JPH0322985A - 酵母酸性ホスファターゼシグナル配列を用いる酵母宿主によるヒト血清アルブミンａの製造 - Google Patents
酵母酸性ホスファターゼシグナル配列を用いる酵母宿主によるヒト血清アルブミンａの製造Info
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- JPH0322985A JPH0322985A JP15668889A JP15668889A JPH0322985A JP H0322985 A JPH0322985 A JP H0322985A JP 15668889 A JP15668889 A JP 15668889A JP 15668889 A JP15668889 A JP 15668889A JP H0322985 A JPH0322985 A JP H0322985A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は戒熟ヒト血清アルプミン八の酵母による製造方
法、及びそのための遺伝子系に関する．この方法によれ
ば成熟型のヒト血清アルブミンＡが細胞外に分泌される
ため、その回収・精製が簡単となり、工業的製造のため
に極めて好ましい。
法、及びそのための遺伝子系に関する．この方法によれ
ば成熟型のヒト血清アルブミンＡが細胞外に分泌される
ため、その回収・精製が簡単となり、工業的製造のため
に極めて好ましい。
今まで、遺伝子工学的方法によりヒト血清アルブミンを
製造するための方法として、大腸菌を用いる方法（Ｌａ
ｋｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｉ＋
６１０３−６１１４， １９８１； Ｌａｔｔａ等、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５ ＋ １３０９−１３１
４． （１９８７） ；特開昭５８−１５０５１７）
、枯草菌を用いる方法（Ｓａｕｎｄｅｒｓ等、Ｊ．Ｒａ
ｃｔｅｒｉｏｌ， １６９＋２９１７−２９２５． （
１９Ｂ？） ） 、及び酵母を用いる方法（Ｅ ｔｃｈ
ｅｖｅｒｒｙ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉ，
？２６−７３０，（１９８６） ）が知られている．し
かしながら、これらの方法により製造される血清アルブ
ミンは正常なヒト血清アルブミンとはアミノ酸配列を幾
分異にし、また生産された血清アルブミンは不溶化沈澱
となったり、シグナルペブチドのプロセシング効率が低
い、細胞外への分泌が困難である、等の問題点を有する
と報告されている。
製造するための方法として、大腸菌を用いる方法（Ｌａ
ｋｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｉ＋
６１０３−６１１４， １９８１； Ｌａｔｔａ等、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５ ＋ １３０９−１３１
４． （１９８７） ；特開昭５８−１５０５１７）
、枯草菌を用いる方法（Ｓａｕｎｄｅｒｓ等、Ｊ．Ｒａ
ｃｔｅｒｉｏｌ， １６９＋２９１７−２９２５． （
１９Ｂ？） ） 、及び酵母を用いる方法（Ｅ ｔｃｈ
ｅｖｅｒｒｙ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉ，
？２６−７３０，（１９８６） ）が知られている．し
かしながら、これらの方法により製造される血清アルブ
ミンは正常なヒト血清アルブミンとはアミノ酸配列を幾
分異にし、また生産された血清アルブミンは不溶化沈澱
となったり、シグナルペブチドのプロセシング効率が低
い、細胞外への分泌が困難である、等の問題点を有する
と報告されている。
（発明が解決しようとする課Ｂ）
従って、本発明は戒熟ヒト血清アルブ藁ンＡを可溶性の
形で、且つ天然血清アルブミンＡと同じ立体構造におい
て細胞外又はペリプラズム空間に分泌せしめ、あるいは
細胞内に蓄積せしめ、これによって回収・精製を容易に
することにより大量のヒト血清アルブミンを工業的に製
造することができる方法を提供しようとするものである
。
形で、且つ天然血清アルブミンＡと同じ立体構造におい
て細胞外又はペリプラズム空間に分泌せしめ、あるいは
細胞内に蓄積せしめ、これによって回収・精製を容易に
することにより大量のヒト血清アルブミンを工業的に製
造することができる方法を提供しようとするものである
。
上記の目的を達成するため、本発明は（１）酵母酸性ホ
スファターゼＰＨ０５シグナル配列をコードしているＤ
ＮＡ配列と該ＤＮＡ配列の下流に存在するヒト血清アル
ブミンＡをコードするｃＤＮＡとを有するＤＮＡ； （
２）酵母酸性ホスファターゼＰＨ０５シグナル配列をコ
ードしているＤＮＡ配列、ヒト血清アルブミンＡをコー
ドするｃＤＮＡ、及びポリ（Ａ）配列をこの順序で有す
るＤＮＡ； （３）酵母で機能し得るプロモーターと
ター≧ネーターとの間に前記（２）に記載のＤＮＡが発
現可能な方向に挿入されている発現プラスミド； （４
）前記（３）に記載の発現ベクターにより形質転換され
た酵母；及び（５）前記（４）に記載の酵母を培養し、
成熟ヒト血清アルブミンＡを産生・分泌せしめ、これを
採取することを特徴とする成熟ヒト血清アルプ旦ンＡの
製造方法を提供する。
スファターゼＰＨ０５シグナル配列をコードしているＤ
ＮＡ配列と該ＤＮＡ配列の下流に存在するヒト血清アル
ブミンＡをコードするｃＤＮＡとを有するＤＮＡ； （
２）酵母酸性ホスファターゼＰＨ０５シグナル配列をコ
ードしているＤＮＡ配列、ヒト血清アルブミンＡをコー
ドするｃＤＮＡ、及びポリ（Ａ）配列をこの順序で有す
るＤＮＡ； （３）酵母で機能し得るプロモーターと
ター≧ネーターとの間に前記（２）に記載のＤＮＡが発
現可能な方向に挿入されている発現プラスミド； （４
）前記（３）に記載の発現ベクターにより形質転換され
た酵母；及び（５）前記（４）に記載の酵母を培養し、
成熟ヒト血清アルブミンＡを産生・分泌せしめ、これを
採取することを特徴とする成熟ヒト血清アルプ旦ンＡの
製造方法を提供する。
（具体的な記載）
Ｉ．這猛ヱ系
征一土
正常ヒト血清アルブミンは分子内に多くのジスルフィド
結合を含有しており、組換えＤＮＡ法によって天然物と
同じ立体構造を有する正常ヒト血清アルブミンを製造す
るには、これらのジスルフィド結合が生産宿主細胞中で
正しく形威されることが必須である。正常な立体構造の
形戒にはプロテインジスルフィドイソメラーゼ、ペブチ
ジルブロリルｃｉｓ− ｔｒａｎｓイソメラーゼ等の酵
素が関与していることが最近明らかになり、多数のＳ−
Ｓ結合を有し複雑な立体構造をとる蛋白質を殆ど含まな
い大腸菌や枯草菌のような原核生物細胞ではたとえあっ
てもこのような立体横造形戒（フォールディング）関連
酵素系の働きは強くないことが予想される．一方、ヒト
をはじめとする真核高等生物の細胞は数多くの複雑な高
次構造を有する蛋白質（糖蛋白質や他の修飾蛋白質も含
む）を細胞外に分泌することが知られているが、下等真
核微生物である酵母菌でも、咄乳動物の細胞で蛋白質が
分泌されるのと非常によく似た経路により蛋白質が分泌
されることが知られている（Ｈｕｆｆａｋｅｒ，Ｔ．Ｃ
，ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ， ＰＪ．Ｊ．Ｂｉｏ１
、Ｃｈｅｅ＋．ｌｆｑヱ， ３２０３−３２１０（１
９８２）； Ｓｒ＋ｉｄｅｒ＋ Ｍ．Ｄ． ｉｎ Ｇｉ
ｎｓｂｕｒｇ， Ｖ． ＆ Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ，Ｗ．
（ｅｄｓ．） Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅｓ， Ｖｏ１、２．Ｗｌｌｅｙ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， （１９８４）， ｐｐ．１６３−１９８
） ．このため本発明においては宿主として酵母を使用
する。
結合を含有しており、組換えＤＮＡ法によって天然物と
同じ立体構造を有する正常ヒト血清アルブミンを製造す
るには、これらのジスルフィド結合が生産宿主細胞中で
正しく形威されることが必須である。正常な立体構造の
形戒にはプロテインジスルフィドイソメラーゼ、ペブチ
ジルブロリルｃｉｓ− ｔｒａｎｓイソメラーゼ等の酵
素が関与していることが最近明らかになり、多数のＳ−
Ｓ結合を有し複雑な立体構造をとる蛋白質を殆ど含まな
い大腸菌や枯草菌のような原核生物細胞ではたとえあっ
てもこのような立体横造形戒（フォールディング）関連
酵素系の働きは強くないことが予想される．一方、ヒト
をはじめとする真核高等生物の細胞は数多くの複雑な高
次構造を有する蛋白質（糖蛋白質や他の修飾蛋白質も含
む）を細胞外に分泌することが知られているが、下等真
核微生物である酵母菌でも、咄乳動物の細胞で蛋白質が
分泌されるのと非常によく似た経路により蛋白質が分泌
されることが知られている（Ｈｕｆｆａｋｅｒ，Ｔ．Ｃ
，ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ， ＰＪ．Ｊ．Ｂｉｏ１
、Ｃｈｅｅ＋．ｌｆｑヱ， ３２０３−３２１０（１
９８２）； Ｓｒ＋ｉｄｅｒ＋ Ｍ．Ｄ． ｉｎ Ｇｉ
ｎｓｂｕｒｇ， Ｖ． ＆ Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ，Ｗ．
（ｅｄｓ．） Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅｓ， Ｖｏ１、２．Ｗｌｌｅｙ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， （１９８４）， ｐｐ．１６３−１９８
） ．このため本発明においては宿主として酵母を使用
する。
之Ｌ±止Ｌ剋
ブレブロ配列をリーダー配列としてアξノ末端側に配置
した形でヒト血清アルブミンＡを酵母菌内で産生させ、
酵母菌細胞の保有するプロセシングシステムにより成熟
ヒト血清アルプミンＡを生じさせるためには、２段階の
正確なプロセシングが起きなければならない．これらの
プロセシングは酵母菌自体のシステムを直接利用してい
るので、外来性の前駆体タンパク質であるヒト血清アル
プミンＡのリーダー配列のプロセシングよりもインベル
ターゼ、酸性ホスファターゼ、ＭＦα１タンパク質のよ
うな酵母菌前駆体タンパク質のリーダー配列のプロセシ
ングの方が正確かつ高い効率で起こる可能性がある．も
し成熟ヒト血清アルブミンがブレブロ配列のついた前駆
体構造からでなくシグナルベプチドのみが結合したプレ
蛋白質の形で産生でき、しかもその成熟タンパク質が分
泌されれば、タンパク賞のプロセシングの過程が一つで
すみ、酵母菌タンパク賞のシグナルベプチドと異種タン
パク質の融合したキメラタンパク賞の酵母菌内での発現
においてよくみられる不都合な部位での切断が起きる可
能性を低減できるものと考えられる。この目的にあうシ
グナルペブチドは酵母菌で分泌されうるタンパク質のも
のならなんでもよく酵母菌のタンパク質のみならず異種
のタンパク賞のシグナルベブチドでも使用できる．本発
明においてはベリブラスムタンパク質としてよく知られ
ている酸性ホスファターゼのシグナルベブチドを利用す
る．酸性ホスファターゼはプレタンパク賞の形で酵母菌
内で合威され、小胞体膜でシグナルベブチダーゼにより
シグナルベブチドの切断を受けたのち、形質膜を通過し
てペリブラスムまで移行するタンパク質である．酸性ホ
スファターゼのシグナルベブチドをコードするＤＮＡは
合或することができ、これを戒熟ヒト血清アルブミンＡ
をコードする， ｃＤＮＡ配列に直結させた形で酵母菌
内で発現を行うことができる。このシグナルベブチドの
例を実施例ｌに示す． 互』″ ル′ミンＡＵＭ ヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）
はすでにクローン化されており、その塩基配列及び該塩
基配列から推定されるアミノ酸配列は、特願昭６３ −
０３７４５３に詳細に記載されている。
した形でヒト血清アルブミンＡを酵母菌内で産生させ、
酵母菌細胞の保有するプロセシングシステムにより成熟
ヒト血清アルプミンＡを生じさせるためには、２段階の
正確なプロセシングが起きなければならない．これらの
プロセシングは酵母菌自体のシステムを直接利用してい
るので、外来性の前駆体タンパク質であるヒト血清アル
プミンＡのリーダー配列のプロセシングよりもインベル
ターゼ、酸性ホスファターゼ、ＭＦα１タンパク質のよ
うな酵母菌前駆体タンパク質のリーダー配列のプロセシ
ングの方が正確かつ高い効率で起こる可能性がある．も
し成熟ヒト血清アルブミンがブレブロ配列のついた前駆
体構造からでなくシグナルベプチドのみが結合したプレ
蛋白質の形で産生でき、しかもその成熟タンパク質が分
泌されれば、タンパク賞のプロセシングの過程が一つで
すみ、酵母菌タンパク賞のシグナルベプチドと異種タン
パク質の融合したキメラタンパク賞の酵母菌内での発現
においてよくみられる不都合な部位での切断が起きる可
能性を低減できるものと考えられる。この目的にあうシ
グナルペブチドは酵母菌で分泌されうるタンパク質のも
のならなんでもよく酵母菌のタンパク質のみならず異種
のタンパク賞のシグナルベブチドでも使用できる．本発
明においてはベリブラスムタンパク質としてよく知られ
ている酸性ホスファターゼのシグナルベブチドを利用す
る．酸性ホスファターゼはプレタンパク賞の形で酵母菌
内で合威され、小胞体膜でシグナルベブチダーゼにより
シグナルベブチドの切断を受けたのち、形質膜を通過し
てペリブラスムまで移行するタンパク質である．酸性ホ
スファターゼのシグナルベブチドをコードするＤＮＡは
合或することができ、これを戒熟ヒト血清アルブミンＡ
をコードする， ｃＤＮＡ配列に直結させた形で酵母菌
内で発現を行うことができる。このシグナルベブチドの
例を実施例ｌに示す． 互』″ ル′ミンＡＵＭ ヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）
はすでにクローン化されており、その塩基配列及び該塩
基配列から推定されるアミノ酸配列は、特願昭６３ −
０３７４５３に詳細に記載されている。
従って本発明においては、このｃＤＮＡを含有するプラ
スξドρＤＣ − ＨＳＡ − Ｃ｝Ｉ等をヒト血清ア
ルブミンＡをコードする遺伝子の供給源とし７て使用す
ることができる．なお、これらのプラスミドの作製方法
を参考例として後記する． ボ富Ａ びＡＡＴＡＡＡシグ ル コード配列の３′ 一末端の下流に存在するボリＡ配列
及びＡＡＴＡＡ＾シグナルが真核生物のａＩＩＲＮＡの
安定性に寄与すると言われている（Ｂｅｒｇｍａｎｎ及
びＢｒａｗｅｒｍａｎ Ｂｆｏｃｈｅｓ＋ｉ＊ｔｒｙ
ｔ 上ｆｉ， ２５９−２６４（１９７７）ｉＨｕ
ｅｚら、Ｐｒｏｃ ． Ｎａ ｔ １ ．＾ｃａｄ．ｓ
ｃｉ． ＩＩｓ＾． ７８， ９０８−９１１（１９８
１） ） ．従って、本発明の好ましい態様においては
、ヒト血清アルプミンＡをコードするｃＤＮＡの下流に
これらの配列を配置する．ボリＡ配列及びＡＡＴＡＡＡ
シグナルとしては、例えばヒト血清アルブミンＡｅＤＮ
Ａに自然に付随しているこれらの配列を使用することが
できる．これらの配列を含有するヒト血清アルブミンＡ
遺伝子はすでにクローン化されており、特願昭６３ −
０３７４５３に記載されている．これらの配列の供給
源として例えばλｇｔｌｌ（ＨＳＡ４＾）を使用するこ
とができ、その作製方法を参考例において後記する． １旦至二ｌ二 本発明においては、酵母細胞中で機能するものであれば
いずれのプロモーターを使用することもできる．しかし
ながら本発明においては誘導可能なプロモーターではな
く構成的プロモーターを使用するのが好ましい．誘導可
能なプロモーターを使用して誘導操作を行った場合には
ヒト血清アルブミンが細胞内に急激に蓄積し、分子間ジ
スルフィド結合が形威されて非天然型の立体構造を有す
る分子が生成する可能性があるからである．弱い誘発性
を示すか又は構戒性の酵母プロモーターの内、強力な活
性を持つものとしては、例えば、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ＡＤＨ Ｉ ）プロモーター、グリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモー
ター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧκ）プロ
モーターがあり、本発明においては、ＡＤＨ Ｉプロモ
ーターを例にとって具体的に説明する． 酵母＾ＤＨＩ遺伝子（ＡＤＣＩ ）を含む約２，１００
塩基対の領域の塩基配列が既に決定されており、ＡＤＨ
１をコードする約１．１００塩基対の配列の他に７５
０塩基対の５′側非翻訳配列と３２０塩基対の３′側非
翻訳配列が判明している（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ． Ｊお
よびＨａｌｌ， Ｂ．Ｊ．ＢＩｏ１、Ｃｈｅｍ．
２５７， ３０１８−３０２５（１９８２）） ．
転写においてＲＮＡボリメラーゼによるｍｔＪ＆配列と
考えられているＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボッ
クス（ＴＡＴＡボックス）は翻訳開始コドンＡＴＧの１
２８塩基上涜（−１２８の位Ｗ）にあり、ＡＤＨ ｒプ
ロモーター活性は−４１０の位置にあるＳｐｈｌ認！？
＋部位より上流を欠失させても失われないといわれてい
る（Ｂｅｉｅｒ，Ｄ．及びＹｏｕｎｇ，↑．， Ｎａｔ
ｕｒｅ史曵， ７２４−７２８（１９Ｂ２） ） ．Ａ
ＤＩＩ Ｉプロモーターによる転写物は通常の酵母菌で
全ポリ（Ａ）ＲＮＡの少なくとも１％に達する［Ａａｎ
ｅｒｅｒ＋ Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ１
、 王，Ｑｌ， １９２−２０１（１９８３））
． ，え：〕」２二Ｌ二 転写における読み越し（ ｒｅａｄ− ｔｈｒｏｕｇｈ
）により遺伝子生成物の量が減少する例が報告されて
いる〔例えば、Ｚａｒｅｔ＋ Ｋ．Ｓ．及びＳｈｅｒｍ
ｅｎ． Ｆ．． Ｃｅｌｌ鼎， ５６３−５７３． （
１９８２） ） ．この現象を防止するためには発現さ
れるべき構造遺伝子の下流にターミネーターを設けるの
が好ましい．酵母ター逅ネーターを外来遺伝子の下流に
配置し、遺伝子の発現を上昇させた例としてはたとえば
ＰＧＫプロモーター／夕一竃ネーターからなるサンドイ
ンチベクターを用いて子牛キモシンを発現させた実験が
あり、夕一ξネーターの導入により数倍〜十倍程度の発
現上昇が報告されている（ＭｅｌｌｏｒらＧｅｎｅ ２
４＋１−１４（１９８３） ） ．このような目的のた
めのターミネーターとしてはさまざまな遺伝子由来のも
のが使用でき、たとえばＴＲＰ５（｝リブトファン合戒
酵素）遺伝子やＣＹＣＩ（イソ−１−チトクロームＣ）
遺伝子などのターξネーターが利用されている。
スξドρＤＣ − ＨＳＡ − Ｃ｝Ｉ等をヒト血清ア
ルブミンＡをコードする遺伝子の供給源とし７て使用す
ることができる．なお、これらのプラスミドの作製方法
を参考例として後記する． ボ富Ａ びＡＡＴＡＡＡシグ ル コード配列の３′ 一末端の下流に存在するボリＡ配列
及びＡＡＴＡＡ＾シグナルが真核生物のａＩＩＲＮＡの
安定性に寄与すると言われている（Ｂｅｒｇｍａｎｎ及
びＢｒａｗｅｒｍａｎ Ｂｆｏｃｈｅｓ＋ｉ＊ｔｒｙ
ｔ 上ｆｉ， ２５９−２６４（１９７７）ｉＨｕ
ｅｚら、Ｐｒｏｃ ． Ｎａ ｔ １ ．＾ｃａｄ．ｓ
ｃｉ． ＩＩｓ＾． ７８， ９０８−９１１（１９８
１） ） ．従って、本発明の好ましい態様においては
、ヒト血清アルプミンＡをコードするｃＤＮＡの下流に
これらの配列を配置する．ボリＡ配列及びＡＡＴＡＡＡ
シグナルとしては、例えばヒト血清アルブミンＡｅＤＮ
Ａに自然に付随しているこれらの配列を使用することが
できる．これらの配列を含有するヒト血清アルブミンＡ
遺伝子はすでにクローン化されており、特願昭６３ −
０３７４５３に記載されている．これらの配列の供給
源として例えばλｇｔｌｌ（ＨＳＡ４＾）を使用するこ
とができ、その作製方法を参考例において後記する． １旦至二ｌ二 本発明においては、酵母細胞中で機能するものであれば
いずれのプロモーターを使用することもできる．しかし
ながら本発明においては誘導可能なプロモーターではな
く構成的プロモーターを使用するのが好ましい．誘導可
能なプロモーターを使用して誘導操作を行った場合には
ヒト血清アルブミンが細胞内に急激に蓄積し、分子間ジ
スルフィド結合が形威されて非天然型の立体構造を有す
る分子が生成する可能性があるからである．弱い誘発性
を示すか又は構戒性の酵母プロモーターの内、強力な活
性を持つものとしては、例えば、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ＡＤＨ Ｉ ）プロモーター、グリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモー
ター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧκ）プロ
モーターがあり、本発明においては、ＡＤＨ Ｉプロモ
ーターを例にとって具体的に説明する． 酵母＾ＤＨＩ遺伝子（ＡＤＣＩ ）を含む約２，１００
塩基対の領域の塩基配列が既に決定されており、ＡＤＨ
１をコードする約１．１００塩基対の配列の他に７５
０塩基対の５′側非翻訳配列と３２０塩基対の３′側非
翻訳配列が判明している（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ． Ｊお
よびＨａｌｌ， Ｂ．Ｊ．ＢＩｏ１、Ｃｈｅｍ．
２５７， ３０１８−３０２５（１９８２）） ．
転写においてＲＮＡボリメラーゼによるｍｔＪ＆配列と
考えられているＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボッ
クス（ＴＡＴＡボックス）は翻訳開始コドンＡＴＧの１
２８塩基上涜（−１２８の位Ｗ）にあり、ＡＤＨ ｒプ
ロモーター活性は−４１０の位置にあるＳｐｈｌ認！？
＋部位より上流を欠失させても失われないといわれてい
る（Ｂｅｉｅｒ，Ｄ．及びＹｏｕｎｇ，↑．， Ｎａｔ
ｕｒｅ史曵， ７２４−７２８（１９Ｂ２） ） ．Ａ
ＤＩＩ Ｉプロモーターによる転写物は通常の酵母菌で
全ポリ（Ａ）ＲＮＡの少なくとも１％に達する［Ａａｎ
ｅｒｅｒ＋ Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ１
、 王，Ｑｌ， １９２−２０１（１９８３））
． ，え：〕」２二Ｌ二 転写における読み越し（ ｒｅａｄ− ｔｈｒｏｕｇｈ
）により遺伝子生成物の量が減少する例が報告されて
いる〔例えば、Ｚａｒｅｔ＋ Ｋ．Ｓ．及びＳｈｅｒｍ
ｅｎ． Ｆ．． Ｃｅｌｌ鼎， ５６３−５７３． （
１９８２） ） ．この現象を防止するためには発現さ
れるべき構造遺伝子の下流にターミネーターを設けるの
が好ましい．酵母ター逅ネーターを外来遺伝子の下流に
配置し、遺伝子の発現を上昇させた例としてはたとえば
ＰＧＫプロモーター／夕一竃ネーターからなるサンドイ
ンチベクターを用いて子牛キモシンを発現させた実験が
あり、夕一ξネーターの導入により数倍〜十倍程度の発
現上昇が報告されている（ＭｅｌｌｏｒらＧｅｎｅ ２
４＋１−１４（１９８３） ） ．このような目的のた
めのターミネーターとしてはさまざまな遺伝子由来のも
のが使用でき、たとえばＴＲＰ５（｝リブトファン合戒
酵素）遺伝子やＣＹＣＩ（イソ−１−チトクロームＣ）
遺伝子などのターξネーターが利用されている。
強力なプロモーターが関与する転写の場合、読み越しを
防ぐために強力なターミネーターがその下流に配置され
ている方が発現の制ａｌｌに好都合と考えられる．この
ため本発明においては例えば強力なプロモーターを有す
る遺伝子のターミネーターであるＡＤＨ Ｉターξネー
ター、ＧＡＰター累ネーター等を用いるのが好ましい． 一玄ｌ二叉素 以上、本発明の発現ブラスξド中に含有される、発現に
直接関連する要素について説明したが、本発明の発現ブ
ラスξドは、さらに、酵母複製起点及び標識遺伝子を含
有しなければならない．酵母複製起点としては、例えば
酵母由来の２μプラスミドＤＮＡの複製起点等を使用す
ることができる．標識遺伝子としては、宿主に薬剤耐性
を付与する遺伝子、宿主の栄養要求性を補完する遺伝子
等、常用の標識遺伝子を用いることができる．さらに、
プラスξドの組換え操作の際にプラスξドの複製を大腸
菌中で行わせる必要があるため、本発明のプラス泉ドは
大腸菌複製起点及び標識遺伝子を含有するシャトルベク
ターであることが好ましい．この様な、シャトルベクタ
ーとしての基本的要件を備えたベクターとして市販のプ
ラス旦ドｐＪＤＢ２０７等を用いることができる．この
プラスミド９ＪＤＢ２０７仲の酵母標識遺伝子は、ロイ
シン生合成酵素であるβ−イソブロビルリンゴ酸脱水素
酵素をコードするＬＥＤ ２遺伝子である． Ａ里工孟去まヱ 従って本発明の好ましい発現プラスミドにおいては、酵
母複製起点及び標識遺伝子並びに大腸菌複製起点及び標
識遺伝子を含んでなるシャトルベクターに、プロモータ
ー、プレ配列をコードするリーダー配列が連結されたヒ
ト血清アルブミンＡをコードする遺伝子、ボリＡ配列及
びターミネーターがこの順序で挿入されている． ２。塁１藍盪 本発明のプラスミドによる宿主酵母の形質転換は常法に
従って行うことができ、その具体例を実施例４に記載す
る． ヒト血清アルブミンｃＤＮＡを含んだ発現プラスξドに
より形質転換された宿主酵母菌は通常の酵母の培養法に
より培養できる．たとえばＹＰＤのような天然完全培地
やＳＤ培地に１％の酵母エキスを加えたような不完全合
威培地でも培養できる．培養後細胞外に分泌されたヒト
血清アルブミンの回収は種々の方法で可能である。エタ
ノール、アセトン、硫酸アンモニウムなどによる分別沈
澱、等電点沈澱、限外ろ過などによる濃縮及び部分精製
を行った後に各種クロマトグラフィーや上記部分精製法
を組み合わせれば高度に分泌ヒト血清アルブ竃ンが精製
されることが期待できる．〔発明の効果〕 本発明によれば、正確にプロセスされた成熟ヒト血清ア
ルブミンＡを効率よく細胞外に分泌させることができる
．そして細胞外に分泌されたヒト血清アルブミンＡはそ
のままの形で培地から回収でき、精製に使用できる．ま
た細胞内に不溶性の抗ヒト血清アルブミンＡ抗体と反応
するタンパク質を多量に蓄積できる．このものはシグナ
ルベプチドが結合したままのＰＨ０５シグナルベブチド
ーヒト血清アルプミンＡの形の前駆体構造と考えられる
．細胞内に蓄積した前駆体タンパク賞は、抽出した後、
酵母菌のみならず大腸菌や噛乳類細胞由来のシグナルベ
プチダーゼを作用させることにより、試験管内で成熟Ｈ
ＳＡに変換することも可能である． 次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る．酵素反応は次の条件下で行った．ＥｃｏＲＩ （
ニッポンジーン；ｌ２ユニット／ｄ）、Ｃｌａ！（ニュ
ーイングランドバイオラブス；５ユニット／Ｊ） 、ｔ
ｌｉｎｄｌ［Ｉ （ニッポンジーン：１２ユニット／ｄ
）、Ｘｈｏｌ（宝酒造；ｌ２ユニット／〆）、及びＢａ
ｓｉＨＩ （二７ボンジーン：３５ユニット／ｉ１ｌ）
によるＤＮＡの消化ＩＮＡ１＊，酵素１一、及びＩＯＸ
ＥｃｏＲ Ｉ緩衝液（ Ｉ Ｈ Ｔｒｉｓ−｝１ｃＩ
（ｐＨ ７． ５ ），１００ｍＭ ＭｇＣＩｔ．
５００ａｅＭ ＮａＣ１ ） ３ ＩＩ１に滅菌蒸留水
を加えて３０バとする．３７゜Ｃ，１時間保温して切断
を完了させる，Ｓａｉｌ（ニッポンジーン．１５ユニッ
ト／Ｉｌｌ）及びＸｂａｌ（ニッポンジーン；１５ユニ
ット／ｄ）の場合はｔＯＸ ＥｃｏＲ Ｉ Ｅｌ衝液の
代わりニ１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７．
５）． ７ ０ａ＋Ｍ ＭｇＣ】．？．７５Ｍ ＮａＣ
ｔ ， ７ ０ｍＭ ２−メルヵブトエタノール、２■
Ｍ ＥＤＴＡ ， ０． １％ウシ血清アルブミンを使
用し、またＨｐａ ＩＩ （Ｍｓｐ ｒ ） （ニッポ
ンジーン；１２２ニット／Ｉｔ１）の場合は１００ａｉ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７． ５），１００ｌＩ
＋ＭＭｇＣｌｇ． ６ ０ ｓ＋Ｍ ＮａＣ１を使用し
、ｓｓａｌ（ニッポンジーン；１５ユニット／ｍ） （
７）場合ハ２００ｍＭ ＫＣＩ，６ ０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．９ ） ． ６ ０
ｍＭ ＭｇＣＩｚをＩＯＸＥｃｏＲ Ｉ ｉｌ衝液の
代りに使用する。
防ぐために強力なターミネーターがその下流に配置され
ている方が発現の制ａｌｌに好都合と考えられる．この
ため本発明においては例えば強力なプロモーターを有す
る遺伝子のターミネーターであるＡＤＨ Ｉターξネー
ター、ＧＡＰター累ネーター等を用いるのが好ましい． 一玄ｌ二叉素 以上、本発明の発現ブラスξド中に含有される、発現に
直接関連する要素について説明したが、本発明の発現ブ
ラスξドは、さらに、酵母複製起点及び標識遺伝子を含
有しなければならない．酵母複製起点としては、例えば
酵母由来の２μプラスミドＤＮＡの複製起点等を使用す
ることができる．標識遺伝子としては、宿主に薬剤耐性
を付与する遺伝子、宿主の栄養要求性を補完する遺伝子
等、常用の標識遺伝子を用いることができる．さらに、
プラスξドの組換え操作の際にプラスξドの複製を大腸
菌中で行わせる必要があるため、本発明のプラス泉ドは
大腸菌複製起点及び標識遺伝子を含有するシャトルベク
ターであることが好ましい．この様な、シャトルベクタ
ーとしての基本的要件を備えたベクターとして市販のプ
ラス旦ドｐＪＤＢ２０７等を用いることができる．この
プラスミド９ＪＤＢ２０７仲の酵母標識遺伝子は、ロイ
シン生合成酵素であるβ−イソブロビルリンゴ酸脱水素
酵素をコードするＬＥＤ ２遺伝子である． Ａ里工孟去まヱ 従って本発明の好ましい発現プラスミドにおいては、酵
母複製起点及び標識遺伝子並びに大腸菌複製起点及び標
識遺伝子を含んでなるシャトルベクターに、プロモータ
ー、プレ配列をコードするリーダー配列が連結されたヒ
ト血清アルブミンＡをコードする遺伝子、ボリＡ配列及
びターミネーターがこの順序で挿入されている． ２。塁１藍盪 本発明のプラスミドによる宿主酵母の形質転換は常法に
従って行うことができ、その具体例を実施例４に記載す
る． ヒト血清アルブミンｃＤＮＡを含んだ発現プラスξドに
より形質転換された宿主酵母菌は通常の酵母の培養法に
より培養できる．たとえばＹＰＤのような天然完全培地
やＳＤ培地に１％の酵母エキスを加えたような不完全合
威培地でも培養できる．培養後細胞外に分泌されたヒト
血清アルブミンの回収は種々の方法で可能である。エタ
ノール、アセトン、硫酸アンモニウムなどによる分別沈
澱、等電点沈澱、限外ろ過などによる濃縮及び部分精製
を行った後に各種クロマトグラフィーや上記部分精製法
を組み合わせれば高度に分泌ヒト血清アルブ竃ンが精製
されることが期待できる．〔発明の効果〕 本発明によれば、正確にプロセスされた成熟ヒト血清ア
ルブミンＡを効率よく細胞外に分泌させることができる
．そして細胞外に分泌されたヒト血清アルブミンＡはそ
のままの形で培地から回収でき、精製に使用できる．ま
た細胞内に不溶性の抗ヒト血清アルブミンＡ抗体と反応
するタンパク質を多量に蓄積できる．このものはシグナ
ルベプチドが結合したままのＰＨ０５シグナルベブチド
ーヒト血清アルプミンＡの形の前駆体構造と考えられる
．細胞内に蓄積した前駆体タンパク賞は、抽出した後、
酵母菌のみならず大腸菌や噛乳類細胞由来のシグナルベ
プチダーゼを作用させることにより、試験管内で成熟Ｈ
ＳＡに変換することも可能である． 次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る．酵素反応は次の条件下で行った．ＥｃｏＲＩ （
ニッポンジーン；ｌ２ユニット／ｄ）、Ｃｌａ！（ニュ
ーイングランドバイオラブス；５ユニット／Ｊ） 、ｔ
ｌｉｎｄｌ［Ｉ （ニッポンジーン：１２ユニット／ｄ
）、Ｘｈｏｌ（宝酒造；ｌ２ユニット／〆）、及びＢａ
ｓｉＨＩ （二７ボンジーン：３５ユニット／ｉ１ｌ）
によるＤＮＡの消化ＩＮＡ１＊，酵素１一、及びＩＯＸ
ＥｃｏＲ Ｉ緩衝液（ Ｉ Ｈ Ｔｒｉｓ−｝１ｃＩ
（ｐＨ ７． ５ ），１００ｍＭ ＭｇＣＩｔ．
５００ａｅＭ ＮａＣ１ ） ３ ＩＩ１に滅菌蒸留水
を加えて３０バとする．３７゜Ｃ，１時間保温して切断
を完了させる，Ｓａｉｌ（ニッポンジーン．１５ユニッ
ト／Ｉｌｌ）及びＸｂａｌ（ニッポンジーン；１５ユニ
ット／ｄ）の場合はｔＯＸ ＥｃｏＲ Ｉ Ｅｌ衝液の
代わりニ１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７．
５）． ７ ０ａ＋Ｍ ＭｇＣ】．？．７５Ｍ ＮａＣ
ｔ ， ７ ０ｍＭ ２−メルヵブトエタノール、２■
Ｍ ＥＤＴＡ ， ０． １％ウシ血清アルブミンを使
用し、またＨｐａ ＩＩ （Ｍｓｐ ｒ ） （ニッポ
ンジーン；１２２ニット／Ｉｔ１）の場合は１００ａｉ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７． ５），１００ｌＩ
＋ＭＭｇＣｌｇ． ６ ０ ｓ＋Ｍ ＮａＣ１を使用し
、ｓｓａｌ（ニッポンジーン；１５ユニット／ｍ） （
７）場合ハ２００ｍＭ ＫＣＩ，６ ０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．９ ） ． ６ ０
ｍＭ ＭｇＣＩｚをＩＯＸＥｃｏＲ Ｉ ｉｌ衝液の
代りに使用する。
バクテリアアルカリ性ホスファターゼ処理＝ＤＮＡ１ｇ
、制限酵素ｆ！ｃｏＲ Ｉ又は旧ｎｄｌｎ各々１ｔｌｌ
及びＩＯＸ ＲｃｏＲ ｌ緩衝液２ｐに滅菌蒸留水を加
えて２０ｐ１とし、３７゜Ｃで１時間保温した後、９０
″０１５分間加熱して酵素を失活させる．次に滅菌蒸留
水３８Ｉ１１、バクテリアアルカリ性ホスファターゼ２
ｍ（宝酒造０．５ユニット／ｌ１ｌ）を加えて３７゜Ｃ
、１時間保温した後、フェノール抽出を行い、得られた
水層をエタノール沈澱に用いる． Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ処理：たとえばベクターＤＮＡ
１μｇ、ベクターＤＮＡと等モル量のＤＮＡフラグメン
ト、ＩＯＸリガーゼａ街液（６６０ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−
｝ｒｃｌ（ｐＨ７。５ ） ， ６ ６ｍＭ Ｍｇｃ
ｈ， １００−ジチオスライトール、ｌ■ＭＡＴＰ〕
３Ｉ１１及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｌＩ１（宝酒造、
約４００ユニット／ハ）に滅菌蒸留水を加えて３０ｄと
しｌ６゜Ｃで一晩保温する．フラグメントのＴ４ボリヌ
クレオチドキナーゼによる５′−リン酸化： ５ ０
−Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ ７． ６ ），１０
−Ｍけｇｃ１！、５鶴汽ジチオスライトーノレ、０．２
ｍＭ＾ＴＰを含有する溶液（２５Ｉ１１）中でＤＮＡフ
ラグメントの各々の分量（約３ ０ ｐｓｏｌｅｓ）を
６ユニットのＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）
で３７℃、６０分間処理することにより５′端をリン酸
化する．リン酸化されたフラグメントを含む溶液を混ぜ
（計１００ｍ）１００゜Ｃの水浴に５分間放置した後室
温で放冷しアニーリングを行う．２ＩＩＩのＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを加え１６゜Ｃで一晩保温し、フラグメント
間を連結し、二本鎖フラグメントとする。
、制限酵素ｆ！ｃｏＲ Ｉ又は旧ｎｄｌｎ各々１ｔｌｌ
及びＩＯＸ ＲｃｏＲ ｌ緩衝液２ｐに滅菌蒸留水を加
えて２０ｐ１とし、３７゜Ｃで１時間保温した後、９０
″０１５分間加熱して酵素を失活させる．次に滅菌蒸留
水３８Ｉ１１、バクテリアアルカリ性ホスファターゼ２
ｍ（宝酒造０．５ユニット／ｌ１ｌ）を加えて３７゜Ｃ
、１時間保温した後、フェノール抽出を行い、得られた
水層をエタノール沈澱に用いる． Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ処理：たとえばベクターＤＮＡ
１μｇ、ベクターＤＮＡと等モル量のＤＮＡフラグメン
ト、ＩＯＸリガーゼａ街液（６６０ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−
｝ｒｃｌ（ｐＨ７。５ ） ， ６ ６ｍＭ Ｍｇｃ
ｈ， １００−ジチオスライトール、ｌ■ＭＡＴＰ〕
３Ｉ１１及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｌＩ１（宝酒造、
約４００ユニット／ハ）に滅菌蒸留水を加えて３０ｄと
しｌ６゜Ｃで一晩保温する．フラグメントのＴ４ボリヌ
クレオチドキナーゼによる５′−リン酸化： ５ ０
−Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ ７． ６ ），１０
−Ｍけｇｃ１！、５鶴汽ジチオスライトーノレ、０．２
ｍＭ＾ＴＰを含有する溶液（２５Ｉ１１）中でＤＮＡフ
ラグメントの各々の分量（約３ ０ ｐｓｏｌｅｓ）を
６ユニットのＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）
で３７℃、６０分間処理することにより５′端をリン酸
化する．リン酸化されたフラグメントを含む溶液を混ぜ
（計１００ｍ）１００゜Ｃの水浴に５分間放置した後室
温で放冷しアニーリングを行う．２ＩＩＩのＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを加え１６゜Ｃで一晩保温し、フラグメント
間を連結し、二本鎖フラグメントとする。
二本ｉＩＩＤＮＡフラグメントの５′−リン酸化もアニ
ーリング反応の前までの操作と同様に行う．大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ反応：ＤＮＡ１ｘ、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ （Ｈｅｎｏ−フラグメント、宝酒造３．５ユニ
ット／Ｉ）Ｉ Ｊ， １ｍＭ ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ． ＴＴＰの混合物）ｌｊ１１及
びＩＯＸＩ衝液（７ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ − Ｈ
Ｃ１（ｐＨ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ，
２００ｍＭＮａＣ１． ７ ０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ）
３ ｔｄに滅菌蒸留水を加えて全量を３０１１１とし、
３７℃で３０分間保温する。
ーリング反応の前までの操作と同様に行う．大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ反応：ＤＮＡ１ｘ、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ （Ｈｅｎｏ−フラグメント、宝酒造３．５ユニ
ット／Ｉ）Ｉ Ｊ， １ｍＭ ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ． ＴＴＰの混合物）ｌｊ１１及
びＩＯＸＩ衝液（７ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ − Ｈ
Ｃ１（ｐＨ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ，
２００ｍＭＮａＣ１． ７ ０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ）
３ ｔｄに滅菌蒸留水を加えて全量を３０１１１とし、
３７℃で３０分間保温する。
ブローブの標ｖａ：
ＩＩ４の合戒ＤＮＡ，５０μＣｉのγ一”Ｐ−ＡＴＰ水
溶液（３０００Ｃｉ／ ｖｕｓｏｌ ）、（ ５ ０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７．５） ． １ ０
ｓＭ ＭｇＣＩｚ， ５ｍＭ ＤＴＴ， １ ０ユニッ
トＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を含む１０
Ｉｌ！の溶液を３７゜ＣでＩ時間反応後、未反応のヌク
レオチドをＮ ｉｃｋ−ｃｏｌｕｍｎ （ファルマシア
）ヲ用い、メーカーのプロトコールにのっとり除き、”
Ｐｒｙ識されたＤＮＡを得る（ ｌ ＸＩＯ”ｃｐｍ／
ＩＲＤＮＡ／４００〆）． ハイブリダイゼーション： ＤＮＡを固定した膜をハイブリダイゼーション液（６
ＸＳＳＣ（ Ｉ ＸＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０
．０１５Ｍクｘン酸ナトリウム、ｐ｝１７．０）、５Ｘ
デンハート液（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％
フイコール、０．１％ポリビニルビロリドン）、０．５
％ＳＤＳ ，１００ｕｇ変性サケ精子ＤＮＡ．）１０ｄ
中で、４２℃、３時間保温する．液を捨て、プローブを
ＩＸＩＯ’ｃｐｓ＋／ｄ加えたハイフ゛リダイゼーシッ
ン液１０ｄを加え、８０″Ｃ、３分保温する．次に、４
２゛ｃで一夜保温する．液を捨て、膜を２ＸＳＳＣによ
り室温で５分洗い、さらに２ＸＳＳＣにょり６０”Ｃで
３０分洗う． なお、酵素反応によりブラス巣ドを作製する場合には、
その酵素反応混合物を用いて大腸菌Ｉｆ Ｂ Ｉ Ｑ
１を常法に従って形質転換し、大腸菌標識遺伝子に依存
して適切な常法により形質転換体を選択し、目的とする
プラスミドを含有するクローンを例えばよニブレバレー
シッン法により形質転換体から抽出したＤＮＡを種々の
制限酵素で切断して電気泳動法により分析する方法（た
とえばＭａｎｌａｔｉｓ，Ｔ． Ｆｒｉｒｓｃｈ， Ｅ
＋ Ｆ， ＆ Ｓａ＠ｂｒｏｏｋ， Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ １９Ｂ２）により選択した．そし
て選択されたクローンを培養し、菌体から常法に従って
プラスミドＤＮＡを抽出することにより、所望の組換え
ブラスａドを増幅・回収した．この方法は組換え操作の
各段階により必要に応じて行った．戚 次の配列を有する２種類のオリゴヌクレオチド：ＡＡＴ
ＡＡＡＣＡＡＣＡ［ｉＡＴＴＴＡＡＡｌ；Ａ’ｒ１、ｉ
を、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ．Ｄ．及びＣａｒｕｔｈ
ｅｒｓ， Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ ２１， ７１９（１９８０）に記載されている
ホスホアξダイト法により、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐ
ｌｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＋モデル３８０Ｂ ）
を用いて合威した．この２つのオリゴヌクレオチドをア
ニールさせ、酸性ホスファターゼシグナルベブチドをコ
ードする一個の二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖ＤＮＡ
は下記の構造を有する． Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔ
ｙｒ ＳｅｒＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＴＴ ＡＡＡ
ＴＣＴ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＡＴ ＴＣＡＧ ＴＡＣ
ＡＡＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＴＡ Ａ
ＧＴ［！ｃｏＲ Ｉ ｌｉｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ＾１’Ｔ
ＴＴＡ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＴＧ
ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＧＧＣＴＡＡ ＡＡ
Ｔ ＣＧＧ ＣＧＡ ＡＧ＾ ＾ＡＣ ＣＧＧ
ＴＴＡ ＣＧＧ ＣＣＧＨｐａ ＩＩ ５′一末端にはＥｃｏＲ Ｉの粘着末端配列を配置し、
３′末端は平滑末端としてある．＾ｌａ−Ｇｌｙの３′
末端側の配列のためのＤＮＡはＮａｅ Ｉ及びＨｐａ
ＩＩサイトを設けるために各々のコドンの３番目のヌク
レオチドをそれぞれ置換してある（ＧＣＡ−＋ＧＣＣ
．ＧＧＴ→ＧＧＣ） ，酸性ホスファターゼのシグナ
ルベプチドは１７番目のアラニンまでの配列である．合
成した酸性ホスファターゼシグナルベプチドをコードす
るＤＮＡの５′末端をＴ４ボリヌクレオチドキナーゼに
よりりん酸化した後、ｐＵｃ１８のマルチクローニング
サイトに存在するＥｃｏＲ ＩとＳｍａｌｌｍｌｍ配列
を二重消化して得られた、２．６ｋｂのフラグメントと
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＵｃ−ＰＨ０
５ブラス亙ドを得た．これよりＥｃｏＲ ＩとＨｐａ
■の二重消化により５５ｂｐの酸性ホスファファターゼ
シグナルベブチドをコードするＤＮＡ部分を切り出、し
た．これを成熟ヒト血清アルブミンＡの全構造遺伝子と
３′一非翻訳領域を含む配列を有するｐｔｌｃ１８を基
礎とした組換えプラスξドｐ（ＩＣ−ＨＳＡ−ＣＩ （
参考例２）をＥｃｏＲ ｌとＣｌａ Ｉで二本消化して
得られる４．４ｋｂのフラグメントと連結し、酸性ホス
ファターゼシグナルベブチドと成熟ヒト血清アルブミン
Ａとが直接つながった融合タンパク賞をコードできるＤ
ＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐＵｃ−ＰＨ０５−Ｕ
ＳＡ作戒をした．叉益班又 ブースミ′の 作成した組換えプラスミドｐＵｃ−ＰＨ０５−ＵＳＡの
ＢｃｏＲ Ｉサイトに、両端にＥｃｏＲ Ｉ粘着末端を
有し、内部のＸｈｏｌサイトを有する という配列の合威リンカー（Ｅｃｏ−Ｘｈｏ−Ｅｃｏリ
ンカー）を挿入し、また構造遺伝子の下流に位置するＨ
ｉｎｄｌＩＩサイトに、ヒト血清アルブ友ンＡｃＤＮＡ
配列の３′一非翻訳領域（ボリＡ付加シグナル及びボＪ
Ａ配列を含む）を含む旧ｎｄｍフラグメント（約２００
ｂｐ）をｍ換えプラスミドｐＵｃ−｝ＩＳＡ−１’
（参考例４）より切り出し挿入して、ａ換えプラス箋ド
ｐＵｃ−Ｘ−ＰＨ０５−ＩＳＡ一Ａを得た．コノプラス
ミドをＸｈｏＩとＢａｗｌ Ｎで二重消化して得られた
２．０ｋｂのフラグメントを、酵母菌アルコールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＣＩ）のプロモーターとターξ
ネーターを含む酵母菌用発現ベクター１）１８６−１０
−Ｎｅｏ−ＡＴＥ（参考例８）のＸｔ＋ｏ ｌ −Ｂａ
ｍ｝ｌ Ｉフラグメント（８．Ｎｃｂ）と連結し、酸性
ホスファターゼシグナルベブヂドと成熟ヒト血清アルブ
２ンＡとの融合タンパク質を産生ずるための発現組換え
プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＩＩ−ＬＹ５−ＩＳＡ−Ａを
作威した． このブラス逅ドを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ
剋旦［８１０１／ｐＪ［）Ｂ−ＡＤＨ−ＬＹ５−ＩＳＡ
−Ａは、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条
寄第２４５６号（ＰＩ！ＲＭ ＢＰ−２４５６）として
１９８９年６月８日にブダペスト条約に基き国際寄託さ
れた． 発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤｉ｛−ＬＹ５−［１３＾
−＾による酵母菌ＡＨ２２の形質転換を基本的には橋本
英明、木村光〔発酵と工業，４，！． ６３０−６３７
（１９８５） ） １７） Ｋ Ｕ Ｒ 法ニ従い、少
し改良した方法によって行った。まずＹＰＤ培地（２％
ポリベブトン（Ｄｉｒｃｏ）、１％酵母エキス（Ｄｉｒ
ｃｏ） 、２％グルコース）５ｄにＡＨ２２株（ＭＡＴ
ａ． １ｅｕ２−３． ｌｅｕ２−１１２． ｈｉｓ４
−５１９． Ｃａｎｌ）のＹＰＤ培地による一晩培養液
０． １ ｄを加え３０℃で約４時間（濁度が００ ６
００で０． ５に達するまで）振盪培養を行った．４゜
Ｃで２． ００Ｏｒｐｍ、５分間の遠心を行い集菌し、
菌体を５． ０一の０． １ ？ＩＬｉＳＣＨに懸濁し
、そのうち１． ５ ｄを分取し、２．００Ｏｒｐｍ、
５分間または１０， ＯＯＯｒｐｍ＋、１分間の遠心で
集菌した。
溶液（３０００Ｃｉ／ ｖｕｓｏｌ ）、（ ５ ０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７．５） ． １ ０
ｓＭ ＭｇＣＩｚ， ５ｍＭ ＤＴＴ， １ ０ユニッ
トＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を含む１０
Ｉｌ！の溶液を３７゜ＣでＩ時間反応後、未反応のヌク
レオチドをＮ ｉｃｋ−ｃｏｌｕｍｎ （ファルマシア
）ヲ用い、メーカーのプロトコールにのっとり除き、”
Ｐｒｙ識されたＤＮＡを得る（ ｌ ＸＩＯ”ｃｐｍ／
ＩＲＤＮＡ／４００〆）． ハイブリダイゼーション： ＤＮＡを固定した膜をハイブリダイゼーション液（６
ＸＳＳＣ（ Ｉ ＸＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０
．０１５Ｍクｘン酸ナトリウム、ｐ｝１７．０）、５Ｘ
デンハート液（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％
フイコール、０．１％ポリビニルビロリドン）、０．５
％ＳＤＳ ，１００ｕｇ変性サケ精子ＤＮＡ．）１０ｄ
中で、４２℃、３時間保温する．液を捨て、プローブを
ＩＸＩＯ’ｃｐｓ＋／ｄ加えたハイフ゛リダイゼーシッ
ン液１０ｄを加え、８０″Ｃ、３分保温する．次に、４
２゛ｃで一夜保温する．液を捨て、膜を２ＸＳＳＣによ
り室温で５分洗い、さらに２ＸＳＳＣにょり６０”Ｃで
３０分洗う． なお、酵素反応によりブラス巣ドを作製する場合には、
その酵素反応混合物を用いて大腸菌Ｉｆ Ｂ Ｉ Ｑ
１を常法に従って形質転換し、大腸菌標識遺伝子に依存
して適切な常法により形質転換体を選択し、目的とする
プラスミドを含有するクローンを例えばよニブレバレー
シッン法により形質転換体から抽出したＤＮＡを種々の
制限酵素で切断して電気泳動法により分析する方法（た
とえばＭａｎｌａｔｉｓ，Ｔ． Ｆｒｉｒｓｃｈ， Ｅ
＋ Ｆ， ＆ Ｓａ＠ｂｒｏｏｋ， Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ １９Ｂ２）により選択した．そし
て選択されたクローンを培養し、菌体から常法に従って
プラスミドＤＮＡを抽出することにより、所望の組換え
ブラスａドを増幅・回収した．この方法は組換え操作の
各段階により必要に応じて行った．戚 次の配列を有する２種類のオリゴヌクレオチド：ＡＡＴ
ＡＡＡＣＡＡＣＡ［ｉＡＴＴＴＡＡＡｌ；Ａ’ｒ１、ｉ
を、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ．Ｄ．及びＣａｒｕｔｈ
ｅｒｓ， Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ ２１， ７１９（１９８０）に記載されている
ホスホアξダイト法により、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐ
ｌｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＋モデル３８０Ｂ ）
を用いて合威した．この２つのオリゴヌクレオチドをア
ニールさせ、酸性ホスファターゼシグナルベブチドをコ
ードする一個の二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖ＤＮＡ
は下記の構造を有する． Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔ
ｙｒ ＳｅｒＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＴＴ ＡＡＡ
ＴＣＴ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＡＴ ＴＣＡＧ ＴＡＣ
ＡＡＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＴＡ Ａ
ＧＴ［！ｃｏＲ Ｉ ｌｉｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ＾１’Ｔ
ＴＴＡ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＴＧ
ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＧＧＣＴＡＡ ＡＡ
Ｔ ＣＧＧ ＣＧＡ ＡＧ＾ ＾ＡＣ ＣＧＧ
ＴＴＡ ＣＧＧ ＣＣＧＨｐａ ＩＩ ５′一末端にはＥｃｏＲ Ｉの粘着末端配列を配置し、
３′末端は平滑末端としてある．＾ｌａ−Ｇｌｙの３′
末端側の配列のためのＤＮＡはＮａｅ Ｉ及びＨｐａ
ＩＩサイトを設けるために各々のコドンの３番目のヌク
レオチドをそれぞれ置換してある（ＧＣＡ−＋ＧＣＣ
．ＧＧＴ→ＧＧＣ） ，酸性ホスファターゼのシグナ
ルベプチドは１７番目のアラニンまでの配列である．合
成した酸性ホスファターゼシグナルベプチドをコードす
るＤＮＡの５′末端をＴ４ボリヌクレオチドキナーゼに
よりりん酸化した後、ｐＵｃ１８のマルチクローニング
サイトに存在するＥｃｏＲ ＩとＳｍａｌｌｍｌｍ配列
を二重消化して得られた、２．６ｋｂのフラグメントと
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＵｃ−ＰＨ０
５ブラス亙ドを得た．これよりＥｃｏＲ ＩとＨｐａ
■の二重消化により５５ｂｐの酸性ホスファファターゼ
シグナルベブチドをコードするＤＮＡ部分を切り出、し
た．これを成熟ヒト血清アルブミンＡの全構造遺伝子と
３′一非翻訳領域を含む配列を有するｐｔｌｃ１８を基
礎とした組換えプラスξドｐ（ＩＣ−ＨＳＡ−ＣＩ （
参考例２）をＥｃｏＲ ｌとＣｌａ Ｉで二本消化して
得られる４．４ｋｂのフラグメントと連結し、酸性ホス
ファターゼシグナルベブチドと成熟ヒト血清アルブミン
Ａとが直接つながった融合タンパク賞をコードできるＤ
ＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐＵｃ−ＰＨ０５−Ｕ
ＳＡ作戒をした．叉益班又 ブースミ′の 作成した組換えプラスミドｐＵｃ−ＰＨ０５−ＵＳＡの
ＢｃｏＲ Ｉサイトに、両端にＥｃｏＲ Ｉ粘着末端を
有し、内部のＸｈｏｌサイトを有する という配列の合威リンカー（Ｅｃｏ−Ｘｈｏ−Ｅｃｏリ
ンカー）を挿入し、また構造遺伝子の下流に位置するＨ
ｉｎｄｌＩＩサイトに、ヒト血清アルブ友ンＡｃＤＮＡ
配列の３′一非翻訳領域（ボリＡ付加シグナル及びボＪ
Ａ配列を含む）を含む旧ｎｄｍフラグメント（約２００
ｂｐ）をｍ換えプラスミドｐＵｃ−｝ＩＳＡ−１’
（参考例４）より切り出し挿入して、ａ換えプラス箋ド
ｐＵｃ−Ｘ−ＰＨ０５−ＩＳＡ一Ａを得た．コノプラス
ミドをＸｈｏＩとＢａｗｌ Ｎで二重消化して得られた
２．０ｋｂのフラグメントを、酵母菌アルコールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＣＩ）のプロモーターとターξ
ネーターを含む酵母菌用発現ベクター１）１８６−１０
−Ｎｅｏ−ＡＴＥ（参考例８）のＸｔ＋ｏ ｌ −Ｂａ
ｍ｝ｌ Ｉフラグメント（８．Ｎｃｂ）と連結し、酸性
ホスファターゼシグナルベブヂドと成熟ヒト血清アルブ
２ンＡとの融合タンパク質を産生ずるための発現組換え
プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＩＩ−ＬＹ５−ＩＳＡ−Ａを
作威した． このブラス逅ドを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ
剋旦［８１０１／ｐＪ［）Ｂ−ＡＤＨ−ＬＹ５−ＩＳＡ
−Ａは、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条
寄第２４５６号（ＰＩ！ＲＭ ＢＰ−２４５６）として
１９８９年６月８日にブダペスト条約に基き国際寄託さ
れた． 発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤｉ｛−ＬＹ５−［１３＾
−＾による酵母菌ＡＨ２２の形質転換を基本的には橋本
英明、木村光〔発酵と工業，４，！． ６３０−６３７
（１９８５） ） １７） Ｋ Ｕ Ｒ 法ニ従い、少
し改良した方法によって行った。まずＹＰＤ培地（２％
ポリベブトン（Ｄｉｒｃｏ）、１％酵母エキス（Ｄｉｒ
ｃｏ） 、２％グルコース）５ｄにＡＨ２２株（ＭＡＴ
ａ． １ｅｕ２−３． ｌｅｕ２−１１２． ｈｉｓ４
−５１９． Ｃａｎｌ）のＹＰＤ培地による一晩培養液
０． １ ｄを加え３０℃で約４時間（濁度が００ ６
００で０． ５に達するまで）振盪培養を行った．４゜
Ｃで２． ００Ｏｒｐｍ、５分間の遠心を行い集菌し、
菌体を５． ０一の０． １ ？ＩＬｉＳＣＨに懸濁し
、そのうち１． ５ ｄを分取し、２．００Ｏｒｐｍ、
５分間または１０， ＯＯＯｒｐｍ＋、１分間の遠心で
集菌した。
得られた菌体を２ ＭＬｉＳＣＮ １ ０ ｊ１１、５
０％Ｐ已Ｇ４０００４６Ｉｌ！に再懸濁し、そこにｌｉ
のＤＮＡ溶液（５〜１０ｎのＤＮＡを含む）を加え、３
０℃で一晩保温した。その懸濁液に１一の滅菌蒸留水を
加えゆるくボルテックスξキサーにて振盪した。
０％Ｐ已Ｇ４０００４６Ｉｌ！に再懸濁し、そこにｌｉ
のＤＮＡ溶液（５〜１０ｎのＤＮＡを含む）を加え、３
０℃で一晩保温した。その懸濁液に１一の滅菌蒸留水を
加えゆるくボルテックスξキサーにて振盪した。
次に２． ００Ｏｒｐｍ、５分間または１０．０００ｒ
ｐｓ＋ ， １分間の遠心を行い、得られた菌体を１０
０４の滅菌蒸留水に再懸濁し、選択用の寒天培地（ＳＤ
培地＝２０１４／−アデニン硫酸塩、２０躍／ｄアルギ
ニン塩酸塩、２０ｔｎｒ／ｄメチオニン、２０ｇ／−ヒ
スチジン塩酸塩、２ ０ ｎ／ｄ トリプトファン、２
０雌／−ウラシル、３０ｌａ／ｄイソロイシン、３０ｎ
／ｙｄリジン塩酸塩、３０ｓ／ａｔチロシン、５０ｎ／
−フエニルアラニン、 １５０趨／−バリン、０，１５
％アａノ酸不含イースト・ニトロゲン・ベース（Ｏｆｆ
ｃｏ） 、０． ５％硫酸アンモニウム、２％デキスト
ロースに１．５％の寒天を加えたもの〕にまいた．生じ
たコロニー（Ｌｅｕ“）をＳＤ培地５耐に懸濁し、２日
間３０゛Ｃで振盪培養した。２． ＯＯＯｒｐｇＩｓ分
間、４゜Ｃでの遠心により集菌し、菌体を０．５献のＩ
Ｍソルビトールに再懸濁し、遠心後、菌体を０． ５
ｄのＬＭソルビトール、０．１％２−メルカブトエタノ
ール、４００Ｎ／ｄのザイモリエース（Ｚｙｓｏｌｙａ
ｓｅ−１００７生化学工業）に再懸濁した。
ｐｓ＋ ， １分間の遠心を行い、得られた菌体を１０
０４の滅菌蒸留水に再懸濁し、選択用の寒天培地（ＳＤ
培地＝２０１４／−アデニン硫酸塩、２０躍／ｄアルギ
ニン塩酸塩、２０ｔｎｒ／ｄメチオニン、２０ｇ／−ヒ
スチジン塩酸塩、２ ０ ｎ／ｄ トリプトファン、２
０雌／−ウラシル、３０ｌａ／ｄイソロイシン、３０ｎ
／ｙｄリジン塩酸塩、３０ｓ／ａｔチロシン、５０ｎ／
−フエニルアラニン、 １５０趨／−バリン、０，１５
％アａノ酸不含イースト・ニトロゲン・ベース（Ｏｆｆ
ｃｏ） 、０． ５％硫酸アンモニウム、２％デキスト
ロースに１．５％の寒天を加えたもの〕にまいた．生じ
たコロニー（Ｌｅｕ“）をＳＤ培地５耐に懸濁し、２日
間３０゛Ｃで振盪培養した。２． ＯＯＯｒｐｇＩｓ分
間、４゜Ｃでの遠心により集菌し、菌体を０．５献のＩ
Ｍソルビトールに再懸濁し、遠心後、菌体を０． ５
ｄのＬＭソルビトール、０．１％２−メルカブトエタノ
ール、４００Ｎ／ｄのザイモリエース（Ｚｙｓｏｌｙａ
ｓｅ−１００７生化学工業）に再懸濁した。
３０℃で３０分間保温後、生成したスフェロブラストを
遠心（２， ＯＯＯｒｐｓ＋、５分間）して集め、１０
０βの溶液Ｉ（５０ｓ＋Ｍグルコース、ｌ Ｏｄ ＥＤ
ＴＡ ，２ ５ ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐＨ ８
． ０ ））に再懸濁し、次に２００４の溶液■（Ｏ。
遠心（２， ＯＯＯｒｐｓ＋、５分間）して集め、１０
０βの溶液Ｉ（５０ｓ＋Ｍグルコース、ｌ Ｏｄ ＥＤ
ＴＡ ，２ ５ ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐＨ ８
． ０ ））に再懸濁し、次に２００４の溶液■（Ｏ。
２ＮＮａＯＨ、１％ＳＯＳ）を加え、よく混合した後、
氷上に５分間放置した． １５０ＩＩ１の５Ｍ酢酸カ
リウムを加え、よく混合し氷上に１０分間放置した後、
１５．００Ｏｒｐｍ 、５分間、４゜Ｃでの遠心を行い
、得た上清を新しいチューブに移した．等量のフェノー
ル／クロロホルム（ｌ：１混合液）を加え激しく攪拌し
、遠心（１２．００Ｏｒｐｍ＋， ５分間）して得た水
層を新しいチューブに移し、７５０４のエタノールとボ
ルテックスミキサーを用いてよく混合した．混合液を１
５．ＯＯＯｒｐｍ 、５分間遠心し、得られた沈澱に０
． ５ ｄの７０％エタノールを加えボルテックスミキ
サーを用いて振盪した後、１５．００Ｏｒｐｍ 、５分
間の遠心で沈澱を回収した．このＤＮＡの沈澱を真空中
で減圧乾燥し、次に３０ｍのＴＥ緩衝液（ １ ０ ｍ
Ｗ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８． ０ ）． １ ｓ
Ｍ ＥＤＴＡ）に溶解した．プラス逅ドｐＪＤＢ−ＡＤ
Ｈ−ＬＹ５−ＩＳＡ−＾を含むＡＨ２２の形質転換株か
ら得られたＤＮＡ標品を各種酵素（たとえば旧ｎｄｌｌ
ｌ ， Ｘｈｏ Ｉ ， Ｅ！ｃｏＲ Ｉ ＋ ８ａ
ｗＨ１ ＋ Ｓａ口など）単独または、組合せにより
制限酵素分解し、得られたフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動、ポリアクリルアξドゲル電気泳動法で分析
することによりプラスミドの構造を確認した． １蓬貫孟 に るヒ アルブ壽ン５０（
−Ｌｅｕ）培地上に生じた単一のコロニーを５．０一の
新鮮なＳＤ（−Ｌｅｕ）培地に懸濁し、３０″Ｃで２日
間振壜培養し、０ロ．。。が約２．０になった時点で培
養液のｏ． ｉ Ｍ１を５． ０ ｄのＹＰＤ培地に加
えた．これを２４時間３０℃で、ＯＤｉａ。が約３，
Ｏになるまで培養した．培養液を５．００Ｏｒｐｍ、１
０分間、４゜Ｃで遠心し、上清画分を回収した．上清画
分に等量の９９％エタノールを加え、混合した後３０分
間４℃に放置した．次に１２．００Ｏｒｐｍ ， １
０分間、４℃で遠心し、沈澱物を得た．この沈澱物を
１００ｍの１×ローディング（Ｌｏａｄｉｎｇ）緩衝液
（５％２−メルカブトエタノール、０．００２５％プロ
モフェノールブルー、２％ＳＯＳ． ０．０２５Ｍ Ｔ
ｒｌｓ−ＨＣＩ， ８％グリセロール）に溶解し、その
うち１０Ｉ１１を電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル：４〜２０％濃度勾配ゲル８４（幅）Ｘ９０
（高さ）×１．０（厚み〉（単位は閣）〕に重層して分
析した。
氷上に５分間放置した． １５０ＩＩ１の５Ｍ酢酸カ
リウムを加え、よく混合し氷上に１０分間放置した後、
１５．００Ｏｒｐｍ 、５分間、４゜Ｃでの遠心を行い
、得た上清を新しいチューブに移した．等量のフェノー
ル／クロロホルム（ｌ：１混合液）を加え激しく攪拌し
、遠心（１２．００Ｏｒｐｍ＋， ５分間）して得た水
層を新しいチューブに移し、７５０４のエタノールとボ
ルテックスミキサーを用いてよく混合した．混合液を１
５．ＯＯＯｒｐｍ 、５分間遠心し、得られた沈澱に０
． ５ ｄの７０％エタノールを加えボルテックスミキ
サーを用いて振盪した後、１５．００Ｏｒｐｍ 、５分
間の遠心で沈澱を回収した．このＤＮＡの沈澱を真空中
で減圧乾燥し、次に３０ｍのＴＥ緩衝液（ １ ０ ｍ
Ｗ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８． ０ ）． １ ｓ
Ｍ ＥＤＴＡ）に溶解した．プラス逅ドｐＪＤＢ−ＡＤ
Ｈ−ＬＹ５−ＩＳＡ−＾を含むＡＨ２２の形質転換株か
ら得られたＤＮＡ標品を各種酵素（たとえば旧ｎｄｌｌ
ｌ ， Ｘｈｏ Ｉ ， Ｅ！ｃｏＲ Ｉ ＋ ８ａ
ｗＨ１ ＋ Ｓａ口など）単独または、組合せにより
制限酵素分解し、得られたフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動、ポリアクリルアξドゲル電気泳動法で分析
することによりプラスミドの構造を確認した． １蓬貫孟 に るヒ アルブ壽ン５０（
−Ｌｅｕ）培地上に生じた単一のコロニーを５．０一の
新鮮なＳＤ（−Ｌｅｕ）培地に懸濁し、３０″Ｃで２日
間振壜培養し、０ロ．。。が約２．０になった時点で培
養液のｏ． ｉ Ｍ１を５． ０ ｄのＹＰＤ培地に加
えた．これを２４時間３０℃で、ＯＤｉａ。が約３，
Ｏになるまで培養した．培養液を５．００Ｏｒｐｍ、１
０分間、４゜Ｃで遠心し、上清画分を回収した．上清画
分に等量の９９％エタノールを加え、混合した後３０分
間４℃に放置した．次に１２．００Ｏｒｐｍ ， １
０分間、４℃で遠心し、沈澱物を得た．この沈澱物を
１００ｍの１×ローディング（Ｌｏａｄｉｎｇ）緩衝液
（５％２−メルカブトエタノール、０．００２５％プロ
モフェノールブルー、２％ＳＯＳ． ０．０２５Ｍ Ｔ
ｒｌｓ−ＨＣＩ， ８％グリセロール）に溶解し、その
うち１０Ｉ１１を電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル：４〜２０％濃度勾配ゲル８４（幅）Ｘ９０
（高さ）×１．０（厚み〉（単位は閣）〕に重層して分
析した。
泳動は泳動緩衝液（０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ８． ４ ）、０．１９２Ｍグリシン、０． １％
ＳＯＳ ）を用い、６０−Ａの定電流下６０分間行った
．同時に泳動したマーカーは卵白リゾチーム（分子量１
４．４００）、トリブシンインヒビター（分子量２１，
５００） 、炭酸脱水酵素（分子量３１，０００） 、
オバルブミン（分子量４５．０００） 、子牛血清アル
ブミン（分子量６６，２００）、ホスホリラーゼＢ（分
子量９２． ５００） （全てＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で
あった．泳動終了後、常法に従いクマシー・ブリリアン
ト・ブルーにより染色し、または以下に示すようにウエ
スタンブロッティングＩ免疫検出を行った．泳動後、分
離された蛋白質をＳａｒｔｏｒｉｕｓ社製のセミドライ
ブロッターを用いてニトロセルロースフィルター（ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ社）に移した．フィルターを、ｌ時間メタノ
ールに浸した後、５分間２ ５ ｓＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ１０．４） ／ ２ ０％メタノールに浸し
泳動ゲルと密着させた．これを上記緩衝液、及び２０％
メタノールを含む０．３ Ｍ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐ
Ｈ１０．０ ）と２ ５ｗＭ Ｔｒｉｓ−１ｔｃ１（ｐ
Ｈ９． ４ ） ／ ４ ０ｓ＋ＭＳ−アミノーｎ一カ
ブロン酸等の緩衝液に各々浸したろ紙ではさみブロッタ
ーに装着した，６Ｖの定電圧を約１． ５時間かけた後
、フィルターを３％ゼラチンを含む２ ０ ｗＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ （ｐ｝１７． ５ ）／ ５００一Ｍ
ＮａＣ１（ＴＢＳ）溶液中で３７゜Ｃ、１時間振盪した
後↑ＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で５分間振盪
することによりフィルターを洗浄した．次に抗ヒト血清
アルブミンウサギ抗体（カッペル社）を１％ゼラチンを
含むＴＢＳで２．０００倍に希釈した溶液４〇一中でフ
ィルターを室温で１晩振盪した。フィルターを０．０５
％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴ Ｂ Ｓ （ｐＨ７．
５ （Ｔ−ＴＢＳ））で５分間振盪しながら洗浄した．
この操作をもう一度繰り返した後、第二抗体（西洋ワサ
ビベルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体
、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を１％ゼラチンを含むＴＢＳで
３．０００倍に希釈した溶液４０ＩＩｌ中でフィルター
を室温で１時間振盪した．次にＴ−ＴＢＳで５分間ずつ
２回およびＴＢＳで５分間１回上述のように洗浄した．
当該バンド（ＩＳＡ ）の検出は４−クロロナフトーノ
レ３０■を１０Ｊｄのメタノーノレに溶かしたｔ容液と
ＴＢ５ ５０ｍ、３０％過酸化水素３０Ｉｔ１を混ぜた
溶液に浸漬することにより行い、発色反応は蒸留水で希
釈することにより停止させた．結果を第４図に示す． 正常ヒト血清アルブミンＡｃＤＮＡを含むクローンのブ
ラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングの
ため米国ＣＬＯＮＴＥＣ｝１社のλｇｔｌｌをベクター
として作威されたヒト肝ｃＤＮ＾ライブラリイーを用い
た。λｇｔ１１＆Ｉｌ換え体ファージを大腸菌Ｙ１０９
０を宿主として感染させ、形質転換ブラーク計５．５×
１０Ｓ個をＬＢ寒天培地上に形威させ組換えＤＮＡをメ
ンプランフィルター（ Ａｓ＋ｅｒｓｈａｍ社Ｈｙｂｏ
−ｎｄ − Ｎ）に移した後、３！Ｐ放射性同位元素で
標識した合戒オリゴヌクレオチド３種（比活性≧ｌＯ１
ｃｐ＠／ｎ）をプローブとして用いスクリーニングした
（Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔ阻
＋ １８０−１８２（１９７７）） ．この３種のブロ
ーブは各々Ｌａｗｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｋｄｓ
Ｒｅｓ ｉ． ６１０３−６１１４（１９Ｂ！） ）に
よって報告されたヒト血清アルブミンｃＤＮＡの配列の
うち５′非翻訳領域（翻訳開始のＡＴＧコドンより１２
ヌクレオチド上流からＡＴＧコドンの前のヌクレオチド
までの部分）と翻訳領域（アξノ末端のメチオニンコド
ンすなわちＡＴＧより９番目のアミノ酸ロイシンをコー
ドする部分）を含むもの（ＩＳＡ− １ ）、２４８番
目のグリシンから２６０番目のロイシンをコードするも
の（ＨＳ＾−２）、並びに５７６番目のバリンからカル
ボキシル末＠５８５番目のロイシンをコードする部分と
それに続く６ヌクレオチドから或る３′一非翻訳領域を
含むもの（ＩＳＡ− ３ ）と同じ配列である。これら
のブローブの塩基配列を第６図に示す．このブローブの
合或は自動ＤＮＡシンセサイザーにより行い、標識は（
ｒ−”Ｐ）ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いて
行った， ＩＳＡ−２で陽性のシグナルを与えた２０
０個のλｇｔｌｌクローンのうち４個のクローンからＤ
ＮＡを調製（ＢｌａｔｔｎｅｒらＳｃｉｅｎｃｅ ２０
２＋１２７９−１２８４（１９７８） ） Ｌ、これを
ＥｃｏＲ Ｉで消化し、消化物のサザーンプロットをＩ
ＳＡ−２プローブとハイブリダイズさせた（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ， Ｊ．Ｍｏ１、Ｂｆｏｌ，５０３−５１７（１
９７５） ） ．ハイブリダイズしたフラグメントは３
つのクローンから得られ各々１． ８ ｋｂ ，１．４
ｋｂ，１．３ｋｂの長さであった．このうち１． ８
ｋｂと１． ３ ｋｂの長さのフラグメントをｐｌＪｃ
１９ベクターにサブクローニングした．このサブクロー
ンをＩＳＡ−１とＨＳＡ−３を各々プローブとしてコロ
ニーハイブリダイゼーシジン（Ｇｒｕｎｓｔｅｔｒｉお
よびＨｏｇｎｅｓｓ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１、Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ｌｌ，＋ ３９６１−３９６５（１
９７５） ）によりスクリーンした．この結果ＨＳＡ
−３のみにハイブリダイズするクローンλｇｔｌｌ（｝
！ＳＡ１−Ａ）が得られた．このクローンの各種ＤＮＡ
・断片を塩基配列決定用ベクターＭ１３■ｐｌＢおよび
−ｐｌ９ＲＰ−ＤＮＡ上に移し、ダイデオキシヌクレオ
チドターξネーシッン法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｐ．， Ｎ
ｌｃｋｌｅｎ， Ｓ．およびＣｏｕｌｓｏｎ．＾．Ｒ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １
４＋５４６３−５４６７（１９７７） ）により塩基配
列を決定した．一方ＩＳＡ−２をブローブとして行った
λｇｔｌｌクローンのブラークハイプリダイゼーション
において陽性のシグナルを与えたクローンのうち２０個
についてＨＳＡ−１をブローブとして再びブラークハイ
プリダイゼーションを行い、１個の陽性のシグナルを与
えるクローンλｇｔｌｌ（ＩＳＡ − ＩＩ ）を得た
。
ｐＨ８． ４ ）、０．１９２Ｍグリシン、０． １％
ＳＯＳ ）を用い、６０−Ａの定電流下６０分間行った
．同時に泳動したマーカーは卵白リゾチーム（分子量１
４．４００）、トリブシンインヒビター（分子量２１，
５００） 、炭酸脱水酵素（分子量３１，０００） 、
オバルブミン（分子量４５．０００） 、子牛血清アル
ブミン（分子量６６，２００）、ホスホリラーゼＢ（分
子量９２． ５００） （全てＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で
あった．泳動終了後、常法に従いクマシー・ブリリアン
ト・ブルーにより染色し、または以下に示すようにウエ
スタンブロッティングＩ免疫検出を行った．泳動後、分
離された蛋白質をＳａｒｔｏｒｉｕｓ社製のセミドライ
ブロッターを用いてニトロセルロースフィルター（ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ社）に移した．フィルターを、ｌ時間メタノ
ールに浸した後、５分間２ ５ ｓＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ１０．４） ／ ２ ０％メタノールに浸し
泳動ゲルと密着させた．これを上記緩衝液、及び２０％
メタノールを含む０．３ Ｍ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐ
Ｈ１０．０ ）と２ ５ｗＭ Ｔｒｉｓ−１ｔｃ１（ｐ
Ｈ９． ４ ） ／ ４ ０ｓ＋ＭＳ−アミノーｎ一カ
ブロン酸等の緩衝液に各々浸したろ紙ではさみブロッタ
ーに装着した，６Ｖの定電圧を約１． ５時間かけた後
、フィルターを３％ゼラチンを含む２ ０ ｗＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ （ｐ｝１７． ５ ）／ ５００一Ｍ
ＮａＣ１（ＴＢＳ）溶液中で３７゜Ｃ、１時間振盪した
後↑ＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で５分間振盪
することによりフィルターを洗浄した．次に抗ヒト血清
アルブミンウサギ抗体（カッペル社）を１％ゼラチンを
含むＴＢＳで２．０００倍に希釈した溶液４〇一中でフ
ィルターを室温で１晩振盪した。フィルターを０．０５
％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴ Ｂ Ｓ （ｐＨ７．
５ （Ｔ−ＴＢＳ））で５分間振盪しながら洗浄した．
この操作をもう一度繰り返した後、第二抗体（西洋ワサ
ビベルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体
、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を１％ゼラチンを含むＴＢＳで
３．０００倍に希釈した溶液４０ＩＩｌ中でフィルター
を室温で１時間振盪した．次にＴ−ＴＢＳで５分間ずつ
２回およびＴＢＳで５分間１回上述のように洗浄した．
当該バンド（ＩＳＡ ）の検出は４−クロロナフトーノ
レ３０■を１０Ｊｄのメタノーノレに溶かしたｔ容液と
ＴＢ５ ５０ｍ、３０％過酸化水素３０Ｉｔ１を混ぜた
溶液に浸漬することにより行い、発色反応は蒸留水で希
釈することにより停止させた．結果を第４図に示す． 正常ヒト血清アルブミンＡｃＤＮＡを含むクローンのブ
ラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングの
ため米国ＣＬＯＮＴＥＣ｝１社のλｇｔｌｌをベクター
として作威されたヒト肝ｃＤＮ＾ライブラリイーを用い
た。λｇｔ１１＆Ｉｌ換え体ファージを大腸菌Ｙ１０９
０を宿主として感染させ、形質転換ブラーク計５．５×
１０Ｓ個をＬＢ寒天培地上に形威させ組換えＤＮＡをメ
ンプランフィルター（ Ａｓ＋ｅｒｓｈａｍ社Ｈｙｂｏ
−ｎｄ − Ｎ）に移した後、３！Ｐ放射性同位元素で
標識した合戒オリゴヌクレオチド３種（比活性≧ｌＯ１
ｃｐ＠／ｎ）をプローブとして用いスクリーニングした
（Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔ阻
＋ １８０−１８２（１９７７）） ．この３種のブロ
ーブは各々Ｌａｗｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｋｄｓ
Ｒｅｓ ｉ． ６１０３−６１１４（１９Ｂ！） ）に
よって報告されたヒト血清アルブミンｃＤＮＡの配列の
うち５′非翻訳領域（翻訳開始のＡＴＧコドンより１２
ヌクレオチド上流からＡＴＧコドンの前のヌクレオチド
までの部分）と翻訳領域（アξノ末端のメチオニンコド
ンすなわちＡＴＧより９番目のアミノ酸ロイシンをコー
ドする部分）を含むもの（ＩＳＡ− １ ）、２４８番
目のグリシンから２６０番目のロイシンをコードするも
の（ＨＳ＾−２）、並びに５７６番目のバリンからカル
ボキシル末＠５８５番目のロイシンをコードする部分と
それに続く６ヌクレオチドから或る３′一非翻訳領域を
含むもの（ＩＳＡ− ３ ）と同じ配列である。これら
のブローブの塩基配列を第６図に示す．このブローブの
合或は自動ＤＮＡシンセサイザーにより行い、標識は（
ｒ−”Ｐ）ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いて
行った， ＩＳＡ−２で陽性のシグナルを与えた２０
０個のλｇｔｌｌクローンのうち４個のクローンからＤ
ＮＡを調製（ＢｌａｔｔｎｅｒらＳｃｉｅｎｃｅ ２０
２＋１２７９−１２８４（１９７８） ） Ｌ、これを
ＥｃｏＲ Ｉで消化し、消化物のサザーンプロットをＩ
ＳＡ−２プローブとハイブリダイズさせた（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ， Ｊ．Ｍｏ１、Ｂｆｏｌ，５０３−５１７（１
９７５） ） ．ハイブリダイズしたフラグメントは３
つのクローンから得られ各々１． ８ ｋｂ ，１．４
ｋｂ，１．３ｋｂの長さであった．このうち１． ８
ｋｂと１． ３ ｋｂの長さのフラグメントをｐｌＪｃ
１９ベクターにサブクローニングした．このサブクロー
ンをＩＳＡ−１とＨＳＡ−３を各々プローブとしてコロ
ニーハイブリダイゼーシジン（Ｇｒｕｎｓｔｅｔｒｉお
よびＨｏｇｎｅｓｓ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１、Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ｌｌ，＋ ３９６１−３９６５（１
９７５） ）によりスクリーンした．この結果ＨＳＡ
−３のみにハイブリダイズするクローンλｇｔｌｌ（｝
！ＳＡ１−Ａ）が得られた．このクローンの各種ＤＮＡ
・断片を塩基配列決定用ベクターＭ１３■ｐｌＢおよび
−ｐｌ９ＲＰ−ＤＮＡ上に移し、ダイデオキシヌクレオ
チドターξネーシッン法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｐ．， Ｎ
ｌｃｋｌｅｎ， Ｓ．およびＣｏｕｌｓｏｎ．＾．Ｒ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １
４＋５４６３−５４６７（１９７７） ）により塩基配
列を決定した．一方ＩＳＡ−２をブローブとして行った
λｇｔｌｌクローンのブラークハイプリダイゼーション
において陽性のシグナルを与えたクローンのうち２０個
についてＨＳＡ−１をブローブとして再びブラークハイ
プリダイゼーションを行い、１個の陽性のシグナルを与
えるクローンλｇｔｌｌ（ＩＳＡ − ＩＩ ）を得た
。
これからファージＤＮＡを調製しＥｃｏＲ Ｉ消化物に
ついてＩＳＡ−１をブローブとして用いサザーンハイプ
リダイゼーションを行い、１．２５ｋｂのフラグメント
（ＩＩＳＡ− ｎ ）がブローブとハイブリダイズする
ことを確認した．このフラグメントの塩基配列をダイデ
オキシヌクレオチドターミネーション法で決定した，
ＩＳＡ−ＩＩはＩＳＡ−３プローブとは交雑しなかっ
た．この結果｝ＩＳＡ−Ｉ１はカルボキシル末端側をコ
ードする部分を欠き、ＨＳＡ Ｉ−Ａはヒト血清ルブミ
ンのアミノ末端側をコードする部分を欠き、さらに３０
４番目のセリンをコードするコドン（ＴＣＡ ）が翻訳
終止コドンのオパールコドンＴＧＡに変化していること
がわかった．この２つのＤＮＡフラグメントの制限酵素
地図を第５図に示す．酵素認識サイトの正確な位置は最
終的な塩基配列から得た． 第５図からわかるようにＨＳＡ Ｉ−Ａと｝ＩｓＡ Ｉ
Ｉの２つのＤＮＡを適当な位置（例えばＸｂａｌやＰｓ
ｔｌサイト）で切断し互いに再結合すればシグナルベブ
チドやプロ配列の結合したヒト血清アルブａンの前駆体
タンパク質の全長をコードできるｃＤＮＡを構築するこ
とができる． 豊主班ム ース箋 ” ＵＣ−ＩＳＡ−ＣＩの
７大腸菌アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシ
グナルベブチドと正常ヒト血清アルブミンＡが融合した
タンパク賞をコードするＤＮＡを含むブラスξドｐＵｃ
−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａを次の様にして造成した．ヒト
肝ｃＤＮＡライブラリイーから得たＨＳＡｃＤＮＡを含
むクローンλｇｔｌｌ（ＨＳＡ − ＩＩ ）からｆ！
ｃｏＲ ＩとＸｂａ １消化によって生じるフラグメン
トを調製し、これをｐｔｌｃ１９ブラスξドのＥｃｏＲ
ＩとＸｂａ Ｉとの二重消化物のうち大きな方のフラ
グメントとＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ組換
えブラスξドｐＵＣ−ＩＳＡ−ＥＸを構築した． このプラスミドからＡｈａ ［１とＳａｉｌの二重消化
により生ずる小さい方のフラグメントを精製した．この
フラグメントは成熟正常ヒト血清アルブミンＡタンパク
質の１２番目のＬ）＋９から３５６番目のＴｈｒまでを
コードする．戒熟正常ヒト血清アルブ泉ンＡタンパク賞
をアミノ末端からコードする遺伝子を構築するために５
′端に相当するＤＮＡ配列を、化学合威したフラグメン
ト２本をア二一ルすることにより作威した．この合威Ｄ
ＮＡ配列はアルカリ性ホスファターゼのシグナルペブチ
ドをコードするＤＮＡ配列と融合できるようにＨｐａ
ＩＩ及びＣｌａｌ酵素切断によって生ずる粘着末端配列
ＣＧを５′端側に有し成熟正常ヒト血清アルブミンＡタ
ンパク賞の１番目のアξノ酸Ａｓｐから１１番目のアξ
ノ酸Ｐｈｅをコードする配列を有している．このアニー
ルさせたＤＮＡ配列にＴ４ボリヌクレオチドキナーゼを
作用させて５′端をリン酸化させたものと、ｐｕｅ−ｕ
ｓ＾−ＥＸから生じたＡｈａ ｍ ／Ｓａｌ ！二重消
化物とを混合し、さらにこれに大腸菌のマルチコビーク
ローニングベクターの代表的なものの一つｐＡＴ １５
３（Ａｓｅｒｓｈａ一社製、Ｔｗｉｇｇ， Ａ−’．及
びＳｈｅｒｒａｔｔ， Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ ２８３ ２
１６−２１８． １９８０）のＣｌａ Ｉ／Ｓａｉｌの
二重消化物のうち大きなフラグメントと混合し、この３
者をＴ４ ＤＮＡリガーゼにより結合させ、組換えブラ
スξドｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸを得た．このプラスミド上
で正常ヒト血清アルブミンＡの１位のアミノ酸Ａｓｐか
らｌ１位のアミノ酸ＰｈｅをコードするＤＮＡ配列がつ
ながった， ｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸをＢｃｏＲ ｆ ／
Ｘｂａ Ｉで二重消化し、正常ヒト血清アルブミンＡ
の＾ｓｐ Ｉ ＮＰｈｅ３５６をコードするＤＮＡ配列
を含む小さい方のフラグメントを得た．一方ＨＳＡ−Ａ
のカルボキシル末＃Ａ＠をコードするｃＤＮＡは、ヒト
肝ｃＤＮＡライブラリイーから得たクローンλｇｔｌｌ
（ＩＳＡ Ｉ−Ａ）から外来ｃＤＮＡ配列の挿入されて
いるＥｃｏＲ １フラグメントを調製し、ｐＵｃ１８プ
ラスミドのＥｃｏＲ Ｉサイトに挿入することにより組
換えブラヌミドｐｔｌＣ−ＩＳＡ− １中にクローニン
グした．これよりＩＳＡ−．Ａの３５８番目のアミノ酸
Ｌｅｕからカルボキシル末端の５８５番目のＬｅｕをコ
ードし、さらに３′便の非翻訳頷域６２ヌクレオチドを
含むＸｂａ Ｉ ／ Ｈｉｎｄ ｍの二重消化物を調製
した．これをｐ＾↑−｝ＩＳＡ−ＣＸより得たＥｃｏＲ
Ｉ ／ Ｘｂａ Ｉ二重消化物及びｐＵｃ１Ｂのビｃ
ｏＲ １ ／旧ｎｄｌｌｌ二重消化物のうち大きなフラ
グメントと混ぜてＴ４ ＤＮＡリガーゼにより連結反応
を行い、成熟正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡ全体
を含む組換えプラスミドｐＵｃ−ＩＳＡ−ＣＩを得た． 成熟正常とト血清アルブミンＡの全アミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を
第８−ｌ図〜第８−３図に示す．次の配列を有する４種
類のオリゴヌクレオチド：１． ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡ
ＧＴＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＴＴＧ
ＴＴ２．＾ＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡ
ＴＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＧ３． Ｃ
ＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＡＧ
ＧＴＧＴ丁↑ＴＣＡＧＡＣＧ４． ＣＧＣＧＴＣＴＧＡ
ＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧを
、Ｍａｔｔｅｕｃｃｌ，Ｍ．Ｄ．及びＣａｒｕｔｂｓｒ
ｓ＋Ｍ．Ｈ．＋Ｔｅｔｒａｈｅ−ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ，１．７１９（１９８０）に記載されているホス
ホアミダイト法により、自動ＤＮＡ合戒機（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ ＢｔｏｓｙｓＬｅｓｓモデル３８０Ｂ）を用いて
合威した．オリゴヌクレオチド断片をＴ４ボリヌクレオ
チドキナーゼにより５′−リン酸化した後、アニーリン
グサしめ、次に７４ ＤＮＡリガーゼにより連結して、
ブレプロ配列をコードする一個の二本鎖ＤＮＡを得た． 正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡを含むブラスξド
ｐＵｃ−１ＩＳＡ−ＣＨ （参考例２）を制限酵素ｌ！
ｃｏＲ Ｉ及びＣｌａｌで二重消化して大きい方のフラ
グメントを得、これを前記の合或ＤＮＡとＴ４ ＤＮ＾
リガーゼにより結合させブラスａドｐＵｃ−ＨＳＡ−Ｏ
Ｈを作或した．ｐＵｃ−ＩＳＡ−ＥＨプラスミドをＥｃ
ｏＲ Ｉで処理し開環し、バクテリアアルカリ性ホスフ
ァターゼで５′−リン酸基を除去後、 の配列から或るＸｈｏ Ｉ Ｌ！！識部位を含むＸｈｏ
ｌリンカーと７４ ＤＮＡリガーゼにより結合させ環
状ブラス壽ドｐＬｌｃ−Ｘ−｝ＩＳＡを作威した．ヒト
血清アルブミンＡのｃＤＮＡの３′側領域を含有するλ
ｇｔｌｌ（ＩＳＡ−１＾）（参考例１、第５図）をＢｃ
ｏＲ Ｉにより消化してヒト血清アルブミンＡのｃＤＮ
Ａを含有するＤＮＡフラグメントを得、これをＥｃｏＲ
ｌにより切断したプラス竃ドｐｔｌｃ１Ｂに連結して
プラスミドｐＬＩＣ−ＨＳＡ− １ ’を得た．このプ
ラスミドｐｕｃ−ＩＳＡ− ｒ ’を旧ｎｄｌ［Ｉで切
断しＨＳＡのボリＡ配列及びＡＡＴＡＡＡシグナルを含
む小さい方のフラグメントを得て、これを旧ｎｄｌ処理
で開環しアルカリ性ホスファターゼで処理して末端の５
′リン酸基を除去したｐＵｃ−Ｘ−ＨＳＡ ！：組み込
みｐｌｊｃ−Ｘ−｝１５Ａ−Ａプラスミドを作威した． 皇マ貞炙 ブースミ ＪＤＢ−ＮｅＯの １
０基本となる大腸菌一酵母菌シャトルベクターとして市
販されているプラスξドｐＪＤＢ２０７ （アマシャム
）を使用した．また、Ｎｅｏ （アミノグルコシドホス
ホトランスフェラーゼ３’ （１））遺伝子源として
市販されているブラスξドｐＮＥｏ （ファルマシア）
を使用した．プラスミドｐＮＥｏを｝ＩｉｎｄＩＩｌ及
びＢｃｏＲ ｌにより二重消化し、大きい方のフラグメ
ントを得た．次に、下記の配列： ｊ！！ＪＬＬＬＬ！！ｉＩｌＬ ５ ’ −ＡＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧ
ＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＣＧＧ
ＧＣＣＣＴＣＧＡ− ５ ’を有する二本鎖オリゴヌク
レオチドを、前記ｐＮＥｏの大きい方のフラグメントに
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結・環状化してプラス
ミドｐＮｅｏ−ＰＬを得た．前記二本鎖オリゴヌクレオ
チドは５′一末端にＥｃｏＲ Ｉ粘着末端配列を有し、
３′一末端に旧ｎｄｌｍ末端を有するほか、内部に旧ｎ
ｄＩＩ［，Ｘｈｏｌ及びＳｌｌａ １部位を有する．従
って前記ブラスａドｐＮｅｏ−ＰＬはＮｅｏ遺伝子の上
流に複数の制限酵素切断部位を有する．次に、このプラ
スξドｐＮｅｏ−ＰＬをＨｔｎｄ［［及びＢａｍＨ Ｉ
により二重消化し、１．４ｋｂフラグメントを得た．ブ
ラス逅ドｐＪＤＢ２０７を旧ｎｄＩＩ［及びＢａ＋ｍＨ
Ｉにより二重消化し、２ｎ酵母複製起点及び標識遺伝
子ＬＥ［Ｉ２等を含有するベクターフラグメントを得た
．次に、これらのフラグメントをＴ４ ＤＮＡリガーゼ
により連結することによりプラスミドｐＪＤＢ−Ｎｅｏ
を得た． 酵母菌＾８２２株の染色体ＤＮＡ １００ｎを１ユニッ
トのＳａｕ３ＡＩと３７゜Ｃ、１５分反応させた（２０
０Ｉ１ｌの５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−｝ＩＣＩ（ｐＨ７．
５）， ７ｓ＋Ｍ ＭｇＣｈ，５ ０ｍＭＮａＣｌ
中３．１０ｔＩＩの０．５Ｍｌ！ＤＴ＾（ｐＨ８．０）
を加え、６５℃１０分反応させ、酵素を失活させた．５
％シ！ＩＩＩ 一ＴＥ （ＴＥ ： １ ０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ（ｐＨ７．５ ）ｌ ｍＭ
ＥＤＴＡ）と２０％シ！！ Ｉ１− Ｔ Ｅを用い、密
度勾配を全量１２ｄで作製した．この勾配の上に上記反
応液を重層し、ベツクマン社のＳＷ４１ローターを用い
、２２Ｋｒｐ−で１５時間、１６℃で遠心した．遠心後
、各分画について電気泳動を行い、１５ｋｂ〜２０ｋｂ
のフラグメントを含む百分に５０４の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム液（ｐＨ５．２）を加え、次にｌ一のエタノールを加
え、よく混合した後、−２０℃に一夜静置し、ＤＮＡを
沈澱させた．遠心（１５κｒｐｓ，５分、４℃）により
、ＤＮＡ沈渣を回収した．この沈渣を７０％エタノール
で洗った後、減圧乾燥した．以上の操作により、５Ｒの
ＤＮＡを得た．このＤＮＡ１ｓｒを２ｎのＥＭＢＬ ３
のアーム（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）、及び３５０ユ
ニットの７４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）と混ぜ、１６
℃で一夜反応させた〔反応液：１０ＩＩＩの５ ０ｍＭ
Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７． ５ ） ． １ ０
ｍＭ ＭｇＣ１ｘ．１ ０ｍＭ ＤＴＴ， １ｍＭ
ＡＴＰ） ．上記反応液ｌＩ１１を用い、ＧＩＧＡ−Ｐ
ＡＣＫ Ｐｌｕｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ， Ｉ
ＧＰ６−Ｐ）により、インビトロ・バッケージング反応
を行った．その結果、３ Ｘ １ ０’ｐｆｕの、大腸
菌Ｐ ２３９２株（ｈｓｄＲ ５１４（ｒｋ−． ｓ＋
ｋ”）＋ ｓｕｐＥ４４． ｓｕｐＦ５８， １ａｃＹ
Ｉ．ｇａｌＫ２， ｇａｌＴ２２． ｓｅｔＢ１． ｔ
ｒｐＲ５５， （Ｐ２））に感染しうるファージを得た
， １０００ｐｆｕのファージを５０ｄのＰ ２３９２
細胞に加え、３７゜Ｃで２０分反応させた後、２． ５
ｄのＬ−Ｔｏｐ−Ａｇａｒｏｓｅ （ Ｌ Ｂ培地（
ｌ％トリプトン、０．５％酵母エキス、ｌ％ＮａＣｌ）
中０．７％アガロース）と共に、直径９０ｍのＬ−プレ
ート（ＬＢ培地＋１．５％寒天）にまいた．このような
プレートを５枚用意し、３７゜Ｃにて一夜培養し、ブラ
ークを形威させた．ブラークの形成されたプレートを１
時間４℃で保存した．Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（アマシャム
）をアガロース面に密着させ、室温に２分静置した．膜
をアガロースからはがし、接着面を上に、０． ５Ｎ
ＮａＯ｝！， Ｉ Ｍ ＮａＣｌを浸した，３ＭＭフ
ィルター（Ｗｈａｔ＠ａｎ）上に５分間置いた。膜を０
． ５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐ｝１７． ２ ）
． １． ５ ＭＮａＣｌに浸した３ＭＭフィルター上
に移し、５分静置した，ｚｘｓｓｃ液で膜を洗い、風乾
させた．風乾した膜をサランラップで包み、ＵＶ照射し
、ＤＮＡを膜に固定した。この膜を、ＡＤＣ １遺伝子
の翻訳領域のアミノ末端より１０残基に相当する塩基配
列を化学合成したプローブＡＤＨ（５’ＡＴＧＴＣＴ
ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＣＴ ＣＡＡ ＡＡＡ Ｇ
ＧＴ ＧＴＴ）とハイブリダイズさせた．膜を洗浄後サ
ランラップに包み、ＸＲＡ− ５フィルム（コダック社
）に密着させ、Ｉｎｔｅｎ−ｓｉｆｙ ｓｃｒｅｅｎを
用い、− ７ ０ ”Ｃにて５時間露光させた． 現像後、ハイブリダイゼーションシグナルを与えたブラ
ークをバスツールピペットの先でかきとり、１００Ｉｉ
のＴＭ液（ＩＯＩＩＭ↑ｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ ７．
５ ）１ ０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ）に懸濁し、室温に２
０分間静置した．懸濁液０．５ｄをＩＩＲｉのＴＭ液で
希釈し、そのうち５４を前述した方法で大腸菌Ｐ ２３
９２に感染させ、直径９０謹のプレートにまきプラーク
を形威させた．形威させたブラークは、再度上記のよう
にプラークハイプリダイゼーシリンを行い、単一ブラー
クからなるポジティブクローンを得た．ポジティブブラ
ークをパスツールピペットの先でかきとり、５０ＩＩ１
のＰ ２３９２細胞に加え、３７℃で２０分間静置した
後、液を２１１１のＬＢ培地、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４に
加え、３７℃で６時間振とう培養した．クロロホルムを
１００４加え、ボルテックスミキサーにかけ完全に溶菌
させた− ２．５００ｒｐ−で５分遠心し、上清を得た
。この上清中に１０１０オーダーのファージが含まれて
いた．この上清８００Ｉ１ｆに１００パの５ＭＮａＣ１
を加え、次に５４０Ｉｌ１のイソプロバノールを加えよ
くまぜ、− ２ ０ ’Ｃで２０分間静置した．遠心し
、得た沈渣を５００ ｄの７０％エタノールで洗い、２
００ Ｊ１１のＴＥに溶解させた．１ｍ（６０ユ−’−
７ト／ハ〕のＤＮａｓｅ Ｉ （宝酒造］と、２Ｉ１１
のＩ Ｍ ＭｇＣｌｇを加え、３７℃で３０分反応させ
た． ｉｏｏＩ１１のＴＥ飽和フェノールを加え、ボ
ルテックス主キサーで混合した．１２κｒｐ園、５分遠
心し、得られた水層をフェノール／クロロホルム（１：
１）で一回抽出した．得られた水層に２０パの３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐｌ４５．２）を加え、さらに５００ Ｉ
ＩＩのエタノールを加え、遠心してＤＮＡを沈澱させた
．得られた沈渣を７０％エタノールで洗った後、減圧乾
燥させ、そして５０μのＴＥに溶解した．この操作でｌ
ｊｒｇ相当のファージＤＮＡが得られた．得られた溶液
２０ｄに、２．２〆の１０倍濃度ＥｃｏＲ Ｉ緩衝液（
０． ５Ｍ ＮａＣ１ ． ０． ５ＭＴｒｉａ−ｉ１
ｃｆ （ｐＨ７． ５ ） ， ７ ０＋ｗＭ Ｍｇ
Ｃ！ｚ）を加え、ＩＩ１１（５ユニット／ｊ１１）のＥ
ＣＯＲＩ （−’−７ボンジーン）と１バの１０■／
ｄのＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ）を加え、３７℃で１時
間反応させた．反応後、０．７％アガロース電気泳動を
行い、常法に従い、ＤＮＡバンドをＨｙｂｏｎｄ ＮＩ
ｌｌにプロッティングした，ＤＮＡの結合したＨｙｂｏ
ｎｄ−Ｎ膜は、ブラークハイブリダイゼーシツンと同一
の条件でハイブリダイゼーシッンを行った。このように
して得られたいくつかのクローンのうち、λ−ＭＤＩで
は、８．４ｋｂのＥｃｏＲ Ｉフラグメントにブローブ
が結合することが分かった．残りのＤＮＡｔＩ液のうち
２０Ｊ１！を、前述の条件下・で、ＥｃｏＲ １により
切断し、０． ７％アガロースゲル電気泳動でフラグメ
ントを分離した， ８． ４ ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグ
メントを含むアガロース断片を切り出し、グラスパウダ
ー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ”＋ Ｂｉｏ−１０１社）
により、ＤＮＡをアガロースから分離、精製した．Ｉｏ
ｎのＴＥ中に溶出されたＤＮＡを、ＢｃｏＲ Ｉで切断
したｐＵｃ１９と連結反応させ（ ３ ０ ｎｇ ｐｔ
Ｊｃ１９．５ ０＋ｌＩ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７．５） ． １ ０＋ｓＭ ＭｇＣｌｇ．
１ ０ｍＭ ＯＴＴ， １ｓＭ ＡＴＰ ．
３５０ユニットＴ４ ＤＮＡリガーゼ／３０バ中、１６
゜Ｃ、２時間）、反応液５Ｉｌ１を用いて大腸菌ＪＭ１
０７を形質転換させた．形質転換した大腸菌を５ ０
ｎ／ ａｔ Ｘ −Ｇａｌ （ ５−ブロモー４−クロ
ロー３−インドリルーβ−Ｄ−ガラクトシド）５ｍｒＰ
ＴＧ（イソブロビルーβ−Ｄ−チオガラクトビラノシド
）、５０ｘ／−アンビシリンを含むＬ−７”レート（χ
一Ｇプレート）にまき、コロニーを形或させた．発色し
ていないクローンを５ｏｎ ／ ｄアンピシリンを含む
５ＩＩ１のＬＢ培地に接種し、３７゜Ｃで一夜培養し、
菌を増殖させた．ミニプレバレーシッン法によりＤＮＡ
ｔ−ｍ製し、最終的に得られたエタノール沈澱を５（Ｊ
ｄのＴＥに溶解させた．！ｌｌ製したＤＮＡの内５ｉ！
１をＥｃｏＲ Ｉで切断し（５ ０ａＭ Ｔｒ！ｓ−｝
！Ｃｌ（ｐ｝１７． ５）， ７＊Ｍ ＭｇＣＩｇ ，
５ ０ｓＭＮａＣ１． ＬＭ／ｄ ＲＮａｓｅ＾、５
ユニットＥｃｏＲ１／１５ｍｌ、０．７％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、８，４ｋｂのＢｃｏＲ Ｉフラグメ
ントがｐＵＣに挿入されていることを確かめた．さらに
、サザーン法により、このフラグメントがプローブと結
合することを確かめた．このようにして得られたクロー
ンｐＢｃＯ８．４のＤＮＡを精製し、０． ５ ｎをＳ
ａｕ３ＡＩで完全分解し（５ ０ｌＩ？ｔ Ｔｒｌｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ７． ５ ） ， ５ ０ｍＮＮａｃ１
， ７ ｍｌｌ ＭｇＣ１ｇ、４ユニットＳａｕ３Ａ
Ｉ／ １ ５ Ｊ中、３７゜Ｃ，２時間）、０．７％ア
ガロースゲル電気泳動によりＤＮＡフラグメントを分離
した．１．６ｋｂフラグメントを含むアガロース断片よ
り、ＣｅｎｅＣ１ｅａｎ”により、ＤＮＡを１０ｍＴＥ
中に回収した． これをＢａ＊Ｈ Ｉで切断したｐｌｌｃ１１９と連結反
応させ、反応液の５４を用い、大腸菌ＭＶ１１８４を形
質転換した．形質転換した大腸菌をＸ−Ｇプレートにま
き、コロニーを形或させた．発色しないコロニーのＤＮ
Ａをミニプレバレーションで調製し、分析を行った，５
ｄＤＮＡをＥｃｏＲ ｌとＨｉｎｄ ｍで切断したもの
（５ユニットＥｃｏＲｔ，５ユニット旧ｎｄＩＩ［）、
及び６ユニットｓｐｈ Ｉで切断したものをそれぞれゲ
ル電気泳動で分析し、前者においては１．６ｋｂのフラ
グメント、後者においては、１．Ｏｋｂのフラグメント
を生ずるクローンを選別した．このようにして得られた
クローン、ｐＳａｕ １． ６のＤＮＡを調製し、以下
の実験に用いた． ＤＮＡ５贈をＳ■ａ ＩとＳａｃ Ｉで切断した〔１〇
一Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７． ５ ） ． ２ ０
−κＣｔ ， ７＋ｍ）ｉ ＭｇＣｌｇ、２０ユニット
Ｓｇｅａｌ，２０ユニットＳａｃｌ／５０バ．３７℃、
２時間〕．反応終了後、フェノールークロロホルムで抽
出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した，ＤＮＡ
沈渣を５０１１１のＥｘｏ ｍ緩衝液（５ ０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８． ０ ） ， １００ｓ
Ｍ ＮａＣ１ ，５ｄ ＭｇＣＩｘ ． １ ０ｍＭ
２−メノレカ７” ｝エタ／ −７Ｌ／）に溶解させた
．もう一本のチューブに５０バのＭＢｌｌ街液〔４０ｌ
ＩＩＭ酢酸ナトリウム｛ｐ｝ｆ４． ５ ＞、１０Ｑｍ
Ｍ ＮａＣｔ ． ２ ｍＭ ＺｎＣｌｇ ． １ ０
％グリセローノレ〕を入れ水中に置いた，ＤＮＡ液に１
８０ユニットの１！ｘｏ ｍヌクレアーゼ（宝酒造）を
加え、３７゜Ｃに保温した．酵素添加後３０秒ごとに５
ｊ１１をサンプリングし、ＭＢＩｌ衝液の入ったチュー
ブに移した。
ついてＩＳＡ−１をブローブとして用いサザーンハイプ
リダイゼーションを行い、１．２５ｋｂのフラグメント
（ＩＩＳＡ− ｎ ）がブローブとハイブリダイズする
ことを確認した．このフラグメントの塩基配列をダイデ
オキシヌクレオチドターミネーション法で決定した，
ＩＳＡ−ＩＩはＩＳＡ−３プローブとは交雑しなかっ
た．この結果｝ＩＳＡ−Ｉ１はカルボキシル末端側をコ
ードする部分を欠き、ＨＳＡ Ｉ−Ａはヒト血清ルブミ
ンのアミノ末端側をコードする部分を欠き、さらに３０
４番目のセリンをコードするコドン（ＴＣＡ ）が翻訳
終止コドンのオパールコドンＴＧＡに変化していること
がわかった．この２つのＤＮＡフラグメントの制限酵素
地図を第５図に示す．酵素認識サイトの正確な位置は最
終的な塩基配列から得た． 第５図からわかるようにＨＳＡ Ｉ−Ａと｝ＩｓＡ Ｉ
Ｉの２つのＤＮＡを適当な位置（例えばＸｂａｌやＰｓ
ｔｌサイト）で切断し互いに再結合すればシグナルベブ
チドやプロ配列の結合したヒト血清アルブａンの前駆体
タンパク質の全長をコードできるｃＤＮＡを構築するこ
とができる． 豊主班ム ース箋 ” ＵＣ−ＩＳＡ−ＣＩの
７大腸菌アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシ
グナルベブチドと正常ヒト血清アルブミンＡが融合した
タンパク賞をコードするＤＮＡを含むブラスξドｐＵｃ
−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａを次の様にして造成した．ヒト
肝ｃＤＮＡライブラリイーから得たＨＳＡｃＤＮＡを含
むクローンλｇｔｌｌ（ＨＳＡ − ＩＩ ）からｆ！
ｃｏＲ ＩとＸｂａ １消化によって生じるフラグメン
トを調製し、これをｐｔｌｃ１９ブラスξドのＥｃｏＲ
ＩとＸｂａ Ｉとの二重消化物のうち大きな方のフラ
グメントとＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ組換
えブラスξドｐＵＣ−ＩＳＡ−ＥＸを構築した． このプラスミドからＡｈａ ［１とＳａｉｌの二重消化
により生ずる小さい方のフラグメントを精製した．この
フラグメントは成熟正常ヒト血清アルブミンＡタンパク
質の１２番目のＬ）＋９から３５６番目のＴｈｒまでを
コードする．戒熟正常ヒト血清アルブ泉ンＡタンパク賞
をアミノ末端からコードする遺伝子を構築するために５
′端に相当するＤＮＡ配列を、化学合威したフラグメン
ト２本をア二一ルすることにより作威した．この合威Ｄ
ＮＡ配列はアルカリ性ホスファターゼのシグナルペブチ
ドをコードするＤＮＡ配列と融合できるようにＨｐａ
ＩＩ及びＣｌａｌ酵素切断によって生ずる粘着末端配列
ＣＧを５′端側に有し成熟正常ヒト血清アルブミンＡタ
ンパク賞の１番目のアξノ酸Ａｓｐから１１番目のアξ
ノ酸Ｐｈｅをコードする配列を有している．このアニー
ルさせたＤＮＡ配列にＴ４ボリヌクレオチドキナーゼを
作用させて５′端をリン酸化させたものと、ｐｕｅ−ｕ
ｓ＾−ＥＸから生じたＡｈａ ｍ ／Ｓａｌ ！二重消
化物とを混合し、さらにこれに大腸菌のマルチコビーク
ローニングベクターの代表的なものの一つｐＡＴ １５
３（Ａｓｅｒｓｈａ一社製、Ｔｗｉｇｇ， Ａ−’．及
びＳｈｅｒｒａｔｔ， Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ ２８３ ２
１６−２１８． １９８０）のＣｌａ Ｉ／Ｓａｉｌの
二重消化物のうち大きなフラグメントと混合し、この３
者をＴ４ ＤＮＡリガーゼにより結合させ、組換えブラ
スξドｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸを得た．このプラスミド上
で正常ヒト血清アルブミンＡの１位のアミノ酸Ａｓｐか
らｌ１位のアミノ酸ＰｈｅをコードするＤＮＡ配列がつ
ながった， ｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸをＢｃｏＲ ｆ ／
Ｘｂａ Ｉで二重消化し、正常ヒト血清アルブミンＡ
の＾ｓｐ Ｉ ＮＰｈｅ３５６をコードするＤＮＡ配列
を含む小さい方のフラグメントを得た．一方ＨＳＡ−Ａ
のカルボキシル末＃Ａ＠をコードするｃＤＮＡは、ヒト
肝ｃＤＮＡライブラリイーから得たクローンλｇｔｌｌ
（ＩＳＡ Ｉ−Ａ）から外来ｃＤＮＡ配列の挿入されて
いるＥｃｏＲ １フラグメントを調製し、ｐＵｃ１８プ
ラスミドのＥｃｏＲ Ｉサイトに挿入することにより組
換えブラヌミドｐｔｌＣ−ＩＳＡ− １中にクローニン
グした．これよりＩＳＡ−．Ａの３５８番目のアミノ酸
Ｌｅｕからカルボキシル末端の５８５番目のＬｅｕをコ
ードし、さらに３′便の非翻訳頷域６２ヌクレオチドを
含むＸｂａ Ｉ ／ Ｈｉｎｄ ｍの二重消化物を調製
した．これをｐ＾↑−｝ＩＳＡ−ＣＸより得たＥｃｏＲ
Ｉ ／ Ｘｂａ Ｉ二重消化物及びｐＵｃ１Ｂのビｃ
ｏＲ １ ／旧ｎｄｌｌｌ二重消化物のうち大きなフラ
グメントと混ぜてＴ４ ＤＮＡリガーゼにより連結反応
を行い、成熟正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡ全体
を含む組換えプラスミドｐＵｃ−ＩＳＡ−ＣＩを得た． 成熟正常とト血清アルブミンＡの全アミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を
第８−ｌ図〜第８−３図に示す．次の配列を有する４種
類のオリゴヌクレオチド：１． ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡ
ＧＴＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＴＴＧ
ＴＴ２．＾ＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡ
ＴＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＧ３． Ｃ
ＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＡＧ
ＧＴＧＴ丁↑ＴＣＡＧＡＣＧ４． ＣＧＣＧＴＣＴＧＡ
ＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧを
、Ｍａｔｔｅｕｃｃｌ，Ｍ．Ｄ．及びＣａｒｕｔｂｓｒ
ｓ＋Ｍ．Ｈ．＋Ｔｅｔｒａｈｅ−ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ，１．７１９（１９８０）に記載されているホス
ホアミダイト法により、自動ＤＮＡ合戒機（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ ＢｔｏｓｙｓＬｅｓｓモデル３８０Ｂ）を用いて
合威した．オリゴヌクレオチド断片をＴ４ボリヌクレオ
チドキナーゼにより５′−リン酸化した後、アニーリン
グサしめ、次に７４ ＤＮＡリガーゼにより連結して、
ブレプロ配列をコードする一個の二本鎖ＤＮＡを得た． 正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡを含むブラスξド
ｐＵｃ−１ＩＳＡ−ＣＨ （参考例２）を制限酵素ｌ！
ｃｏＲ Ｉ及びＣｌａｌで二重消化して大きい方のフラ
グメントを得、これを前記の合或ＤＮＡとＴ４ ＤＮ＾
リガーゼにより結合させブラスａドｐＵｃ−ＨＳＡ−Ｏ
Ｈを作或した．ｐＵｃ−ＩＳＡ−ＥＨプラスミドをＥｃ
ｏＲ Ｉで処理し開環し、バクテリアアルカリ性ホスフ
ァターゼで５′−リン酸基を除去後、 の配列から或るＸｈｏ Ｉ Ｌ！！識部位を含むＸｈｏ
ｌリンカーと７４ ＤＮＡリガーゼにより結合させ環
状ブラス壽ドｐＬｌｃ−Ｘ−｝ＩＳＡを作威した．ヒト
血清アルブミンＡのｃＤＮＡの３′側領域を含有するλ
ｇｔｌｌ（ＩＳＡ−１＾）（参考例１、第５図）をＢｃ
ｏＲ Ｉにより消化してヒト血清アルブミンＡのｃＤＮ
Ａを含有するＤＮＡフラグメントを得、これをＥｃｏＲ
ｌにより切断したプラス竃ドｐｔｌｃ１Ｂに連結して
プラスミドｐＬＩＣ−ＨＳＡ− １ ’を得た．このプ
ラスミドｐｕｃ−ＩＳＡ− ｒ ’を旧ｎｄｌ［Ｉで切
断しＨＳＡのボリＡ配列及びＡＡＴＡＡＡシグナルを含
む小さい方のフラグメントを得て、これを旧ｎｄｌ処理
で開環しアルカリ性ホスファターゼで処理して末端の５
′リン酸基を除去したｐＵｃ−Ｘ−ＨＳＡ ！：組み込
みｐｌｊｃ−Ｘ−｝１５Ａ−Ａプラスミドを作威した． 皇マ貞炙 ブースミ ＪＤＢ−ＮｅＯの １
０基本となる大腸菌一酵母菌シャトルベクターとして市
販されているプラスξドｐＪＤＢ２０７ （アマシャム
）を使用した．また、Ｎｅｏ （アミノグルコシドホス
ホトランスフェラーゼ３’ （１））遺伝子源として
市販されているブラスξドｐＮＥｏ （ファルマシア）
を使用した．プラスミドｐＮＥｏを｝ＩｉｎｄＩＩｌ及
びＢｃｏＲ ｌにより二重消化し、大きい方のフラグメ
ントを得た．次に、下記の配列： ｊ！！ＪＬＬＬＬ！！ｉＩｌＬ ５ ’ −ＡＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧ
ＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＣＧＧ
ＧＣＣＣＴＣＧＡ− ５ ’を有する二本鎖オリゴヌク
レオチドを、前記ｐＮＥｏの大きい方のフラグメントに
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結・環状化してプラス
ミドｐＮｅｏ−ＰＬを得た．前記二本鎖オリゴヌクレオ
チドは５′一末端にＥｃｏＲ Ｉ粘着末端配列を有し、
３′一末端に旧ｎｄｌｍ末端を有するほか、内部に旧ｎ
ｄＩＩ［，Ｘｈｏｌ及びＳｌｌａ １部位を有する．従
って前記ブラスａドｐＮｅｏ−ＰＬはＮｅｏ遺伝子の上
流に複数の制限酵素切断部位を有する．次に、このプラ
スξドｐＮｅｏ−ＰＬをＨｔｎｄ［［及びＢａｍＨ Ｉ
により二重消化し、１．４ｋｂフラグメントを得た．ブ
ラス逅ドｐＪＤＢ２０７を旧ｎｄＩＩ［及びＢａ＋ｍＨ
Ｉにより二重消化し、２ｎ酵母複製起点及び標識遺伝
子ＬＥ［Ｉ２等を含有するベクターフラグメントを得た
．次に、これらのフラグメントをＴ４ ＤＮＡリガーゼ
により連結することによりプラスミドｐＪＤＢ−Ｎｅｏ
を得た． 酵母菌＾８２２株の染色体ＤＮＡ １００ｎを１ユニッ
トのＳａｕ３ＡＩと３７゜Ｃ、１５分反応させた（２０
０Ｉ１ｌの５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−｝ＩＣＩ（ｐＨ７．
５）， ７ｓ＋Ｍ ＭｇＣｈ，５ ０ｍＭＮａＣｌ
中３．１０ｔＩＩの０．５Ｍｌ！ＤＴ＾（ｐＨ８．０）
を加え、６５℃１０分反応させ、酵素を失活させた．５
％シ！ＩＩＩ 一ＴＥ （ＴＥ ： １ ０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ（ｐＨ７．５ ）ｌ ｍＭ
ＥＤＴＡ）と２０％シ！！ Ｉ１− Ｔ Ｅを用い、密
度勾配を全量１２ｄで作製した．この勾配の上に上記反
応液を重層し、ベツクマン社のＳＷ４１ローターを用い
、２２Ｋｒｐ−で１５時間、１６℃で遠心した．遠心後
、各分画について電気泳動を行い、１５ｋｂ〜２０ｋｂ
のフラグメントを含む百分に５０４の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム液（ｐＨ５．２）を加え、次にｌ一のエタノールを加
え、よく混合した後、−２０℃に一夜静置し、ＤＮＡを
沈澱させた．遠心（１５κｒｐｓ，５分、４℃）により
、ＤＮＡ沈渣を回収した．この沈渣を７０％エタノール
で洗った後、減圧乾燥した．以上の操作により、５Ｒの
ＤＮＡを得た．このＤＮＡ１ｓｒを２ｎのＥＭＢＬ ３
のアーム（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）、及び３５０ユ
ニットの７４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）と混ぜ、１６
℃で一夜反応させた〔反応液：１０ＩＩＩの５ ０ｍＭ
Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７． ５ ） ． １ ０
ｍＭ ＭｇＣ１ｘ．１ ０ｍＭ ＤＴＴ， １ｍＭ
ＡＴＰ） ．上記反応液ｌＩ１１を用い、ＧＩＧＡ−Ｐ
ＡＣＫ Ｐｌｕｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ， Ｉ
ＧＰ６−Ｐ）により、インビトロ・バッケージング反応
を行った．その結果、３ Ｘ １ ０’ｐｆｕの、大腸
菌Ｐ ２３９２株（ｈｓｄＲ ５１４（ｒｋ−． ｓ＋
ｋ”）＋ ｓｕｐＥ４４． ｓｕｐＦ５８， １ａｃＹ
Ｉ．ｇａｌＫ２， ｇａｌＴ２２． ｓｅｔＢ１． ｔ
ｒｐＲ５５， （Ｐ２））に感染しうるファージを得た
， １０００ｐｆｕのファージを５０ｄのＰ ２３９２
細胞に加え、３７゜Ｃで２０分反応させた後、２． ５
ｄのＬ−Ｔｏｐ−Ａｇａｒｏｓｅ （ Ｌ Ｂ培地（
ｌ％トリプトン、０．５％酵母エキス、ｌ％ＮａＣｌ）
中０．７％アガロース）と共に、直径９０ｍのＬ−プレ
ート（ＬＢ培地＋１．５％寒天）にまいた．このような
プレートを５枚用意し、３７゜Ｃにて一夜培養し、ブラ
ークを形威させた．ブラークの形成されたプレートを１
時間４℃で保存した．Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（アマシャム
）をアガロース面に密着させ、室温に２分静置した．膜
をアガロースからはがし、接着面を上に、０． ５Ｎ
ＮａＯ｝！， Ｉ Ｍ ＮａＣｌを浸した，３ＭＭフ
ィルター（Ｗｈａｔ＠ａｎ）上に５分間置いた。膜を０
． ５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐ｝１７． ２ ）
． １． ５ ＭＮａＣｌに浸した３ＭＭフィルター上
に移し、５分静置した，ｚｘｓｓｃ液で膜を洗い、風乾
させた．風乾した膜をサランラップで包み、ＵＶ照射し
、ＤＮＡを膜に固定した。この膜を、ＡＤＣ １遺伝子
の翻訳領域のアミノ末端より１０残基に相当する塩基配
列を化学合成したプローブＡＤＨ（５’ＡＴＧＴＣＴ
ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＣＴ ＣＡＡ ＡＡＡ Ｇ
ＧＴ ＧＴＴ）とハイブリダイズさせた．膜を洗浄後サ
ランラップに包み、ＸＲＡ− ５フィルム（コダック社
）に密着させ、Ｉｎｔｅｎ−ｓｉｆｙ ｓｃｒｅｅｎを
用い、− ７ ０ ”Ｃにて５時間露光させた． 現像後、ハイブリダイゼーションシグナルを与えたブラ
ークをバスツールピペットの先でかきとり、１００Ｉｉ
のＴＭ液（ＩＯＩＩＭ↑ｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ ７．
５ ）１ ０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ）に懸濁し、室温に２
０分間静置した．懸濁液０．５ｄをＩＩＲｉのＴＭ液で
希釈し、そのうち５４を前述した方法で大腸菌Ｐ ２３
９２に感染させ、直径９０謹のプレートにまきプラーク
を形威させた．形威させたブラークは、再度上記のよう
にプラークハイプリダイゼーシリンを行い、単一ブラー
クからなるポジティブクローンを得た．ポジティブブラ
ークをパスツールピペットの先でかきとり、５０ＩＩ１
のＰ ２３９２細胞に加え、３７℃で２０分間静置した
後、液を２１１１のＬＢ培地、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４に
加え、３７℃で６時間振とう培養した．クロロホルムを
１００４加え、ボルテックスミキサーにかけ完全に溶菌
させた− ２．５００ｒｐ−で５分遠心し、上清を得た
。この上清中に１０１０オーダーのファージが含まれて
いた．この上清８００Ｉ１ｆに１００パの５ＭＮａＣ１
を加え、次に５４０Ｉｌ１のイソプロバノールを加えよ
くまぜ、− ２ ０ ’Ｃで２０分間静置した．遠心し
、得た沈渣を５００ ｄの７０％エタノールで洗い、２
００ Ｊ１１のＴＥに溶解させた．１ｍ（６０ユ−’−
７ト／ハ〕のＤＮａｓｅ Ｉ （宝酒造］と、２Ｉ１１
のＩ Ｍ ＭｇＣｌｇを加え、３７℃で３０分反応させ
た． ｉｏｏＩ１１のＴＥ飽和フェノールを加え、ボ
ルテックス主キサーで混合した．１２κｒｐ園、５分遠
心し、得られた水層をフェノール／クロロホルム（１：
１）で一回抽出した．得られた水層に２０パの３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐｌ４５．２）を加え、さらに５００ Ｉ
ＩＩのエタノールを加え、遠心してＤＮＡを沈澱させた
．得られた沈渣を７０％エタノールで洗った後、減圧乾
燥させ、そして５０μのＴＥに溶解した．この操作でｌ
ｊｒｇ相当のファージＤＮＡが得られた．得られた溶液
２０ｄに、２．２〆の１０倍濃度ＥｃｏＲ Ｉ緩衝液（
０． ５Ｍ ＮａＣ１ ． ０． ５ＭＴｒｉａ−ｉ１
ｃｆ （ｐＨ７． ５ ） ， ７ ０＋ｗＭ Ｍｇ
Ｃ！ｚ）を加え、ＩＩ１１（５ユニット／ｊ１１）のＥ
ＣＯＲＩ （−’−７ボンジーン）と１バの１０■／
ｄのＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ）を加え、３７℃で１時
間反応させた．反応後、０．７％アガロース電気泳動を
行い、常法に従い、ＤＮＡバンドをＨｙｂｏｎｄ ＮＩ
ｌｌにプロッティングした，ＤＮＡの結合したＨｙｂｏ
ｎｄ−Ｎ膜は、ブラークハイブリダイゼーシツンと同一
の条件でハイブリダイゼーシッンを行った。このように
して得られたいくつかのクローンのうち、λ−ＭＤＩで
は、８．４ｋｂのＥｃｏＲ Ｉフラグメントにブローブ
が結合することが分かった．残りのＤＮＡｔＩ液のうち
２０Ｊ１！を、前述の条件下・で、ＥｃｏＲ １により
切断し、０． ７％アガロースゲル電気泳動でフラグメ
ントを分離した， ８． ４ ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグ
メントを含むアガロース断片を切り出し、グラスパウダ
ー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ”＋ Ｂｉｏ−１０１社）
により、ＤＮＡをアガロースから分離、精製した．Ｉｏ
ｎのＴＥ中に溶出されたＤＮＡを、ＢｃｏＲ Ｉで切断
したｐＵｃ１９と連結反応させ（ ３ ０ ｎｇ ｐｔ
Ｊｃ１９．５ ０＋ｌＩ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７．５） ． １ ０＋ｓＭ ＭｇＣｌｇ．
１ ０ｍＭ ＯＴＴ， １ｓＭ ＡＴＰ ．
３５０ユニットＴ４ ＤＮＡリガーゼ／３０バ中、１６
゜Ｃ、２時間）、反応液５Ｉｌ１を用いて大腸菌ＪＭ１
０７を形質転換させた．形質転換した大腸菌を５ ０
ｎ／ ａｔ Ｘ −Ｇａｌ （ ５−ブロモー４−クロ
ロー３−インドリルーβ−Ｄ−ガラクトシド）５ｍｒＰ
ＴＧ（イソブロビルーβ−Ｄ−チオガラクトビラノシド
）、５０ｘ／−アンビシリンを含むＬ−７”レート（χ
一Ｇプレート）にまき、コロニーを形或させた．発色し
ていないクローンを５ｏｎ ／ ｄアンピシリンを含む
５ＩＩ１のＬＢ培地に接種し、３７゜Ｃで一夜培養し、
菌を増殖させた．ミニプレバレーシッン法によりＤＮＡ
ｔ−ｍ製し、最終的に得られたエタノール沈澱を５（Ｊ
ｄのＴＥに溶解させた．！ｌｌ製したＤＮＡの内５ｉ！
１をＥｃｏＲ Ｉで切断し（５ ０ａＭ Ｔｒ！ｓ−｝
！Ｃｌ（ｐ｝１７． ５）， ７＊Ｍ ＭｇＣＩｇ ，
５ ０ｓＭＮａＣ１． ＬＭ／ｄ ＲＮａｓｅ＾、５
ユニットＥｃｏＲ１／１５ｍｌ、０．７％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、８，４ｋｂのＢｃｏＲ Ｉフラグメ
ントがｐＵＣに挿入されていることを確かめた．さらに
、サザーン法により、このフラグメントがプローブと結
合することを確かめた．このようにして得られたクロー
ンｐＢｃＯ８．４のＤＮＡを精製し、０． ５ ｎをＳ
ａｕ３ＡＩで完全分解し（５ ０ｌＩ？ｔ Ｔｒｌｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ７． ５ ） ， ５ ０ｍＮＮａｃ１
， ７ ｍｌｌ ＭｇＣ１ｇ、４ユニットＳａｕ３Ａ
Ｉ／ １ ５ Ｊ中、３７゜Ｃ，２時間）、０．７％ア
ガロースゲル電気泳動によりＤＮＡフラグメントを分離
した．１．６ｋｂフラグメントを含むアガロース断片よ
り、ＣｅｎｅＣ１ｅａｎ”により、ＤＮＡを１０ｍＴＥ
中に回収した． これをＢａ＊Ｈ Ｉで切断したｐｌｌｃ１１９と連結反
応させ、反応液の５４を用い、大腸菌ＭＶ１１８４を形
質転換した．形質転換した大腸菌をＸ−Ｇプレートにま
き、コロニーを形或させた．発色しないコロニーのＤＮ
Ａをミニプレバレーションで調製し、分析を行った，５
ｄＤＮＡをＥｃｏＲ ｌとＨｉｎｄ ｍで切断したもの
（５ユニットＥｃｏＲｔ，５ユニット旧ｎｄＩＩ［）、
及び６ユニットｓｐｈ Ｉで切断したものをそれぞれゲ
ル電気泳動で分析し、前者においては１．６ｋｂのフラ
グメント、後者においては、１．Ｏｋｂのフラグメント
を生ずるクローンを選別した．このようにして得られた
クローン、ｐＳａｕ １． ６のＤＮＡを調製し、以下
の実験に用いた． ＤＮＡ５贈をＳ■ａ ＩとＳａｃ Ｉで切断した〔１〇
一Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７． ５ ） ． ２ ０
−κＣｔ ， ７＋ｍ）ｉ ＭｇＣｌｇ、２０ユニット
Ｓｇｅａｌ，２０ユニットＳａｃｌ／５０バ．３７℃、
２時間〕．反応終了後、フェノールークロロホルムで抽
出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した，ＤＮＡ
沈渣を５０１１１のＥｘｏ ｍ緩衝液（５ ０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８． ０ ） ， １００ｓ
Ｍ ＮａＣ１ ，５ｄ ＭｇＣＩｘ ． １ ０ｍＭ
２−メノレカ７” ｝エタ／ −７Ｌ／）に溶解させた
．もう一本のチューブに５０バのＭＢｌｌ街液〔４０ｌ
ＩＩＭ酢酸ナトリウム｛ｐ｝ｆ４． ５ ＞、１０Ｑｍ
Ｍ ＮａＣｔ ． ２ ｍＭ ＺｎＣｌｇ ． １ ０
％グリセローノレ〕を入れ水中に置いた，ＤＮＡ液に１
８０ユニットの１！ｘｏ ｍヌクレアーゼ（宝酒造）を
加え、３７゜Ｃに保温した．酵素添加後３０秒ごとに５
ｊ１１をサンプリングし、ＭＢＩｌ衝液の入ったチュー
ブに移した。
サンプリング終了後、氷上のチューブを６５゜Ｃ１５分
保温し、次に３７℃に冷し、５０ユニットのマング・ビ
ーンヌクレアーゼを加え、３７゜Ｃ、３０分保温した．
反応後、この液をＴＥで飽和させたフェノールで抽出し
、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した．回収したＤＮＡ
を３０１１１のＴＥに溶解させた． １ｄをとり２ｌ
１１のＩＯＸライゲーシッン液（５００ａ＋Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ （ｐＨ ７． ５ ）． １００ｍＭ Ｍ
ｇＣ１ｚ ．１００■Ｍ ＤＴＴ ， １ ０ −Ｍ
ＡＴＰ）を力■え、１６パのＴＥ，１ｄのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（３５０ユニット／Ｉ１１）を加え、１６℃で
一夜保温した．次に、７０゜Ｃにて１０分間保温し、リ
ガーゼを失活させた後、０．２ＭＫＣＩを２１１１、Ｓ
ｅａ Ｉをｌｍ（１０ユニット／Ｉ１ｌ）加え、３７℃
、１時間保温した．次に７０゜Ｃにて５分間保温し、水
中に移した． これを用い、ＭＶ１１８４を形質転換させ、形質転換体
を一夜３７℃で培養し、コロニーを形威させた．コロニ
ーからＤＮＡを調製し、欠失変異が生じているクローン
を検出した．次に、欠失の起こっているクローンの一本
鎖ファージＤＮＡを調製した．ファージＤＮＡは、？−
ＤＥＡＺＡ−ジデオキシ・シークエンシングキット（宝
酒造）を用い、メーカーマニュアルに従い、配列決定を
行い、ＡＴＧより上流−１０ｂｐまで欠失したクローン
ｐＤＥ６−１０を得た， ｐＤＥ６−１０のＤＮＡを調
製し、１ａｒＤＮＡをＥＣＯＲ Ｉで完全消化し、１０
０ＩＩ１のＴＥに溶解させた。
保温し、次に３７℃に冷し、５０ユニットのマング・ビ
ーンヌクレアーゼを加え、３７゜Ｃ、３０分保温した．
反応後、この液をＴＥで飽和させたフェノールで抽出し
、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した．回収したＤＮＡ
を３０１１１のＴＥに溶解させた． １ｄをとり２ｌ
１１のＩＯＸライゲーシッン液（５００ａ＋Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ （ｐＨ ７． ５ ）． １００ｍＭ Ｍ
ｇＣ１ｚ ．１００■Ｍ ＤＴＴ ， １ ０ −Ｍ
ＡＴＰ）を力■え、１６パのＴＥ，１ｄのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（３５０ユニット／Ｉ１１）を加え、１６℃で
一夜保温した．次に、７０゜Ｃにて１０分間保温し、リ
ガーゼを失活させた後、０．２ＭＫＣＩを２１１１、Ｓ
ｅａ Ｉをｌｍ（１０ユニット／Ｉ１ｌ）加え、３７℃
、１時間保温した．次に７０゜Ｃにて５分間保温し、水
中に移した． これを用い、ＭＶ１１８４を形質転換させ、形質転換体
を一夜３７℃で培養し、コロニーを形威させた．コロニ
ーからＤＮＡを調製し、欠失変異が生じているクローン
を検出した．次に、欠失の起こっているクローンの一本
鎖ファージＤＮＡを調製した．ファージＤＮＡは、？−
ＤＥＡＺＡ−ジデオキシ・シークエンシングキット（宝
酒造）を用い、メーカーマニュアルに従い、配列決定を
行い、ＡＴＧより上流−１０ｂｐまで欠失したクローン
ｐＤＥ６−１０を得た， ｐＤＥ６−１０のＤＮＡを調
製し、１ａｒＤＮＡをＥＣＯＲ Ｉで完全消化し、１０
０ＩＩ１のＴＥに溶解させた。
この溶液２ｄに１００ｎｇのＸｈｏリンカー（ＡＡＴＴ
ＧＣＴＣＧＡＧＣ）を加え、ＩＩ１１のＩＯＸライゲー
ション液、１パのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（３５０ユニン
ト）及び６ｐ１の滅菌蒸留水と混合し、計１０ｕｌの反
応液中で連結反応させた（１６゜Ｃ， ２時間）．７０
℃にてｌＯ分間保温し酵素を失活させ、１１１１の０．
５ Ｍ ＮａＣｉ、５ユニ・ントのＥｃｏＲ Ｉを加
え、３７゜Ｃ３０分間保温した後、これを用いて、大腸
菌ＭＶ１１８４を形質転換させた．得られたコロニーか
らＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲ Ｉで切断されず、Ｘｈｏ
Ｉで切断されるクローンを選別した．このようにして
ｐＤＢ６−１０ （Ｘｈｏ） （プロモータ一カセット
ベクター）を得た． このベクターｐＤ［！６−１０ （Ｘｈｏ）を含有する
大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦ＭＶ１１８４／
ｐＤＨ６−１０（Ｘｈｏ）は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１０３１１号（ＦＯＲＮ Ｐ−１
０３１１）として寄託されている．ｐＥｃＯ８． ４
１ ｐｇを４ユ−’−７１のＢａｌｌで切断した（’
１ ０ＩＩＭ Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７． ５ ）
， ７ 麟Ｍ ＭｇＣ１ｇ／２０ｄ．３１℃、１時間
）．次に、ＩＭＮａＣ１を３ｌ加え、４ユニットのＳｐ
ｈ Ｉを加え、■時間３７゜Ｃに保温した．反応後０．
７％アガロースゲル電気泳動を行い、ｌｋｂのフラグメ
ントを分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎでＤＮＡを抽出した
。回収したＤＮＡを、ｓｐｈ ＩとＳｍａ Ｉで切断し
たｐＵｃ１１８と連結反応させ、ＭＶ１１８４を形質転
換させた．形質転換クローンからＤＮＡを調製し、フラ
グメントの挿入されたクローンを捜した．このＤＮＡを
調製し、１，ｑＤＮＡをＳｐｈ Ｉ及びＨｉｎｄｌｆｌ
で切断し（ ｌ Ｘｆ！ｃｏＲ Ｉ緩衝液、４ユ−’−
７トＳｐｈｌ，１２ユニット旧ｎｄＩＩＩ）、１．２％
アガ口−スゲル電気泳動を行い、０．３３ｋｂフラグメ
ントを単離し、そしてＧｅｎｅ ＣｌｅａｎによりＤＮ
Ａを抽出した．これを、プラス泉ドｐＭＭＴＶ−ＰＬＩ
をＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＳｐｈ Ｉにより二重消化して得
られた５、７ｋｂフラグメン｝５０ｎｇと連結反応（全
反応溶液量２０パ）させた． 反応後、大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、゜アンビシ
リンを含むＬ−プレー｝ （Ｌ−ａｓｐプレート）上で
コロニーを形威させた．コロニーよりＤＮＡを調製し、
制限酵素分析により挿入ＤＮＡを調べ、目的とするフラ
グメントが挿入されたクローンを得た。そのクローンか
らＤＮＡを調製し、その０．５ｎを旧ｎｄｌｌｌで切断
した．７０℃５分保温して、氷上に移し、ＩＲの１ｓＭ
ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ，ｄＴ
ＴＰを各々１ｓＭ含む）、と２ユニットのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏ−フラグメント）〔宝酒造］を
加え、３７゜Ｃで３０分間保温した．フェノール・クロ
ロホルムで除蛋白後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた
，ＤＮＡをｌＯＩ１１の１×ライゲーション液に溶かし
、３５０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、１６゜Ｃ
で一夜保温した．７０゜Ｃで１０分間処理し、リガーゼ
を失活させた後、０． ５ Ｗ ＮａＣ１を１． ２
４、旧ｎｄＩ［を１２ユニット加え、３７゜Ｃで３０分
間処理した．これを用い、大腸菌ＪＭ１０７を形質転換
させた， Ｌ−ａｍｐプレートに形成されたコロニー
の一部をＬ−ａｍ＋ｐ液体培地（Ｌ−ａｍｐプレートか
ら寒天を除いたもの）中で培養し、得られた菌体からＤ
ＮＡを調製し、旧ｎｄｌｆｌサイトが失われたものを得
た．次に０． ５ ｎ ＤＮＡを４ユニットのＢａｓＨ
ｆ．１２単位のＳｐｈ Ｉで切断した（ １ ０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ （ｐＨ７．５） ，ｔ５０ｍＭ
ＮａＣ１ ． ７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ） ． ！． ４
％アガロースゲル電気泳動で、０．３４ｋｂのＤＮＡフ
ラグメントを分離し、Ｇｅｎｅ ＣｌｅａｎでＤＮＡを
１０４のＴＥ中に回収した．これを３０ｎｇのｐＡＴ１
５３を、ＢａａｇＨ Ｉ及びＳｐｈ ！で切断して得た
３．５ｋｂフラグメントと連結反応させた． 反応液で大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、Ｌ−ａｍｐ
プレートにコロニーを形威させた．コロニーの一部をＬ
−ａｍｐ液体培地中で培養し、得られた菌体からＤＮＡ
を調製し、０．４２ｋｂのサイズＢａｍＨ Ｉ − Ｓ
ａｌ Ｉ二重消化物（ＤＮＡフラグメント）を与えるク
ローンをさがした．クローンから得られたＤＮＡ０．５
趨を、Ｂａｗｌ Ｉ及びＳａ目で切断し、１．４％アガ
ロースゲル電気泳動により、０． ４２ｋｂフラグメン
トを分離し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎにより５ｌのＴＥ中
に回収した．これを、Ｂａｔ｝Ｉ Ｉ − Ｓａｌ Ｉ
で切断した１０ｎｇのｐＵｃ−１１９と連結反応させた
．反応液ｌｍを用い、大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換さ
せ、ＸＧプレートにまき、コロニーを形威させた．白色
のコロニーより、ＤＮＡを調製し、フラグメントの挿入
されたものを得た（ｐＵｃ−ＡＴＥ ；ターミネーター
カセット・ベクター）． このベクターｐｔｌｃ−ＡＴＥを含有する大腸菌Ｅｓｃ
ｈｅｒ ｉｃｈ ｌａｃｏｌｉ ＭＶ１１８４（ρυＣ
−ＡＴＥ）は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第１０３１０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０３１０）とし
て寄託されている． プロモーターカセットベクターｐＤＢ６− １０ （Ｘ
ｈｏ）０．５罐を旧ｎｄＩＩ［及びＸｈｏ Ｉで切断し
、０．７％アガロースゲル電気泳動により１． ６ ｋ
ｂのフラグメントを分離した．一方、ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ
０． ５ 趨を旧ｎｄｎ［及びＸｈｏ Ｉで切断し、
８ｋｂフラグメントを分離した．両者を連結し大Ｉｉ菌
ＪＭ１０７に導入し、アンビシリン耐性コロニーヲ得た
．コロニーよりＤＮＡを得、挿入フラグメントを確認し
た（ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ） ．ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ
０． ５ ｎをＢａｓ＋｝ｌ Ｉ及びＳａｌｌで切断し
、約８ｋｂのフラグメントを分離した．一方ｌＩ４のｐ
ＵＣ−ＡＴＦ！をＢａｍｉ｝ｌ Ｉ及びＳａｉ！で切断
し、０。４２ｋｂのフラグメントを分離した．Ｍ者を連
結し、形威されたプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０７を
形質転換させ、アンビシリン耐性コロニーを得た．これ
らのコロニーよりＤＮＡを調製し、目的のプラスミドｐ
ＪＤＢ−Ｎｅｏ−ＡＴＥを有していることを確かめた，
ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ−ＡＴＥ ０． ５ ｍを旧ｎｄｎ
ｌ及びχｈｏｌで切断し、約８ｋｂのフラグメントを得
た．一方、ｐＤＥ−６−１０（Ｘｈｏ ）より、１．６
ｋｂの旧ｎｄｎｌ−Ｘｈｏｌフラグメントを回収した．
両者を連結し、形威されたプラス竃ドにより大腸菌ＪＭ
１０７を形質転換させた。アンビシリン耐性コロニーの
ＤＮＡを調べ、目的のプラスミド（ｐＡ｝１６−１０−
Ｎｅｏ−ＡＴＥ）を有しているクローンを見つけた． このベクターを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ
ｃｏｔｉＪＭ１０７／ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴ
［よ工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１
０３０９号（Ｆ’ＢＲＭ Ｐ−１０３０９）として寄託
されている．
ＧＣＴＣＧＡＧＣ）を加え、ＩＩ１１のＩＯＸライゲー
ション液、１パのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（３５０ユニン
ト）及び６ｐ１の滅菌蒸留水と混合し、計１０ｕｌの反
応液中で連結反応させた（１６゜Ｃ， ２時間）．７０
℃にてｌＯ分間保温し酵素を失活させ、１１１１の０．
５ Ｍ ＮａＣｉ、５ユニ・ントのＥｃｏＲ Ｉを加
え、３７゜Ｃ３０分間保温した後、これを用いて、大腸
菌ＭＶ１１８４を形質転換させた．得られたコロニーか
らＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲ Ｉで切断されず、Ｘｈｏ
Ｉで切断されるクローンを選別した．このようにして
ｐＤＢ６−１０ （Ｘｈｏ） （プロモータ一カセット
ベクター）を得た． このベクターｐＤ［！６−１０ （Ｘｈｏ）を含有する
大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦ＭＶ１１８４／
ｐＤＨ６−１０（Ｘｈｏ）は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１０３１１号（ＦＯＲＮ Ｐ−１
０３１１）として寄託されている．ｐＥｃＯ８． ４
１ ｐｇを４ユ−’−７１のＢａｌｌで切断した（’
１ ０ＩＩＭ Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７． ５ ）
， ７ 麟Ｍ ＭｇＣ１ｇ／２０ｄ．３１℃、１時間
）．次に、ＩＭＮａＣ１を３ｌ加え、４ユニットのＳｐ
ｈ Ｉを加え、■時間３７゜Ｃに保温した．反応後０．
７％アガロースゲル電気泳動を行い、ｌｋｂのフラグメ
ントを分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎでＤＮＡを抽出した
。回収したＤＮＡを、ｓｐｈ ＩとＳｍａ Ｉで切断し
たｐＵｃ１１８と連結反応させ、ＭＶ１１８４を形質転
換させた．形質転換クローンからＤＮＡを調製し、フラ
グメントの挿入されたクローンを捜した．このＤＮＡを
調製し、１，ｑＤＮＡをＳｐｈ Ｉ及びＨｉｎｄｌｆｌ
で切断し（ ｌ Ｘｆ！ｃｏＲ Ｉ緩衝液、４ユ−’−
７トＳｐｈｌ，１２ユニット旧ｎｄＩＩＩ）、１．２％
アガ口−スゲル電気泳動を行い、０．３３ｋｂフラグメ
ントを単離し、そしてＧｅｎｅ ＣｌｅａｎによりＤＮ
Ａを抽出した．これを、プラス泉ドｐＭＭＴＶ−ＰＬＩ
をＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＳｐｈ Ｉにより二重消化して得
られた５、７ｋｂフラグメン｝５０ｎｇと連結反応（全
反応溶液量２０パ）させた． 反応後、大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、゜アンビシ
リンを含むＬ−プレー｝ （Ｌ−ａｓｐプレート）上で
コロニーを形威させた．コロニーよりＤＮＡを調製し、
制限酵素分析により挿入ＤＮＡを調べ、目的とするフラ
グメントが挿入されたクローンを得た。そのクローンか
らＤＮＡを調製し、その０．５ｎを旧ｎｄｌｌｌで切断
した．７０℃５分保温して、氷上に移し、ＩＲの１ｓＭ
ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ，ｄＴ
ＴＰを各々１ｓＭ含む）、と２ユニットのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏ−フラグメント）〔宝酒造］を
加え、３７゜Ｃで３０分間保温した．フェノール・クロ
ロホルムで除蛋白後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた
，ＤＮＡをｌＯＩ１１の１×ライゲーション液に溶かし
、３５０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、１６゜Ｃ
で一夜保温した．７０゜Ｃで１０分間処理し、リガーゼ
を失活させた後、０． ５ Ｗ ＮａＣ１を１． ２
４、旧ｎｄＩ［を１２ユニット加え、３７゜Ｃで３０分
間処理した．これを用い、大腸菌ＪＭ１０７を形質転換
させた， Ｌ−ａｍｐプレートに形成されたコロニー
の一部をＬ−ａｍ＋ｐ液体培地（Ｌ−ａｍｐプレートか
ら寒天を除いたもの）中で培養し、得られた菌体からＤ
ＮＡを調製し、旧ｎｄｌｆｌサイトが失われたものを得
た．次に０． ５ ｎ ＤＮＡを４ユニットのＢａｓＨ
ｆ．１２単位のＳｐｈ Ｉで切断した（ １ ０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ （ｐＨ７．５） ，ｔ５０ｍＭ
ＮａＣ１ ． ７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ） ． ！． ４
％アガロースゲル電気泳動で、０．３４ｋｂのＤＮＡフ
ラグメントを分離し、Ｇｅｎｅ ＣｌｅａｎでＤＮＡを
１０４のＴＥ中に回収した．これを３０ｎｇのｐＡＴ１
５３を、ＢａａｇＨ Ｉ及びＳｐｈ ！で切断して得た
３．５ｋｂフラグメントと連結反応させた． 反応液で大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、Ｌ−ａｍｐ
プレートにコロニーを形威させた．コロニーの一部をＬ
−ａｍｐ液体培地中で培養し、得られた菌体からＤＮＡ
を調製し、０．４２ｋｂのサイズＢａｍＨ Ｉ − Ｓ
ａｌ Ｉ二重消化物（ＤＮＡフラグメント）を与えるク
ローンをさがした．クローンから得られたＤＮＡ０．５
趨を、Ｂａｗｌ Ｉ及びＳａ目で切断し、１．４％アガ
ロースゲル電気泳動により、０． ４２ｋｂフラグメン
トを分離し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎにより５ｌのＴＥ中
に回収した．これを、Ｂａｔ｝Ｉ Ｉ − Ｓａｌ Ｉ
で切断した１０ｎｇのｐＵｃ−１１９と連結反応させた
．反応液ｌｍを用い、大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換さ
せ、ＸＧプレートにまき、コロニーを形威させた．白色
のコロニーより、ＤＮＡを調製し、フラグメントの挿入
されたものを得た（ｐＵｃ−ＡＴＥ ；ターミネーター
カセット・ベクター）． このベクターｐｔｌｃ−ＡＴＥを含有する大腸菌Ｅｓｃ
ｈｅｒ ｉｃｈ ｌａｃｏｌｉ ＭＶ１１８４（ρυＣ
−ＡＴＥ）は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第１０３１０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０３１０）とし
て寄託されている． プロモーターカセットベクターｐＤＢ６− １０ （Ｘ
ｈｏ）０．５罐を旧ｎｄＩＩ［及びＸｈｏ Ｉで切断し
、０．７％アガロースゲル電気泳動により１． ６ ｋ
ｂのフラグメントを分離した．一方、ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ
０． ５ 趨を旧ｎｄｎ［及びＸｈｏ Ｉで切断し、
８ｋｂフラグメントを分離した．両者を連結し大Ｉｉ菌
ＪＭ１０７に導入し、アンビシリン耐性コロニーヲ得た
．コロニーよりＤＮＡを得、挿入フラグメントを確認し
た（ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ） ．ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ
０． ５ ｎをＢａｓ＋｝ｌ Ｉ及びＳａｌｌで切断し
、約８ｋｂのフラグメントを分離した．一方ｌＩ４のｐ
ＵＣ−ＡＴＦ！をＢａｍｉ｝ｌ Ｉ及びＳａｉ！で切断
し、０。４２ｋｂのフラグメントを分離した．Ｍ者を連
結し、形威されたプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０７を
形質転換させ、アンビシリン耐性コロニーを得た．これ
らのコロニーよりＤＮＡを調製し、目的のプラスミドｐ
ＪＤＢ−Ｎｅｏ−ＡＴＥを有していることを確かめた，
ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ−ＡＴＥ ０． ５ ｍを旧ｎｄｎ
ｌ及びχｈｏｌで切断し、約８ｋｂのフラグメントを得
た．一方、ｐＤＥ−６−１０（Ｘｈｏ ）より、１．６
ｋｂの旧ｎｄｎｌ−Ｘｈｏｌフラグメントを回収した．
両者を連結し、形威されたプラス竃ドにより大腸菌ＪＭ
１０７を形質転換させた。アンビシリン耐性コロニーの
ＤＮＡを調べ、目的のプラスミド（ｐＡ｝１６−１０−
Ｎｅｏ−ＡＴＥ）を有しているクローンを見つけた． このベクターを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ
ｃｏｔｉＪＭ１０７／ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴ
［よ工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１
０３０９号（Ｆ’ＢＲＭ Ｐ−１０３０９）として寄託
されている．
第１図はプラス泉ドｐＵｃ−ＰＨ０５−｝ＩＳＡの作製
の過程を示す． 第２図はブラスξドｐＵｃ−Ｘ−ＰＨＯ−．ＨＳＡ−Ａ
の作製の過程を示す． 第３図は発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＬＹＦ，−
ＨＳＡ−＾の作製の過程を示す． 第４図は、本発明の発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨＬ
Ｙ５−ＨＳＡ−Ａにより形質転換された酵母培養物の、
細胞抽出物（レーン１）、上清画分（レーン２）、及び
対照としてのヒト血清由来のＨＳＡのウエスタンプロッ
トの図である。 第５図はこの発明の正常ヒト血清アルブミンＡの全体を
コードするｃＤＮＡ（ＨＳＡｃＤＮＡ） 、並びにこの
ｃＤＮＡｏ造威に使用された、３′末端側をコードする
ｃＤＮＡ （ＩＳＡ− １＾）及び５′末端側をコード
するｃＤＮＡ（Ｉｓ＾一■）の制限酵素地図を示す．第
６図は、ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡのスクリーニ
ングに使用した３種のブロープの塩基配列を示す． 第７図は、ブラスξドｐｕｃ−ＨＳＡ−Ｃｌｌの作製の
過程を示す． 第８−１図〜第８−３図は、ヒト血清アルブミンＡの全
体をコードするｃＤＮ＾の塩基配列を示す．第９図は、
ブラス竃ドｐｔｌｃ−Ｘ−ＨＳＡ−八の作製の過程を示
す． 第１０図は、ブラスξドｐＪＤＢ−Ｎｅｏの作製の過程
を示す． 第１１−１図及び第１１−２図は本発明のＡＤＤ Ｉプ
ロモーターカセットベクターｐＤＥ６−１０ （Ｘｈｏ
）の作製の過程を示す． 第１２−１図及び第１２−２図は、ＡＤＨ Ｉター湾ネ
ーターカセットベクターｐ［ｌｃ−ＡＴＨの作製の過程
を示す． 第１３図は、酵母用発現ベクター（ＭＤＩ｛ Ｉサンド
イツチベクター） ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴＥの
作製の過程を示す．
の過程を示す． 第２図はブラスξドｐＵｃ−Ｘ−ＰＨＯ−．ＨＳＡ−Ａ
の作製の過程を示す． 第３図は発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＬＹＦ，−
ＨＳＡ−＾の作製の過程を示す． 第４図は、本発明の発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨＬ
Ｙ５−ＨＳＡ−Ａにより形質転換された酵母培養物の、
細胞抽出物（レーン１）、上清画分（レーン２）、及び
対照としてのヒト血清由来のＨＳＡのウエスタンプロッ
トの図である。 第５図はこの発明の正常ヒト血清アルブミンＡの全体を
コードするｃＤＮＡ（ＨＳＡｃＤＮＡ） 、並びにこの
ｃＤＮＡｏ造威に使用された、３′末端側をコードする
ｃＤＮＡ （ＩＳＡ− １＾）及び５′末端側をコード
するｃＤＮＡ（Ｉｓ＾一■）の制限酵素地図を示す．第
６図は、ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡのスクリーニ
ングに使用した３種のブロープの塩基配列を示す． 第７図は、ブラスξドｐｕｃ−ＨＳＡ−Ｃｌｌの作製の
過程を示す． 第８−１図〜第８−３図は、ヒト血清アルブミンＡの全
体をコードするｃＤＮ＾の塩基配列を示す．第９図は、
ブラス竃ドｐｔｌｃ−Ｘ−ＨＳＡ−八の作製の過程を示
す． 第１０図は、ブラスξドｐＪＤＢ−Ｎｅｏの作製の過程
を示す． 第１１−１図及び第１１−２図は本発明のＡＤＤ Ｉプ
ロモーターカセットベクターｐＤＥ６−１０ （Ｘｈｏ
）の作製の過程を示す． 第１２−１図及び第１２−２図は、ＡＤＨ Ｉター湾ネ
ーターカセットベクターｐ［ｌｃ−ＡＴＨの作製の過程
を示す． 第１３図は、酵母用発現ベクター（ＭＤＩ｛ Ｉサンド
イツチベクター） ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴＥの
作製の過程を示す．
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、酵母酸性ホスファターゼＰＨ０５シグナル配列をコ
ードしているＤＮＡ配列と該ＤＮＡ配列の下流に存在す
るヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮＡとを有す
るＤＮＡ。 ２、酵母酸性ホスファターゼＰＨ０５シグナル配列をコ
ードしているＤＮＡ配列、ヒト血清アルブミンＡをコー
ドするｃＤＮＡ、及びポリ（Ａ）配列をこの順序で有す
るＤＮＡ。 ３、前記シグナル配列が次の式： Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔ
ｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ＬｅｕＡｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａで表わされる、請求
項１又は２に記載のＤＮＡ。 ４、酵母で機能し得るプロモーターとターミネーターと
の間に請求項２に記載のＤＮＡが発現可能な方向に挿入
されている発現プラスミド。 ５、請求項４に記載の発現プラスミドにより形質転換さ
れた酵母。 ６、請求項５に記載の酵母を培養し、成熟ヒト血清アル
ブミンＡを産生・分泌せしめ、これを採取することを特
徴とする成熟ヒト血清アルブミンＡの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15668889A JPH0322985A (ja) | 1989-06-21 | 1989-06-21 | 酵母酸性ホスファターゼシグナル配列を用いる酵母宿主によるヒト血清アルブミンａの製造 |
| US07/417,429 US5759802A (en) | 1988-10-26 | 1989-10-05 | Production of human serum alubumin A |
| DE68927583T DE68927583T2 (de) | 1988-10-26 | 1989-10-24 | Für menschliches Serum Albumin (HSA) kodierende DNA, Plasmide und Wirtzellen, die solche DNA enthalten sowie die Herstellung von HSA |
| EP89310928A EP0366400B1 (en) | 1988-10-26 | 1989-10-24 | DNA encoding human serum albumin a (HSA), plasmids and hosts containing such DNA, and the production of HSA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15668889A JPH0322985A (ja) | 1989-06-21 | 1989-06-21 | 酵母酸性ホスファターゼシグナル配列を用いる酵母宿主によるヒト血清アルブミンａの製造 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0322985A true JPH0322985A (ja) | 1991-01-31 |
Family
ID=15633156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15668889A Pending JPH0322985A (ja) | 1988-10-26 | 1989-06-21 | 酵母酸性ホスファターゼシグナル配列を用いる酵母宿主によるヒト血清アルブミンａの製造 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0322985A (ja) |
-
1989
- 1989-06-21 JP JP15668889A patent/JPH0322985A/ja active Pending
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