JPH03229144A - 酵素センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は溶液中の各種成分の測定に利用される酵素セン
サーに関するものである。更に詳しくは、本発明は「酵
素及び／又は酵素含有物とメディエータ−を電極成分と
して混在せしめた酵素修飾電極と参照電極とを組合わせ
てなることを特徴とする酵素センサー」に関するもので
ある。

本発明によれば目的成分を簡便迅速に測定することかで
きるので、本発明は、発酵工業や化学工業における測定
センサー止して有用であるだけでなく、臨床検査の分野
シこおける生体試料中の各種生体成分の測定センサーと
しても有用であり、各種疾病の診断、検査にも広く利用
することができる。

［従来の技術］ 各種化合物の測定において、酵素の高い基質選択性を利
用した酵素センサーの有用性が認められ、グルコースな
どの定量分析においては、既に実用化されている。現在
、実用化されている酵素センサーは、測定物質に対して
高い特異性を有する酵素を固定化し、試料中の目的物質
に酵素が作用することにより、生成する過酸化水素量ま
たは消費される酸素量を過酸化水素電極または酸素電極
により電気化学的に検出することによって定量している
。したがって、このタイプの酵素センサーで利用できる
酵素としては、反応により酸素を消費するかもしくは過
酸化水素を生成する酸化酵素、いわゆるオキシダーゼ（
ｏｘ　１ｄａｓｅ）のみに限定されること二こなる。

通常、測定物質をｉＨ沢的に酸化するオキシダゼは、ス
クリーニングによって選択された微生物から分離精製さ
れ、使用されている。しかし、必ずしもスクリーニング
により目的酵素を生産する微生物が発見できるとは限ら
ないこと、またたとえ発見できたとしても酵素の基質特
異性やｂ値、安定性など酵素学的性質の面で使用できな
い場合も多々生じる。また微生物の生産性が低かったり
、分離精製が困難なため、実用化に至らない場合が多く
、実際に使用されているのは、グルコースセンサーだけ
と言うのが実情である。

また、オキシダーゼに関しては、酵母由来のアルコール
オキシダーゼを用いるエタノール測定用の酵素センサー
が開発され、過酸化水素電極や酸素電極を使う系で実用
化が検討されてはいるが、実際には、商業的成功には至
っていない。これは、酵素の基質特異性が低いこ七や酵
素の安定性が著しく短いためである。

他方、ある化合物を酸化する酵素としては、上記オキシ
ダーゼとは別に、化合物の酸化Ｓこともなって生しる電
子をＰＱＱ、ＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰといっだ補酵素
に供与し、必ずしも酸素消費や過酸化水素の発生をとも
なわないデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓ
ｅ）がある。このタイプの酵素は、オキシダーゼよりも
種類が多く、その中には、センサーに通した酵素の存在
も知られている。

そこで本発明者らは、先に酵母由来の酵素を使ったセン
サーよりも基質特異性が高く、安定性にもすくれた新し
いタイプの酵素センサーを開発した（特願昭６２−２５
３８５０号）。その際に使用した酵素は、酢酸菌由来の
ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）を補欠分子族とするア
ルコールデヒドロゲナーゼ（アルコール脱水素酵素）で
あり、この発明によって、酵母由来の酵素を用いたセン
サーよりもすくれたセンサーが開発され、一応の成功を
おさめた。

しかし、アルコールデヒドロゲナーセ以外のデヒドロゲ
ナーゼは、未だほとんどセンサー用酵素源としてｆｌｌ
用されていない。この原因は、補酵素であるＰＱＱ、Ｆ
ＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰが高価であるため、分析コスト
が高くつ（ためである。

この問題を解決するために、たとえば、ＮＡＤを固定化
し、再生使用する試みがなされているが、いまだ実用に
至っていない。

また、一方、人工の電子受容体をメディエータ−（電子
伝達中間体）として使用する方法が開発され、エタノー
ルの場合と同様にグルコースなどで選択性の高い酵素セ
ンサーが作製され、実用化が検討されている。しかし、
人工のメディエータ−を使った場合でもコスト的に高く
なることは明らかであり、また通常使用されるメディエ
ータ−は、色素がほとんどであり、廃液が着色するため
、そのまま廃棄するには廃水処理等に問題があり、また
、高価なメディエータ−を測定の度毎に廃棄するため、
更にコストが高くなり、改良が求められていた。

そこで人工のメディエータ−を電極表面に薄膜状に塗布
し、その上に酵素を塗布し、更にその上を半透膜で被覆
する方法も提案されている　（ＥＰ７８６３６Ｂｌ）。

また、難水溶性のメディエータ−蛋電翫剤中に含灯させ
たり（，１ｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、５２１５
５７　、　（１９８８）　）、水溶性の高いメディエー
タ−の場合には、電極にあらかじめメディエータ−を含
有させた後、イオン性高分子と酵素からなる混合物を電
極表面に薄膜として形成させることにより、電解液中に
メディエータ−が溶出しないようにする方法（八ｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、、　５２．３１８７　（１９
８８））力（提案されている。しかしながら、いずれの
場合も電極の調製が煩雑であり、酵素はメディエータ−
を含有させた後の電極表面に薄膜を形成するように用い
られている。また、後者ではデヒドロゲナーゼを検討し
た例がない。

〔発明が解決しようとする課題］ 前述のように、従来の酵素修飾電極は調製方法が煩雑で
、測定機器として品質管理された製品を量産するには非
常に困難な作業を必要とし、しかも、反復使用の際の寿
命が短かく、利用出来る酵素が制限される等、種々の問
題があった。そこで、本発明者等は電極表面を段階的に
メゾイータ−薄膜層、酵素薄膜層及び半透膜層で順次被
覆する従来の煩雑な方法に代えて、グラファイト、カー
ボンペースト等のような通常の電極に利用されている電
子伝導体と酵素及びメディエータ−を適宜流動パラフィ
ンのようなビヒクル又は界面活性剤の添加により均一組
成物とし、これを成形して酵素修飾電極とするか又はこ
の均一組成物（酵素修飾電極剤という）で電極基材（例
えばカーボン電極）の表面を被覆するという非常に簡単
な方法による酵素修飾電極の製造法を各種の酵素につい
て確立し、その酵素修飾電極を内蔵する優れた性能のセ
ンサーを提供することを目的として種々研究を重ねた結
果本発明を完成した。

［課題を解決するための手段〕 本発明は下記（１）乃至０３）に記載の各発明を包含す
るものである。

（１）酵素及び／又は酵素含有物とメディエータ−を電
極成分として混在せしめた酵素修飾電極と参照電極とを
組合わせてなることを特徴とする酵素センサー （２）酵素含有物が、該酵素生産菌体、該酵素生産培養
液、該菌体破砕物、該菌体破砕物からの分画成分、該菌
体抽出物、該菌細胞膜画分及び粗製酵素からなる群から
選択されるものであることを特徴とする上記（１）記載
の酵素センサー（３）酵素がデヒドロゲナーゼであるこ
とを特徴とする上記（１）又は（２）記載の酵素センサ
ー（４）デヒドロゲナーゼが、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒド
ロゲナーゼ、フラクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビト
ールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ
からなる群れから選択されるものであることを特徴とす
る上記（３）記載の酵素センサー （５）メディエータ−がレドックス化合物及び／又は補
酵素であることを特徴とする上記（１）乃至（４）記載
の酵素センサー （６）　　メディエータ−が、ｐ−ベンゾキノン、フェ
ロセン、ジメチルフェロセン、フェリシアン化カリウム
、フェナジンメトサルフェート、２６ジクロロフエノー
ルイントフエノール、ＰＱＱ、ＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤ
Ｐからなる群れから選択されるものであることを特徴と
する上記（１）又は（５）記載の酵素センサー （７）電極成分として混在させる酵素及びメディエータ
−が、アルデヒドデヒドロゲナーゼとパラベンゾキノン
、フラクトースデヒドロゲナーゼとジメチルフェロセン
、ソルビトールデヒドロゲナーゼとジメチルフェロセン
又はグリセロールデヒドロゲナーゼとフェリシアン化カ
リウムであることを特徴とする上記（６）記載の酵素セ
ンサー。

（８）電極成分が炭素又はグラファイトを含有すること
を特徴とする上記（１）乃至（７）記載の酵素センサー
。

（９）酵素及び／又は酵素含有物とメディエータ−を電
極成分として混在せしめたことを特徴とする酵素修飾電
極。

００）非水溶性メディエータ−を有機溶媒に溶かし、流
動パラフィンを加えて混合した後、溶媒を除去し、得ら
れた混合物にグラファイト粉末と酵素及び／又は酵素含
有物を混合して酵素修飾電極剤を調製し、これをカーボ
ン電極表面上に適用してなることを特徴とする上記（９
）記載の酵素修飾電極。

（１１）　　水溶性メディエータ−が取り込まれた逆相
ミセルにグラファイト粉末と酵素及び／又は酵素含有物
を混合して酵素修飾電極剤を調製し、これをカーボン電
極表面上に適用してなることを特徴とする上記（９）記
載の酵素修飾電極。

（＋２）　　フェリシアン化化合物とカチオン性界面活
性剤からなる非水溶性複合化物に流動パラフィンを加え
て混合した後、グラファイト粉末と酵素及び／又は酵素
含有物を混合して酵素修飾電極剤を調製し、これをカー
ボン電極表面に適用してなることを特徴とする上記（９
）記載の酵素修飾電極。

側　反応室、定電圧電源部、電流電圧変換部及び増幅部
からなり、該反応室は、サンプル注入口、電解液流入口
、廃液排出口、撹拌装置、参照電極及び酵素修飾電極を
備え、しかも該酵素修飾電極は酵素及び／又は酵素含有
物とメディエータ−を電極成分として混在せしめたもの
であることを特徴とする測定装置。

本発明に利用する酵素は、被測定物質の酸化還元反応を
触媒し、その反応に基因する電子の授受を行う能力を有
するものであればいずれでもよい。

例えば、ＰＱＱＳＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ等を補酵素
とするデヒドロゲナーゼが好適に利用される。

更に具体的に説明すれば、エタノール測定の場合には、
アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８４、グルコノバク
タ−・サブオキシダンスＩＦＯ１２５２８、アセトハク
ターアルトアセチゲネスＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１起源の
アルコールデヒドロゲナーゼ；アセトアルデヒド測定の
場合には、上記３菌株起源のアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ；グルコース測定の場合には、グルコノバクタ−・サ
ブオキシダンスＩＰ０１２５２Ｂやグルコノバクタ−・
サブオキシダンスＩＦＯ３２５４起源のグルコースデヒ
ドロゲナーゼ；フラクトース測定の場合には、グルコノ
バクタ−・インダストリウスＩＦＯ３２６０起源のフラ
クトースデヒドロゲナーゼ；ソルビトール測定の場合に
は、グルコノバクタ−・サブオキシダンスＩＦＯ３２５
４起源のソルビトールデヒドロゲナーゼ；グリセロール
測定の場合には、グルコノバクタ−・インダストリウス
ｒＦｏ　３２６０起源のグリセロール脱水素酵素などが
、好適に用いられる。

また、パン酵母やカンディダ　ウチリス起源のインへル
ターゼのようなショ糖を分解し、グルコースまたはフラ
クトースを生成するような酵素をグルコースデヒドロゲ
ナーゼまたはフラクトースデヒドロゲナーゼと共に電極
成分として混在させることにより、シーｙｔＪ！を測定
することができる。

本発明に利用する酵素の中で、特に好ましいものとして
、培養時菌体細胞膜に結合した状態で菌体内に蓄積され
る酵素（以下細胞膜結合型酵素という）を挙げることが
出来る。細胞膜結合型酵素は、電極成分として混在させ
たときの安定性が優れており、電極使用の際、酵素が殆
んど溶出されず、再現性の良い測定値を与え、しがも酵
素源として安価に入手し得る利点かある。

本発明においては、上記した酵素のみでなく、酵素含有
物も広く使用できる。酵素含有物としては、該酵素生産
菌体、該酵素生産培養液、該菌体破砕物、該菌体破砕物
からの分画成分、該菌体抽出物、咳菌体細胞膜画分、細
胞膜結合型酵素及び粗製酵素からなる群れから適宜選択
する。精製酵素を所望する場合は、超音波やフレンチプ
レスなどの常法により菌体を破砕した後、硫安分画や種
々のクロマトグラフィーによる分画などの常法により目
的酵素を分離精製し採取することが出来る。

また、細胞膜結合型酵素の場合は、前述のように、酵素
を高度に精製することなく、菌体破砕物のままで利用し
ても良好な結果を得ることが出来る。

本発明に利用するメディエータ−としては、酵素反応に
よって生じる電子を授受することのできるものであれば
、いずれでもかまわないが、使用する酵素と電子の授受
が円滑に進行するものを選択することが好ましい。また
、２４超以上のメディエータ−を同時に使用する。二と
も可能である。

具体的には、ｐ−ベンゾキノン、フェロセン、ジメチル
フェロセン、フェリシアン化カリウム、フェナジンメト
サルフェート、２，６−−ジクロロフェノールインドフ
ェノールなどの人工のメディエータ−を単独または併用
じで使用すれば良いが、ＰＱＱ、ＦＡＤＸＮＡＤ、ＮＡ
ＤＰといった酵素本来の補酵素も使用できる。

本発明に利用する電極成分は、酵素及びメディエータ−
を必須成分とするが、それら以外に電極を構成し得る電
子伝導体であればいずれを利用してもよい。そのような
電子伝導体として、通常、炭素又はグラファイトを利用
するのが好ましい。

酵素及びメディエータ−を電極成分として混在せしめた
酵素修飾電極の調製は例えば以下の方法で行うことが出
来る。

ｐ−ベンゾキノン、フェロセン、ジメチルフェロセンな
どの非水溶性のメディエータ−を用いる場合には、まず
メディエータ−をエーテルなどの溶媒に溶解し、適当量
の流動パラフィンＳこ加え、よく混和した後、減圧など
の通常の方法により溶媒を除去し、酵素およびグラファ
イト粉末と混和する。

流動パラフィン：グラファイト粉末：酵素の使用割合は
、一般に（１〜３）：　　（０，５〜１．５）　　：　
Ｌであり、最小酵素活性度は蛋白質１■あたり０．５〜
ｌユニツトのアルコール脱水素酵素活性である。

流動パラフィンのかわりに、室温で液体の疎水性ないし
非水溶性の物質、例えば炭素数１０以上の炭化水素を用
いることもできる。

また、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフ
ェート、２，６−−ジクロロフェノールインドフェノー
ルなどの水溶性のメディエータ−を用いる場合には、電
極剤中に混入させるために界面活性剤を用いてメディエ
ータ−を含む逆相ミセルを作成し、酵素およびグラファ
イト粉末とよ（混和することにより、メディエータ−を
含んだ酵素修飾電極剤を調製する。

さらにフェリシアン化カリウムの場合には、カ千オン性
界面活性剤と混合することにより、水に不溶性の複合化
物が調製でき、この複合化物を適当な割合で流動パラフ
ィンに加え、よく混和した後、酵素およびグラファイト
粉末と混和することにより、メディエータ−を含んだ酵
素修飾電極を調製できる。このときに使用できるカチオ
ン性界面活性剤としては、臭化ジメチルジ−ｎ−オクタ
デシルアンモニウム、塩化トリオクチルメチルアンモニ
ウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ドデシルピリジニ
ウム、塩化テトラデシルジメチルヘンジルアンモニウム
などが好適に用いられる。

メディエータ−を含む流動パラフィンあるいはフェリシ
アン化カリウム−カチオン性界面活性剤とグラファイト
粉末及び酵素の混和割合は、（１〜３）：　（０，５〜
１．５）　：　１の範囲が好適に用いられる。

なお、グラファイト粉末および流動パラフィンまたは界
面活性剤以外のものであっても、酵素と混和することが
可能な電極剤であればいずれも使用できる。

メディエータ−としては、上記したように、各種化合物
、補酵素、レドックス化合物（例えば、キノン、メチレ
ンブルー等）等が適宜使用可能である。

第１回は、本発明に係る酵素（修飾カーボン電極の実施
例を図示したものである。つまり、この実施例において
は、グラファイト粉末とメディエータ−を適当な割合で
よく混合したものに、酵素を均一になるように混合し、
混合物を電極表面に塗布し、酵素修飾カーボン電極を作
成するのである。

塗布する酵素電極剤の量は、測定物質に対して応答可能
であれば、特に限定はないが、作業性、応答速度や経済
性の面から、電極表面１　ｍｍ２あたり０．３〜２　ｍ
ｇの範囲でまたは５０〜５００μｍの厚さで塗布するの
が好ましい。

このようにして作成した電極を第２図に示す通りの装置
に組み込んで、試料溶液中の目的物質を測定する。すな
わち、はじめに第２図−Ａに示すように反応室を組み立
てる。反応室には先ずその中央部に試料室ないしは電解
槽を形成し、磁気攬１Ｔ子等撹拌装置をその中に設ける
。試料室にはサンプルｌ工人口、電解液流入口、廃液排
出口を設けるとともに、酵素修飾電極（第１図）及び参
照電極（例え：よ′、塩化銀電極）を組み込み、反応室
アセンブリーを完了する。

、二のようにして組み立てた反応室を用い、第２図−Ｂ
に図示した装置により測定を行う。

すなわち、第１図に図示した酵素修飾カーボン電極を試
料室（電解槽）に組み込み、ポンプを用いて試料室を電
解液で満たし、適当な参照電極を対極として加電する。

次いで、この試料室に測定物質を含有する試料をサンプ
ル注入口から適当量注入する。試料中に含まれる測定物
質と酵素修飾カーボン電極中の酵素との反応によって生
しる酸化電流を電流電圧変換回路を用いて、電流値を電
圧値に変換した後、レコーダーで記録するか、Ａ／Ｄ変
換することによりコンピューターに取り込んで測定する
。あらかしめ濃度の明らかな標準液の測定値と比較する
ことにより、試料中の濃度を求めることができる。この
場合、本発明の酵素修飾電極か測定溶液と接触する表面
積は、一般に約３ｍｍ”と小さくてよい。また１０〜４
０°Ｃの温度及びｐＨ４〜８の範囲で測定できる。

また、測定中、電解液を連続的に供給することにより、
フローインジェクション型の装置として使用できる。フ
ローインジェクション型の装置として使用することによ
り、測定濃度域を広げることができる。

〔発明の効果］ 本発明により、酵素とメディエータ−が他の電極成分と
共に均一に混合された状態で電極を形成し、反復使用の
際酵素やメディエータ−の漏出等による電極成分の変化
が少なく、安定した特性を示し、しかも非常に簡単な方
法で製造し得る新規な酵素修飾電極及びこの酵素修飾電
極と参照電極とを組合わせた新規な酵素センサーが提供
された。

本発明の酵素センサーは、応答性及び測定値の再現性が
非常に優れており、且つ、幅広く各種の酸化還元酵素を
利用し得るため、基質特異性により利用する酵素を選択
することにより各種の成分の測定を可能にした。特に、
センサー用酵素として殆んど利用されていなかったデヒ
ドロゲナーゼのｆｉｌ用を可能にした利点は大きい。

本発明によれば、メディエータ−が電極成分として酵素
とともに電極に強固に固定されているため、高価なメデ
ィエータ−や酵素が流しすることがなく、くり返し長時
間使用することができるので非常に大きな経済的効果が
奏される。また、着色物質か多々用いられているメディ
エータ−が流出することがないので、廃液の着色が防止
され、廃液処理液上の問題もないという著効が得られる
。

したがって本発明によれば、極微量の食品中の成分や生
体成分を迅速且つ正確に測定することができ、疾病の診
断、発酵プロセスの管理、反応工程のコントロールにも
利用することができる。

以下、本発明を実施例により更に詳しく説明する。

なお、以下の実施例に於いては、デヒドロゲナーゼ産生
菌の菌体破砕物を超遠心分離して得た沈澱物（細胞膜結
合型酵素）をそのまま酵素とじて利用する例のみを示し
たが、本発明は以下の実施例のみに限定されること無く
、適宜精製された酵素を利用するか、あるいは、被測定
物質の種類により適宜酵素を選択して利用し得るもので
ある。

［実施例］ １、細胞膜結合型アルコールデヒドロゲナーゼおよび細
胞膜結合型アルデヒドデヒドロゲナーゼの調製 培養したアセトバクター・アルトアセチゲネスＦＥＲＭ
　ＢＰ−４９１の菌体を遠心分離して集菌し、得られた
菌体を遠心分離して集菌し、得られた菌体をフレンチプ
レスにより破砕した。この破砕物を超遠心分離（１００
，０００Ｘ　ｇ、６０分、４°Ｃ）した後、沈澱部分を
そのまま細胞膜結合型アルコールデヒドロゲナーゼ標品
および細胞膜結合型アルデヒドデヒドロゲナーゼ標品と
して用いた。

２、細胞膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼおよび細
胞膜結合型ソルビトールデヒドロゲナーゼの二周製 培孜したグルコノバクタ−・サブオキンダンスＩＦＯ３
２５４の菌体を上記１と同様に処理し、得られた枕、殿
部分をそのまま細胞膜結合型グルコースデヒドロゲナー
ゼ標品および細胞膜結合型／′ルビトールデヒドロゲナ
ーゼ標品として用いた。

３、非水溶性メディエータ−を含有する細胞膜結合型ア
ルコールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極の作製 ジメチルフェロセン１ｇをエーテル１戚に？容かし、流
動パラフィンｌｄを加えよく混合し、減圧下でエーテル
を揮散させ除去した。この混合物に２５０メツシュ以上
のグラファイト粉末と上記１で調製した酵素標品を３：
３：１　　（重量比）の割合で混合し、減圧下で３時間
脱水処理し、酵素修飾電極剤を調製した。

調製した電極剤を第１図に示す電極の接液部表面に少量
塗布（塗布量：約１■／１ＩＩ１１２）シ、ジメチルフ
ェロセンを含有する細胞膜結合型アルコールデヒドロゲ
ナーゼ修飾カーボン電極を作製した。

メディエータ−が、ジメチルフェロセンのかわりにρ−
ベンゾキノンを使用している以外は、上記と同し方法に
より、ｐ−ヘンドキノンを含有する細胞膜結合型アルコ
ールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極を作製した。

４、水溶性メディエータ−を含有する細胞膜結合型アル
コールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極の作製 α−ブロモナフタレン１　ｍｌにエーロゾルＯＴ０．０
２５ｇを加え、よく分散させた。この分散液に、ＩＭの
フェリシアン化カリウム水溶液を０．１　ｄを加え、と
きどき振り混ぜながら２０分間音波処理をおこなった。

上部に残った水分は、濾紙で吸い取り、除いた。このよ
うにしてフェリシアン化カリウムが取りこまれた逆相ミ
セルを含むα−ブロモナフタレンを調製した。一方、α
−ブロモナフタレンと２５０メツシュ以上のグラファイ
ト粉末と上記１で調製した酵素標品を３：３：ｌの割合
で混合しておき、減圧下で３時間脱水処理した。

この混合物に対し、上記逆相ミセルを含んだα−フロモ
ナフタレ〉′を１：２の割合でよく混合し、酵素修飾電
極剤を調製した。

このようにして調製した電極剤を上記３と同様な方法で
フェリシアン化カリウムを含有する細胞膜結合型アルコ
ールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極を作製した。

メディエータ−が、フェリシアン化カリウムのかわりに
フェナジンメトサルフェートである以外は、上記と同じ
方法により、フェナジンメトサルフェートを含有する細
胞膜結合型アルコールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電
極を作製した。

５、水溶性メディエータ−を含有する細胞膜結合型グル
コースデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極の作製 上記２で調製した酵素標品を用いて上記４と同様な方法
により、フェリシアン化カリウムを含有する細胞膜結合
型グルコースデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極を作製
した。

６、エタノール濃度の測定 上記３，４で作製したメディエータ−を含有する酵素修
飾カーボン電極を第２図に示す装置に取り付け、Ｏ，１
Ｍ　ＫＣＩを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
を減圧下で脱気処理した電解液を反応室にポンプで満た
し、反応室内部にある磁気撹拌子をスター９で撹拌した
。反応室内にある塩化銀電極を対極として、＋０．６Ｖ
加電し、電流値をレコーダーで記録した。反応室は２０
’Ｃに保持した。

１０％（Ｗ／Ｖ）エタノールを含む試料５μｉをマイク
ロシリンジによりサンプル注入口から注入し、上記反応
条件下で得られる電流値を測定したところ、第３図に示
すような応答曲線が得られた。

いずれのメディエータ−を用いた場合も、エタノールを
含む試料を注入することにより、酸化電流は上昇し、最
終的に一定の値をとった。

なお、エタノールを全く含まない試料では、酸化電流の
上昇は見られなかった。

各メディエータ−を用いた場合の酸化電流を電圧値に変
換した値は、ジメチルフェロセンを用いた場合１４ｍＬ
　ｐ−ベンゾキノンを用いた場合５ｍＶ、フェリシアン
化カリウムを用いた場合４４ｍＶ、フェナジンメトサル
フェートを用いた場合３ｍＶであった。最も高い酸化電
流が得られたフェリシアン化カリウムを含有する酵素電
極を用いて、エタノール濃度の影響を検討したところ、
第４図のような結果が得られ、エタノール濃度に対応し
て電流測定値の上昇が見られた。

また、電極の安定性を検討するため、同一試料（エタノ
ール濃度１０％）を１３回連続して測定した場合に得ら
れる電流値は、標準偏差が１．９％であり、きわめて再
現性が高かった。

７、グルコース濃度の測定 上記５で作製したメディエータ−を含有する酵素修飾カ
ーボン電極を第２図に示す装置に取り付け、上記６と同
一の測定条件で種々の濃度ノクルコースを含む試料をマ
イクロシリンジで５μｌずつサンプル注入口から注入し
、得られる電流値をレコーダーで記録し、最終的にほぼ
一定となった電流値とグルコース濃度の関係をプロット
したところ、第５図のような結果が得られ、試料のグル
コース濃度に対応した測定値が得られた。

８、細胞膜結合型フラクトースデヒドロゲナーゼおよび
細胞膜結合型グリセロールデヒドロゲナーゼの調製 培養したグルコノバクタ−・インダストリウスＩＦＯ３
２６０の菌体を上記１と同様に処理し、得られた沈澱部
分をそのまま細胞膜結合型フラクトースデヒドロゲナー
ゼ標品および細胞膜結合型グリセロールデヒドロゲナー
ゼ標品として用いた。

９、非水溶性メディエータ−を含有する細胞膜結合型ア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ修飾カーボンを掻の作製 ｐ−ベンゾキノンＩｇをエーテルｌｄに溶カし、流動パ
ラフィンＩｙｄを加えよく混合し、減１下でエーテルを
揮散させ除去した。、二の混合物に２５０メノンユ以上
のグラファイト粉末と上記ｌで調製した酵素漂品をｌ：
ｌ：ｌ（重量比）の割合で混合り、４圧下で１時間脱水
処理し、酵素修飾電極剤を調製した。調製した電極剤を
上記３と同様な方法により、ｐ−ヘンヅキノンを含有す
る細胞膜結合型アルデヒドデヒドロゲナーゼ修飾カーホ
ン電極を作製した。

２０、非水溶性メディエータ−を含有する細胞膜結合フ
ラクトースデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極の作製 上記８で調製した酵素標品を用いて上記３と同様な方法
により、ジメチルフェロセンを含有する細胞膜結合型フ
ラクトースデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極を作製し
た。

１１、非水溶性メディエータ−を含有する細胞膜結合ソ
ルビトールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極の作製 上記２で調製した酵素標品を用いて上記３と同様な方法
により、ジメチルフェロセンを含有する細胞膜結合型ソ
ルビトールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極を作製し
た。

１２、水溶性メディエータ−を含有する細胞膜結合型グ
リセロールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極の作製 上記８で調製した酵素標品を用いて上記４と同様な方法
により、フェリシアン化カリウムを含有する細胞膜結合
型グルセロールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極を作
製した。

１３、アセトアルデヒドおよびｎ−ヘキサアルデヒド濃
度の測定 上記９で作製したメディエータ−を含有する酵素修飾カ
ーボン電極を第２図に示す装置に取り付け、上記６と同
一の測定条件で種々の濃度のアセトアルデヒドまたはｎ
−へキサアルデヒドを含む試料をマイクロシリンジで１
０μｉずつサンプル注入口から注入した。サンプル注入
後、２分間の電流値の変化をレコーダーで記録し、最終
的に一定になった電流値とアセトアルデヒドまたはｎ−
ヘキサアルデヒド濃度の関係をプロットしたところ、第
６図のような結果が得られ、試料のアルデヒドの濃度に
対応した測定値が得あれだ。

１４、フラクトース濃度の測定 上記１０で作製したメディエータ−を含有する酵素修飾
カーボン電極を第２図に示す装置に取りつけ、上記６と
同一の測定条件で種々の濃度のフラクトースを含む試料
をマイクロシリンジで１０１Ｉｌずつサンプル注入口か
ら注入した。サンプル注入後、２分後の電流値を測定し
、試料のフラクトース濃度との関係をプロットしたとこ
ろ、第７図のようにフラクトース濃度に対応した電流値
が測定された。

１５、　ソルビトール濃度の測定 上記１１で作製したメディエータ−を含有する酵素修飾
カーボン電極を第２図に示す装置に取りつけ、上記６と
同一の測定条件で測定した。

種々の濃度のソルビトールを含む試料１０μｌをマイク
ロシリンジで、サンプル注入口から注入した。電流値の
変化をレコーダーで記録し、サンプル注入後、２分後の
電流値をもとに、試′１４のソルヒトール濃度との関係
をプロ、トしたところ、第８図に示すように、電流測定
値とソルヒトール濃度か相関していた。

１６、グリセロール濃度の測定 上記１２で作製したメディエータ−を含有する酵素修飾
カーボン電極を用い、上記１５と同様な方法で試料のグ
リセロール濃度と電流測定値の関係を求めたところ、第
９図のような関係にあり、グリセロール濃度と電流測定
値が相関していた。

１７、−非水溶性メディエータ−を含有する細胞膜結合
型グルコースデヒドロケナーゼーインへルターゼ修飾カ
ーボン電掻の作製 上記２で調製した酵素標品とインへルターセ（シグマ社
製、パン酵母起源、４００／ユニツト／　Ｂ）を重量比
で２：１の割合で混合して調整した細胞膜結合型グルコ
ースデヒドロゲナーゼとインへルターゼを含む酵素標品
を用いて上記９と同様な方法により、Ｐ−ペンシイノン
を含有する細胞膜結合型クルコースデヒドロゲナーゼ−
インへルターゼ修飾カーホン電極を作成した。

１８、　　ショ糖濃度の測定 上記１７で作製したメディエータ−を含有する酵素修飾
カーボン電極を用い、注入試料の量が５μｅである以外
は、上記１５と同様な方法で試料のンヨＩ！濃麿と電流
測定値の関係を求めたところ、第１０図のような関係に
あり、ショＷ濃変と電流測定値が相関していた。

１９、フェリシアン化カリウム−カチオン性界面活性剤
複合化物の調製 臭化ジメチルジ−ｎ−オクタデシルアンモニウムｌ０ｍ
Ｍ水溶液１００ｄとフェリシアン化カリウム　３０ｍＭ
水溶液１０ｍ１調製した。両液を混合し、３０分間撹拌
し、よく混合した。生成した同形物を遠心分離（６，Ｏ
ＯＯＸｇ、１０分間）で分離し、沈澱物として得た。こ
の沈澱物を水で２回良く洗浄した。得られた沈澱物を室
温で１昼夜放置し、良く乾燥させ、非水溶性のフェリシ
アン化カリウム−臭化ジメチルジ−ローオクタデシルア
ンモニウム複合化物（５００■）を得た。

２０、　フェリシアン化カリウム−臭化ジメチルジ−ｎ
−オクタデシルアンモニウム複合化物を含有する細胞膜
結合型アルコールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極の
作成 上記１９で調製したフェリシアン化カリウム−臭化ジメ
チルジ−ローオクタデシルアンモニウム複合化物８０■
を流動パラフィン１ｇと良く混和した。この混和物２５
■に上記ｌで調製した酵素標品１０■と２５０メツシュ
以上のグラファイト粉末１０■を加え、均一になるよう
によく混和し、酵素修飾電極剤を調製した。調製した電
極剤、を第１図に示す電極の接液部表面に少量塗布し、
フェリシアン化カリウム−臭化ジメチルジ−ｎオクタデ
シルアンモニウム複合化物を含有する細胞膜結合型アル
コールデヒドロゲナーゼ修飾カーボン電極を作製した。

２１、エタノール濃度の測定 上記２０で作製したメディエータ−を含有する酵素修飾
カーボン電極を用いて、上記６と同様な方法で試料中の
エタノール濃度と電流測定値の関係を求めたところ、第
１１図のような関係にあり、エタノール濃度と電流測定
値が相関していた。

２２、フェリ／アン化カリウム−塩化セチルピリジニウ
ム複合化物を含有する細胞膜結合型アルコールデヒドロ
ゲナーゼ修飾カーボン電極の作製とエタノール濃度の測
定 上記１９の臭化ジメチルジ−ローオクタデシルアンモニ
ウムのかわりに塩化セチルピリジニウムを使用し、上記
１９と同様な方法でフェリシアン化カリウム−塩化セチ
ルピリジニウム複合化物を得た。この複合化物を用いて
上記２０と同様な方法で酵素修飾電極剤を調製した。調
製した電極剤を第１図に示す電極の接液部表面に少量塗
布し、フェリシアン化カリウム−塩化セチルピリジニウ
ム複合化物を含有する細胞膜結合型アルコールデヒドロ
ゲナーゼ修飾カーボン電極を作製した。作製したメディ
エータ−を含有する酵素修飾カーボン電極を用いて、上
記６と同様な方法で試料中のエタノール濃度と電流測定
値の関係を求めたところ、第１２図のような関係にあり
、エタノール濃度と電流測定値が相関していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素修飾電極の構造を、第２図−Ａは、反応
室の構造を、第２図−Ｂは、測定装置を、第３図は、４
種類のメディエータ−を用いた場合の１０％エタノール
溶液に対する応答曲線を、第４図、第５図、第６図、第
７図、第８図、第９図及び第１０図は本発明の酵素セン
サーを用いて、エタノール、グルコース、アルデヒド、
フラクトース、ソルビトール、グリセロール及びシｇ糖
の濃度を測定する場合の検量線の１例をそれぞれ示した
図、第１１図およ第１２図は同様に、本発明の酵素セン
サーを用いてエタノールの濃度を測定する場合の検量線
の例を示した図である。 第１図 酵素修飾電極の構造 ナンド（二重） 測定電流値− 測定電流値− 測疋砿ｌ− 第４図 ニタノール濃度（Ｖ／Ｖ　’／、ン 第５図 グル＝−スＩ１１度 （９Ａ） アノげヒト獣 （Ｖ／Ｖ”／、） 第７図 フラクトース濃度（（１／Ｉ） 第８図 ソルビトール濃度 （ｇ／ｌ） 第９図 グリセロールぷＵ莞 （９／１） 第１０図 ンｘ”１ｌｌｌ渡Ｃ９７Ｉ　） 第１１図 ０ ５ ＝ｙノーｖ４１ｔ（Ｖ／Ｖ’／−）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵素及び／又は酵素含有物とメディエーターを電極
   成分として混在せしめた酵素修飾電極と参照電極とを組
   合わせてなることを特徴とする酵素センサー。 ２、酵素含有物が、該酵素生産菌体、該酵素生産培養液
   、該菌体破砕物、該菌体破砕物からの分画成分、該菌体
   抽出物、該菌細胞膜画分及び粗製酵素からなる群から選
   択されるものであることを特徴とする請求項１記載の酵
   素センサー。 ３、酵素がデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請
   求項１又は２記載の酵素センサー。 ４、デヒドロゲナーゼが、アルコールデヒドロゲナーゼ
   、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲ
   ナーゼ、フラクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトール
   デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼから
   なる群れから選択されるものであることを特徴とする請
   求項３記載の酵素センサー。 ５、メディエーターがレドックス化合物及び／又は補酵
   素であることを特徴とする請求項１乃至４記載の酵素セ
   ンサー。 ６、メディエーターが、ｐ−ベンゾキノン、フェロセン
   、ジメチルフェロセン、フェリシアン化カリウム、フェ
   ナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノール
   インドフェノール、ＰＱＱ、ＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ
   からなる群れから選択されるものであることを特徴とす
   る請求項１又は５記載の酵素センサー。 ７、電極成分として混在させる酵素及びメディエーター
   が、アルデヒドデヒドロゲナーゼとパラベンゾキノン、
   フラクトースデヒドロゲナーゼとジメチルフェロセン、
   ソルビトールデヒドロゲナーゼとジメチニフェロセン又
   はグリセロールデヒドロゲナーゼとフェリシアン化カリ
   ウムであることを特徴とする請求項６記載の酵素センサ
   ー。 ８、電極成分が炭素又はグラファイトを含有することを
   特徴とする請求項１乃至７記載の酵素センサー。 ９、酵素及び／又は酵素含有物とメディエーターを電極
   成分として混在せしめたことを特徴とする酵素修飾電極
   。 １０、非水溶性メディエーターを有機溶媒に溶かし、流
   動パラフィンを加えて混合した後、溶媒を除去し、得ら
   れた混合物にグラファイト粉末と酵素及び／又は酵素含
   有物を混合して酵素修飾電極剤を調製し、これをカーボ
   ン電極表面上に適用してなることを特徴とする請求項９
   記載の酵素修飾電極。 １１、水溶性メディエーターが取り込まれた逆相ミセル
   にグラファイト粉末と酵素及び／又は酵素含有物を混合
   して酵素修飾電極剤を調製し、これをカーボン電極表面
   上に適用してなることを特徴とする請求項９記載の酵素
   修飾電極。 １２、フェリシアン化化合物とカチオン性界面活性剤か
   らなる非水溶性複合化物に流動パラフィンを加えて混合
   した後、グラファイト粉末と酵素及び／又は酵素含有物
   を混合して酵素修飾電極剤を調製し、これをカーボン電
   極表面に適用してなることを特徴とする請求項９記載の
   酵素修飾電極。 １３、反応室、定電圧電源部、電流電圧変換部及び増幅
   部からなり、該反応室は、サンプル注入口、電解液流入
   口、廃液排出口、撹拌装置、参照電極及び酵素修飾電極
   を備え、しかも該酵素修飾電極は酵素及び／又は酵素含
   有物とメディエーターを電極成分として混在せしめたも
   のであることを特徴とする測定装置。