JPH03232485A - ハイブリドーマ細胞株の製造方法 - Google Patents
ハイブリドーマ細胞株の製造方法Info
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- JPH03232485A JPH03232485A JP2337033A JP33703390A JPH03232485A JP H03232485 A JPH03232485 A JP H03232485A JP 2337033 A JP2337033 A JP 2337033A JP 33703390 A JP33703390 A JP 33703390A JP H03232485 A JPH03232485 A JP H03232485A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は三種の新しいハイブリドーマ細胞株の製造及び
それにより産生されたモノクローナル抗体てあってヒト
インターロイキン−６を認識又はインターロイキン−６
の作用を阻害するものに関する。
それにより産生されたモノクローナル抗体てあってヒト
インターロイキン−６を認識又はインターロイキン−６
の作用を阻害するものに関する。
本発明はまた、これらモノクローナル抗体の、治療目的
及び診断目的のための使用に関する。
及び診断目的のための使用に関する。
インターロイキン−６（ＩＬ−６）はもともとヒトＢ細
胞刺激因子２ （ＢＳＦ−２） （Ｍ Ｋａｗａｎ
ｏ、Ｔ、Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａ ｔ ｕ ｒ ｅ。
胞刺激因子２ （ＢＳＦ−２） （Ｍ Ｋａｗａｎ
ｏ、Ｔ、Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａ ｔ ｕ ｒ ｅ。
３３２巻、３号、８３〜８５頁、１９８８年）又はハイ
ブリトーマ成長因子（ＨＧＦ）（Ｒ，ＢａｚｉｎとＲ，
Ｌｅｍｉｅｕｘ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。
ブリトーマ成長因子（ＨＧＦ）（Ｒ，ＢａｚｉｎとＲ，
Ｌｅｍｉｅｕｘ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。
１、 １３９巻、７８号、８７頁、１９８７年）とも
いわれ、細胞性免疫系の媒介物に属する。
いわれ、細胞性免疫系の媒介物に属する。
ｒＬ−６をコードするｃＤＮＡの配列とそれに由来する
アミノ酸配列（１８４個のアミノ酸）は文献に記載され
ている（Ｔ、Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻
、６号、７３〜７６頁、ＩＯ２・・・）。
アミノ酸配列（１８４個のアミノ酸）は文献に記載され
ている（Ｔ、Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻
、６号、７３〜７６頁、ＩＯ２・・・）。
インターロイキン−６（ＩＬ−６）か広い生物学的機能
スペクトルを有することは知られている。
スペクトルを有することは知られている。
Ｔ細胞（Ｒ，Ｄ、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｎ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４巻、７６２９〜７６
３３頁、１９８７年）、形質細胞腫（Ｊ、ｖａｎ Ｄ
ａｍｍｅら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ。
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４巻、７６２９〜７６
３３頁、１９８７年）、形質細胞腫（Ｊ、ｖａｎ Ｄ
ａｍｍｅら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ。
ｄ、 １６５巻、９１４〜９１９頁、１９８７年）
、肝細胞（Ｔ、Ａｎｄｕｓら、ＦＥＢｓ Ｌｅｔｔ、
２２１巻、１８〜２２頁、１９８７年）及び繊維芽
細胞（Ｍ、Ｋｏｈａｓｅら、Ｃｅ１１．４５巻、６５９
〜６６６頁、１９８６年）に対するインターロイキン−
６の効果はそれぞれの文献に明瞭に記載されている。
、肝細胞（Ｔ、Ａｎｄｕｓら、ＦＥＢｓ Ｌｅｔｔ、
２２１巻、１８〜２２頁、１９８７年）及び繊維芽
細胞（Ｍ、Ｋｏｈａｓｅら、Ｃｅ１１．４５巻、６５９
〜６６６頁、１９８６年）に対するインターロイキン−
６の効果はそれぞれの文献に明瞭に記載されている。
ＩＬ−６とＩＬ−６拮抗因の役割は以下の総説に記載さ
れている。
れている。
「急性期免疫応答の調整（Ｒｅｇｕｌａ↑１０ｎ ｏ
ｆ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ
ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：ＭＦインタ
ーロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｌｎ−６コ 編者Ｐ、Ｂ、Ｓｅｈｇａｌら、Ｔ ｈ ｅ Ｎ ｅ
ｗＹｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ、２、Ｅａｓｔ ６３ｒｄ ５ｔｒｅｅｔ
。
ｆ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ
ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：ＭＦインタ
ーロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｌｎ−６コ 編者Ｐ、Ｂ、Ｓｅｈｇａｌら、Ｔ ｈ ｅ Ｎ ｅ
ｗＹｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ、２、Ｅａｓｔ ６３ｒｄ ５ｔｒｅｅｔ
。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ及びＴ、Ａｎｄｕｓら、Ｄ
ＭＷ、４４巻、１９８９年。
ＭＷ、４４巻、１９８９年。
上記の文献は、様々な症候群の形成とそれらの進行にδ
けるＴＬ−６の重要性ならびに血液学的腫瘍、固形腫瘍
、自己免疫疾患、炎症過程、ウィルス感染、細菌感染、
糸状菌感染、急性期応答障害棒び１１ ＞−才力インカ
スケードへの影響（こお：するＩＬ−６拮抗因ＣＩＬ−
６抗体）による影響をまとぬている。
けるＴＬ−６の重要性ならびに血液学的腫瘍、固形腫瘍
、自己免疫疾患、炎症過程、ウィルス感染、細菌感染、
糸状菌感染、急性期応答障害棒び１１ ＞−才力インカ
スケードへの影響（こお：するＩＬ−６拮抗因ＣＩＬ−
６抗体）による影響をまとぬている。
さらへこ、ＩＬ−６の病態生理学的役割については文献
に非常に多くの例か見られるか、ここではそのうちのほ
んの数例のみを引用している。
に非常に多くの例か見られるか、ここではそのうちのほ
んの数例のみを引用している。
たとえば、Ｃ，Ｐ、ＣｈｉｎとＦ、Ｌｅｅ （Ｊｏｆ
Ｉｍｍｕｎ、 １４２巻、ｔ９０９〜１９１５頁
、１９８９年）は骨髄白血病細胞の増殖と分化の調整に
おけるＩＬ−６の役割について記載した。
Ｉｍｍｕｎ、 １４２巻、ｔ９０９〜１９１５頁
、１９８９年）は骨髄白血病細胞の増殖と分化の調整に
おけるＩＬ−６の役割について記載した。
Ｐ、Ａ、Ｇｕｅｒｎｅら（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ
、 ８３巻、５８５〜５９２頁、１９８９年）は、
特に高い濃度のＩＬ６が関節炎患者に見出され、明らか
にこれらの症候群の進行に重要な役割を演していること
を示している。
、 ８３巻、５８５〜５９２頁、１９８９年）は、
特に高い濃度のＩＬ６が関節炎患者に見出され、明らか
にこれらの症候群の進行に重要な役割を演していること
を示している。
Ｃ，Ｅ、Ｈａｃｋ （Ｂｌｏｏｄ、７４巻、Ｎａ １５
．１７０４〜１７１０頁、１９８９年）は、インターロ
イキン−６か敗血性ショックの病態生理学において重要
な役割を果たすことを最初に示した。彼らはその研究中
、敗血性ショックの患者の大多数に、対照集団に比パ＼
てＩ Ｌ−６濃度の大きな上昇か見られることを発見し
たのである。全身性狼癒紅斑患者のＩＬ−６濃度につい
ての研究て、Ａ、Ｊ、Ｇ、Ｓｗａａｋら（Ｒｈ ｅ ｕ
ｍａ ｔ ｏ ＩＩｎｔ、 ８巻、２６３〜２６８
頁、１９８９年）はＩＬ−６の量と急性期タンパク応答
との間の相関性を見出した。これらの研究及び他の研究
により、ＩＬ−６はおそらく肝細胞による急性期タンパ
クの産生誘導の原因となっているであろうことか示され
ている。
．１７０４〜１７１０頁、１９８９年）は、インターロ
イキン−６か敗血性ショックの病態生理学において重要
な役割を果たすことを最初に示した。彼らはその研究中
、敗血性ショックの患者の大多数に、対照集団に比パ＼
てＩ Ｌ−６濃度の大きな上昇か見られることを発見し
たのである。全身性狼癒紅斑患者のＩＬ−６濃度につい
ての研究て、Ａ、Ｊ、Ｇ、Ｓｗａａｋら（Ｒｈ ｅ ｕ
ｍａ ｔ ｏ ＩＩｎｔ、 ８巻、２６３〜２６８
頁、１９８９年）はＩＬ−６の量と急性期タンパク応答
との間の相関性を見出した。これらの研究及び他の研究
により、ＩＬ−６はおそらく肝細胞による急性期タンパ
クの産生誘導の原因となっているであろうことか示され
ている。
キャッスルマン（Ｋａ ｓ ｔ ｌ ｅｍａｎ’ ｓ
）症候群はリンパ球異常増殖、形質細胞浸潤、熱、貧血
、高γグロブリン症を特徴とする疾患である。
）症候群はリンパ球異常増殖、形質細胞浸潤、熱、貧血
、高γグロブリン症を特徴とする疾患である。
Ｔ、ＮｉｓｈＮ１５ｈｉら（Ｂｌｏｏｄ、４巻、１３６
０〜１３６７頁、１９８９年）は、この疾患において血
清中のＩＬ−６！１度と疾患の臨床的態様との間に明瞭
な相関関係かあり、ＩＬ−６を様々な臨床的徴候の発生
にとって重要な要素として考えなければならないことを
示すことかてきた。
０〜１３６７頁、１９８９年）は、この疾患において血
清中のＩＬ−６！１度と疾患の臨床的態様との間に明瞭
な相関関係かあり、ＩＬ−６を様々な臨床的徴候の発生
にとって重要な要素として考えなければならないことを
示すことかてきた。
Ｔ Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ （ＦＥＢｓ Ｌｅｔｔ。
２５０巻、６０７〜６１０頁、１９３９年）をめぐる同
じ研究集団は、ＩＬ−６か腎臓細胞癌腫の自己分泌増殖
因子てあり、これら腫瘍細胞の増殖を抗ＩＬ−６抗血清
により阻害し得ることを示すことかできた。骨髄腫細胞
の決定的増殖因子としてのＩＬ−６の役割は多くの研究
集団によって研究されている。
じ研究集団は、ＩＬ−６か腎臓細胞癌腫の自己分泌増殖
因子てあり、これら腫瘍細胞の増殖を抗ＩＬ−６抗血清
により阻害し得ることを示すことかできた。骨髄腫細胞
の決定的増殖因子としてのＩＬ−６の役割は多くの研究
集団によって研究されている。
Ｘ、Ｇ、Ｚｈａｎｇら（Ｂｌｏｏｄ、７４巻、１１〜１
３頁、１９８９）は、ｉｎ ｖｉｔｒ。
３頁、１９８９）は、ｉｎ ｖｉｔｒ。
ての骨髄腫細胞のＩＬ−６応答かｉｌ ｖｉｖ。
ての増殖状態と、従って疾患の重さと直接相関関係かあ
ることを示すことかできた。
ることを示すことかできた。
Ｌ、Ｂｅｒｇｉｎら（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ１７０巻、６
１３〜６１８頁、１９８９年）は、ＩＬ−６か悪性の成
熟細胞に作用するたけてなく、多発生骨髄腫における悪
性形質細胞前駆体の増殖と分化を促進することを示すこ
とかできた。
１３〜６１８頁、１９８９年）は、ＩＬ−６か悪性の成
熟細胞に作用するたけてなく、多発生骨髄腫における悪
性形質細胞前駆体の増殖と分化を促進することを示すこ
とかできた。
Ｔ、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら（Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、
８３〜８５頁、１９８８年）は、ＩＬ−６依存性骨髄腫
細胞の増殖を抗ＩＬ−６抗体で阻害し得ることを初めて
実験的に証明することかできた。
８３〜８５頁、１９８８年）は、ＩＬ−６依存性骨髄腫
細胞の増殖を抗ＩＬ−６抗体で阻害し得ることを初めて
実験的に証明することかできた。
ＰＣＴ公報ＷＯ３８１００２０６には、ＩＬ−６の調製
と使用か記載されており、公知の方法においてＩＬ−６
を使用すればポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
か得られることも指摘されている。しかしながら、この
ような抗体の調製法は記載されていない。同様に、化学
的・物理的パラメータで抗体か定義されているわけては
なく、またこのような抗体を産生し得る細胞か寄託され
ているわけてもない。この点て再現性のある教示かされ
ているわけてはない。つまり、このＰＣＴ公報の開示は
純粋に推論的な考察にすぎないのである。
と使用か記載されており、公知の方法においてＩＬ−６
を使用すればポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
か得られることも指摘されている。しかしながら、この
ような抗体の調製法は記載されていない。同様に、化学
的・物理的パラメータで抗体か定義されているわけては
なく、またこのような抗体を産生し得る細胞か寄託され
ているわけてもない。この点て再現性のある教示かされ
ているわけてはない。つまり、このＰＣＴ公報の開示は
純粋に推論的な考察にすぎないのである。
本発明の目的はＩＬ−６依存性細胞の増殖を効率的に阻
害又は抑制することのできるモノクローナル抗体を調製
することである。これらのモノクローナル抗体は治療的
にも予防的にも低用量て使用することかてき、処置の間
も何らの二次的効果も生しないのである。
害又は抑制することのできるモノクローナル抗体を調製
することである。これらのモノクローナル抗体は治療的
にも予防的にも低用量て使用することかてき、処置の間
も何らの二次的効果も生しないのである。
二の目的は、Ｃ，ＭｉｌｓｔｅｉｎとＧ、Ｋ。
ｈｌｅｒにより開発された公知の融合法を使用し、ＩＬ
−６に対するマウスモノクローナル抗体を水生する新し
いハイブリトーマ細胞株を単離することにより達成され
る。
−６に対するマウスモノクローナル抗体を水生する新し
いハイブリトーマ細胞株を単離することにより達成され
る。
ＢＥ−４（ＩｇＧ２ｂ） 、ＢＥ−８（ＩｇＧｌ）及び
ＢＦ−６（ＩｇＧ１）とそれぞれ呼ばれるこれらの細胞
株は、Ｆｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉ。
ＢＦ−６（ＩｇＧ１）とそれぞれ呼ばれるこれらの細胞
株は、Ｆｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉ。
ｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （ＣＮＣＭ）に、それぞれＩ
／９１１、Ｉ／９１３及びＩ／９１２という番号で寄託
されており、これらからマウス免疫グロブリンのクラス
変換した変種を単離することかできる。たとえば、Ｉｇ
Ｇ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、１ｇＧ３、ＩｇＧ１及び他の免疫
グロブリンクラスなとである。
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （ＣＮＣＭ）に、それぞれＩ
／９１１、Ｉ／９１３及びＩ／９１２という番号で寄託
されており、これらからマウス免疫グロブリンのクラス
変換した変種を単離することかできる。たとえば、Ｉｇ
Ｇ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、１ｇＧ３、ＩｇＧ１及び他の免疫
グロブリンクラスなとである。
モノクローナル抗体ＢＥ−４とＢＥ−８はヒト及びマウ
ス細胞株上のＩＬ−６受容体への結合に対して、ＩＬ−
６と競合し、ＩＬ−６依存性細胞株の増殖を阻害する。
ス細胞株上のＩＬ−６受容体への結合に対して、ＩＬ−
６と競合し、ＩＬ−６依存性細胞株の増殖を阻害する。
両抗体ともに受容体に結合しているＩＬ−６を認識する
ことかでき、またＢＥ−４とＢＥ−８はＩＬ−６分子上
の異なるエピドープを認識するものであることか示され
ている。
ことかでき、またＢＥ−４とＢＥ−８はＩＬ−６分子上
の異なるエピドープを認識するものであることか示され
ている。
モノクローナル抗体ＢＦ−６も同様にＩＬ−６を認識す
るが、ＩＬ−６受容体への結合をＩＬ６と競合するもの
ではなく、またＴＬ−６依存性細胞の増殖を阻害し得る
ものてもない。ＢＦ−６は受容体に結合しているＩＬ−
６を認識する能力を有しており、ＢＥ−４とＢＥ−８に
より認識されるエピドープとは異なるエピドープを認識
するものであることか示されている。
るが、ＩＬ−６受容体への結合をＩＬ６と競合するもの
ではなく、またＴＬ−６依存性細胞の増殖を阻害し得る
ものてもない。ＢＦ−６は受容体に結合しているＩＬ−
６を認識する能力を有しており、ＢＥ−４とＢＥ−８に
より認識されるエピドープとは異なるエピドープを認識
するものであることか示されている。
それ故、このモノクロナール抗体は多発性骨髄腫、骨髄
性白血病、キャッスルマン症候群、全身性狼癒紅斑、腎
臓細胞癌腫、関節炎のような疾患、及びＩＬ−６依存性
であることか示されている池の疾患の治療に適している
。
性白血病、キャッスルマン症候群、全身性狼癒紅斑、腎
臓細胞癌腫、関節炎のような疾患、及びＩＬ−６依存性
であることか示されている池の疾患の治療に適している
。
このモノクローナル抗体は、純物質として、毒素（たと
えばリシンＡ又はサボリン）もしくは放射性物質もしく
は池の薬物に結合して、又はリポソーム中にカプセル化
して使用してもよい。
えばリシンＡ又はサボリン）もしくは放射性物質もしく
は池の薬物に結合して、又はリポソーム中にカプセル化
して使用してもよい。
抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８又はＢＦ−６を含有する薬物は
液状又は凍結乾燥状にしてもよい。安定化のためにタン
パク、糖、糖アルコール、アミノ酸及び粘度増強剤を使
用してもよく、また緩衝化のために無機酸、好ましくは
生理学的媒体（ＰＢＳ ｐ８７．４）中リン酸ナトリ
ウムを使用してもよい。
液状又は凍結乾燥状にしてもよい。安定化のためにタン
パク、糖、糖アルコール、アミノ酸及び粘度増強剤を使
用してもよく、また緩衝化のために無機酸、好ましくは
生理学的媒体（ＰＢＳ ｐ８７．４）中リン酸ナトリ
ウムを使用してもよい。
この抗体は治療目的のために０．５〜５■／ｒｆＬｌ、
好ましくは１■／−の濃度で使用され、概して全身的に
投与されるか、局所的な投与も排除されるものではない
。
好ましくは１■／−の濃度で使用され、概して全身的に
投与されるか、局所的な投与も排除されるものではない
。
モノクローナル抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６は
同様に、受容体、細胞表面又は体液中のＴＬ−６を同定
するための診断薬として用いることもできる。このよう
な使用においては、抗体は蛍光物質等に結合していても
よい。同様に体液中のＩＬ−６を測定するためのＥＬＩ
ＳＡ又はラノオイムノアッセイにこの抗体を用いること
もてきる。
同様に、受容体、細胞表面又は体液中のＴＬ−６を同定
するための診断薬として用いることもできる。このよう
な使用においては、抗体は蛍光物質等に結合していても
よい。同様に体液中のＩＬ−６を測定するためのＥＬＩ
ＳＡ又はラノオイムノアッセイにこの抗体を用いること
もてきる。
本発明に係るモノクローナル抗体は、これを出発として
、ヒト起源（ヒト免疫グロブリン）の−定ドメイン、ネ
ズミ起源（ネズミ免疫グロブリン）可変領域、特に超可
変領域のみとのキメラ抗体を製造するのに適している。
、ヒト起源（ヒト免疫グロブリン）の−定ドメイン、ネ
ズミ起源（ネズミ免疫グロブリン）可変領域、特に超可
変領域のみとのキメラ抗体を製造するのに適している。
ＩＬ−６依存性疾患の治療のためには、このキメラは純
物質として、あるいは毒素、放射性物質、池の薬物に結
合して、もしくはリポソーム中にカプセル化して使用し
てもよい。
物質として、あるいは毒素、放射性物質、池の薬物に結
合して、もしくはリポソーム中にカプセル化して使用し
てもよい。
本発明を以下の例により詳細に説明する。
■ モノクローナル抗体の調製
雌Ｂａ１ｂ／ｃマウスを２週問おきに４回、各回１０
Ｉｉｇの組替えＩＬ−６を腹腔内投与して免疫ｒヒした
。４回目の免疫化は静脈内投与により行い、稗細胞を４
日後に抽出１７、融合した。融合は次のよう（こして行
った。
Ｉｉｇの組替えＩＬ−６を腹腔内投与して免疫ｒヒした
。４回目の免疫化は静脈内投与により行い、稗細胞を４
日後に抽出１７、融合した。融合は次のよう（こして行
った。
免疫化した脾細胞を・Ｘ６３Ａｇ８６５３ネズミ骨髄腫
細胞と５．１の比率でポリエチ・レンゲリコールの存在
下で融合した（Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｊｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、 １２３巻、１５４８頁、１９７８年）。
細胞と５．１の比率でポリエチ・レンゲリコールの存在
下で融合した（Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｊｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、 １２３巻、１５４８頁、１９７８年）。
この細胞株はｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ
Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ （ＥＣＡＣＣ）、ＰＨＬＳ Ｃ
ｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄＲ，ｅｓｅａｒｃｈ、Ｐ
ｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ。
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ
Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ （ＥＣＡＣＣ）、ＰＨＬＳ Ｃ
ｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄＲ，ｅｓｅａｒｃｈ、Ｐ
ｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ。
５ａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＦ３ ０
ＪＧ、ＵＫに、ＥＣＡＣＣＮα８５０１１４ ２０の下
て寄託されている。
ＪＧ、ＵＫに、ＥＣＡＣＣＮα８５０１１４ ２０の下
て寄託されている。
融合細胞群濁液を一回洗浄し、選択培地中て培養した（
ＲＰＭＩ １６４０．１０％熱不活化ウマ血清、４ｍ
Ｍグルタミン、ヒポキサンチン１３．６■／ｌ、アミノ
プテリン０．１７■／β及び１０μｇ／ｍｌインシュリ
ン）。
ＲＰＭＩ １６４０．１０％熱不活化ウマ血清、４ｍ
Ｍグルタミン、ヒポキサンチン１３．６■／ｌ、アミノ
プテリン０．１７■／β及び１０μｇ／ｍｌインシュリ
ン）。
１０日後、ハイブリドーマ増殖を示した培養の融合上澄
液の抗ＩＬ−６モノクローナル抗体の産生をテストした
。
液の抗ＩＬ−６モノクローナル抗体の産生をテストした
。
この目的のため、１００μｌのハイブリドーマ上澄液を
、あらかじめ１１０００ｎの抗マウス免疫グロブリンに
より４°Ｃて一晩被覆したＥＬＩＳＡプレートて、１時
間インキュベートした。
、あらかじめ１１０００ｎの抗マウス免疫グロブリンに
より４°Ｃて一晩被覆したＥＬＩＳＡプレートて、１時
間インキュベートした。
個々のウェルを３回洗浄後、各々１００ｄのＰＢＳ中１
１００ｎのビオチン化したＩＬ−６を用いて室温で１時
間インキュベートした。再び３回洗浄後、ストレブタビ
ジン パーオキシダーゼとの反応を室温で１時間行い、
もう−度洗浄して、基質（ＤＰＯ）とのインキュベーシ
ョンを行った。
１００ｎのビオチン化したＩＬ−６を用いて室温で１時
間インキュベートした。再び３回洗浄後、ストレブタビ
ジン パーオキシダーゼとの反応を室温で１時間行い、
もう−度洗浄して、基質（ＤＰＯ）とのインキュベーシ
ョンを行った。
その後プレートの４０５ｎｍでの光学濃度を測定した。
陽性のクローンを、限定希釈法（シーディング（ｓｅｅ
ｄｉｎｇ）密度０．２細胞／培養）を用いた４段階のク
ローニングの後に調べ、クローンＢＥ−４、ＢＥ−８及
びＢＦ−６を単離した。
ｄｉｎｇ）密度０．２細胞／培養）を用いた４段階のク
ローニングの後に調べ、クローンＢＥ−４、ＢＥ−８及
びＢＦ−６を単離した。
ＢＥ−４はマウスＩｇＧ２ｂ抗体、ＢＦ−６とＢＥ−８
はＩｇＧ１抗体であり、いずれもｋ（カッパ）Ｌ鎖を有
しており、組替えＩＬ−６への顕著な結合を示すもので
ある。
はＩｇＧ１抗体であり、いずれもｋ（カッパ）Ｌ鎖を有
しており、組替えＩＬ−６への顕著な結合を示すもので
ある。
抗ＩＬ−６モノクローナル抗体ＢＥ＝４、ＢＥ−８及び
ＢＦ−６はＢａ１ｂ／ｃマウスにＢＥ４、ＢＥ−８及び
ＢＦ−６ハイブリドーマ細胞をそれぞれ腹腔内注射する
ことにより、ｉｎ ｖｉＶ○で大量に産生された。ハ
イブリトーマ細胞注射の一週間前に、０．５ｍｌのフロ
イントの不完全補助液をマウスの腹腔に注入した。ハイ
ブリドーマ細胞注射の８〜１４日後に腹水を抽呂するこ
とかてきた。
ＢＦ−６はＢａ１ｂ／ｃマウスにＢＥ４、ＢＥ−８及び
ＢＦ−６ハイブリドーマ細胞をそれぞれ腹腔内注射する
ことにより、ｉｎ ｖｉＶ○で大量に産生された。ハ
イブリトーマ細胞注射の一週間前に、０．５ｍｌのフロ
イントの不完全補助液をマウスの腹腔に注入した。ハイ
ブリドーマ細胞注射の８〜１４日後に腹水を抽呂するこ
とかてきた。
硫酸アンモニウム（４５％飽和）により腹水からモノク
ローナル抗体を沈殿させ、０．０２ｍＭＴ ｒ ｉ ｓ
（ｐＨ７，７）で再緩衝させ、Ｑ−セファロースカラ
ムに結合させた。このカラム上でモノクローナル抗体を
０．０２ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，７）中１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０で洗浄した後、ｏ、３５Ｍ Ｎａｃｌ溶液
（ｐＨ７，７）てカラムから溶離させた。
ローナル抗体を沈殿させ、０．０２ｍＭＴ ｒ ｉ ｓ
（ｐＨ７，７）で再緩衝させ、Ｑ−セファロースカラ
ムに結合させた。このカラム上でモノクローナル抗体を
０．０２ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，７）中１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０で洗浄した後、ｏ、３５Ｍ Ｎａｃｌ溶液
（ｐＨ７，７）てカラムから溶離させた。
治療の目的でモノクローナル抗体を生理的ＰＢＳ緩衝液
（リン酸緩衝食塩水）て再緩衝させた。
（リン酸緩衝食塩水）て再緩衝させた。
■、モノクローナル抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−
６の生物活性 細胞株Ｂ９はＩＬ−６に依存したマウスハイブリドーマ
株であり、その性質はり、Ａ、ｖａｎＡａｒｄｅｎによ
り記載されている（Ｅｕｒ、Ｊ。
６の生物活性 細胞株Ｂ９はＩＬ−６に依存したマウスハイブリドーマ
株であり、その性質はり、Ａ、ｖａｎＡａｒｄｅｎによ
り記載されている（Ｅｕｒ、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １７巻、１４１１頁、１９８７
年）。細胞株Ｂ９をＲＰＭｌ１６０８中て、１０％ウシ
胎児血清とメルカプトエタノールとともに、１ｍｌあた
り２ｐｇのＩＬ−６を添加して３日間培養する。その後
１６時間の間、Ｈ２−チミジンを添加する。その後細胞
を集め、洗浄し、ベータカウンターで測定する。
年）。細胞株Ｂ９をＲＰＭｌ１６０８中て、１０％ウシ
胎児血清とメルカプトエタノールとともに、１ｍｌあた
り２ｐｇのＩＬ−６を添加して３日間培養する。その後
１６時間の間、Ｈ２−チミジンを添加する。その後細胞
を集め、洗浄し、ベータカウンターで測定する。
以下の実験では、１ＴＬｌあたり２ｐｇのＩＬ−６を添
加するとともに、様々な濃度の抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８
及びＢＦ−６も添加した。ＤＮＡ合成は、細胞増殖又は
細胞阻害の指標としてのＨ３−チミジン取込みとして放
射活性を検呂することにより測定した。
加するとともに、様々な濃度の抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８
及びＢＦ−６も添加した。ＤＮＡ合成は、細胞増殖又は
細胞阻害の指標としてのＨ３−チミジン取込みとして放
射活性を検呂することにより測定した。
この結果は明らかに、細胞増殖の指標としてＨチミンン
の取込み、従ってＤＮＡ合成か、ＢＥ−４及びＢＥ−８
を用いるとテストしたＢ９培養よイ、）も幾分低いこと
を示している。これらの抗体は細胞株Ｂ９のＩＬ−６依
存性増殖を阻害するか、ＢＦ−６は細胞株Ｂ９の増殖を
阻害することはできなし）。
の取込み、従ってＤＮＡ合成か、ＢＥ−４及びＢＥ−８
を用いるとテストしたＢ９培養よイ、）も幾分低いこと
を示している。これらの抗体は細胞株Ｂ９のＩＬ−６依
存性増殖を阻害するか、ＢＦ−６は細胞株Ｂ９の増殖を
阻害することはできなし）。
ＩＬ−６のヨウ素化
ｌＯμｒのホウ酸緩衝液（０，１Ｍ、 ｐ Ｈ８，０）
中５ｕｇのＩＬ−６をｌｍＣ４の１１２５ （Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社のＢｏｌｔｏｎ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ
試藁、コート１Ｍ５８６）とともにＯ′Ｃて１５分間イ
シキュヘートした。次に反応を５００μｒのグリシ＞
（０，１Ｍホウ素緩衝液（ｐＨ８，５）中０．２Ｍ）を
用いて５分間で停止した。
中５ｕｇのＩＬ−６をｌｍＣ４の１１２５ （Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社のＢｏｌｔｏｎ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ
試藁、コート１Ｍ５８６）とともにＯ′Ｃて１５分間イ
シキュヘートした。次に反応を５００μｒのグリシ＞
（０，１Ｍホウ素緩衝液（ｐＨ８，５）中０．２Ｍ）を
用いて５分間で停止した。
遊離１１２５と結合ｌ１２５を、あらかじめＰＢＳｌ”
６ウシアルブミンで平衡にしておいたＰＤＩＯカラム（
ファルマンア社製、Ｇ−２５）に通して分離した。ｌｎ
ｇのＩＬ−６の比活性は１１０３２０ｃｐてあった。
６ウシアルブミンで平衡にしておいたＰＤＩＯカラム（
ファルマンア社製、Ｇ−２５）に通して分離した。ｌｎ
ｇのＩＬ−６の比活性は１１０３２０ｃｐてあった。
１カツプあたり２．５ＸＩＯ’個のＵ２２６株の細胞を
、様々な濃度の１１２５−ＩＬ−６と５００倍過剰の非
標識ＩＬ−６とともに、総体積ｌイのＰＢ３１％中４°
Ｃて９０分間インキュベートシた。
、様々な濃度の１１２５−ＩＬ−６と５００倍過剰の非
標識ＩＬ−６とともに、総体積ｌイのＰＢ３１％中４°
Ｃて９０分間インキュベートシた。
その後３回洗浄の後、測定を行った。
結合ＩＬ−６
（最大）
１、５ ｎ ｇ
０．０５７Ｘ １０−１２
ｍＭ。
０、０６３
一細胞当たりの受容対数
２．５ Ｘｌ０６
スカツチヤート分析により、細胞株Ｕ２２６については
ＫＤ値は８．７Ｘ１０−”Ｍであり、−細胞あたりの受
容体数は１３６８０であることか示された。
ＫＤ値は８．７Ｘ１０−”Ｍであり、−細胞あたりの受
容体数は１３６８０であることか示された。
競合の研究
ｌウェルあたり２．５ Ｘ １０ ’個のＵ２２６細胞
を０．１μｆ （０，３３μｇ）の放射標識ＩＬ−６と
インキュベートし、陽性の対照とした。ｃｐｍ計数は３
２６９±１５６てあり、これをＩＬ−６の全結合に対す
る値とした。
を０．１μｆ （０，３３μｇ）の放射標識ＩＬ−６と
インキュベートし、陽性の対照とした。ｃｐｍ計数は３
２６９±１５６てあり、これをＩＬ−６の全結合に対す
る値とした。
５００倍過剰の非標識［、−６を０．１μｌ（０，３３
μｇ）の放射標識ＩＬ−６に添加したところ、非特異的
結合に対する値として２５３ｃｐｍか観測された。これ
から３０１６ｃｐｍという値か特異的結合の１００％に
相当することがわかる。
μｇ）の放射標識ＩＬ−６に添加したところ、非特異的
結合に対する値として２５３ｃｐｍか観測された。これ
から３０１６ｃｐｍという値か特異的結合の１００％に
相当することがわかる。
ｌμｇ／ｒｒＬｌのＢＥ−４、ＢＥ−８又はＢＦ−６を
添加した他は同様の実験を放射標識ＩＬ−６を用いて行
ったところ、次の値か得られた。
添加した他は同様の実験を放射標識ＩＬ−６を用いて行
ったところ、次の値か得られた。
ＢＥ−４： １１％ＩＬ−６結合
ＢＥ−８： １４％ＩＬ−６結合
ＢＰ−６二 ９２％ＩＬ−６結合
この実験は明らかに、ＢＥ−４とＢＥ−８は工Ｌ−６の
受容体に対してその特異的結合を阻害することかできる
か、ＢＦ−６はこの結合を阻害できないことを示してい
る。
受容体に対してその特異的結合を阻害することかできる
か、ＢＦ−６はこの結合を阻害できないことを示してい
る。
各々について４０ｍｇの精製モノクローナル抗体を１８
０μｍのＰＢＳ中てＮ ａ １２５１ （０，５ｍＣ１
）とインキュベートした。その後、１０ｍ１（０，４■
／イ）のクロラミンＴを添加し、１分後にｌＯμｌの亜
硫酸水素ナトリウム（０，５μｇ／ｍｊ）を添加して反
応を停止した。このように標識したモノクローナル抗体
を遊離ヨウ素からクロマトグラフィー（セファデックス
Ｇ−２５）により分離した。
０μｍのＰＢＳ中てＮ ａ １２５１ （０，５ｍＣ１
）とインキュベートした。その後、１０ｍ１（０，４■
／イ）のクロラミンＴを添加し、１分後にｌＯμｌの亜
硫酸水素ナトリウム（０，５μｇ／ｍｊ）を添加して反
応を停止した。このように標識したモノクローナル抗体
を遊離ヨウ素からクロマトグラフィー（セファデックス
Ｇ−２５）により分離した。
スカッチャート分析ては、Ｍ２５−ＢＥ−４、Ｍ” −
ＢＥ−８及びＩ”−ＢＦ−６をＥＬＩＳＡで用いた。即
ち、 （イ）１カツプあたり１１０００ｎのＢＥ−４又はＢＦ
−８又はＢＰ−６でプレートを４°Ｃて一晩インキユベ
ートし、 （ロ）その後ＰＢ３５％アルブミンで飽和を行（ハ）そ
の後ｌｏｎｇのＩＬ−６により４°Ｃて２時間インキュ
ベーションを行った後、様々な濃度のヨウ素化抗体及び
、ある濃度に対してはまた、一連の非標識抗体をも４°
Ｃて９０分間インキユヘートし、 （ニ）３回洗浄して測定を行った。
ＢＥ−８及びＩ”−ＢＦ−６をＥＬＩＳＡで用いた。即
ち、 （イ）１カツプあたり１１０００ｎのＢＥ−４又はＢＦ
−８又はＢＰ−６でプレートを４°Ｃて一晩インキユベ
ートし、 （ロ）その後ＰＢ３５％アルブミンで飽和を行（ハ）そ
の後ｌｏｎｇのＩＬ−６により４°Ｃて２時間インキュ
ベーションを行った後、様々な濃度のヨウ素化抗体及び
、ある濃度に対してはまた、一連の非標識抗体をも４°
Ｃて９０分間インキユヘートし、 （ニ）３回洗浄して測定を行った。
Ｕ２６６２６６細胞いた測定は次のようにして行った。
ヨウ素化ＩＬ−６の代わりに、１０個６の細胞あたり２
０ｎｇという一定量のＩＬ−６を用いた他は実施例４と
同様にインキュベーションを３７°Ｃて３０分間行った
後、様々な濃度のヨウ素化モノクローナル抗体を添加し
て４°Ｃて６０分間インキュベートした。
０ｎｇという一定量のＩＬ−６を用いた他は実施例４と
同様にインキュベーションを３７°Ｃて３０分間行った
後、様々な濃度のヨウ素化モノクローナル抗体を添加し
て４°Ｃて６０分間インキュベートした。
結果 比活性
ＢＥ−４１ｎｇ＝４６６４ｃｐｍ
ＢＥ−８１ｎｇ＝４５７１ｃｐｍ
ＢＦ−６１ｎｇ＝４５１０ｃｐｍ
８Ｆ−６８Ｅ−４０，８Ｘｌ０−９Ｍ １５１８０
ＢＢ−４ＢＦ−６２，７Ｘｌ０−’Ｍ １５１６
８ＢＥ−４ＢＥ−８０，Ｉ Ｘｌ０−’Ｍ １４
８０２ＵＬ ２６６ ＩＬ−６＋抗体 ２６６ 受容体数 ＢＥ−４ ＢＦ−６ ＢＥ−８ ３、９Ｘ １０−’Ｍ ４．７ Ｘｌ０−’Ｍ ２．５ ｘｔｏ−’Ｍ １７３３ ７１６８ ３４２５ ＥＬＩＳＡスカッチャードは、全抗体について、この系
で結合したＩＬ−６は同一の濃度を示している。即ち、
得られたＫＤ値は合理的な値を示してでいる。
ＢＢ−４ＢＦ−６２，７Ｘｌ０−’Ｍ １５１６
８ＢＥ−４ＢＥ−８０，Ｉ Ｘｌ０−’Ｍ １４
８０２ＵＬ ２６６ ＩＬ−６＋抗体 ２６６ 受容体数 ＢＥ−４ ＢＦ−６ ＢＥ−８ ３、９Ｘ １０−’Ｍ ４．７ Ｘｌ０−’Ｍ ２．５ ｘｔｏ−’Ｍ １７３３ ７１６８ ３４２５ ＥＬＩＳＡスカッチャードは、全抗体について、この系
で結合したＩＬ−６は同一の濃度を示している。即ち、
得られたＫＤ値は合理的な値を示してでいる。
細胞株はＵ２６６上の受容体に結合したＩＬ−６のＫＤ
値はＥＬＴＳＡで得られた定数と異なっている。これは
受容体に結合した後はＩＬ−６の三次元構造に若干の変
化か起こることにより説明される。
値はＥＬＴＳＡで得られた定数と異なっている。これは
受容体に結合した後はＩＬ−６の三次元構造に若干の変
化か起こることにより説明される。
ＢＥ−４とＢＥ−８かＢＦ−６よりも受容体結合ＩＬ−
６の識別に劣るという発見は、ＢＥ−４とＢＥ−８とは
分子上の活性部位を同定し、受容体でのＩＬ−６ダイマ
ーしか認識できないか、ＢＦ−６はダイマー形状は別と
してモノマー形状を認識することかできるということて
説明することかできる。
６の識別に劣るという発見は、ＢＥ−４とＢＥ−８とは
分子上の活性部位を同定し、受容体でのＩＬ−６ダイマ
ーしか認識できないか、ＢＦ−６はダイマー形状は別と
してモノマー形状を認識することかできるということて
説明することかできる。
実施例７： ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６間の競
合実験 炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）中て４°Ｃて一晩インキュ
ベー１・することによりＴ Ｌ −６（ｔＩｉｇ ／ｃ
ｕｐ）をＥＬＩＳＡプレートに結合させた。その後、プ
レートをＰ Ｂ ３５ ％アルブミンて鉋和させ、４回
洗浄した。放射標識したＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−
６をそれぞれ異なる実験において添加し、インキュベー
トした。さらに、各放射標識抗体をまた１倍、１０倍、
１００倍過剰の非標識抗体てインキュベートした。
合実験 炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）中て４°Ｃて一晩インキュ
ベー１・することによりＴ Ｌ −６（ｔＩｉｇ ／ｃ
ｕｐ）をＥＬＩＳＡプレートに結合させた。その後、プ
レートをＰ Ｂ ３５ ％アルブミンて鉋和させ、４回
洗浄した。放射標識したＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−
６をそれぞれ異なる実験において添加し、インキュベー
トした。さらに、各放射標識抗体をまた１倍、１０倍、
１００倍過剰の非標識抗体てインキュベートした。
この実験は各抗体はそれ自身とのみ競合するたけてあっ
て、ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６の間に置換かない
ことを示している。これは三種の抗体すへてか異なるエ
ピドープを有していることを意味している。
て、ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６の間に置換かない
ことを示している。これは三種の抗体すへてか異なるエ
ピドープを有していることを意味している。
実施例８： ＩＬ−６の測定のためのサンドイッチＥ
ＬＩＳＡ （イ）ＢＥ−８（１０００ｎｇ／ｃｕｐ／１００μｌ）
により４°Ｃて一晩飽和し、 （ロ）ＰＢ３５％アルブミンにより室温で９０分間飽和
し、 （ロ）ヒト血清中ての様々な濃度のＩＬ−６とともに３
７°Ｃて２時間インキュベートし、（ニ）ビオチン化Ｂ
Ｅ−４（６，５μｇ／ｃｕｐ１００μＩ、ＰＢＳ、Ｔｗ
ｅｅｎＯ，５％）により室温で９０分間インキュベート
し、 （ホ）基質を添加し、測定した。
ＬＩＳＡ （イ）ＢＥ−８（１０００ｎｇ／ｃｕｐ／１００μｌ）
により４°Ｃて一晩飽和し、 （ロ）ＰＢ３５％アルブミンにより室温で９０分間飽和
し、 （ロ）ヒト血清中ての様々な濃度のＩＬ−６とともに３
７°Ｃて２時間インキュベートし、（ニ）ビオチン化Ｂ
Ｅ−４（６，５μｇ／ｃｕｐ１００μＩ、ＰＢＳ、Ｔｗ
ｅｅｎＯ，５％）により室温で９０分間インキュベート
し、 （ホ）基質を添加し、測定した。
ｎｇ ［Ｌ−６／ｃｕｐ／１００ｍ１ 光学濃
度１００ １、８０７１０
１．５６６１
１．３５６０、５
０．９２１０、２５ ０．５７３
０、１２５ ０．４０１０、０６２
０．３１１０、０３１
０．２１２０、０１５
０．１９００、００８ ０．１９
５０、００４ ０．１７０バック
グラウンド：光学濃度０．１５０テストの感度は血清中
０．３ ｎ ｇ／ｄののＩＬ−６である。
度１００ １、８０７１０
１．５６６１
１．３５６０、５
０．９２１０、２５ ０．５７３
０、１２５ ０．４０１０、０６２
０．３１１０、０３１
０．２１２０、０１５
０．１９００、００８ ０．１９
５０、００４ ０．１７０バック
グラウンド：光学濃度０．１５０テストの感度は血清中
０．３ ｎ ｇ／ｄののＩＬ−６である。
１カツプあたり２ＸＩＯ＠個のＧＢ株の細胞を、様々な
濃度の天然ＩＬ−６と様々な濃度の抗体ＢＥ−８ととも
にＨ３−チミジンを添加して５日間インキュヘートした
。
濃度の天然ＩＬ−６と様々な濃度の抗体ＢＥ−８ととも
にＨ３−チミジンを添加して５日間インキュヘートした
。
！Ｌ−６
０／ｍ１
７６４ １０２１３ ５６４３２ ７８
４２１１１９ １１０ ７２３７
７７６１０２２２ ２８０ ５９４
７３１９７２１２ ２０６ ２５６
６１０４０１９６ ２２４ ２３０
３８８５９ＩＵ ＩＬ’−６： ５０％最大
増殖を誘起させるのに必要なＩＬ−６の量 抵体ＢＥ−４についても同一の結果が得られた。
４２１１１９ １１０ ７２３７
７７６１０２２２ ２８０ ５９４
７３１９７２１２ ２０６ ２５６
６１０４０１９６ ２２４ ２３０
３８８５９ＩＵ ＩＬ’−６： ５０％最大
増殖を誘起させるのに必要なＩＬ−６の量 抵体ＢＥ−４についても同一の結果が得られた。
これらの結果はＩＬ−６依存性ヒト細胞株ＧＢ上におけ
るＢＥ−８及びＢＥ−４による天然ＩＬ−６（ヒトリン
パ球由来）の著しい阻害を示している。
るＢＥ−８及びＢＥ−４による天然ＩＬ−６（ヒトリン
パ球由来）の著しい阻害を示している。
Ｉ［１，ＢＥ−４を用いた初期的臨床結果最終段階の多
発性骨髄腫と診断され、２日て１ｉあたり５０，０００
〜１００，０００個の割合て形質細胞腫細胞の数か増加
していく患者を精製ＢＥ−４で処置した。
発性骨髄腫と診断され、２日て１ｉあたり５０，０００
〜１００，０００個の割合て形質細胞腫細胞の数か増加
していく患者を精製ＢＥ−４で処置した。
投与量は全４日にわたり１日あたり１０■（全投与量：
４０■）であった。抵抗は、１％ヒトアルブミンの食塩
水溶液中１ ｍｇ／−の濃度で３０分間注入された。治
療中いかなる副作用も見られなかった。
４０■）であった。抵抗は、１％ヒトアルブミンの食塩
水溶液中１ ｍｇ／−の濃度で３０分間注入された。治
療中いかなる副作用も見られなかった。
臨床的所見：熱か急速に下かり通常の体温に戻った。最
初の投与後すぐに全患者 とも重病感か消失した。
初の投与後すぐに全患者 とも重病感か消失した。
血液学的所見：腫瘍塊（形質細胞腫細胞）か最初の注入
後ただちに減少し、細胞 数が１７ｎｌあたり１００，０００個 からｔｙあたり４０，０００個に なり、全処置期間を通して安定し ていた。
後ただちに減少し、細胞 数が１７ｎｌあたり１００，０００個 からｔｙあたり４０，０００個に なり、全処置期間を通して安定し ていた。
Ｓ相（前分割相）における細胞数は処置により３０％か
ら１０％に減少した。
ら１０％に減少した。
これらの初期的臨床結果は多発性骨髄腫疾患の最終段階
にある患者について得られた。そのため、疾患の初期的
段階て処置をすれば、腫瘍塊は池の処置の可能性（たと
えば骨髄移植）か表われるほどに減少し得ることか期待
てきる。
にある患者について得られた。そのため、疾患の初期的
段階て処置をすれば、腫瘍塊は池の処置の可能性（たと
えば骨髄移植）か表われるほどに減少し得ることか期待
てきる。
今日までにこれらの患者のための有望な治療法は得られ
ていないのて、ＩＬ−６に対するモノクローナル抵抗を
用いた治療は、この致命的な疾患の治療に新風をもたら
すものであろう。
ていないのて、ＩＬ−６に対するモノクローナル抵抗を
用いた治療は、この致命的な疾患の治療に新風をもたら
すものであろう。
異なるエピドープを認識し、ともにＩＬ−６の活性を阻
害する抵体ＢＥ−４とＢＥ−８を組合わせて処置するこ
とにより、−層の改良か得られるてあろう。
害する抵体ＢＥ−４とＢＥ−８を組合わせて処置するこ
とにより、−層の改良か得られるてあろう。
あるいは、抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６は毒素
と結合させることもてき、これによりＩＬ−６活性のブ
ロックとは別に、形質細胞腫をその細胞上の受容体・＼
ＩＬ−６を固定することにより破壊することか可能とな
る。
と結合させることもてき、これによりＩＬ−６活性のブ
ロックとは別に、形質細胞腫をその細胞上の受容体・＼
ＩＬ−６を固定することにより破壊することか可能とな
る。
Claims (7)
- （１）マウスの免疫化脾細胞をマウス骨髄腫細胞と融合
することによるハイブリドーマ細胞株の製造方法におい
て、脾細胞を融合に先立ってインターロイキン−６に対
して免疫にし、融合細胞から三種の異なる細胞株、即ち
Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号Ｉ／９１３（ＢＥ−８）のハ
イブリドーマ細胞株、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号Ｉ／９
１１（ＢＥ−４）及びＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号Ｉ／９
１２（ＢＦ−６）のハイブリドーマ細胞株を同定、単離
し、これらの細胞株がヒトインターロイキン−６を認識
するモノクローナル抗体を産生し、異なる細胞株に応じ
てインターロイキン−６分子上の異なるエピドープに各
々結合するものであることを特徴とする製造方法。 - （２）ハイブリドーマ細胞株がＸ６３Ａｇ８６５３ネズ
ミ骨髄腫細胞により得られることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - （３）モノクローナル抗体がヒトインターロイキン−６
に対して特異的な結合作用を有することを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の方法。 - （４）細胞株ＢＥ−４とＢＥ−８により産生された抗体
がヒトの細胞及びネズミの細胞のインターロイキン−６
受容体に結合し得ることを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - （５）モノクローナル抗体がキメラを形成し、一定部が
ヒトＩｇからなり、可変部、特に超可変部がネズミＩｇ
からなることを特徴とする特許請求第１項記載の方法。 - （６）モノクローナル抗体が毒素及び（又は）化学療法
剤に結合していることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。 - （７）インターロイキン６依存性疾患、特に腫瘍疾患、
自己免疫疾患、あらゆる感染症、急性期応答障害の治療
、予防及び診断のための、特許請求の範囲第１項記載の
方法により得られたモノクローナル抗体の使用。
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- 1990-12-03 BR BR909006128A patent/BR9006128A/pt not_active Application Discontinuation
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