ１、１０ｍＭメルカプトエタノールバッ
ファ中１００μｇ／ｍｌのＤＮＡ３００μｍを３本の試
験管に分けた。試験管にＨｉｎｄ　ＩＩＩ　５０単位を
加えた。試験管を３７℃で１時間インキュベートし、次
ぎにフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで
沈澱させた。１０ｍＭトリス−ＭＣＩ、１ｍＭＥＤＴＡ
　（ｐＨ８，０）の３００μｌ中にペレットを再懸濁し
、その各１０μｍをアガロースゲル電気泳動で分析した
。

Ａ−３，連結：断片に切断したＤＮＡを次のようにｐＢ
ｌｌ）Ｉｌ、　２　（Ｐｖｕ　１１部位にＨｐｇ　ｌ　
　リンカ−を挿入し、ＥｃｏＲ１部位にＢｇｌ　Ｉｌ　
リンカ−を挿入したｐＮＯ１５２３）ｌ：連結した：　
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、　ＥｃｏＲＩ　　ＢａｍＨ！、　　
Ｂｇｌ　ＩｌまたはＣｌａ　Ｉで消化したバラインフル
エンザ菌Ｄ　Ｎ　Ａ　（１００μｌ）　１０．　Ｏｕｇ
を、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩＥｃｏＲＩ、　　ＢｇｍＨｌ、　
　Ｂｇｌ　ＩｆまたはＣＩｌ　ｌで切断し、脱燐酸化し
たｐＢＩＩＨＩ．　２　（２０，０μｍ）２．０Ｍｇと
混合し、エタノール沈澱させた。ＤＮＡを４℃、１２、
０００ｇで１５分間遠心分離し、７０％エタノール−０
０μｍで１度洗った。Ｄ　Ｎ　Ａを１ｘ連結バツフｙ（
５０ｍＭトリス（ｐＦＩ７．　５）　、１０ｍＭＭｇＣ
１，１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　　Ａ７Ｐ）９９
μｍに再懸濁し、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ１μＩを加え
、混合物を１６℃で１６時間インキュベートした。２．
５μｌ及び５．０μｍのアリコートを使用して次のよう
に大腸菌株ＲＲＩを形質転換した：各アリコートを氷冷
したコンピテント大腸菌ＲＲＩ細胞２００μｍと混合し
、氷上に３０分聞装いた。４２℃の２分間加熱ショック
後、細胞をルリアーブロス（Ｌ−ブロス）１１で希釈し
、３７℃で１時間増殖させた。

Ａ−４，−次細胞ライブラリー：形質転換細胞培養物を
遠心分離し、２５０μｍに再懸濁し、１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含有するルリアー寒天（Ｌ−寒天）板
上にブレーティングした。３７℃で一晩インキユベート
した後、寒天板を取り出し、約８０００個のコロニーを
掻き取って抗生物質含有し８２５ｍ１に入れた。これら
の細胞からプラスミドＤＮＡを次のように調製した：細
胞を遠心分離によりペレッＩ・とじ、細胞ペースト３ｇ
を２５ｍＭト　リ　ス−ＨＣｌ、　　１　０ｍＭ　　　
　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ８，０）及び５０ｍＭグルコース
１４ｍ１に再懸濁した。懸濁液はりゾチーム中４．０ｍ
ｇ／ｍｌとし、２５℃で５分間インキュベートした。１
％ドデシル硫酸ナトリウム及び０．２Ｎ　　ＮａＯＨの
アリコート２７山１を加え、溶液を混合し、０℃で５分
間インキュベートした。氷冷した３Ｍ酢酸カリウム（ｐ
Ｈ４，８）２０ｍｌを加えてゲノムＤＮＡを沈澱させ、
これを１０秒間緩かに撹拌し、氷上に５分間置き、１２
、０００ｘ　ｇで１０分間遠心分離した。上清を取り出
し、等量のフェノール／クロロホルム（１：　１）で抽
出した。１０．０００ｘ　ｇで５分間遠心分離して層を
分離した。上層を取り出し、等量のクロロホルムで抽出
した。ｔｏ、　０００ｇで５分間遠心分離し層を分離し
た。上層を取り出し、２倍量のエタノールを添加して核
酸を沈澱させた。１２．０００ｘ　ｇで２０分間遠心分
離して沈澱を集めた。ベレットを７０％エタノールで１
回洗い、前記と同様に再度ペレット化した。ペレットを
真空下で乾燥させ、１０ｍＭ）　　リ　ス　−　ＨＣＩ
　　、　　１ｍＭ　　　　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ８，０）
３ｍｌに再懸濁した。塩化セシウム８．９ｇ及び臭化エ
チジウム溶液（５ｍｇ／ｍｌ）　０．　９ｍを加えて、
塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度遠心分離用にＤ
ＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液を４４．０００＋ｐｍ
で４８時間遠心分離し、得られたＤＮＡのプラスミドバ
ンドをシリンジと１８ｇ針で取り出した。等量のＣｓＣ
１−水一飽和イツブロバノールで抽出して臭化エチジウ
ムを除去した。

塩化セシウムは透析で除去した。ＤＮＡは等量のフェノ
ール／クロロホルム（１：　１）で抽出し、エタノール
で沈澱させた。得られたＤＮＡペレットを１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　１．
０ｍｌに再懸濁した。

Ｂ、ライブラリーの選択及びスクリーニングＢ−１．−
次選択及び選択ライブラリー：　Ｈｉｎｄｌ、　　Ｅｉ
Ｒｌ、　　ＢａｍＨ１，Ｂｇｌ　Ｉｆ及びＣｌａ　ｌプ
ラスミドライブラリ−２μｇ　　（３０，０μｍ）を制
限エンドヌクレアーゼ消化バッファ（１０ｍＭ）リスｐ
Ｈ７，５，１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ　　、１０ｍＭメルカ
ブトエタノール、１００ｍＭ　　ＮａＣ１及び牛血清ア
ルブミン１００μｇ）６０μｍに希釈した。

Ｈｐａ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ１００単位（３μｍ
）を加え、試験管を３７℃で２時間インキュベートした
。そのときに子牛小腸ホスファターゼ７Ｕ（１μｍ）を
加え、反応混合物をさらに３０分間インキュベートした
。−次ライブラリーと同様に、この反応混合物のアリコ
ート２μｍ及び４μｍを水冷したコンピテント大腸菌Ｒ
ＲＩ細胞２００μと混合し、形質転換させ、ブレーティ
ングし、−晩増殖させた。

Ｂ−２１個々の分析二上記形質転換からのコロニーを採
り、アンピシリン含有ＬＢ寒天板及びアンピシリン及び
ストレプトマイシン含有ＬＢ寒天板上にブレーティング
した。ａｍｐＲ及び＋ｔ＋ｅｐ”のＨｉｎｄ　Ｉｌｌラ
イブラリーからの８個のコロニーを１０＋＋＋ｌの培養
物中で増殖させ、コロニーが有するプラスミドをＢｉ＋
ｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
＋Ｒｅｓ、　　７：１５１３　（１９７９））の方法か
ら採用した次の微少製造（ｍｉΩ１ｐｒｅｐ）精製法に
より製造した。

微少製造法：各培養物を次のように処理したニー晩培養
した培養物１．５ｍｌを６．ＱＱＱ　ｘ　ｇ、　５分で
ペレットにした。上清を流し捨て、リゾチームＬｏｇ／
ｍｌを含有する２５ｍＭ）リス、１０ｍＭＥＤＴＡ、５
０ｍＭグルコース（ｐＨ８，０）　１５０μｍに再懸濁
した。室温に５分装置いた後、０．２Ｍ　　ＮａＯＨ，
１％５ＤＳ２００μｌ　を加え、試験管を振とうして細
胞を溶解し、氷上に置いた。

５分後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）１５０μｍ
を加え、振とうし、さらに５分間氷上に置いた。形成さ
れた沈澱を４℃、１２．０００ｘ　ｇで１０分間回転さ
せて沈澱させた。上清を取り出し、等量のフェノール／
クロロホルム（１：　１）で抽出した。１０．０ＯＯＸ
　ｇで５分間層を遠心分離した。エタノール８８０μｍ
含有する遠心管に上清を注ぎ入れ、混合した。室温に１
００分間層た後、遠心管を１２．Ｑ（１０ｘｇで１０分
間回転させて沈澱した核酸をペレットにした。上清を捨
て、ペレットを再度１ｍｌの７０％エタノール−水で洗
い、再度ペレット化し、真空下、室温で３０分間乾燥さ
せた。−度乾燥させた後、２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ
を含有する１０ｍＭ）リス、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ
８，０）５０μｍに再懸濁し、３７℃で１時間インキュ
ベートしてＲＮＡを消化した。

次に、プラスミド微少調製物をＨｐｇ　ｌ及び旧ｃｄＩ
Ｉ＋消化により分析した。

Ｂ−３，メチラーゼ遺伝子クローン；分析したプラスミ
ドの７５％はＨｐｇ　Ｉに耐性であり、約２、３ｋｂ長
のＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片を有していることが判明した。

さらに、これらのプラスミドはＨｐｇ　Ｉ修飾メチラー
ゼ遺伝子のみを含有し、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
は含有していないことが判明した。

調べたプラスミドの他の２５％はＨｐａ　Ｉに耐性では
なく、疑似断片を含有するかまたは再連結したベクター
であった。Ｆｌｐａ　ｌエンドヌクレアーゼ切断に耐性
な他の４個のライブラリーＥｃｏＲＩ、　　ＢｘｍＨｌ
、　　Ｂｇｌ　Ｉ＋及びＣｌａ　Ｉにはクローンは認め
られず、従ってこれ等のライブラリーはそれ以上調査し
なかった。

Ｂ−４，制限遺伝子クローン：ＨＩ＋１１修飾メチラー
ゼ遺伝子を含有すると上記（１（Ｂ−３））で同定され
たクローンをＨｐａ　ｌ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
についても調べた。操作は次の通りであったニー晩培養
物の残部を使用してエンドヌクレアーゼ活性を調べた。

これは次のように実施した： エンドヌクレアーゼアッセイ： １０Ｘ制限工ンドヌクレアーゼバツフア＝１００ｍＭ　
　ト　リ　ス　（ｐＨ７，５）　　、　　１００ｍ　Ｍ
　　　　Ｍ　　ｇ　　ＣＩ　　２　．１００ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、ＩＭａＣ１０ 細胞抽出物は次のように調製した：　４．０００＋ｐｍ
で５分間遠心分離して、１１１１から細胞をペレット化
した。上清を捨て、ペレットを超音波処理バッフｙ（５
０ｍＭ）　　リ　ス　　（ｐＨ８，０）　　、　　５ｍ
Ｍ　　　　ＤＴＴ、５％グリセロール）１１に再懸濁し
、１０秒ずつ２回緩かに超音波処理して細胞を破壊した
。

試験管を４℃で１０分間マイクロ遠心分離にかけ、上溝
を細胞抽出物として使用した。抽出物１μ及び１０μＩ
を、ＩＸ制限エンドヌクレアーゼバッファ５０μｍ中の
λＤＮＡ１μｇと共に３７℃で１５分間インキュベート
した。テストしたクローンのいずれもエンドヌクレアー
ゼ活性を有していなかった。

Ｃ，ＨｐａＩルミｌエンドヌクレアーゼの製造、Ｈｐａ
　Ｉエンドヌクレアーゼの蛋白質配列決定、１（ｐｇ　
ｌエンドヌクレアーゼ位置のマツピング及びＨ２Ｓ　１
エンドヌクレアーゼの領域のＤＮＡ配列決定 Ｃ−１，３７℃の培養器内で、下記のものからなるＴＲ
Ｙ−ＹＥブロス培地中で、ＮＥＢｔ１２７と表すパライ
ンフルエンザ園由来のＨｐａ　ｌエンドヌクレアーゼを
増殖させたニドリブトン１０．Ｏｇ／ｌ；酵母抽出物５
．Ｏｇ／ｌ　：ＮａＣ１２，０ｇ／Ｉ　；に２ＨＰＯ４
４，４ｇ／Ｉ　：　グルコ−ｘ　　２．Ｏｇ／ｌ；牛ヘ
ミ：／１０ｍｇ／　１　；　ＮＡＤ　；　ＤＰＮ　２．
（１＋Ｂ／１゜遠心分離して細胞を集め、細胞ペースト
をすぐに使用するか一７０℃で保存した。

Ｃ−２，以下の全ステップは４℃で実施した。

Ｃ−３，細胞ペースト（３６２ｇ）を解凍し、細胞を超
音波処理バッファ（５０ｍＭト’Ｊス（ｐ）！８．０）
、５ｍＭ　　ＤＴＴ、５％グリセロール）１０００ｍｌ
に再懸濁した。

Ｃ−４，ガラリンミルで細胞を破壊し、懸濁細胞１１当
り約５０ｍｇの可溶性蛋白賀を放出させた。

Ｃ−５，１５，０００ｘｇで４０分間遠心分離して不溶
性の細胞残渣を除去した。

Ｃ−６１次のように、上清の液体を硫酸ストレプトマイ
シン沈澱（容量当り５重量％）させた硫酸ストレプトマ
イシン１７．３５ｇを超音波処理バッファ　３４７１に
加え、この溶液を４℃で４５分かけてゆっくりと上清に
加えた。溶液をさらに３０分間撹拌し、４℃、２１．０
００ｘ　ｇで３０分間遠心分離して、上清を集めた。

Ｃ−７，上滑液を次のように硫酸アンモニウム（７０％
）沈澱させた： ４５分かけて上溝１．４１に硫酸アンモニウム６６０ｇ
を加えた。溶液をさらに３０分間撹拌し、４℃、２１．
０００ｘｇで３０分間遠心分離して、沈澱物を集めた。

硫酸アンモニウム溶液の４０％飽和溶液（超音波バッフ
ァ中で調製）６０ｈｌに沈澱物を再懸濁した。硫酸アン
モニウムをさらに９７ｇ加えて、溶液の飽和度を５５％
とした。溶液を４℃で３０分間撹拌し、４℃、２１．Ｏ
ＯＯｘｇで３０分間遠心分離した。

沈澱を集め、２０　ｍＭ　　Ｋ２８　Ｐ　０４　（ｐＨ
６，９）、０．１ｍ　　ＭＥＤＴＡ、５ｍＭ　　ＤＴＴ
、１０％クリセロ−／ｌｚ３００ｍｌに再懸濁した。同
じバッファに対して透析した。次に、２倍量の同じバッ
ファで希釈した。

Ｃ８，２０ｍＭ　　Ｋ２　ＨＰ　０４　　（ｐＨ６，９
）、５０　ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃｌ、５ｍＭ　　ＤＴＴ及
び１０％グリセロールで平衡化したホスホセルロースカ
ラム（５Ｘ　３５　ｃ　ｍ）　　（Ｗｈａ＋ｍａｎ　ｐ
−１１）に上清液をかける。カラム容量の２倍の上記バ
ッファでカラムを洗う。カラムからの流出を１つのフラ
スコに集めた。Ｈｐａ　ｌエンドヌクレアーゼはカラム
に保持され、０．３及び０．６Ｍ　　ＮａＣ１の間で溶
出された。最大活性の画分を集め、２０ｍＭＫ　　ＨＰ
　Ｏｉ、　　（ｐＨ７，４）　、Ｏ−５ｍＭ　　Ｅ　Ｄ
　ＴＡ１５ｍＭ　　ＤＴＴ、１０％グリセロール及び０
．０５ＭＫＣｌに対して透析する。

Ｃ−９，ホスホセルロースカラムからのプールを、２０
ｍＭ　　Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７，４）、　０．５ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　　ＤＴＴ、０．０５ＭＫＣｌ及び
１０％グリセロールで平衡化したヘパリン−セファ０−
スＣＬ−６Ｂカラム（２，５Ｘ２５　ｃ＋ａ）にかけ、
カラム容量の２倍量の同じバッファで洗う。Ｏ，０５Ｍ
から１．０ＭのＫＣＩ（全量７００　ｍｌ）を直線勾配
とし、カラムにかける。１０１１の画分を集める。λＤ
ＮＡに対するＨｐａ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性の
存在について画分をアッセイする。活性画分を集め、バ
ッファＳ（２０ｍＭ　　Ｋ　　ＨＰ　０４　　（ｐＨ６
，９）　、０．　１　ｍＭ２ ＥＤＴＡ、５ｍＭ　　　ＤＴＴ、０．　０５Ｍ　　　Ｋ
ＣＩ。

１０％グリセロール）１００容に対して透析する。

Ｃ−１０，ＨｐａＩ活性画分の透析プール（５０ｍｌ）
を１ｍｌのＭｏｎｏ　Ｓ　ＦＰＬＣカラム（Ｐｈｉ　＋
ｍａｅ　ｉｓ）にかけ、バッフｙｓ　（２０ｍＭ　　Ｋ
　　ＨＰＯ４（ｐＨ６，９）　、５ｍＭ　　ＤＴＴ、１
０％グリセロール、０、０５Ｍ　　ＫＣｌ、　０．１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ）で洗い、Ｓバッファ中で５０ｍＭから
１．０ＭのＫＣｌ４０ｍ１の直線勾配を作り、カラムに
かける。

１ｍｌの画分を集め、ＨｐａＩルミｌ制限エンドヌクレ
アーゼ存在についてアッセイする。４つの活性の最強の
画分は均質であり、比活性的２５０．０００単位／ｍｇ
蛋白質、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での分子量
は３０．０００ダルトンであることが判った。

Ｃ−１１，均質な　Ｈｐａ　ｌエンドヌクレアーゼ１０
Ｍｇを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７
０Ａ型気相蛋白質シークエンサーでのアミノ末端蛋白質
配列決定にかける（　Ｂｒｏｏｋｓら、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１７：９７９−９９
７．　　（１９８９））。最初の２０残基が分解された
。得られた最初の１１残基の配列は：　Ｘ　Ｋ　Ｖ／Ｙ
　Ｅ　Ｅ　Ｉ　Ｎ　Ｗ　Ｋ　Ｖ／Ｙ　Ｐ　　（蛋白質配
列に関する一文字コードの説明は第１表を参照のこと）
であった。

Ｃ−１２，蛋白質配列に基づき、配列：５’ＴＴＣＣＡ
　ＲＴＴ　ＤＡＴ　ＹＴＣＹＴＣ３’　（Ｙ＝Ｔ、　　
Ｃ，Ｄ＝Ａ、　Ｇ、　Ｔ、　Ｒ・ＡまたはＧ）の１７−
マーを作成し、ｐ　（ｐＢＩＩＨＩ．　２）Ｈｐａ１Ｍ
７．５−＾１０上のエンドヌクレアーゼアミノ末端位置
マツピングに使用した。ＤＮＡ配列が得られ、これとプ
ローブハイブリダイゼーションの結果とからエンドヌク
レアーゼの方向を決定した。得られたＤＮＡ配列は ５’ＡＡＧＣπＴＡＧ　ＴＣＧ　ＡＡＴＴＡＧ　　ＡＡ
ＣＴＧＣＡＴＡ　　ＴＧＴ　　ＴＡＡ　　ＡＧＡ　　Ｃ
ＣＣＴＡＡ　　ＴＴＴ　　ＴＡＴ　　？τ丁ＴＡＴ　　
ＡＡＴ　　ＡＴＴ　　ＡＴＣＣＡＴ　　ＡＡＡ　　ＡＣ
Ａ　　ＧＡＧ　　ＴＧＴ　　ＡＴＡ　　ＴＧＴ　　入入
ＡＡＧＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＴＡＣＡＣＡ　ＡＡ’ｒ　
ＴＡＡ　ＴＧＧ　ＡＴＧ　Ｇ入ＡτＡ入ＴＧＣ入ＡＡ　
　ＴＡＴ　　ＴＧＡ　　ＣＴＴ　　ＴＡＡ　　ＴＧＴ　
　ＴＴＡ　ＴＧＡ　ＴＴＴ　　ＡＡＡ　　ＧＴＡ　　Ｔ
ＡＴＡＴＣＴＧＡ　　ＴＴＣＡＣＡ　ＣＡＴ　　入ＡＧ
　　ＴＴＡ　　ＴＡＣＣＣＡ　　ＧＣＡ　　ＴＡＧ　　
ＧＩ であった。１７−マーオリゴマー及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ
ライブラリー（９（ｐａｌ　ＩＨｌ、　２）　Ｈｐｔ　
ＩＭ−７，５−Ａｌｅ）から得たメチラーゼクローンを
使用して、バラインフルエンザ菌ゲノムの種々の制限断
片に対してエンドヌクレアーゼ遺伝子とメチラーゼ遺伝
子をマツピングした。ｐ（ｐＢｌｌＨｌ、２）ＨｐａＩ
ＭｌＧ、５−Ａｌｅの制限地図及びエンドヌクレアーゼ
プローブがメチラーゼクローンにハイブリダイズしてい
る位置については第３図参照のこと。

Ｉｌ、Ｈｐ１＋制限−修飾系のクローニングＡ、ライブ
ラリーの作成 Ａ−１，Ｉ　　（ｃ−１１）で得たデータに基づき、次
のようにＩ　　（Ａ−１）で調製した精製パラインフル
エンザ菌ゲノムＤＮＡをＫｐｎ　Ｉで限定消化した：１
０ｍＭトリス（ｐ）ｌ　７．５）　、１０　ｍＭＭ　ｇ
　ＣＩ　２、ＯｍＭ　　ＮａＣ１，１０ｍＭメルカプト
エタノールハッファ中ニ１００μｇ　／ｍｌのＤＮＡ　
　３００μｌを試験管１本に入れた。この試験管にＫｐ
ｎ１５０単位を加えた。試験管を３７℃で１時間インキ
ュベートし、次いでフェノール／クロロホルム抽出し、
エタノール沈澱させた。ｌＱｍＭトリス−）ＩＣｌ。

１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）３００μｌにペレ
ットを再度溶解し、各１０μｌをアガロースゲル電気泳
動で分析した。

Ａ−２，連結二次のようにして、ｐＢｌｌＨｌ、　２Ｋ
Ｉ（Ｐｖｕ　１１部位に挿入したＨｐａ　Ｉ　　リンカ
−１ＥＣＯＲ１部位に挿入したＢｇｌ　１１リンカ−及
びＥｃｏＲＶ部位；こ挿入したＫｐｎ　ｌリンカ−を有
するｐＮＯ１５２３）　ｊこ断片化したＤＮＡを連結し
た：Ｋｐｎｌで消化したノくラインフルエンザ菌Ｄ　Ｎ
　Ａ　１０．０Ｍｇ　（１００μｍ）を、Ｋｐｎ　ｌで
切断し脱燐酸化したｐＢＩＩＩ（１，２Ｋｌ　２．　Ｏ
ｕ　ｇ（２１０μｌ）と混合し、エタノール沈澱させた
。

ＤＮＡを４℃、１２，０００ｇで１５分間遠心分離し、
７０％エタノール　１００μｍで１回洗った。ＤＮＡを
１ｘ連結バツフｙ（５０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）、１
０ｍＭ　　ＭｇＣｌ　　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５
ｍＭ　　ＡＴＰ）９９μｌ　に再懸濁し、Ｔ４　　ＤＮ
Ａリガーゼ１μｍを加え、混合物を１６℃で１６時間イ
ンキュベートした。アリコート２，５及び５．０μｍを
使用して次のように大腸菌株ＲＲＩを形質転換した：各
アリコートを水冷したコンピテント大腸菌ＲＲＩ細胞２
００μｍと混合し、氷上に３０分間装いた。４２℃で２
分間加熱ショックを行った後、細胞をルリアーブロス（
Ｌ−ブロス）１「１で希釈し、３７℃で１時間増殖させ
た。

Ａ−３，−次細胞ライブラリ−、ステップ■（Ａ−４）
にもう一つのステップを追加して製造したニステップＩ
　（ｃ−１０）で得たデータに基づき、（ササンハイプ
リダイゼーションを介して）ライブラリーを、ＨｐａＩ
ルミｌメチラーゼエンドヌクレアーゼのアミノ末端とを
含有する（ｐ（ｐＢＩＩＩ、　２）　Ｈｐａ　１ドア、
　５−ＡＩＯから単離した）　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片と
のプローブとし、エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼを
含有すると思われる適当な大きさのＫｐｎ１断片を捜し
た。この断片は一次細胞ライブラリー中に存在した。

Ｂ、ライブラリーの選択とスクリーニングＢ−１．−次
選択と選択ライブラリー：ステップＩ　　（Ｂ−１）と
同様に調製した。選択ライブラリーはステップｒ　Ｉ　
（Ａ−２）に記載のようにプローブ化した。

Ｂ−２、個々の分析：上記形質転換からのコロニーを取
り、アンピシリン含有ＬＢ−寒天板及びアンピシリン及
びストレプトマイシン含有ＬＢ−寒天板上にブレーティ
ングした。約９０％がストレプトマイソノ　であった。

Ｂ−３，１００μ！／ｍ！アンピシリン含有ＬＢを使用
して板から９６群のコロニーを掻き取り、次のように微
少製造した： 細胞ペレットを、リゾチームＬｏｇ／ｉｔ含有した２５
ｍＭ　　ト　リ　ス、　１０ｍＭ　　　　ＥＤＴＡ、　
　５０ｍＭグルコース（ｐＨ８，０）２．０ｍｌに再懸
濁した。

室温に５分装置いた後、０．２Ｍ　　ＮａＯＨ，１％５
ＤＳ４．０ｍｌを加え、試験管を振とうして細胞を溶解
し、次に氷上に置いた。５分後に、３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４，８）３．０ｍｌを加え、振とうし、さらに５
分間氷上に置いた。形成された沈澱を４℃、１２．　Ｏ
Ｈｘ　ｇで１０分間回転し、沈澱させた。上清を取り出
し、等量のフェノール／クロロホルム（１：　１）で抽
出した。１０．０００ｘ　ｇで５分間遠心分離し層を分
離した。上清を取り出シ、等量のクロロホルム（１：　
１）で抽出した。

１０、０００ｘ　ｇで５分間遠心して層を分離した。エ
タノール１８．０ｍｌ含有する遠心管に上清を注ぎ入れ
、混合した。室温に２分装置いた後、遠心管を１２、０
００ｘ　ｇで２０分間回転させて、沈澱した核酸をペレ
ット化した。上清を捨て、ベレットを７０％エタノール
−水５ｍｌで再度洗い、再度ベレット化し、真空下室温
で３Ｑ分間乾燥させた。−度乾燥させてから、ペレット
をＲＡアーゼ２０μｇ／ｌ含有１０ｍＭＩ□リス、１ｍ
１４　　ＥＤＴＡ　（ｐｉ（８，０）５００μｍに再懸
濁し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを）角
化した。

Ｂ−４，ステップＩ　１　（Ｂ−３）のプレートからの
掻き取り物からのプラスミドＤＮＡをメチラーゼ遺伝子
含有Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ断片についてプローブ化しくステ
ップＩ　Ｉ　（Ａ−３）参照）、１つのプレートは正し
い大きさのＫｐｏ　ｌ断片を含有していることが判明し
た。

Ｂ−５，ｒ陽性」のプレート（Ｉ　Ｉ　（Ｂ−４）参照
）から８群のコロニーを掻き取り、ステップＩ　（Ｂ−
４）と同様にエンドヌクレアーゼ活性についてアッセイ
した。８群の内１群はＨｐｘ　Ｉ活性を有していた。

Ｂ−６，８群のコロニー（ＩＩ　（Ｂ−５）参照）を微
少製造しくＩ　　（Ｂ−２）参照）、１つは正しい大き
さのにＨｌ断片を有し、Ｈ１ｌ！　ｌエンドヌクレアー
ゼ消化に耐性であることが判った。

Ｂ−７，制限遺伝子クローン：ＨｐａＩルミｌ修飾メチ
ラーゼを含有することが上記（ＩＩ（Ｂ−６））で同定
されたクローンをＨｐｇ　ｌ制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子についても調べた。これはステップ８と同様に行っ
た。このクローンはＨｐａ　１エンドヌクレアーゼ活性
を有し、湿った細胞ペースト１ｇ当り約４０．０００単
位のＨｐａ　ｌ制限エンドヌクレアーゼを合成すること
が判った。

Ｃ０Ｈｐａ　Ｉ制限−修飾クローンの制限地図作成と欠
損サブクローンの調製 Ｃ−１、ｐ（ｐＢＩＩＨＩ．　２Ｋｌ）ＨｐａＩＲＭ−
１０，５−４５を使用して同質遺伝子型の大腸菌株を形
質転換し、ＭｒｃＡ　、　ＭｃｒＢまたはｍｒｒ表現型
のいずれかによる強力な作用を捜した。このＲＭクロー
ンはどのｍａｒ＋株中にも形質転換できず、従って増殖
できないことが発見された。

Ｃ−２，いくらかの変更を加えステップ９−１６に記載
のように、ｐ（ｐＢｌＩＨｌ、２）ＨｐａＩＲＭｌｏ、
５−ＡＩＯ含有大腸菌ＲＲＩ細胞から）ｌｐａ　ｌエン
ドヌクレアーゼを調製した：カゼイン加水分解物１０ｇ
／ｌ酵母抽出物５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ　　Ｌｏｇ／ｌ；塩
化マグネシウム大水塩１ｇ／ｌ；グルコース１ｇ／ｌ；
アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含有し、ｐＨをＮａＯＨ
で７．２に調整したＬＢブロス培地中で細胞を増殖させ
た。細胞を超音波処理して融解させた。硫酸ストレプト
マイシン及び硫酸アンモニウム沈澱ステップは実施しな
かった。精製したエンドヌクレアーゼは細胞１ｇ当り４
０．０００単位のＨｐｇ　ｌエンドヌクレアーゼを産生
じ、比活性的２５００００単位／ｉｇ蛋白質であること
が判った。

Ｃ−３０次のようにＥｃｏＲｌ制限エンドヌクレアーゼ
でｐ（ｐａｌｌ）Ｉｌ、　２）ｌ’ｌｐｇｌＲＭ１０．
５−ＡＬＯ３０μｇを消化した：１０ｍＭ）リス（ｐ）
１７．　５）　、１０ｍＭＭｇＣ１、１００ｍＭ　　Ｎ
ａＣ１，１０ｍＭメルメルトエタノール中１００μｇ／
ｉｆの濃度のＤＮＡ３００μｍを１本の管に入れた。管
にはＥｃｏＲｌエンドヌクレアーゼ１００単 を３７℃で２時間インキュベートした。全消化物を製造
用０．７％アガロースゲルにかけた。全メチラーゼ遺伝
子を含有することが判明しており、全エンドヌクレアー
ゼ遺伝子を含有すると考えられる選択すべき約２．３ｋ
ｂのＥｃｏＲ　ｌ断片をゲルから切り出した。ゲル画分
を２１ゲージの針で押しだし、また凍結させた。これを
３回繰り返した。

得られた混合物を４℃、ｌ［ｉｏ．　０ＯＯｘ　ｇで１
時間遠心分離しアガロースをペレット化した。残りの水
溶液をＮａＣ１濃度０．’４Ｍとし、２倍量のイソプロ
パツールで沈澱させた。１２．　０００ｘ　ｇで２０分
間遠心分離してＤＮＡをペレット化し、７０％冷エタノ
ールで１回洗った。ＤＮＡペレットを２１７Ｅに再懸濁
し、等量のフェノールで抽出した。

１０、０ＯＯｘ　ｇ，　１　０分間遠心分離して層を分
離した。

上層を取り出し、等量のフェノール／クロロホルム（１
　：　１）で抽出し、１０．０００ｘｇで１０分間遠心
分離して層を分離した。上層を取り出して、等量のクロ
ロホルムで抽出し、ｌｏ．０００Ｘ　ｇで遠心分離して
層を分離した。水層を取り出し、２、７５Ｍ酢酸ナトリ
ウム１／１０容（　０　、　　２　ｍｌ）及び冷エタノ
ール２容を加えてＤＮＡを沈澱させた。１２．　ＱＱＧ
ｘｇで２０分間遠心分離してＤＮＡをペレット化し、７
０％の冷エタノールで１回洗った。ＤＮＡを０　、５　
ｍｌＴ　Ｅに再懸濁した。

Ｃ−４１次のようにして、ｐＢＩＩ）Ｉｌ、　２のＥＣ
ＯＲ部位にゲル調製したＥｅｏＲｌ断片を連結したニゲ
ル調製したＥｃｏＲｌ断片６０μｌ　　（０，５μｇ）
を、ＥｃｏＲｌ切断し、脱燐酸化したｐＢＩＩＨＩ．２
５μ（０，５μｇ）と混合した。これに酢酸ナトリウム
１／１０容（１０μｌ　）　、ＴＥ３５μｍ及び冷エタ
ノール２容（２００μｌ）を加えた。４℃、１２、００
０ｘ　ｇで１５分間遠心分離してＤＮＡをペレット化し
、７０％エタノール１００μｍで１回洗った。Ｄ　Ｎ　
Ａを１ｘ連結バツフア（５０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）
、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ　　、１０ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ　、
　０　、　５　ｍ　Ｍ　　Ａ　Ｔ　Ｐ　）に再懸濁し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｍを加え、混合物を１６℃で１
６時間インキュベートした。１．２及び３μｍのアリコ
ートを使用して２２に記載のように大腸菌ＲＲＩ株を形
質転換した。形質転換した細胞培養物を遠心分離し、２
５０μｌ容に再懸濁し、アンピシリン１００μｇ１０ｆ
含有し一寒天上にブレーティングした。寒天プレート上
の培養物を３７℃で一晩インキユベートした。

Ｃ−５，上記形質転換からのコロニーを採り、アンピシ
リン含有ＬＢ寒天プレート及びアンピシリン及びストレ
プトマイシン含有ＬＢ寒天プレート上にブレーティング
した。

Ｃ−６，アンピシリンＲ及びストレプトマイシン２であ
る１８個のコロニーをＩ　　（Ｂ−２）及びＴ　（ｃ−
３）に記載のように微少製造すると、正しい大きさのＥ
ｅｏＲｌ断片を有し、Ｈｐａ　ｌ　エンドヌクレアーゼ
消化に耐性であることが判うた。

Ｃ−７，制限遺伝子クローン：ＨｐａＩルミｌ修飾メチ
ラーゼると上記で同定されたクローンをＨｐａ　ｌ制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子についても調べた。これはス
テップＩ　　（Ｂ−４）に記載のように実施した。調べ
た１１個の内、ｐ　（ｐＢｌｌｌ（＋、　２）ＨｐａＩ
ＲＭ−７，４−１３は細胞１ｇ当りＨｐａ　Ｉエンドヌ
クレアーゼ１５５．０００単位を産生じ、他の１０個は
ｐ　（ｐＢＩＩＨＩ．　２））ｌｐａｌＲＭ−７，４−
２と同様であり、細胞１ｇ当りｆｌｐａ　Ｉエンドヌク
レアーゼ１０．０００単位を産生ずることが判った。

Ｃ−８，９（ｐＢｌｌＨｌ、２）ｌ（ｐｚｌＲＭ−７，
４−Ｈ及びｐ（ｐＢｌｌｔｌｌ、　２Ｈ１ｐａｌＲＭ−
７，４−２を使用して同質遺伝子型の大腸菌株を形質転
換し、強力なＭｅｔ　Ａ、　　Ｍｅｔ８またはｔｆｆｉ
ｒ＋表現型を捜した。Ｉ　Ｉ　　（ｃ−４）に記載した
ように、これらＲＭクローンの両者も、どの１１ｒＩ　
　株中にも形質転換できず、従って増殖できなかった。

Ｃ−９，ＩＩ　　（ｃ−２）に記載のように、ｐｆｐＢ
ｌｌＨｌ、　２１ＨｐａＩＲＭ−７，４−１３含有大腸
１１ＲＲＩ細胞からｆｌｐａ　Ｉエンドヌクレアーゼを
調製した。精製したエンドヌクレアーゼは比活性的２５
０．０００単位／ｍｇ蛋白買であることが判った。

ｒｎＲＮＡ　（ｃ）ＮＡ）ａ乙？’Ｊｒ、す１１番７ξ
／鍜タメ己列Ｇ υ Ａ　ＣＧ　Ｏ／τ Ｎ／Ｘ−人Ｃａυ υ 表

【図面の簡単な説明】

第１図は、［１１１１１制限エンドヌクレアーゼのクロ
ーニングの概要を示す。 第２図は、Ｈｐｉ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼの製造の
概要を示す。 第３図は、ＨｐＨ制限エンドヌクレアーゼと修飾メチラ
ーゼをコードするパラインフルエンザ菌由来の５．５　
Ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉの制限地図である。ｐＢＩＩＨＩ．２
Ｋｌ　（ＮＥ日審５６０１このサンプルは受託番号６８
００２としてＡＴＣＣに寄託しである）のＫｐｎ　１部
位にその断片をクローニングし、ｐ　（ｐＢＩＩＨＩ．
　２にｌ）ＨｐａＩＲＭ−ＩＱ、　５−４５を生成した
。 第４図は、ｐ　（ｐＢＩｌ）Ｉｌ、　２Ｋｌ）　Ｈｐａ
　ＩＲＭ−１ｏ、５−４５を含有する大腸菌ＲＲＩ　（
ＡＴＣＣ３１３４３）の細胞抽出物中のＨｐｉ　Ｉ制限
エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真で
ある。 第５図は、調製した各ライブラリーについて得られな形
質転換体の数、各ライブラリーから得られる　Ｈｐａ　
ｌメチラーゼクローンもしくはＨｐａ　ｌ制限−修飾ク
ローンの数を示す表である。 第６図は、本明細書に記載されているＨｐａ　ｌ制限−
修飾クローンのリストである。 ｐ ■ エンドヌク レアーゼの精製 １Ｈｒｅ 弓 へ ト 、Ｊコー＊Ｄ−Ｄ 中　　α　＼ Ｌｌ’ｌｌ　　　８− Ｐ　　ζ　　ζ Ｐ　　Ｏ。 −工 Δ 医 々 」 べ ねへ謳 主Ｑ　１１０ １　八　１　八 ｌｔ’％　　ｌ　　コ　１ も口へ口 入へＫへ ＼　　＼ ＼ す ＋ｊ％ ＼ ＼ ＼

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＨｐａＩ修
   飾メチラーゼをコードする、￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
   ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ￥から得られるＤＮＡ配
   列。
2. （２）請求項１のＤＮＡ配列を含有するベクター。
3. （３）ＤＮＡ配列： 【遺伝子配列があります】 を含有するベクター。
4. （４）ベクターｐ（ｐＢＩＩＨＩ．２）ＨｐａＩＲＭ−
   ７．５−Ａ１０。
5. （５）ベクターｐ（ｐＢＩＩＨＩ．２ＫＩ）ＨｐａＩＲ
   Ｍ−１０．５−４５。
6. （６）ベクターｐ（ｐＢＩＩＨＩ．２）ＨｐａＩＲＭ−
   ７．４−１３。
7. （７）ベクターｐ（ｐＢＩＩＨＩ．２）ＨｐａＩＲＭ−
   ７．４−２。
8. （８）請求項２から７のいずれかのベクターで形質転換
   した微生物宿主。
9. （９）ＤＮＡ配列ＧＴＴＡＡＣを認識し、前記配列を２
   番目の５’Ｔ残基と１番目の５’Ａ残基との間で切断す
   る￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥￥ｐａｒａｉｎｆｌｕｅ
   ｎｚａｅ￥から得られる組換え制限エンドヌクレアーゼ
   。
10. （１０）請求項９の制限エンドヌクレアーゼによる消化
    からＤＮＡを保護する、￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥￥
    ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ￥から得られる組換え修
    飾メチラーゼ。
11. （１１）（ａ）￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥￥ｐａｒａ
    ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ￥由来のゲノムＤＮＡからライブ
    ラリーを作成し； （ｂ）ＨｐａＩ修飾メチラーゼをコードする遺伝子を含
    有するクローンを単離し； （ｃ）制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を精製して配列を
    決定し； （ｄ）ＤＮＡ配列決定により制限エンドヌクレアーゼの
    配向を決定し、修飾メチラーゼクローン中の制限エンド
    ヌクレアーゼの位置を決定し、そして￥Ｈａｅｍｏｐｈ
    ｉｌｕｓ￥￥ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ￥ゲノム上
    の制限エンドヌクレアーゼの位置を決定し；（ｅ）ステ
    ップ（ｂ）−（ｄ）で得たデータに基づいてライブラリ
    ーを作成し；そして （ｆ）ＨｐａＩ修飾メチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌ
    クレアーゼ遺伝子を含有するクローンを単離する ことからなるＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
    クローニング法。
12. （１２）（ａ）￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥￥ｐａｒａ
    ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ￥由来のゲノムＤＮＡを精製し； （ｂ）精製したＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成し； （ｃ）クローニングベクターに断片を連結し；（ｄ）ク
    ローニングベクターで微生物宿主を形質転換させて細胞
    ライブラリーを作成し；そして（ｅ）細胞ライブラリー
    から組換えベクターを精製してプラスミドライブラリー
    を作成するステップによりライブラリーを作成する請求
    項１１の方法。
13. （１３）クローニングベクターがｐＢＩＩＨＩ．２、ｐ
    ＢＩＩＨＩ、２ＫＩ、ｐＢＩＩ０１、ｐＵＣ１９、ｐＡ
    ＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＢＲ３２２で
    ある請求項１２の方法。
14. （１４）微生物宿主がｍｒｒ＾−の大腸菌株である請求
    項１２の方法。
15. （１５）プラスミドライブラリーをＨｐａＩで消化して
    消化プールを形成し、消化プールを微生物宿主中に形質
    転換し、そして修飾メチラーゼ含有クローンを選択する
    ことにより修飾メチラーゼ遺伝子含有クローンを単離す
    る請求項１２の方法。
16. （１６）請求項２から８のいずれかの遺伝子を発現させ
    ること、または￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥￥ｐａｒａ
    ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ￥からエンドヌクレアーゼを精製
    することからなるＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼの製
    法。
17. （１７）（ａ）￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥￥ｐａｒａ
    ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ￥からＤＮＡを精製し； （ｂ）精製ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで消
    化してＤＮＡ断片を形成し； （ｃ）クローニングベクターに断片を連結させてＤＮＡ
    混合物を形成し； （ｄ）前記ＤＮＡ混合物で微生物宿主を形質転換させて
    ライブラリーを作成し； （ｅ）ＨｐａＩ修飾メチラーゼ遺伝子含有クローンを単
    離し； （ｆ）前記クローンをスクリーニングし、その中からＨ
    ｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をも含有するクロ
    ーンを単離し； （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する微生物宿主
    を培養し；そして （ｈ）培養物からＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼを回
    収する ことからなるＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼの製法。
18. （１８）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
    ルスＤＮＡ分子である請求項１７の方法。
19. （１９）プラスミドがｐＵＣ１９、ｐＢＩＩＨＩ．２ま
    たはｐＢＩＩＨＩ．２ＫＩである請求項１８の方法。