JPH0322973A - ヒトヘパトーム細胞系によるコロニー形成促進因子（ＣＳＦｓ）の構成性産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 た覧仁艷艷 本発明は、ヒトへパトーム細胞系による顆粒球マクロフ
ァージコロニー形成促進因子（ＧＭ−ＣＳＦｓ）の構成
性産生に係わる。

周知のように、造血成長因子は幹細胞の増殖及び１つ以
上の完全に分化された血液細胞タイプＩ＼の分化を刺激
する上で重要な役割を果たす。これらの因子のうち、顆
粒単球形成（ｇｒａｎｕｌｏｍｏｎｏｐｏｉｅＬｉｃ）
前駆細胞をターゲットとする顆粒球−マクロファージコ
ロニー形或促進因子（ＧＭ−ＣＳＦｓ）は顆粒球及び単
球／マクロファージの産生に関して特別の効果を示す（
八．Ｗ．Ｂｕｒｇｅｓｓ　＆　Ｄ．Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｂ
ｌｏｏｄ　５６：９４７，１９８０；及びＮ．Ｓ．Ｎｉ
ｃｏｌａ　＆　Ｍ．Ｖａｄａｓ，Ｉｎｕａｕｎｏｌ．　
Ｔｏｄａｙ　５：７６．１９８４）。ｒＧＭ−ＣＳＦｓ
」という用語は、Ｇ−ＣＳＦ，　Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ〜
ＣＳＦを含む未精製ＧＮＣＳＦ　ｆ！−意味する。

最近では、種々の癌の治療に照射及び化学療法を使用す
る傾向が広まっている。しかしながら、これらの療法に
はミエロサプレッション（ｍｙｅｌｏ−ｓｕｐｐｒｅｓ
ｓ　ｉｏｎ）という副作用が伴うため、白血球数の減少
及び免疫機能の低下という望ましくない事態が不可避的
に生じる。そのため、この種の療法を続けることが極め
て難しくなることも希ではない。ＣＳＦｓ　（特にＧＭ
−ＣＳＦｓ）を前述の治療法と組きわせて使用すると、
予思通り癌の治療に効果が現れ１：｛る（Ｍ．Ｓｈ　ｉ
ｍａｍｕｒａ他，Ｉｌｌｏｏｄ　６９：３５３，１９８
７　；及びＰ．Ｍａｙｅｒ他，　Ｂｌｏｏｄ　　７０：
２０Ｂ，１９８７）。造血及び臨床的使用に関するＣＭ
−ＣＳＦｓの研究を容易にし且つゲノムの研究を更に推
進するためには、ＧＭ−ＣＳＦｓの製造方法を開発しな
ければならず、例えばＧＭ−ＣＳＦｓを精製するための
大量のならし培地（ＣＭ）の椙戒性源となる細胞系が必
要となる。

これまでの研究から、ＧＭ−ＣＳＦｓを産生できる６■
胞は４種類あることが知られている。即ち、単球／マク
ロファージ（Ｄ．Ｗ．Ｇｏｌｄ他，Ｌｏｎｃｅｔ　２：
１３９７，１９７２及びＩ．Ｎ．Ｒｉｃｈ他，　Ｅｘｐ
．ｌｌｅｍａｔｏ１　１４：７３８，１９８６）　；線
維芽細胞（一部）（Ｐ．Ｅ．＾ｕｓｔｉｎ他，Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ　Ｐｂｙｓｉｏ４０２：３３４，１９８０）　．内
皮細胞（Ｇ．Ｅ．Ｂａｇｂｙ他，　Ｂｌｏｏｄ６２：０
６３．１９８３及びＧ．Ｍ．Ｓｅｇａｌ他，　Ｊ．Ｉ＋
ｎｍｕｎｏｌ．　１３８１７７２，１．９８７）　．並
びにリンパ球（Ｒ．Ｇ．Ｓｂａｂ他，　Ｉｌｌｏｏｄ５
０　：８１　１　，　１９７７及びＭ．．ＬＣｌｉ＋ｉ
ｅ池，　Ｎａｔｕｒｅ　２４８：７０３１９７４）てあ
る。しかしながら、医療での使用に足りる大量のＧＭ−
ＣＳＦｓをｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養で正常な組織細胞から
得るのは難しい。ＧＭ−ＣＳＦｓは、或る種のし１〜腫
瘍細胞系、例えば肺に転移した線維性組織球腫から単離
したｒＧＣＴ，　（米国特許第４，１３５，９７５号、
１９７９年）、ヒト膀胱癌に由来するｒ５６３７　Ｊ　
（Ｊ　．ＦｏｇｈＮａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ
．　Ｍｏｎｏｇｒ．　４９＋５．１９８７）及びヒ１・
肺癌に由来するＳＫ．−ＭＥＳ−１（Ｓ．Ｎ．Ｚｉｎｚ
ａｒ他，　Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｌ．　１３：５７４，１
９８５）の培養によって、より高い収率で得られること
が判明した。

我々は驚くべきことに、ヒトヘパ１・−ム細胞系がＧＭ
−ＣＳＦｓを高収率で横或的に産生じ得、且つ池の良く
知られたＧＭ−ＣＳＦｓ産生細胞と比べて著しく大きな
コロニー形或促進能力を有することを発見した。この細
胞系は本発明者Ｃ．Ｃｂａｎｇによって樹立されたもの
であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　ＣｅｌｌｕｌａｒＢ
ｉｏ！ｏｇｙ　３：１１３３−１１３７．１９８３に発
表された。この相胞系は中華民国、台湾、タイペイ市の
Ｄ　ｅ　ｐ　ａ　ｒ　Ｌ　＋ｎ　ｅ　ｎ　ｔｏｆ　Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｅｔｅｒａｎｓ　
Ｇｅｎｅｒａｌ　ｌｌｏｓｐｉＬａｌ（及びＧｒａｄｕ
ａｔｅ　Ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄＬ＋ｕａｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　ＹａｎＨ−＋ｎｉｎ８＋ｎｅｄｉｃａｌ　ｃｏｌ
ｅｇｅ）で入手できる。

免兜へ匙見 本発明の目的の１つは、ヒｌ・ヘパＩ−−ム細胞系を用
いてＧＭ−ＣＳＦｓを産生ずることにある。この相胞系
ＨＡ２２Ｔ／ＶＣＩＩはＧＭ−ＣＳＦｓを高収率で構成
的に産生ずることができ、且つ純粋ＧＭ−ＣＳＦの貴重
な源ともなる。

本発明の別の目的は、骨髄細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ戊長
を刺激することができる、Ｈ八２２Ｔ／ＶＣＩ１細胞系
によって馴化したならしｌｉ’ｆ地を提供することにあ
る。このならし培地は、分子量か１２．４〜２９Ｋｄで
あり且つ見｛エトけ分子量２２．５３Ｋｄ０）　（；Ｍ
−ＣＳＦであると同定されたＧ−ＣＳＦ．Ｍ−ＣＳＦ及
びＧＭ−ＣＳＦを含む（；Ｍ−ＣＳＦＳを含有する。

本発明の更に別の目的は、骨髄細胞のｉｎ　ｖｉＬｒｏ
戒長を刺激する方法を提供Ｊ−ることにある。この：ｆ
ｉ　’ｔ大ｃ１、培養培地をＩＩＡ２２Ｔ／ＶＧＨＪ｛
Ｈ　Ｈａ　系ｔ”Ａｍ　（ｅ　Ｌ、このならし培地に骨
髄ａ胞を接種して顆粒球コロニー、ｒ３球コロニー、顆
粒球及び単球コロニー並びに好酸球コロニ・一を誘導す
ることからなる。

以−Ｆ、：，ｎ付図面に基づき本発明をより詳細に説明
する。

ｊ逃丑ａＺ囮一 本発明では、ＧＭ−ＣＳＦｑの簡単で効果的な製造方法
を開発すべく、大址のＧＭ−ＣＳＦｓの横或性産生にヘ
バトーム細胞系Ｈ＾２　２　Ｔ　／　Ｖ　Ｇ　［！を用
いる。

本発明で使用ずるＨ八２２Ｔ／ＶＧＩＩＩ胞系は、５６
歳の中国人男子から得た肝細胞癌の外■４的標本から樹
立したちのである。この細胞系及びその待性はＭｏｌｅ
ｃｕｆａｒ　＆　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
３：１１３３−１１３７１９８３に記載されている。こ
の細胞系４１［：Ｍ−ＣＳＦｓを高収率で構成的に産生
ｒることができる。この細胞系で馴化したならし培地は
大量のＧＭ−ＣＳＦｓを形戒せしめ、且つヒ１・骨髄造
血をｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激する能力が従来のならし培
地、即′ｒ−）ＧＣＴ−ＣＭ、５６３７ＣＭ、胎盤一Ｃ
Ｍ、肺一ＣＭ及び門１八−Ｌ−ＣＭより大きく、かなり
高い希釈度（１：６４）で活性を検出することができた
。１１＾２２丁一ＣＨにヒト骨’ｔｉ　ＫｆＡ胞を接種
することによって形或したコロニーのタイプを、Ｂ．Ｍ
ｃｎｄｅｌｏｕ＋池の方法（八ｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏ１
　５：１５１，１９７８）並びにＧ　．　Ｒ　．Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ　＆　Ｄ．Ｍｅｔｃａｌｆの方法（Ｅｘｐ．Ｈ
ｃｍａｔｏｌ　８：５４９，１９８０）によって分析し
た．培養物を固定させ且′）染色した後、顕微鏡での形
態学的検査によってコロニーのタイプを調べた。その結
果、形成されたコロニーの大部分（７５％）は顆粒球タ
イプであったが、別の夕・イブのコロニー（単球、好酸
球及び顆粒単球）も含まれていることが判明した。これ
らのオ晶果は、Ｈ八２２Ｔ−ＣＭＬこ含まれているＣＳ
Ｆタンパク質かＧＭ−ＣＳＦｓであるか又は叶一ＣＳＦ
ｓの混合物であることを示唆タる２ ＧＭ−ＣＳＦｓの活性を公知のようにＣＦＵ−ＧＭアッ
セイを川いて調べた（Ｓ．Ｙ．Ｗａｎｇ他，　［Ｉｌｏ
ｏｄ　６５：１１８１，１９８５）。比較実験テハ、１
１　Ａ　２　２　Ｔ　／　Ｖ　Ｇ　｝Ｉ細胞′ζ馴化し
たならし培地の方が従来の叶より大きいｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏヒ１・骨髄成長刺？ｌｊ．能力を示した。従って、前
記培地は夾木的研究及び臨床的研究で使用される純粋な
ＧＭ−ＣＳＦを製造するための貴重な源となる。

本発明がより良く理解されるように、以下に４１ユ限定
的実施例を挙げる。尚、１部」及び「％」は指示のない
明り総て「重量部」及び「重旦？≦」である。

表１目生 細胞系１１＾２２Ｔ／ＶＧＩ１及びその特性は゜’Ｍｃ
ｌｅｃｕｌａｒ　＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　３：１１３３−１１３７．１９８３”に３己載されて
いる。普通の培養として、これらの細胞をウシ胎児血清
（ＦＣＳ，　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
２Ｘ１０５７ｍの濃度で含むＰＲＭＩ　１６４０又はＩ
ＮＤＨ培地（ＧＩＢＣＯｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に
懸濁させた。この細胞懸濁ｉ（｛１／５＋ＩｌｌをＴｔ
ｓフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ＞に植え込み、次いて空気中
に５％のＣＯ２を含む雰囲気の中で３７℃゛ζ培養物を
インキユベートした．細胞を密集状態まで増殖させた（
３日間のインキュベーション）後て継代培養を行った。

ＸＡむ２＋ｊｊ＾２２Ｔ−ＣＭへｌ夏 ＧＭ−ＣＳ＾のアッセイ及びコロニータイプの分析に必
要な、Ｉ１＾２２Ｔ／ＶＧＩ＋４｛Ｂ胞によるならし培
地を形成した。大量のＧＭ−ＣＳＦｓを含むｌ｛八２２
１’−ＣＭはＧＭ−ＣＳＦの精製にも使用する。

５ｘ　１０’／ｍｌの｛ｉ＾２２Ｔ／Ｖ（：Ｉｌｌ胞を
ＲＩ’ＭＩ　１６４０培地中、５％ＦＣＳ、３７℃でイ
ンキユベートし、５日間のインキュベーションの後で上
澄みを集めた。次いで、Ｈ＾２２Ｔ／ＶＧＨＭ胞により
馴化したならし培地（本明細書では１１＾２２Ｔ−ＣＭ
と称する）をコロニー形成促進活性等のテストにかけた
。

実』卸邊３：ＣＳ＾のバイ　アッセ “Ｔｂｅ　Ｉｌｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ”（Ｍ．Ｎｅｔｅａｌｒ，＾
ｎ＋ｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８４）の
１０１〜１０２ページに記載のように、又はＳ．Ｙ．Ｗ
ａｎｇ他により［１ｌｏｏｄ　６５：１１８１．１９８
５に記載されているようにＣＦＵＧＭアッセイを用いて
ＧＭ−ＣＳＦｓの活性を測定した。

即ち、１０％の加熱不活性化ＦＣＳを補足したＭｃＣｏ
ｙの５＾培地に０。３％の寒天（Ｄｉｒｃｏ）を添加し
て形成した培地ｈ１に、５ｘ１０’の低密度非付着ヒト
骨髄細胞を植え込んだ．このアッセイシステムにＨ＾２
２Ｔ−ＣＭ又は他の細胞ＣＭを最終濃度１０％（ｖｏｌ
／ｖｏｌ）で加え７こ。　ｆ人い　（′、　２Ａ甲（こ
０乃ｑノしｕ２τ苫Ｕ碌詞亦囲ヌ翫の中で３７℃で培養
物をインキユベートし、７日間のインキュベーションの
後でコロニー及びクラスターの数を計数した。クラスタ
ーは、この計数操作の後で、固定させ且つ染色してコロ
ニータイプの分析にも使用し得る。

え比ル｛：コロニー　　プ コロニーの計数後、メタノールて脱水した５９≦のグル
タルアルデヒドにより前記寒天培丘↑勿をその場で固定
させ、次いでＬｕｘｏｌ−Ｆａｓｔ−Ｂｌｕｅ及び１１
ａｒｒｉｓのへマトキシリン（Ｉｌｅｍａｔｏｘｙｌｉ
ｎ）（Ｂ．Ｍｅｄｄｅｌｏｗ他，八ｍ．Ｊ．ｌＩｅｍａ
ｔｏ１　５：１５１，１９７８及びＧ．Ｒ．Ｊｏｂｎｓ
ｏｎ　＆　Ｄ．Ｍｅｔｃａｌ（　Ｅｘｐ．ＩＩｅｍａｔ
ｏ１　８：５４９，１９８０）で染色した。１００〜２
００倍の顕微鏡で１００個のコロニーを形態学的に検査
することによってコロニのタイプを調べた． その結果、ＩＩ＾２２Ｔ−ＣＭでの刺激によって形成さ
れたコロニーの大部分く７５％）は顆粒球であったが、
別のタイプのコロニー（単球、好酸球及び顆粒単球）も
含まれていた．これらの結果は、Ｈ八２２Ｔ−ＣＭに含
まれるＣＳＦタンパク質がＧＭ−ＣＳＦであるか又はＧ
Ｍ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦとの混合物であることを示唆す
る。

及範燵ｉ：　ＧＭ−ＣＳＦｓ産生の　　’ＬＩＸＵ動力
学的観察を行ったところ、ＧＭ−ＣＳ＾産主のレベルは
５日間培養したＩＩ＾２２Ｔ培養物において顕著になり
、培養７日目にピークに達した（第１図参照）．また、
活性はかなり高い希釈度（１　：６４）で検出すること
ができたく第２図参照）． 実ＪｊｄｆＬＬ　：　　ヲられｒ・ｃｓＦｓの、゛（１
）加熱処理に対する安定性 Ｉ１＾２２Ｔ−ＣＭに含まれるＧＭ−ＣＳＦｓの活性は
５６℃で３０分間加熱しても安定していたく表１参照）
。

麦−一Ｌ ］１＾２２Ｔ−ＣＭのＧＭ−ＣＳＦｓ活性に対する加熟
処理の影響大対照（未処理〉グループに対する％。

（２）ｐｌｌ値に対する安定性 コロニー形成促進効果を得るための最適ρ１１は７であ
った。この値が９より大きいが又は５より小さいと活性
は著しく減少したく表２参照）。

表　　２ Ｉ１＾２２Ｔ−ＣＭ★のＧＭ−ＣＳＦｓ活性に対ずるｒ
ｏ４の影響★　ＩＩ　Ａ　２　２丁−ＣＭは種／Ｚのｐ
ｌｌ値に′：Ａ整し、ｃＦｕ−いアッセイの１再に４℃
で７日間貯蔵した。

★★この活性は普通の状態（ｐｌｌ７）の活性に対する
％て示す。

（３）分子量の測定 ′Ｆ皓的精製及び分子ｆｉ（１．ｗ．）測定を公知の方
法（Ｋ．Ｗｅｌｔｚ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｃｄ．　１５６
：４５４，１９８２　；及びｖ．ｐ．Ｒ．Ｇｈｉｏ他、
Ｂｌｏｏｄ　６９：１３４０，１９８７＞で行った。

分子量測定はｆ記のように実施した ＋１Ａ２２Ｔ−ＣＭ４：　（ＮＩ１．）２ＳＯ．を３Ｑ
％飽和になるまで加えた．沈澱物を遠心分離にかけ、（
１１Ｈ７．２のＰＢｓ中に）再懸濁させ、同一バッファ
に対して透析した。透析によって得た濃縮物（０　．　
１ｍ　ｌ　）をＳｕｐｅｒｏｓｅＴ１２（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）ゲルｐ過カラム（１　．０　ｘ　１００ｃ＋Ｑ
）に充填した。ａ　Ｂを０．４ｍｔ／分に調整し、ＩＩ
Ｉ　．　Ｗ　．を下記のマーカーで較正した： ブルーデキストラン（２，ＯＯＯＫ）、アルコールデヒ
Ｉ・１７ゲナーゼ（１５０Ｋ）、ＩｌＳ八（６７．３Ｋ
）．カルポニツクアンヒドラーゼ（２９Ｋ）及びシｌ・
クロムＣ（１２．４Ｋ）。イ容離フラクションをＣＦｔ
ｌ−ＯＮアッセイにかけてＣＳＦｓを評価した。ＣＳＦ
活性をもっ溶離タンパク質のｍ．ｔｕ．４．！１２．４
〜２９Ｋｄであったく表３参照）。較正曲線に基づ＜　
ＣＳＦタンパク質の＋ｎ　．　ｗ　．は約２２．５３Ｋ
ｄであった。

これは、ｌｌＡ２２Ｔ−ＣＭ４：　含マれルＣＳＶカ（
；Ｍ−ＣＳＦ”（　７，　ルことを示唆ずる。

胆肱及東江 ＣＳＦ産生をＨ　Ａ　２　２　Ｔ　／　Ｖ　Ｇ　Ｒ　Ｒ
ｄＢ胞と５つの良く知られたＧＭ−ＣＳＦ産生細胞、即
ちＧＣＴ、５６３７、Ｐｌｌ＾刺激リンパ球、胎盤及び
胎児肺との間で比較した。ならし培地を実施例２に記載
の方法で製造し、前記諸細胞によって産生きれたタンパ
ク質のＣＳＦ活性を実施（’；ＩＩ　３に記述したアッ
セイ法で測定し、コロニーのクイフ゜を実施例４に記載
の方法て分析した。

７４！ｉ果を表３に示し、誘発されたＣＭコ１コニーの
サブタイプを表４に示した。コロニー形成促進の相ク１
能力｛ｊ１１＾２２Ｔ−ＣＭ＞　［；ＣＴ−ＣＭ＞胎盤
−ＣＭ＞胎児ルトＣＭ冫５６３７−ＣＭ＞　ＰＨ八−Ｌ
−ＣＭノＩｌＩｎ　−ｒ　アッｆ．：　，　ｌＩＡ２２
Ｔ−ＣＨＩコ土一》で誘発されたコロニーの数は骨髄州
胞５ｘ１０→｛固当たり９４±３であった。

衣一二Ｌ １１＾２２Ｔ／ＶＣ：Ｉ１による（：Ｍ−ＣＳＦｓ産生
と他ノＧＭ−ＣＳＡ産土ｆｌ｛ｔ！胞による（１４−Ｃ
ＳＦｓ産生との比較１：培地を種々の細胞で５日間馴で
ヒした。

２：　ＣＦＵ−（；ＭアッセイシステムニＣＭヲｆｉ４
？ｉｆｌ度１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で加え、ＧＭ−Ｃ
Ｓ八レベルの結果を骨髄細胞５ｘ１０’涸当たりの形戒
ＧＭコロニー数゛Ｃ示した。

３：データをＩＩＡ２２Ｔ／ＶＧＨ−ＣＭ　ト比較Ｌ　
タ。

４：　ＧＭ−ＣＳＦｓを含む（：ＣＴ−ＣＭ（ま（：Ｉ
ＢＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。

球及び単球タイプ、Ｅｏは好酸球タイブである。

５：　５８３７はＧＭ−ＣＳＦｓを構成的に産生ずる良
く知られた細胞系である。

二一のサブタイプ ★　寒天ゲル中で成長したＧＭコロニーをその場で固定
させ、Ｌｕｘｏｌ　ＦａｓＬ　Ｂｌｕｅ及びＨａｒｒｉ
ｓのヘマトキシリンで染色した．サブタイプ分析は、１
００個のコロニーを２００倍顕微鏡で計数することによ
って実施した． ★★Ｃは顆粒球タイプ、Ｎは単球タイプ、ＧＭは顆粒

【図面の簡単な説明】

第１図は培養時間に応じた１｛＾２　２　Ｔ　／　Ｖ　
Ｇ　ＩＩ細胞によるＧＭ−ＣＳＦｓ産生の動力学的観察
結果を示すグラフであり、ＧＭ−ＣＳ＾産生のレベルが
５日間培養したＩ１＾２２Ｔ／ＶＧ｝ｌ培養物において
顕著になり且つ培養物後７日でピークに達することを示
している．第２図は１１＾２２Ｔ／ＶＧＨ細胞で馴化し
たならし培地中のＧＭ−ＣＳＦｓの滴定結果を示すグラ
フであり、活性がかなり高い希釈度（１：６４）で検出
できたことを示している。 第３図ｇｉ　ＩＩＡ２２Ｔ／ＶＧＨ，ｌ［胞によッテ産
生されタＧＭ−ＣＳＦタンパク質の分子及の測定結果を
示すグラフであり、ＣＳＦ活性をもつ溶離タンパク質の
分子Ｈｋ　（ｍ．ｕ＋．）が１２．４〜２９Ｋｄである
ことを示している。 図面の浄書（内容に変更なし） Ｎｏ．ｏｆ　ＣＦＬＪ−ＧＭコロニーの数壇番吟１′２
ｌ（ｅ） ｊ＠％４ｒ，ｎ　１；ん゜七たＨＡ２２Ｔ軸Ｊｔ）ａｔ
：よるＧＭ−ＣＳＦＳ　ｏｊＬＬ第ｌ図 手続補正書 ８．補正の内容 （１） 明ＩＩ中、 第 ４頁第 １行目に ｒＣＳＦ 」 とある を ｌ　ＣＳＡ 』 に補正する。 ■ 明ＩＩＩ中、 第１８頁を別紙の通り補正する。 １，事件の表示 平成１年特許願第１０９５４＠ ２． 発明の名称 ヒトヘバトーム細胞系によるコ〇二一形成促進因子（Ｃ
ＳＦＳ）の構成性産土 ３．袖正をする者 事件との関係

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）コロニー形成促進因子（ＣＳＦｓ）細胞で馴化し
   たならし培地の製造方法であつて、ヘパトーム細胞系Ｈ
   Ａ２２Ｔ／ＶＧＨを普通培地で培養し、それによつてＣ
   ＳＦタンパク質を産生させ且つ前記普通培地中に放出せ
   しめることを含む方法。
2. （２）ならし培地を製造するための前記培養ステップを
   、空気中に５％のＣＯ＿２を含んだ湿潤雰囲気下でのイ
   ンキュベーションによって実施する請求項１に記載の方
   法。
3. （３）１２．４〜２９Ｋｄの分子量をもつ請求項１に記
   載の培地中に含まれたＣＳＦタンパク質。
4. （４）見掛け分子量が２２．５３Ｋｄである請求項３に
   記載のＣＳＦタンパク質。
5. （５）Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦを含むＧＭ−ＣＳＦ
   ｓからなる請求項３又は４に記載のＣＳＦタンパク質。
6. （６）ＧＭ−ＣＳＦからなる請求項５に記載のタンパク
   質。
7. （７）ヒト骨髄前駆細胞を刺激して、顆粒球、単球、顆
   粒単球及び好酸球を含む４つのタイプのコロニーを形成
   させることができる請求項３に記載のＣＳＦタンパク質
   。
8. （８）ヒト骨髄細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ成長を刺激する
   方法であって、培地をヒトヘパトーム細胞系ＨＡ２２Ｔ
   ／ＶＧＨで馴化し、このならし培地にヒト骨髄細胞を接
   種し、得られた培養物をインキュベートすることを含む
   方法。
9. （９）前記培地がＧＭ−ＣＳＦｓを含むことを特徴とす
   る請求項８に記載の方法。
10. （１０）ヒトヘパトーム細胞系ＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨの培
    養によって得た、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで骨髄細胞を成長さ
    せるためのＣＳＦ含有培地。
11. （１１）分子量が１２．４〜２９ＫｄのＣＳＦタンパク
    質を含む請求項１０に記載の培地。