JPH0322986A - 新規なｄｎａ単離物 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は新規なＤＮＡ単離物およびペブチドに関し、詳
細にはラット由来の脳性ナトリウム利尿ベブチドをコー
ドしている新規なＤＮＡ単離物および該ベブチドに関す
る。
細にはラット由来の脳性ナトリウム利尿ベブチドをコー
ドしている新規なＤＮＡ単離物および該ベブチドに関す
る。
従米挟輿
ラノトの心房のホモジネートおよびその顆粒かラノトに
おいてナトリウム利尿を起こすことが発見されて以来Ｃ
ｄｅ Ｂｏｌｄ，＾ｌ． ｅｔ．ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｏｎｃｅ ２８，８９．１９８１ ：Ｋｅｅｌｅ
ｒ，Ｒ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｃｉｏｌ．Ｐｈａｒ自ａ
ｃｏｌ． ， ６０， １０７８， （１９８２）］
、ナトリウム利尿を起こす実体か研究され、既にラット
およびヒトの心房からナトリウム利尿ベブチドが分離さ
れ、その構造か解明されている［ＦＩｙｎｎ， Ｔ．
Ｇ． ｅｔ． ａｔ． ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ、， １１７，
８５９−８６５（１９８３） ； Ｋａｎｇａｗａ，
Ｋ． ｅｔ． ａｌ． ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １１８，１３
１−１３９（１９８４）］。心房性ナトリウム利尿ベブ
チド［＾ｔｒｉａｌ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ， ＡＮ Ｐ］と命名されたこれらのべブチド
は、強力なナトリウム利尿作用、および血管平滑筋弛緩
作用を有し、血圧や体液のホメオスタシスの維持と制御
に重要な役割を果たしていることが明らかになっている
。
おいてナトリウム利尿を起こすことが発見されて以来Ｃ
ｄｅ Ｂｏｌｄ，＾ｌ． ｅｔ．ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓ
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ｃｏｌ． ， ６０， １０７８， （１９８２）］
、ナトリウム利尿を起こす実体か研究され、既にラット
およびヒトの心房からナトリウム利尿ベブチドが分離さ
れ、その構造か解明されている［ＦＩｙｎｎ， Ｔ．
Ｇ． ｅｔ． ａｔ． ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ、， １１７，
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１−１３９（１９８４）］。心房性ナトリウム利尿ベブ
チド［＾ｔｒｉａｌ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ， ＡＮ Ｐ］と命名されたこれらのべブチド
は、強力なナトリウム利尿作用、および血管平滑筋弛緩
作用を有し、血圧や体液のホメオスタシスの維持と制御
に重要な役割を果たしていることが明らかになっている
。
一方、最近ブタの脳抽出物から、２６アミノ酸残基のペ
ブチドおよびそのＮ一末端が延長されたべブチドが同定
された［Ｓｕｄｏ， Ｔ． ａｔ． ａｌ． ， Ｎａ
ｔｕｒｅ， ３３２． ７８−８１（１９８１１） ；
Ｓｕｄｏ， Ｔ． ｅｔ． ａｌ． ＋ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．
１５５， ７２６−７３２（ｉ９ｇｇ）］。これらは、
ＡＮＰと構造および薬理活性が非常に類似しており、２
６アミノ酸残基のベブチドはブタ脳性ナトリウム利尿ベ
プチド［ｐｏｒｃｉｎｅ Ｂｒａｉｎ Ｎａｔｒｉｕｒ
ｅｔｉｃ ＰｅｐｔｉｄｅＳｐＢ Ｎ Ｐ］ と命名さ
れている。さらに、本発明者らにより、ｐＢＮＰ前駆体
をコードしているｃＤＮＡの構造も確立されている［Ｓ
ｕｄｏ， Ｔ． ｅｔ． ａ１． ， Ｂｉｏｃｈｅｍ
． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １
５７． ４ ｔｏ−４ １６（１９８８）］。
ブチドおよびそのＮ一末端が延長されたべブチドが同定
された［Ｓｕｄｏ， Ｔ． ａｔ． ａｌ． ， Ｎａ
ｔｕｒｅ， ３３２． ７８−８１（１９８１１） ；
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ｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．
１５５， ７２６−７３２（ｉ９ｇｇ）］。これらは、
ＡＮＰと構造および薬理活性が非常に類似しており、２
６アミノ酸残基のベブチドはブタ脳性ナトリウム利尿ベ
プチド［ｐｏｒｃｉｎｅ Ｂｒａｉｎ Ｎａｔｒｉｕｒ
ｅｔｉｃ ＰｅｐｔｉｄｅＳｐＢ Ｎ Ｐ］ と命名さ
れている。さらに、本発明者らにより、ｐＢＮＰ前駆体
をコードしているｃＤＮＡの構造も確立されている［Ｓ
ｕｄｏ， Ｔ． ｅｔ． ａ１． ， Ｂｉｏｃｈｅｍ
． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １
５７． ４ ｔｏ−４ １６（１９８８）］。
発明の課題
上記のようにｐＢＮＰおよびこれをコードするＤＮＡ配
列は知られるところとなったが、ラットに関してのＢＮ
Ｐはその存在すら知られていない。
列は知られるところとなったが、ラットに関してのＢＮ
Ｐはその存在すら知られていない。
上記２６アミノ酸のｐＢＮＰに対する抗血清を使用して
もラ・，ト組織中には免疫反応性を見いだすことはでき
なかった。
もラ・，ト組織中には免疫反応性を見いだすことはでき
なかった。
本発明者らは、ブタ種においてＡＮＰのみならずＢＮＰ
が発見されたことに鑑み、これら２つのペズチドは噛乳
動物種に広く存在し得、これらが体液のホメオスタシス
維持の役割を担一っていると想定し、ラッｌ・のＢＮＰ
を検索すべく鋭意研究を重ねた。
が発見されたことに鑑み、これら２つのペズチドは噛乳
動物種に広く存在し得、これらが体液のホメオスタシス
維持の役割を担一っていると想定し、ラッｌ・のＢＮＰ
を検索すべく鋭意研究を重ねた。
本発明者らは、上記ｐＢＮＰ前駆体のｃＤＮＡフラグメ
ントをブローブとして使用し、ラット組織のｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングすることにより、ラノトＢ
ＮＰ（以下、ｒＢＮＰと略す）をコードするｃＤＮＡを
単離し、そのクローニングおよび相当するペブチドのア
ミノ酸配列の決定に戊功し、本発明を完成するに至った
。
ントをブローブとして使用し、ラット組織のｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングすることにより、ラノトＢ
ＮＰ（以下、ｒＢＮＰと略す）をコードするｃＤＮＡを
単離し、そのクローニングおよび相当するペブチドのア
ミノ酸配列の決定に戊功し、本発明を完成するに至った
。
発明の構成および効果
即ち、本発明は、配列式（Ｉ）：
（式中、ＸいＸ，、Ｘ３はＭｅｔの存在または不存在を
表す。） で示されるラット由来の脳性ナトリウム利尿ベブチドま
たはその活性部フラグメントのアミノ酸配列をコードし
ているＩ） Ｎ Ａ単離物を提供するものである。さら
に、本発明は、好ましい態様としてラノト脳性ナトリウ
ム利尿ベブチドをコードしている配列式（ビ） １ Ｙ， ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＴ
Ｇ ＣＴＧ ＣＣＣ ＣＡＧ ＡＴＧ３１ ＡＴＴ
ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＴＴ Ａ
ＡＴ ＣＴＧ ＴＣＧ６１ ＣＣＣ ＣＴＧ ＧＧＡ
ＣＧＴ ＣＡＣ ＴＣＣ ＣＡＴ ＣＣＣ ＣＴＧ
ＧＧＡ９１ ＡＧＴ ＣＣＴ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣ
Ｔ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＣＧ１２１
ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＧ
ＣＴＣ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＡ１５１ ＾＾Ｇ Ｔ
ＣＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＧ
Ａ ＣＡＩＥ ＣＴＣ＋８１ ＴＣ＾＾＾Ｇ ＧＡＣ
ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＡＡ ＧＡＡ
ＣＴＴ２＋１ ＣＴＡ ＾＾Ａ ＡＧＡ ＧＴＣ Ｃ
ＴＴ ＡＧＯ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＾６Ｃ２４１
ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ
ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＡＡＴ２７１ ＴＣＣ
ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＧＴ
ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＴＴ３０１
ＧＧσＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＴ
Ｃ ＧＧＣ ＧＣＡ ＧＴＣＬｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇ
ｉｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ ＧｉｎＧｉｎ Ａｒｇ
Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｉｎ
Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ＬｅｕＬｅ
ｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ
ＧＩ＋＋ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ
ｌｉｅＣｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｉｎ Ｌｙｓ ｌ
ｌｅ Ａｓｐ Ａｒｇ ｌｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ ＡｒｇＬｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ，配列式（■
）； Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇ
ｆｕ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅ
ｒ ＧｌｕＬｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｒｇ ｌ／ａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ ＡｌａＰ
ｈｅ Ａｒｇ ｌｉｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ
ＨｉｓＶａｔ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃ
ｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ，または配列式（Ｉｌｌ） ： ３３１ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＧＴ
ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＴＧ ３６０３
６１ ＴＴＴ， 配列式（ＩＩ’） ： Ｙ． ＣＡＴ ＣＣＣ Ｃ丁Ｇ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＡＡ ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＴ＾＾Ｇ＾ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＣ丁 ＾ＣＡ Ａ＾＾ Ｇ＾＾ ＾ＧＧ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＧ＾＾ＧＴ ＴＣＡ
ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＧＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＧＣ＾ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ または配列弐〇Ｆ）： ＧＧＡ ＡＧＴ ＣＣＴ ＡＧＣ ＡＧＯ ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＴＡ ＾＾Ａ ＡＧ＾ ＾ＧＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＾＾Ｇ ＡＴＧ ＴＴＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＾＾Ｇ ＧＴＣ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＴＴＴ ３６３、 ＣＡＧ ＴＣＴ １０５ ＣＴ［Ｅ Ｃ丁Ｇ １３５ ＧＡＡ ＡＴＣ １６５ Ｃ＾＾ＧＧＣ １９５ ＧＴＣ ＣＴＴ ２２５ ＾ＴＣ ＣＡＧ ２５５ ＧＣＡ ＣＡＴ ２８５ ＾ＴＡ ＧＡＣ ３１５ ＧＧＣ ＴＧＴ ３４５ Ｙ３ ＡＡＴ ＴＣＣ ２９５ ＴＧＣ ＴＴＴ ＧＧＧ ３２５ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ３５５ ＾ＧＧ ＴＴＧ ＴＴＴ ＾＾Ｇ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＧＴ ＴＣＡ Ａ
ＧＣ ２９４ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＣＧＧ
ＡＴＣ ＧＧＣ ３２４ＣＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ Ｔ
ＧＴ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ３５４（式中、Ｙ，、
Ｙ，、Ｙ，はＡＴＧの存在または不存在を表す。）″′ で示されるＤＮＡ単離物を提供するものである。
表す。） で示されるラット由来の脳性ナトリウム利尿ベブチドま
たはその活性部フラグメントのアミノ酸配列をコードし
ているＩ） Ｎ Ａ単離物を提供するものである。さら
に、本発明は、好ましい態様としてラノト脳性ナトリウ
ム利尿ベブチドをコードしている配列式（ビ） １ Ｙ， ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＴ
Ｇ ＣＴＧ ＣＣＣ ＣＡＧ ＡＴＧ３１ ＡＴＴ
ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＴＴ Ａ
ＡＴ ＣＴＧ ＴＣＧ６１ ＣＣＣ ＣＴＧ ＧＧＡ
ＣＧＴ ＣＡＣ ＴＣＣ ＣＡＴ ＣＣＣ ＣＴＧ
ＧＧＡ９１ ＡＧＴ ＣＣＴ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣ
Ｔ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＣＧ１２１
ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＧ
ＣＴＣ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＡ１５１ ＾＾Ｇ Ｔ
ＣＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＧ
Ａ ＣＡＩＥ ＣＴＣ＋８１ ＴＣ＾＾＾Ｇ ＧＡＣ
ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＡＡ ＧＡＡ
ＣＴＴ２＋１ ＣＴＡ ＾＾Ａ ＡＧＡ ＧＴＣ Ｃ
ＴＴ ＡＧＯ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＾６Ｃ２４１
ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ
ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＡＡＴ２７１ ＴＣＣ
ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＧＴ
ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＴＴ３０１
ＧＧσＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＴ
Ｃ ＧＧＣ ＧＣＡ ＧＴＣＬｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇ
ｉｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ ＧｉｎＧｉｎ Ａｒｇ
Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｉｎ
Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ＬｅｕＬｅ
ｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ
ＧＩ＋＋ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ
ｌｉｅＣｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｉｎ Ｌｙｓ ｌ
ｌｅ Ａｓｐ Ａｒｇ ｌｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ ＡｒｇＬｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ，配列式（■
）； Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇ
ｆｕ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅ
ｒ ＧｌｕＬｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｒｇ ｌ／ａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ ＡｌａＰ
ｈｅ Ａｒｇ ｌｉｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ
ＨｉｓＶａｔ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃ
ｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ，または配列式（Ｉｌｌ） ： ３３１ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＧＴ
ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＴＧ ３６０３
６１ ＴＴＴ， 配列式（ＩＩ’） ： Ｙ． ＣＡＴ ＣＣＣ Ｃ丁Ｇ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＡＡ ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＴ＾＾Ｇ＾ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＣ丁 ＾ＣＡ Ａ＾＾ Ｇ＾＾ ＾ＧＧ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＧ＾＾ＧＴ ＴＣＡ
ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＧＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＧＣ＾ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ または配列弐〇Ｆ）： ＧＧＡ ＡＧＴ ＣＣＴ ＡＧＣ ＡＧＯ ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＴＡ ＾＾Ａ ＡＧ＾ ＾ＧＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＾＾Ｇ ＡＴＧ ＴＴＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＾＾Ｇ ＧＴＣ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＴＴＴ ３６３、 ＣＡＧ ＴＣＴ １０５ ＣＴ［Ｅ Ｃ丁Ｇ １３５ ＧＡＡ ＡＴＣ １６５ Ｃ＾＾ＧＧＣ １９５ ＧＴＣ ＣＴＴ ２２５ ＾ＴＣ ＣＡＧ ２５５ ＧＣＡ ＣＡＴ ２８５ ＾ＴＡ ＧＡＣ ３１５ ＧＧＣ ＴＧＴ ３４５ Ｙ３ ＡＡＴ ＴＣＣ ２９５ ＴＧＣ ＴＴＴ ＧＧＧ ３２５ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ３５５ ＾ＧＧ ＴＴＧ ＴＴＴ ＾＾Ｇ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＧＴ ＴＣＡ Ａ
ＧＣ ２９４ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＣＧＧ
ＡＴＣ ＧＧＣ ３２４ＣＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ Ｔ
ＧＴ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ３５４（式中、Ｙ，、
Ｙ，、Ｙ，はＡＴＧの存在または不存在を表す。）″′ で示されるＤＮＡ単離物を提供するものである。
さらに、本発明は、上記配列式（ｒ）、（Ｕ）もしくは
（１）で示されるアミノ酸配列をフードしてぃるＤＮＡ
単離物、好ましくは配列式（■゛）、（■゛）もしくは
（■゜）で示されるＤＮＡ単離物を発現ブラスミドに導
入し、該発現ブラスミドで形質転換された宿主細胞を培
養して得られるラット脳性ナトリウム利尿ベブチドをも
提供するものである。
（１）で示されるアミノ酸配列をフードしてぃるＤＮＡ
単離物、好ましくは配列式（■゛）、（■゛）もしくは
（■゜）で示されるＤＮＡ単離物を発現ブラスミドに導
入し、該発現ブラスミドで形質転換された宿主細胞を培
養して得られるラット脳性ナトリウム利尿ベブチドをも
提供するものである。
配列式（１）で示されるアミノ酸配列は、第２図に示す
ラノト由来の脳性ナトリウム利尿ペブチドのアミノ酸配
列における−２６位または−２５位から９５位までのア
ミノ酸からなり、配列式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配
列は、同第２図のアミノ酸配列における１位から９５位
までのアミノ酸、またはさらに１位のＮ末端にＭｅｔを
有しているアミノ酸からなり、また配列式（ＩＩＩ）で
示されるアミノ酸配列は、同第２図のアミノ酸配列にお
ける６４位から９５位までのアミノ酸、またはさらに６
４位のＮ末端にＭｅｔを有しているアミノ酸からなる。
ラノト由来の脳性ナトリウム利尿ペブチドのアミノ酸配
列における−２６位または−２５位から９５位までのア
ミノ酸からなり、配列式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配
列は、同第２図のアミノ酸配列における１位から９５位
までのアミノ酸、またはさらに１位のＮ末端にＭｅｔを
有しているアミノ酸からなり、また配列式（ＩＩＩ）で
示されるアミノ酸配列は、同第２図のアミノ酸配列にお
ける６４位から９５位までのアミノ酸、またはさらに６
４位のＮ末端にＭｅｔを有しているアミノ酸からなる。
上記アミノ酸配列のうち、Ｎ末端にＭｅｔを有さないも
のは、それぞれ、シグナルベプチドを包含したｒＢＮＰ
，シグナルベブチドを欠失したｒＢＮＰ，およびｒＢＮ
Ｐの活性を保持しているｒＢＮＰの活性部フラグメント
を表している。また、上記ベブチドを遺伝子組換え技術
により、大腸閑体内などで発現させた場合、開始コドン
に対応するＮ末端のＭｅｔが脱離せず、そのままＮ末端
に存在してしまうことがあるが、このことは当業者には
公知の事実であり、そのようなベブチドも本発明に包含
される。
のは、それぞれ、シグナルベプチドを包含したｒＢＮＰ
，シグナルベブチドを欠失したｒＢＮＰ，およびｒＢＮ
Ｐの活性を保持しているｒＢＮＰの活性部フラグメント
を表している。また、上記ベブチドを遺伝子組換え技術
により、大腸閑体内などで発現させた場合、開始コドン
に対応するＮ末端のＭｅｔが脱離せず、そのままＮ末端
に存在してしまうことがあるが、このことは当業者には
公知の事実であり、そのようなベブチドも本発明に包含
される。
尚、本明細書および図面中、アミノ酸を表す略称は、当
業界において一般的に使用されているものであり、次の
意味を有する。
業界において一般的に使用されているものであり、次の
意味を有する。
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸、
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン、
Ｇｌｙ＋グリシン、
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン、
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン、
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン、
Ｌｕｅ：Ｌ−ロイシン、
１１ｅ：Ｌ−インロイシン、
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン、
Ｖａｔ：Ｌ−バリン、
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン。
本発明のＤＮＡ単離物は例えば次のようにして調製され
る。
る。
まず、ｒＢＮＰが含有されていると考えられるラノト絹
織より全ＲＮＡを分離し、これよりＩＩＩＲＮＡを精製
し、常法によりｃＤＮＡライブラリーを構築する。次い
で、このｃＤＮＡライブラリーを、ｐＢＮＰ前駆体をコ
ードするＤＮＡフラグメントをブローブとしたハイブリ
ダイゼーションによってスクリーニングし、ｒＢＮＰク
ローンを得る。以下、これらの操作を具体的に説明する
。
織より全ＲＮＡを分離し、これよりＩＩＩＲＮＡを精製
し、常法によりｃＤＮＡライブラリーを構築する。次い
で、このｃＤＮＡライブラリーを、ｐＢＮＰ前駆体をコ
ードするＤＮＡフラグメントをブローブとしたハイブリ
ダイゼーションによってスクリーニングし、ｒＢＮＰク
ローンを得る。以下、これらの操作を具体的に説明する
。
（１）ｃＤＮΔライブラリーの構築
全ＲＮＡの分離は、ラット心房組織をチオシアン酸グア
ニジンと共に磨砕した後、これを超遠心処理することに
より行った。ポリ（Ａ）ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）の精製は
オリゴｄＴ力ラムクロマトグラフィー処理することによ
り行った［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ， ｅｔａｌ． ， Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋＊ｉｓｔｒｙ， １８． ５２９４−５２９
９（１９７９）］ ． ｍＲ ＮＡからのｃＤＮＡライ
ブラリーの構築は、グラブラ−［Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ
Ｈｏｆｆｍａｎ．Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６９（
１９８３）］らの方法に従って実施した。
ニジンと共に磨砕した後、これを超遠心処理することに
より行った。ポリ（Ａ）ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）の精製は
オリゴｄＴ力ラムクロマトグラフィー処理することによ
り行った［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ， ｅｔａｌ． ， Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋＊ｉｓｔｒｙ， １８． ５２９４−５２９
９（１９７９）］ ． ｍＲ ＮＡからのｃＤＮＡライ
ブラリーの構築は、グラブラ−［Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ
Ｈｏｆｆｍａｎ．Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６９（
１９８３）］らの方法に従って実施した。
（２）ラットｃＤＮＡクローンのスクリーニングｐＢＮ
ＰをコードしているｃＤＮＡの確立されたＤＮＡ配列を
既知のラットＡ Ｎ Ｐ ［Ｋａｎｇａｗａ， ａｔ
ａ１． ， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２， １５２−１５
５（１９８４）］ と比較した場合、ＰＢＮＰの解読フ
レームの３゛末端に位置する３２個のアミノ酸からなる
ｐＢＮＰ（ヌクレオチト２９８−３９３）［以下、ｐＢ
ＮＰ−３２という］に対応する領域にのみ比較的高い相
同性（約６１．１％）が認められ、その残りの５゛側で
は４５％以下の相同性しか認められなかった。ラ，ト心
房組織中に存在するｒＡＮＰとｒＢＮＰとを明確に区別
するために（ラット心房組織中ではｒＡＮＰのほうがｒ
ＢＮＰよりも豊富に存在すると考えられる）、まず、ｒ
ＡＮＰ前駆体と低い相同性を示すｐＢＮＰ前駆体のｌ
９ ５ｂｐ Ｈｈａｌ （９ ２）／ Ｂｃｎｌ （２
８７）フラグメントを使用し、ｒＢＮＰ前駆体をクロー
ンする目的でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェン
シーを低くした場合でさえ、ポジティブブラークは得ら
れなかった。このことは本ブローブと対応する領域にお
いてはｐＢＮＰとｒＢＮＰとが極めて低い配列相同性で
あることを示唆するものである。次いで、上記のｐＢＮ
Ｉ”３２領域に対応するブローブ（以下、ブローブ［ｐ
ＢＮＰ］ という）を使用してスクリーニングを行った
。３０％以上のホルムアミド濃度でハイブリダイセーシ
ョンを行ったところ、ポジティブプラークが得られなか
った。しかし、２０％ホルムアミド濃度としてハイブリ
ダイゼ−７ヨンを行うストリンジェンシーの低い条件下
では、予想よりも多いポジティブブラークが得られた。
ＰをコードしているｃＤＮＡの確立されたＤＮＡ配列を
既知のラットＡ Ｎ Ｐ ［Ｋａｎｇａｗａ， ａｔ
ａ１． ， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２， １５２−１５
５（１９８４）］ と比較した場合、ＰＢＮＰの解読フ
レームの３゛末端に位置する３２個のアミノ酸からなる
ｐＢＮＰ（ヌクレオチト２９８−３９３）［以下、ｐＢ
ＮＰ−３２という］に対応する領域にのみ比較的高い相
同性（約６１．１％）が認められ、その残りの５゛側で
は４５％以下の相同性しか認められなかった。ラ，ト心
房組織中に存在するｒＡＮＰとｒＢＮＰとを明確に区別
するために（ラット心房組織中ではｒＡＮＰのほうがｒ
ＢＮＰよりも豊富に存在すると考えられる）、まず、ｒ
ＡＮＰ前駆体と低い相同性を示すｐＢＮＰ前駆体のｌ
９ ５ｂｐ Ｈｈａｌ （９ ２）／ Ｂｃｎｌ （２
８７）フラグメントを使用し、ｒＢＮＰ前駆体をクロー
ンする目的でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェン
シーを低くした場合でさえ、ポジティブブラークは得ら
れなかった。このことは本ブローブと対応する領域にお
いてはｐＢＮＰとｒＢＮＰとが極めて低い配列相同性で
あることを示唆するものである。次いで、上記のｐＢＮ
Ｉ”３２領域に対応するブローブ（以下、ブローブ［ｐ
ＢＮＰ］ という）を使用してスクリーニングを行った
。３０％以上のホルムアミド濃度でハイブリダイセーシ
ョンを行ったところ、ポジティブプラークが得られなか
った。しかし、２０％ホルムアミド濃度としてハイブリ
ダイゼ−７ヨンを行うストリンジェンシーの低い条件下
では、予想よりも多いポジティブブラークが得られた。
このことは、このブローブとの交差ハイブリダイゼーシ
ョンによって、所望でないＡＮＰクローンも検出されて
くることを示唆するものであった。これらのポジティブ
クローンの内、ＡＮＰクローンを排除するため、ラット
ＡＮＰ−ｃＤＮＡのほとんど全領域に相当する６２５ｂ
ｐの長いブローブ（ブローブ［ｒＡＮＰ］という）を用
い、５０％ホルムアミドの高いストリンジェンシーの条
件下で２回目のハイブリダイゼーションを行った。この
ようにして、２５０．０００絹換えブラークの中から、
ブローブ［ｐＢＮＰ］によってのみポジティブ信号を示
すクローン１８個のクローニングに成功した。
ョンによって、所望でないＡＮＰクローンも検出されて
くることを示唆するものであった。これらのポジティブ
クローンの内、ＡＮＰクローンを排除するため、ラット
ＡＮＰ−ｃＤＮＡのほとんど全領域に相当する６２５ｂ
ｐの長いブローブ（ブローブ［ｒＡＮＰ］という）を用
い、５０％ホルムアミドの高いストリンジェンシーの条
件下で２回目のハイブリダイゼーションを行った。この
ようにして、２５０．０００絹換えブラークの中から、
ブローブ［ｐＢＮＰ］によってのみポジティブ信号を示
すクローン１８個のクローニングに成功した。
（３）ｃＤＮＡの配列決定
最も長いｃＤＮＡ挿入体を有するλｒＢＮＰ５Ｉ７と命
名したクローンを、第１図に記載の制限部位地図に基づ
き、チエインターミネーター法によって配列決定した。
名したクローンを、第１図に記載の制限部位地図に基づ
き、チエインターミネーター法によって配列決定した。
このようにして確立された６２８ｂｐの完全ヌクレオチ
ド配列くボリ（Ａ）テールを除く）を添付の第２図に示
す。他の２つのクローン、λｒＢＮＰ１０７およびλｒ
ＢＮＰ５１８は、それぞれλｒＢＮＰ５１７のヌクレオ
チド「一２９−５７ １１および［６−５６２］と同一
の比較的短いｃＤＮＡ挿人体を有していることがわがっ
た。λｒＢＮＰｌ０７のヌクレオチド配列は、スクレオ
チド３２１、３３６および３９０位がＣからＡに置換さ
れていたが、アミノ酸置換は起こっていなかった。
ド配列くボリ（Ａ）テールを除く）を添付の第２図に示
す。他の２つのクローン、λｒＢＮＰ１０７およびλｒ
ＢＮＰ５１８は、それぞれλｒＢＮＰ５１７のヌクレオ
チド「一２９−５７ １１および［６−５６２］と同一
の比較的短いｃＤＮＡ挿人体を有していることがわがっ
た。λｒＢＮＰｌ０７のヌクレオチド配列は、スクレオ
チド３２１、３３６および３９０位がＣからＡに置換さ
れていたが、アミノ酸置換は起こっていなかった。
クローンλｒＢＮＰ５１７が含有する最も長いｒＢＮＰ
− ｃＤＮＡは、Ａ Ｔ Ｇ開始コドン（ヌクレオチド
１−３）からＴＡＧ終止フドン（ヌクレオチド３６４−
３６６）までの１本鎖の解読フレームを有している（第
２図）。３゜一非翻訳領域は、多くの真核性ｍＲＮＡ中
のポリアデニル化部位に先行するものとして知られてい
るヘキサヌクレオチド配列・ＡＡＴＡＡＡ （ヌクレオ
チド５４３５４８）を含有している。この解読フレーム
は、１２１アミノ酸残基の予想されるラットＢＮＰ前駆
体の分子全体をコードしており、これは、ｐＢＮＰ−３
２と相同的なＣ一末端配列を有している。
− ｃＤＮＡは、Ａ Ｔ Ｇ開始コドン（ヌクレオチド
１−３）からＴＡＧ終止フドン（ヌクレオチド３６４−
３６６）までの１本鎖の解読フレームを有している（第
２図）。３゜一非翻訳領域は、多くの真核性ｍＲＮＡ中
のポリアデニル化部位に先行するものとして知られてい
るヘキサヌクレオチド配列・ＡＡＴＡＡＡ （ヌクレオ
チド５４３５４８）を含有している。この解読フレーム
は、１２１アミノ酸残基の予想されるラットＢＮＰ前駆
体の分子全体をコードしており、これは、ｐＢＮＰ−３
２と相同的なＣ一末端配列を有している。
ラ７｝ＢＮＰ前駆体の予想アミノ酸配列を添付の第２図
に示す。既述したように、この前駆体はラットＡＮＰ前
駆体とは明らかに異なるが、ブタＢＮＰ前駆体とは構造
的に類似している。ｒＢＮＰ前駆体がｒＡＮＰ前駆体と
顕著に相違する特徴は、ｒＢＮＰ−ｃＤＮＡの３゛非翻
訳領域にＡＴ−リッチ領域（ヌクレオチド４５３−４８
５）が認められる点であり（第２図）、これはＡＮＰ−
ｃＤＮＡでは見いだすことができない。このＡＴ− リ
ッチな？列は、ＰＢＮＰ前駆体にも同様に存在している
。
に示す。既述したように、この前駆体はラットＡＮＰ前
駆体とは明らかに異なるが、ブタＢＮＰ前駆体とは構造
的に類似している。ｒＢＮＰ前駆体がｒＡＮＰ前駆体と
顕著に相違する特徴は、ｒＢＮＰ−ｃＤＮＡの３゛非翻
訳領域にＡＴ−リッチ領域（ヌクレオチド４５３−４８
５）が認められる点であり（第２図）、これはＡＮＰ−
ｃＤＮＡでは見いだすことができない。このＡＴ− リ
ッチな？列は、ＰＢＮＰ前駆体にも同様に存在している
。
このようなＡＴ−リッチなヌクレオチド配列は、リンフ
ォカインおよびブロト腫瘍原に見られるように、細胞内
でＩＩＩＲＮＡを不安定化することで知られており、こ
のことは、ＢＮＰの発現は、転写レベルにおいてＡＮＰ
のそれとは異なる態様で調節されている可能性を示唆す
るものである。
ォカインおよびブロト腫瘍原に見られるように、細胞内
でＩＩＩＲＮＡを不安定化することで知られており、こ
のことは、ＢＮＰの発現は、転写レベルにおいてＡＮＰ
のそれとは異なる態様で調節されている可能性を示唆す
るものである。
本発明のＤＮＡフラグメントを発現ベクターに導入し、
これで宿主細胞を形質転換し、そして該形質転換体を培
養するという当業界の常套手段によって、ラッｌ−ＢＮ
Ｐ前駆体、さらにはそれらと同様の生物学的活性を有す
る各種ペブチドを生産することができる。得られるラッ
トＢ Ｎ Ｐは、フタＢＮＰと同様に平滑筋弛緩作用、
利尿およびナトリウム利尿作用、血圧降下作用を有する
と考えられ、例えば心臓性浮腫、高血圧症、うっ血性心
不全、急性および慢性腎不全等の治療薬として有用であ
り得る。
これで宿主細胞を形質転換し、そして該形質転換体を培
養するという当業界の常套手段によって、ラッｌ−ＢＮ
Ｐ前駆体、さらにはそれらと同様の生物学的活性を有す
る各種ペブチドを生産することができる。得られるラッ
トＢ Ｎ Ｐは、フタＢＮＰと同様に平滑筋弛緩作用、
利尿およびナトリウム利尿作用、血圧降下作用を有する
と考えられ、例えば心臓性浮腫、高血圧症、うっ血性心
不全、急性および慢性腎不全等の治療薬として有用であ
り得る。
Ｘ逝■■■逓塑
第１図：クローンλｒＢＮＰ５１７中のｃＤＮＡ挿入体
の配列決定を行うための制限部位地図。この地図には、
本発明に関連した制限エンドヌクレアーゼ部位しか示し
ていない。括弧内の数字は、開裂によって生成される５
′末端ヌクレオチドの番号を示している。各矢印は、配
列決定の方向およびその長さを示している。予想される
γ−ｒＢＮＰ（活性発現部分と考えられる９５個のアミ
ノ酸残基）およびシグナルペブチド相当部を、それぞれ
白帯および斜線帯で示す。
の配列決定を行うための制限部位地図。この地図には、
本発明に関連した制限エンドヌクレアーゼ部位しか示し
ていない。括弧内の数字は、開裂によって生成される５
′末端ヌクレオチドの番号を示している。各矢印は、配
列決定の方向およびその長さを示している。予想される
γ−ｒＢＮＰ（活性発現部分と考えられる９５個のアミ
ノ酸残基）およびシグナルペブチド相当部を、それぞれ
白帯および斜線帯で示す。
第２図；λｒＢＮＰ５１７中のｃＤＮＡ挿入体のヌクレ
オチド配列および予想されるアミノ酸残基配列。ヌクレ
オチド残基配列の番号付は、予想される開始メチオニン
をコードしているＡＴＧコドンのｒＡＪから始めており
、ヌクレオチド１の５゛側のヌクレオチド残基配列には
負の番号を付している。終止コドンは、３つの連続した
星印で示しテイる。矢印は、シグナルベブチダーゼがブ
ロセッシングする可能性の高い部位を示している。ポリ
アデニル化部位に先行するヘキサヌクレオチドに下線を
引いている。３′非翻訳領域（ヌクレオチド４５３ｉ８
５）の点線部分は、３゜ＡＴ−リッチな配列を表してい
る。
オチド配列および予想されるアミノ酸残基配列。ヌクレ
オチド残基配列の番号付は、予想される開始メチオニン
をコードしているＡＴＧコドンのｒＡＪから始めており
、ヌクレオチド１の５゛側のヌクレオチド残基配列には
負の番号を付している。終止コドンは、３つの連続した
星印で示しテイる。矢印は、シグナルベブチダーゼがブ
ロセッシングする可能性の高い部位を示している。ポリ
アデニル化部位に先行するヘキサヌクレオチドに下線を
引いている。３′非翻訳領域（ヌクレオチド４５３ｉ８
５）の点線部分は、３゜ＡＴ−リッチな配列を表してい
る。
本発明の理解を助けるために以下に実施例を挙げるが、
本発明に係るＤＮＡ単離物の調製はこれらに限定される
ものではない。
本発明に係るＤＮＡ単離物の調製はこれらに限定される
ものではない。
ａＲＮＡを調製するためのラット組織としては、ラット
心房を用いた。既述のようにｒＢＮＰはｐＢＮＰに特異
的な抗血清とは免疫反応しなかったので、ラットのどの
組織にｒＢＮＰが多く存在するのか突きとめることはで
きなかった。そこで、ブタにおいては心臓、特に心房に
ｐＢＮＰが最も多く検出されたことから本試験において
もラット心房を用いた。
心房を用いた。既述のようにｒＢＮＰはｐＢＮＰに特異
的な抗血清とは免疫反応しなかったので、ラットのどの
組織にｒＢＮＰが多く存在するのか突きとめることはで
きなかった。そこで、ブタにおいては心臓、特に心房に
ｐＢＮＰが最も多く検出されたことから本試験において
もラット心房を用いた。
チオシアン酸グアニジン法によって、２２匹のラットの
心房から全ＲＮＡを抽出した。グラブラーとホフマン［
Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ ［Ｉｏｆｆａｎ， Ｇｅｎｅ，
２５． ２６３２６９（１９ｇ：｛）］の方法によっ
て、ラット心房のボリ（Ａ）”ＲＮＡ３μｇから２本鎖
ｃＤＮＡを合成した。
心房から全ＲＮＡを抽出した。グラブラーとホフマン［
Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ ［Ｉｏｆｆａｎ， Ｇｅｎｅ，
２５． ２６３２６９（１９ｇ：｛）］の方法によっ
て、ラット心房のボリ（Ａ）”ＲＮＡ３μｇから２本鎖
ｃＤＮＡを合成した。
ＥｃｏＲＩリンカーをライゲートした後、ｃＤＮＡをフ
ァージλｇｔ １ ０ ［Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］にライゲートし、イ
ンビトロパツケージングを行った。これにより、ボＩバ
Ａ）ＲＮＡ１ｎｇ当たり約３．８ＸｌＯ’個の独立した
クローンを得た。
ァージλｇｔ １ ０ ［Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］にライゲートし、イ
ンビトロパツケージングを行った。これにより、ボＩバ
Ａ）ＲＮＡ１ｎｇ当たり約３．８ＸｌＯ’個の独立した
クローンを得た。
Ｂ．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよび配列
決定 ２段階法によってｒＢＮＰクローンを単離した。
決定 ２段階法によってｒＢＮＰクローンを単離した。
マルチブライミング法によって３″Ｐで標識した後、プ
ローブ［ｐＢＮＰＪおよびブローブ［ｒＡＮＰコを使用
し、得られたｃＤＮΔライブラリーをスクリーニングし
た。ブローブ［ｐＢＮＰ］は、ｐＢＮＰ （９６−１３
０）に対応するｐＢＮＰ−ｃＤＮＡの］ ０ ５ｂｐ
Ｂｃｎｌ （２ ８ ７）／ Ｒｓａｌ （３ ９ ２
）フラグメントであり、ブロープ［ｒＡＮＰ］は，ｒＡ
ＮＰ−ｃＤＮＡの６２５ｂｐフラグメント（ヌクレオチ
ド−５７から５６８（Ｐｓｔ１部位））であった。ハイ
ブリダイゼーシｊンは、３ｘＳＳＣ，５０１ＩＭトリス
ー塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ１ ｌ×デンハ
ーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ）、２０μｇ／ｘＱの変
性サケ精子ＤＮＡの溶液中、３７゜Ｃ，１６時間で、ハ
イブリダイゼーションストリンジエンシーを調節するた
めのホルムアミドを２つの異なる濃度で含有させて行っ
た。最初に、約２５０，ＯＯＯ個の組換えファージをニ
トロセルロース膜に移し、２０％ホルムアミド溶液（低
いストリンジェンシー）中で、ブローブ［ｐＢＮＰ］を
使用してスクリーニングした。この膜を３ＸＳＳＣ，０
．１％ＳＤＳ （３７゜Ｃ，１時間）で２回洗浄し、次
いで０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ（４２°Ｃ，１時
間）で２回洗浄した。オートラジオグラフィーを行った
後、膜を水中で煮沸させて放射線標識化プローブを除去
した。次いで、洗浄した膜を、５０％ホルムアミド溶液
（高いストリンジェンシー）中でブローブ［ｒＡＮＰ］
とハイブリダイズした。膜を３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ （６８゜Ｃ１４０分間）で２回洗浄し、次いで０．
１×ＳＳＣ、０．ｌ％ＳＤＳ （６８℃、１時間）で２
回洗浄した。ブローブ［ｐＢＮＰ］ とのみポジティブ
信号を示すクローンを選択し、分析した。最も大きなｃ
ＤＮＡ挿入体を有するクローンλｒＢＮＰ５１７、なら
びに比較的短い挿入体を有するλｒＢＮＰｌ０７および
λｒＢＮＰ５］．８をＭ１３ベクターにサブクローンし
、チエインターミネーター法［Ｓａｎｇｅｒ， ｅｔ．
ａｌ． ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ ｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃ ｉ． ｕ． ｓ．＾． ， ７４． ５４６３
−５４８９（１９７７）］によって配列決定を行った。
ローブ［ｐＢＮＰＪおよびブローブ［ｒＡＮＰコを使用
し、得られたｃＤＮΔライブラリーをスクリーニングし
た。ブローブ［ｐＢＮＰ］は、ｐＢＮＰ （９６−１３
０）に対応するｐＢＮＰ−ｃＤＮＡの］ ０ ５ｂｐ
Ｂｃｎｌ （２ ８ ７）／ Ｒｓａｌ （３ ９ ２
）フラグメントであり、ブロープ［ｒＡＮＰ］は，ｒＡ
ＮＰ−ｃＤＮＡの６２５ｂｐフラグメント（ヌクレオチ
ド−５７から５６８（Ｐｓｔ１部位））であった。ハイ
ブリダイゼーシｊンは、３ｘＳＳＣ，５０１ＩＭトリス
ー塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ１ ｌ×デンハ
ーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ）、２０μｇ／ｘＱの変
性サケ精子ＤＮＡの溶液中、３７゜Ｃ，１６時間で、ハ
イブリダイゼーションストリンジエンシーを調節するた
めのホルムアミドを２つの異なる濃度で含有させて行っ
た。最初に、約２５０，ＯＯＯ個の組換えファージをニ
トロセルロース膜に移し、２０％ホルムアミド溶液（低
いストリンジェンシー）中で、ブローブ［ｐＢＮＰ］を
使用してスクリーニングした。この膜を３ＸＳＳＣ，０
．１％ＳＤＳ （３７゜Ｃ，１時間）で２回洗浄し、次
いで０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ（４２°Ｃ，１時
間）で２回洗浄した。オートラジオグラフィーを行った
後、膜を水中で煮沸させて放射線標識化プローブを除去
した。次いで、洗浄した膜を、５０％ホルムアミド溶液
（高いストリンジェンシー）中でブローブ［ｒＡＮＰ］
とハイブリダイズした。膜を３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ （６８゜Ｃ１４０分間）で２回洗浄し、次いで０．
１×ＳＳＣ、０．ｌ％ＳＤＳ （６８℃、１時間）で２
回洗浄した。ブローブ［ｐＢＮＰ］ とのみポジティブ
信号を示すクローンを選択し、分析した。最も大きなｃ
ＤＮＡ挿入体を有するクローンλｒＢＮＰ５１７、なら
びに比較的短い挿入体を有するλｒＢＮＰｌ０７および
λｒＢＮＰ５］．８をＭ１３ベクターにサブクローンし
、チエインターミネーター法［Ｓａｎｇｅｒ， ｅｔ．
ａｌ． ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ ｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃ ｉ． ｕ． ｓ．＾． ， ７４． ５４６３
−５４８９（１９７７）］によって配列決定を行った。
第１図は、クローンλｒＢＮＰ５１７中のｃＤＮＡ挿入
体の配列決定を行うための制限部位地図であり、第２図
は、λｒＢＮＰ５１７中のｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチ
ド配列および予想されるアミノ酸残基配列を示す模式図
である。
体の配列決定を行うための制限部位地図であり、第２図
は、λｒＢＮＰ５１７中のｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチ
ド配列および予想されるアミノ酸残基配列を示す模式図
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、配列式（ I ）： Ｘ＿１ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌ
ｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ ＬｅｕＬｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓ
ｅｒ Ｈｉｓ ＰｒｏＬｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ ＧｌｎＬｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ ＡｌａＧｌｎ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒ
ｇ ＩｌｅＧｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ ＳｅｒＣｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ ＡｒｇＬｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙ
ｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
（式中、Ｘ＿１はＭｅｔの存在または不存在を表す。）
で示されるラット由来の脳性ナトリウム利尿ペプチドの
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ単離物。 ２、配列式（ I ’）： Ｙ＿１ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＴＧ Ｃ
ＴＧ ＣＣＣ ＣＡＧ ＡＴＧＡＴＴ ＣＴＧ ＣＴＣ
ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＣＴＧ
ＴＣＧＣＣＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＴ ＣＡＣ ＴＣ
Ｃ ＣＡＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＧＧＡＡＧＴ ＣＣＴ
ＡＧＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＡＡ Ｔ
ＣＣ ＡＣＧＡＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ
ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＡＡＡＧ Ｔ
ＣＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＧ
Ａ ＣＡＧ ＣＴＣＴＣＡ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＡＡ
ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＡＡ ＧＡＡ ＣＴＴＣＴ
Ａ ＡＡＡ ＡＧＡ ＧＴＣ ＣＴＴ ＡＧＧ ＴＣＴ
ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＧＣＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧＧ Ａ
ＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＡＡ
ＴＴＣＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＧＴ
ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＴＴＧＧＧ ＣＡＧ ＡＡ
Ｇ ＡＴＡ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＧＣＡ
ＧＴＣＡＧＴ ＣＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＧＴ Ｇ
ＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＴＧＴＴＴ （式中、Ｙ＿１はＡＴＧの存在または不存在を表す。）
で示される請求項１記載のＤＮＡ単離物。 ３、配列式（II）： Ｘ＿２ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｎ ＳｅｒＴｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌ
ｙｓ Ｓｅｒ ＧｌｕＧｌｕ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ＴｈｒＬｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ ＡｌａＰｈｅ Ａ
ｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｈｉｓ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ ＡｌａＶａｌ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ（式中、Ｘ＿２はＸ＿１と同義。） で示されるラット由来の脳性ナトリウム利尿ペプチドの
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ単離物。 ４、配列式（II′）： Ｙ＿２ ＣＡＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＡＧＴ Ｃ
ＣＴ ＡＧＣ ＣＡＧ ＴＣＴＣＣＡ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＴＣＣ ＡＣＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ
ＣＴＧＧＡＧ ＣＴＧ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＡ ＡＡ
Ｇ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＴＧＧＣＴ ＣＡＧ
ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＣＡＣ Ｃ
ＡＡ ＧＧＣＣＣＴ ＡＣＡ ＡＡＡ ＧＡＡ ＣＴＴ
ＣＴＡ ＡＡＡ ＡＧＡ ＧＴＣ ＣＴＴＡＧＧ Ｔ
ＣＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＧＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧ
Ｇ ＡＴＣ ＣＡＧＧＡＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＧＡ
ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＴＡＧ
Ｔ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＴＴ ＧＧＧ ＣＡＧ
ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＣＣＧＧ ＡＴＣ ＧＧＣ Ｇ
ＣＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＴＧ
ＴＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＴＧ ＴＴＴ（
式中、Ｙ＿２はＹ＿１と同義。） で示される請求項３に記載のＤＮＡ単離物。 ５、配列式（III）： Ｘ＿３ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｈ
ｉｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｙ ＧｌｎＬｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｙ Ｃｙｓ ＡｓｐＧｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ （式中、Ｘ＿３はＸ＿１と同義。） で示されるラット由来の脳性ナトリウム利尿ペプチドの
活性部フラグメントのアミノ酸配列をコードしているＤ
ＮＡ単離物。 ６、配列式（III′）： Ｙ＿３ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＣＡ Ｃ
ＡＴ ＡＧＴ ＴＣＡ ＡＧＣＴＧＣ ＴＴＴ ＧＧＧ
ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＴＣ
ＧＧＣＧＣＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＴＧ ＧＧ
Ｃ ＴＧＴ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＧＡＧＧ ＴＴＧ
ＴＴＴ （式中、Ｙ＿３はＹ＿１と同義。） で示される請求項５に記載のＤＮＡ単離物。 ７、請求項１から請求項６までのいずれかに記載のＤＮ
Ａ単離物を導入した発現プラスミドで形質転換した組換
え宿主細胞を培養して得られるラット脳性ナトリウム利
尿ペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1157066A JPH0322986A (ja) | 1989-06-19 | 1989-06-19 | 新規なｄｎａ単離物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1157066A JPH0322986A (ja) | 1989-06-19 | 1989-06-19 | 新規なｄｎａ単離物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0322986A true JPH0322986A (ja) | 1991-01-31 |
Family
ID=15641478
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1157066A Pending JPH0322986A (ja) | 1989-06-19 | 1989-06-19 | 新規なｄｎａ単離物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0322986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6963491B2 (en) | 2001-07-13 | 2005-11-08 | Lenovo (Singapore) Pte Ltd | Expansion board apparatus and removing method |
-
1989
- 1989-06-19 JP JP1157066A patent/JPH0322986A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS=1989 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6963491B2 (en) | 2001-07-13 | 2005-11-08 | Lenovo (Singapore) Pte Ltd | Expansion board apparatus and removing method |
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