JPH03232896A - 凝固点降下ペプチド - Google Patents
凝固点降下ペプチドInfo
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- JPH03232896A JPH03232896A JP2875790A JP2875790A JPH03232896A JP H03232896 A JPH03232896 A JP H03232896A JP 2875790 A JP2875790 A JP 2875790A JP 2875790 A JP2875790 A JP 2875790A JP H03232896 A JPH03232896 A JP H03232896A
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- JP
- Japan
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- dna
- afp
- depressing
- freezing point
- protein
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は多量体凝固点降下ペプチド、該蛋白質の構造遺
伝子、および該蛋白質の製造法に関する。
伝子、および該蛋白質の製造法に関する。
凝固点降下因子は、極地および冬期に凍結する海域に生
息する魚類（タラ、ヒラメなど）の血液より同定され、
その構造から、糖蛋白質と単純ペプチドに大別される（
Ａｄｖ、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ、 ３２．１９１
（１９７８））。これら凝固点降下因子は、氷結晶表面
と水素結合によって結合し、氷結晶の成長を阻害するこ
とにより血液の凝固点を低下させると言われ（Ａｎｎ、
Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｃ
ｈｅｍ、 １５．５９（１９８６））、結果として低温
水域でのこれら魚類の生存を可能にしている。
息する魚類（タラ、ヒラメなど）の血液より同定され、
その構造から、糖蛋白質と単純ペプチドに大別される（
Ａｄｖ、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ、 ３２．１９１
（１９７８））。これら凝固点降下因子は、氷結晶表面
と水素結合によって結合し、氷結晶の成長を阻害するこ
とにより血液の凝固点を低下させると言われ（Ａｎｎ、
Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｃ
ｈｅｍ、 １５．５９（１９８６））、結果として低温
水域でのこれら魚類の生存を可能にしている。
これら凝固点降下因子は、その活性から、食品、医薬品
、臓器、細胞などの非凍結低温保存への応用が考えられ
る。それら目的に利用するための凝固点降下因子の工業
的生産法として、ペプチドの化学的合成、または遺伝子
工学的生産が用いられる。凝固点降下糖蛋白質は、糖部
分がその活性に必須であることから、その工業的生産は
困難である。一方、凝固点降下ペプチドについては、化
学的合成は可能であるが、その際、生産コストが高額と
なり、生産スケールも小さく、問題である。
、臓器、細胞などの非凍結低温保存への応用が考えられ
る。それら目的に利用するための凝固点降下因子の工業
的生産法として、ペプチドの化学的合成、または遺伝子
工学的生産が用いられる。凝固点降下糖蛋白質は、糖部
分がその活性に必須であることから、その工業的生産は
困難である。一方、凝固点降下ペプチドについては、化
学的合成は可能であるが、その際、生産コストが高額と
なり、生産スケールも小さく、問題である。
また、この凝固点降下ペプチドを遺伝子工学的に大腸菌
内で生産させた場合、凝固点降下ペプチドの分子量が小
さいため、菌体内で分解され易いという問題がある。
内で生産させた場合、凝固点降下ペプチドの分子量が小
さいため、菌体内で分解され易いという問題がある。
さらに、天然の凝固点効果ペプチドではそのＣ末がアミ
ド型であるのに対して、遺伝子工学的に大腸菌で生産さ
せた場合、Ｃ末はフリーとなり天然型より活性が低いと
いう問題もある。
ド型であるのに対して、遺伝子工学的に大腸菌で生産さ
せた場合、Ｃ末はフリーとなり天然型より活性が低いと
いう問題もある。
本発明者らは、このような問題点を解決すべく、まず、
凝固点降下ペプチドの多量体のアミノ酸配列をコードす
る構成遺伝子を、ＤＮＡ合成技術および組換えＤＮＡ技
術により作製した。本発明における凝固点降下ペプチド
とは、Ｙｕａｎ Ｌｉｎらによりヒラメ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｕｓ ａｍｅｒｉｃａｍｕｓ）の
肝臓よりクローニングされたｃＤＮＡにコートされた次
に示す３７アミノ酸からなる凝固点降下ペプチド（以下
ＡＦＰと略す）をさす（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ １． Ａ
ｃａｄ、ｓｃｉ、 ７８．２８２５（１９８１））。
凝固点降下ペプチドの多量体のアミノ酸配列をコードす
る構成遺伝子を、ＤＮＡ合成技術および組換えＤＮＡ技
術により作製した。本発明における凝固点降下ペプチド
とは、Ｙｕａｎ Ｌｉｎらによりヒラメ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｕｓ ａｍｅｒｉｃａｍｕｓ）の
肝臓よりクローニングされたｃＤＮＡにコートされた次
に示す３７アミノ酸からなる凝固点降下ペプチド（以下
ＡＦＰと略す）をさす（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ １． Ａ
ｃａｄ、ｓｃｉ、 ７８．２８２５（１９８１））。
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ、−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｌａＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
−ＡｌａＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｌａＡｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ａｓｐは
アスパラキン酸を、Ｔｈｒはスレオニンを、Ａｌａはア
ラニンを、Ｓｅｒはセリンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌ
ｙｓはリジンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ａｓｎはア
スパラギンを、Ａｒｇはアルギニンを表す。） しかしながら、本発明は、上記のアミノ酸配列を持つＡ
ＦＰに限定されるものではなく、他の凝固点降下ペプチ
ド、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ４９５、３８８（１９７７）に記載された凝固点
降下ペプチドや、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ７８．２８２５（１９８１）に記載された
凝固点降下ペプチドについても適用される。
ｌａ、−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｌａＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
−ＡｌａＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｌａＡｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ａｓｐは
アスパラキン酸を、Ｔｈｒはスレオニンを、Ａｌａはア
ラニンを、Ｓｅｒはセリンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌ
ｙｓはリジンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ａｓｎはア
スパラギンを、Ａｒｇはアルギニンを表す。） しかしながら、本発明は、上記のアミノ酸配列を持つＡ
ＦＰに限定されるものではなく、他の凝固点降下ペプチ
ド、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ４９５、３８８（１９７７）に記載された凝固点
降下ペプチドや、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ７８．２８２５（１９８１）に記載された
凝固点降下ペプチドについても適用される。
多量体ＡＦＰのアミノ酸配列をコードする構成遺伝子の
作製の際、多量体ＡＦＰを大腸菌で大量に生産させる目
的で、ＡＦＰの塩基配列のコドン使用を、できる限り大
腸菌のコドン使用に変換した。その変換に際しては、油
付らの総説（細胞工 − 学２．１５４１ （１９８３））を参考にした。また
、５“上流にはりボゾーム結合共通配列を配した。また
、ＤＮＡの組換えをより容易に行うためにＤＮＡ配列内
にできる限り多くの制限酵素部位を配した。
作製の際、多量体ＡＦＰを大腸菌で大量に生産させる目
的で、ＡＦＰの塩基配列のコドン使用を、できる限り大
腸菌のコドン使用に変換した。その変換に際しては、油
付らの総説（細胞工 − 学２．１５４１ （１９８３））を参考にした。また
、５“上流にはりボゾーム結合共通配列を配した。また
、ＤＮＡの組換えをより容易に行うためにＤＮＡ配列内
にできる限り多くの制限酵素部位を配した。
その結果創成した、多量体ＡＦＰを大腸菌で大量に生産
させる目的に合致したＤＮＡ配列を以下に示す。
させる目的に合致したＤＮＡ配列を以下に示す。
ＧＡＴＡＣＴＧＣＴＡ ＧＣＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡ
ＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＡＡＡＣ
ＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＡＧＴＴＡＡ ＣＴ
ＧＣＴＧＣＡＡＡ ＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ
ＧＣＴＧ ＣＴＡＣＴＧＣＧＣＧ Ｃ化学合成法および
組換えＤＮＡ法により上記ＤＮＡ配列を作製し、さらに
組換えＤＮＡ法によりＡＦＰの構成遺伝子部分を多量体
化し、多量体ＡＦＰをコードする構成遺伝子を作製した
。
ＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＡＡＡＣ
ＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＡＧＴＴＡＡ ＣＴ
ＧＣＴＧＣＡＡＡ ＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ
ＧＣＴＧ ＣＴＡＣＴＧＣＧＣＧ Ｃ化学合成法および
組換えＤＮＡ法により上記ＤＮＡ配列を作製し、さらに
組換えＤＮＡ法によりＡＦＰの構成遺伝子部分を多量体
化し、多量体ＡＦＰをコードする構成遺伝子を作製した
。
この遺伝子を発現ベクターに組み込み、遺伝子をプロモ
ーターの下流に含有している組換えベクターを得た。得
られた組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。
ーターの下流に含有している組換えベクターを得た。得
られた組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。
本発明の実施例において、プロモーターとしてはｔａｃ
プロモーター （Ｐｒ。
プロモーター （Ｐｒ。
ｃ、 Ｎａｔ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ７８．２
０１９８３））の−３５領域と１０領域間の距離を１７
塩基対としたｔｒｃプロモーター（Ｇｅｎｅ ４０，１
８３（１９８５））を用い、ｔｒｃプロモーターを構成
的とするため、大腸菌ＪＭＩＯ９株よりＦ因子を脱落さ
せたＪＭ１０９Ｆ−株を宿主菌とした。しかし、公知の
宿主−ベクター系のほとんどはこの該遺伝子の発現に適
用され、上記の宿主−ベクター系に限定されるものでは
ない。
０１９８３））の−３５領域と１０領域間の距離を１７
塩基対としたｔｒｃプロモーター（Ｇｅｎｅ ４０，１
８３（１９８５））を用い、ｔｒｃプロモーターを構成
的とするため、大腸菌ＪＭＩＯ９株よりＦ因子を脱落さ
せたＪＭ１０９Ｆ−株を宿主菌とした。しかし、公知の
宿主−ベクター系のほとんどはこの該遺伝子の発現に適
用され、上記の宿主−ベクター系に限定されるものでは
ない。
ｔｒｃプロモーター以外に例えは、ｔａｃブロモター（
前述）、ｌａｃプロモーター（Ｇｅｎｅ １９，４３（
１９８２））、ｔｒｐプロモーター（Ｎｕｃ！ｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １０．６６８９ （１９８２
）） 、Ｐ Ｒプロモーター（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、 １１，７７３（１９８３）、Ｐ ＋
、プロモーター（Ｇｅｎｅ １７，４５（１９８２））
及びｌｐｐプロモーター（ＥＭＢＯＪ、 Ｌ７７１
（１９８２））などの公知のプロモーターを持つ発現ベ
クターを用いることができる。本発明のＡＦＰのような
低分子のペプチドを遺伝子工学的に大腸菌で生産させる
場合通常、低分子との融合蛋白質として発現させるか、
または分泌シグナルを付加して分泌発現させるといった
手法が用いられる。ＡＦＰを融合蛋白質として発現させ
た場合、融合蛋白質から切り出したＡＦＰは低活性のＣ
末フリー型となり、天然のＣ末がアミド化させているペ
プチドと較べてその活性か低下する。また、分泌発現さ
れたＡＦＰもＣ末フリー型となり、天然のＡＦＰと比較
してその活性が低い。従って、このような従来技術を用
いた場合、天然のＡＦＰと同等の活性を持つ微生物由来
のＡＦＰを取得することは困難である。
前述）、ｌａｃプロモーター（Ｇｅｎｅ １９，４３（
１９８２））、ｔｒｐプロモーター（Ｎｕｃ！ｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １０．６６８９ （１９８２
）） 、Ｐ Ｒプロモーター（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、 １１，７７３（１９８３）、Ｐ ＋
、プロモーター（Ｇｅｎｅ １７，４５（１９８２））
及びｌｐｐプロモーター（ＥＭＢＯＪ、 Ｌ７７１
（１９８２））などの公知のプロモーターを持つ発現ベ
クターを用いることができる。本発明のＡＦＰのような
低分子のペプチドを遺伝子工学的に大腸菌で生産させる
場合通常、低分子との融合蛋白質として発現させるか、
または分泌シグナルを付加して分泌発現させるといった
手法が用いられる。ＡＦＰを融合蛋白質として発現させ
た場合、融合蛋白質から切り出したＡＦＰは低活性のＣ
末フリー型となり、天然のＣ末がアミド化させているペ
プチドと較べてその活性か低下する。また、分泌発現さ
れたＡＦＰもＣ末フリー型となり、天然のＡＦＰと比較
してその活性が低い。従って、このような従来技術を用
いた場合、天然のＡＦＰと同等の活性を持つ微生物由来
のＡＦＰを取得することは困難である。
しかし、本発明者らは、多量体ＡＦＰを作成することに
よって、この問題を解決した。
よって、この問題を解決した。
さらに、得られた形質転換株より多量体ＡＦＰを精製し
た。本発明の実施例においては、４量体ＡＦＰの精製法
を示した。即ち、まず形質転換株を培養し、得られた菌
体を超音波ホモジナイザーにより破砕した後、遠心分離
により菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液に冷エタ
ノールを加えエタノール濃度６０％の条件でエタノール
分別を行い、回収された上清画分を限外濾過法により濃
縮脱塩した。次に、濃縮脱塩された両分を硫酸アンモニ
ウム濃度５０％で硫安分画し、その沈澱画分を透析した
。最後に、透析画分をＤＥＡＥカラムさらに逆相カラム
により精製し、４量体ＡＦＰの純化を達成した。しかし
ながら、この精製法は４量体ＡＦＰに限らず多量体ＡＦ
Ｐの精製に広く適用されるものである。さらに、その他
の有機溶媒分別法、塩析法、クロマトクラフィー、遠心
分離などを適当に組み合わせることによっても多量体Ａ
ＦＰを精製することはでき、多量体ＡＦＰの精製法は本
発明の実施例に限定されるものではない。
た。本発明の実施例においては、４量体ＡＦＰの精製法
を示した。即ち、まず形質転換株を培養し、得られた菌
体を超音波ホモジナイザーにより破砕した後、遠心分離
により菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液に冷エタ
ノールを加えエタノール濃度６０％の条件でエタノール
分別を行い、回収された上清画分を限外濾過法により濃
縮脱塩した。次に、濃縮脱塩された両分を硫酸アンモニ
ウム濃度５０％で硫安分画し、その沈澱画分を透析した
。最後に、透析画分をＤＥＡＥカラムさらに逆相カラム
により精製し、４量体ＡＦＰの純化を達成した。しかし
ながら、この精製法は４量体ＡＦＰに限らず多量体ＡＦ
Ｐの精製に広く適用されるものである。さらに、その他
の有機溶媒分別法、塩析法、クロマトクラフィー、遠心
分離などを適当に組み合わせることによっても多量体Ａ
ＦＰを精製することはでき、多量体ＡＦＰの精製法は本
発明の実施例に限定されるものではない。
最終的に得られた多量体ＡＦＰは、酵素的に切断するこ
とにより単量体化させることができる。
とにより単量体化させることができる。
この場合の酵素とはトリプシン、アルギニルエンドペプ
チダーゼ（蛋白質・核酸・酵素３４．３７４（１９８９
））などがよいが、トリプシンを用いる場合、マレイル
化、シトラコニル化などによりＬｙｓのεアミノ基を可
逆的に化学修飾する必要がある。
チダーゼ（蛋白質・核酸・酵素３４．３７４（１９８９
））などがよいが、トリプシンを用いる場合、マレイル
化、シトラコニル化などによりＬｙｓのεアミノ基を可
逆的に化学修飾する必要がある。
以上のようにして得られた遺伝子工学的に大腸菌で生産
させた多量体ＡＦＰについて、実施例に述べるように、
化学的に合成した天然型ＡＦＰおよびＣ末フリーの単量
体ＡＦＰを対照として凝固点降下能の測定を行なった。
させた多量体ＡＦＰについて、実施例に述べるように、
化学的に合成した天然型ＡＦＰおよびＣ末フリーの単量
体ＡＦＰを対照として凝固点降下能の測定を行なった。
その結果、Ｃ末フリーの単量体ＡＦＰは天然型ＡＦＰの
約４０％の活性しか示さなかったのに対して、多量体Ａ
ＦＰは天然型ＡＦＰの約７３％の活性を示した。
約４０％の活性しか示さなかったのに対して、多量体Ａ
ＦＰは天然型ＡＦＰの約７３％の活性を示した。
このように、遺伝子工学的に大腸菌で産生させた多量体
Ａ、ＦＰは、Ｃ末がフリーとなることに起因する活性の
低下を、多量体化することにより大幅に回復することが
出来た。
Ａ、ＦＰは、Ｃ末がフリーとなることに起因する活性の
低下を、多量体化することにより大幅に回復することが
出来た。
この発明により、従来技術では問題のあった、凝固点降
下ペプチドの工業的生産が可能になった。
下ペプチドの工業的生産が可能になった。
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。し
かし、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明
の技術分野において通常行われる変更をすることができ
る。
かし、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明
の技術分野において通常行われる変更をすることができ
る。
実施例
１、 多量体ＡＦＰをコートする遺伝子の調製１本鎖Ｄ
ＮＡの合成は、すべてＤＮＡ合成機３８０ Ａ （Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて機器操
作手順書に従って合成し、公知の方法（特開昭６３−２
２１９０）に準じて精製した。また、本実施例に記載さ
れているすべてのＤＮＡ組換え技術に関する操作は、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ（１９８２）に準じて行った。また、各種酵
素反応は、それぞれの酵素試薬に添付の納置に従って行
った。
ＮＡの合成は、すべてＤＮＡ合成機３８０ Ａ （Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて機器操
作手順書に従って合成し、公知の方法（特開昭６３−２
２１９０）に準じて精製した。また、本実施例に記載さ
れているすべてのＤＮＡ組換え技術に関する操作は、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ（１９８２）に準じて行った。また、各種酵
素反応は、それぞれの酵素試薬に添付の納置に従って行
った。
ＡＦＰを大腸菌で大量に生産させる目的に合致したＤＮ
Ａ配列を得るために、以下に示した８種類の１本鎖ＤＮ
Ａ（Ｆｌ〜Ｆ８）を化学合成し、精製した。
Ａ配列を得るために、以下に示した８種類の１本鎖ＤＮ
Ａ（Ｆｌ〜Ｆ８）を化学合成し、精製した。
ＣＴＧ
Ｆｌ（６０Ｍｅｒ）
ＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＡＧＴＴＴＴＧ
ＣＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡこれらＦｌ−Ｆ８を用
いての、ＡＦＰをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＡＦ３の構築方法を第２図に示した。Ｆ１〜Ｆ８の５′
末端をリン酸化するため、それぞれ０．５ｎｍｏｌｅず
つを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９，５）、
ｌｏｍＭ ＭｇＣｌ２．５ｍＭ ＤＴＴ、５％Ｇｌｙｃ
ｅｒｏｌ、 ５０μＭ ＡＴＰを含む２００μ！の反応
系で８０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーセ（全酒造
製）と共に、３７℃で１時間反応させた。Ｆｌ−Ｆ６の
反応溶液をそれぞれ５０μβずつ混合し３００μｌとし
、また、Ｆｌ、Ｆ８の反応溶液をそれぞれ１００μβず
つ混合し２００μｌとした。これら２種類の混合液を７
０℃で５分間、５６°Ｃで１時間、４２°Ｃで１時間、
３７°Ｃで１時間と順次反応温度を下げたアニーリング
反応を行い、エタノール沈澱でＤＮＡを回収し、Ｆ１〜
Ｆ６およびＦｌ、Ｆ８のアニーリング物を得た。
ＣＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡこれらＦｌ−Ｆ８を用
いての、ＡＦＰをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＡＦ３の構築方法を第２図に示した。Ｆ１〜Ｆ８の５′
末端をリン酸化するため、それぞれ０．５ｎｍｏｌｅず
つを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９，５）、
ｌｏｍＭ ＭｇＣｌ２．５ｍＭ ＤＴＴ、５％Ｇｌｙｃ
ｅｒｏｌ、 ５０μＭ ＡＴＰを含む２００μ！の反応
系で８０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーセ（全酒造
製）と共に、３７℃で１時間反応させた。Ｆｌ−Ｆ６の
反応溶液をそれぞれ５０μβずつ混合し３００μｌとし
、また、Ｆｌ、Ｆ８の反応溶液をそれぞれ１００μβず
つ混合し２００μｌとした。これら２種類の混合液を７
０℃で５分間、５６°Ｃで１時間、４２°Ｃで１時間、
３７°Ｃで１時間と順次反応温度を下げたアニーリング
反応を行い、エタノール沈澱でＤＮＡを回収し、Ｆ１〜
Ｆ６およびＦｌ、Ｆ８のアニーリング物を得た。
Ｆ１〜Ｆ６のアニーリング物を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、６．５ｍＭ ＭｇＣＬ ５０μ
ｍに溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ のＡ液２００μ、ｉ！、Ｂ液２０μｌを加え、１
６°Ｃで１時間反応させた後、６５°Ｃて５分間熱処理
し酵素を失活させ、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収
した。得られたＤＮＡを５０単位のＳａｌ Ｉおよび５
０単位の旧ｎｄｌｌＩ（いずれも全酒造製）により切断
した。また、プラスミドｐＵｃ１９（全酒造製）０．５
μｇを５単位のＳａｔ Ｉおよび５単位の旧ｎｄｌＩＩ
（いずれも全酒造製）により切断した。これらＤＮＡを
混合しエタノール沈澱により回収した後、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、６．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２５μβに溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ ＫｉｔのＡ液５０μｌ、Ｂ液５μｌを加え、１６℃
で１．５時間反応させた。この反応液１５μｌを用いて
、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテント細胞（全酒造製）
を形質転換しくＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
ｐｐ２５０−２５１ ） 、アンピシリン耐性株を５０
μｇ／−アンピシリンを含むＬ−プレート （１％
バタトトリプトン、０．５％）くクトイースト抽出物、
０．５％ＮａＣ１，１，５％寒天）上で選択した。得ら
れた形質転換株のうち任意の株からプラスミドＤＮＡを
アルカリ法（前述ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ
ｐｐ３６８−３６９ ）により調製し、これらプラスミ
ドの制限酵素地図を作製することにより、目的とするプ
ラスミドが得られていることを確認した。このプラスミ
ドを ｐＡＦ ｌと命名した。次に、Ｆｌ、Ｆ８のアニ
ーリング物を、７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５
）、 ２０ｍＭ ＮａＣｌ、 ７ｍＭ ＭｇＣＬ、 ０
．１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、 ０．
１ｍＭ ｄＣＴＰ、 ０．１ｍＭ ｄＧＴＰ、 ０．１
ｍＭ ｄＴＴＰの反応溶液１００μβ中で５単位のＳｍ
ａＩリンカ−（宝造製）とともに、３７℃で３０分間反
応させた後、７０°Ｃで５分間熱処理し酵素を失活させ
た。このうち１ｎｇを、５単位のＳｍａＩ （全酒造製
）により切断したプラスミドｐＵｃ１９ （全酒造製
）１ｎｇと混合し、エタノール沈澱により回収した後、
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６．５
ｍＭ ＭｇＣＬ ５ ｔｔ （ｌに溶解し、全酒造製Ｄ
ＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔのＡ液５０μＡ、Ｂ液
５μｎを加え、１６°Ｃで１．５時間反応させた。この
反応液３μｌを用いて、大腸菌ＪＭ １０９株のコンピ
テント細胞（全酒造製）を形質転換し、アンピシリン耐
性株を５０μｇ／７ｎｌアンピシリンを含むＬ〜プレー
ト上で選択した。 得られた形質転換株のうち任意の株
からプラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製し、これ
らプラスミドの制限酵素地図を作製することにより、目
的とするプラスミドか得られていることを確認した。こ
のプラスミドをｐＡＦ２と命名した。
ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、６．５ｍＭ ＭｇＣＬ ５０μ
ｍに溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ のＡ液２００μ、ｉ！、Ｂ液２０μｌを加え、１
６°Ｃで１時間反応させた後、６５°Ｃて５分間熱処理
し酵素を失活させ、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収
した。得られたＤＮＡを５０単位のＳａｌ Ｉおよび５
０単位の旧ｎｄｌｌＩ（いずれも全酒造製）により切断
した。また、プラスミドｐＵｃ１９（全酒造製）０．５
μｇを５単位のＳａｔ Ｉおよび５単位の旧ｎｄｌＩＩ
（いずれも全酒造製）により切断した。これらＤＮＡを
混合しエタノール沈澱により回収した後、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、６．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２５μβに溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ ＫｉｔのＡ液５０μｌ、Ｂ液５μｌを加え、１６℃
で１．５時間反応させた。この反応液１５μｌを用いて
、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテント細胞（全酒造製）
を形質転換しくＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
ｐｐ２５０−２５１ ） 、アンピシリン耐性株を５０
μｇ／−アンピシリンを含むＬ−プレート （１％
バタトトリプトン、０．５％）くクトイースト抽出物、
０．５％ＮａＣ１，１，５％寒天）上で選択した。得ら
れた形質転換株のうち任意の株からプラスミドＤＮＡを
アルカリ法（前述ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ
ｐｐ３６８−３６９ ）により調製し、これらプラスミ
ドの制限酵素地図を作製することにより、目的とするプ
ラスミドが得られていることを確認した。このプラスミ
ドを ｐＡＦ ｌと命名した。次に、Ｆｌ、Ｆ８のアニ
ーリング物を、７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５
）、 ２０ｍＭ ＮａＣｌ、 ７ｍＭ ＭｇＣＬ、 ０
．１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、 ０．
１ｍＭ ｄＣＴＰ、 ０．１ｍＭ ｄＧＴＰ、 ０．１
ｍＭ ｄＴＴＰの反応溶液１００μβ中で５単位のＳｍ
ａＩリンカ−（宝造製）とともに、３７℃で３０分間反
応させた後、７０°Ｃで５分間熱処理し酵素を失活させ
た。このうち１ｎｇを、５単位のＳｍａＩ （全酒造製
）により切断したプラスミドｐＵｃ１９ （全酒造製
）１ｎｇと混合し、エタノール沈澱により回収した後、
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６．５
ｍＭ ＭｇＣＬ ５ ｔｔ （ｌに溶解し、全酒造製Ｄ
ＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔのＡ液５０μＡ、Ｂ液
５μｎを加え、１６°Ｃで１．５時間反応させた。この
反応液３μｌを用いて、大腸菌ＪＭ １０９株のコンピ
テント細胞（全酒造製）を形質転換し、アンピシリン耐
性株を５０μｇ／７ｎｌアンピシリンを含むＬ〜プレー
ト上で選択した。 得られた形質転換株のうち任意の株
からプラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製し、これ
らプラスミドの制限酵素地図を作製することにより、目
的とするプラスミドか得られていることを確認した。こ
のプラスミドをｐＡＦ２と命名した。
次に、１０μｇのプラスミドｐＡＦ２を２０単位のＥａ
ｇ■と１２単位のＮｈｅＩ （いずれもＮｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）で切断し、エタノール
沈澱でＤＮＡを回収した。このＤＮＡを８％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し、８８ｂｐＤ Ｎ Ａ断
片を含むゲルを切り出し単離し、ゲルからＤＮＡを精製
した（前述Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｐ
１７８ ） 。また、５μｇのプラスミドｐＡＦ１を２
０単位のＥａｇ Ｉと１２単位のＮｈｅＩ （いずれも
Ｎｅｗ ＥｎｇＩａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）で切断し
、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。先にゲルより回
収した８８ｂｐＤ Ｎ Ａ断片と、Ｅａｇ ＩとＮｈｅ
Ｉで切断したｐＡＦｌのうち０．７５μｇを混合し、エ
タノール沈澱でＤＮＡを回収した後、１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＩ３ ＣＩ（ｐＨ７，５）、 ６．５ ｍＭ ＭｇＣＬ ５μ
＊に溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔのＡ液３０μｆｆ、Ｂ液５μｊ２を加え、１６℃で１
時間反応させた。この全反応液を用いて、大腸菌ＪＭ
１０９株のコンピテント細胞（全酒造製）を形質転換し
、アンピシリン耐性株を５０μｇ／ｍＡ’アンピシリン
を含むし一プレート上で選択した。得られた形質転換株
のうち任意の株からプラスミドＤＮＡをアルカリ法によ
り調製し、これらプラスミドの制限酵素地図を作製する
ことにより、目的とするプラスミドが得られていること
を確認した。このプラスミドをｐＡＦ３と命名した。
ｇ■と１２単位のＮｈｅＩ （いずれもＮｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）で切断し、エタノール
沈澱でＤＮＡを回収した。このＤＮＡを８％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し、８８ｂｐＤ Ｎ Ａ断
片を含むゲルを切り出し単離し、ゲルからＤＮＡを精製
した（前述Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｐ
１７８ ） 。また、５μｇのプラスミドｐＡＦ１を２
０単位のＥａｇ Ｉと１２単位のＮｈｅＩ （いずれも
Ｎｅｗ ＥｎｇＩａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）で切断し
、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。先にゲルより回
収した８８ｂｐＤ Ｎ Ａ断片と、Ｅａｇ ＩとＮｈｅ
Ｉで切断したｐＡＦｌのうち０．７５μｇを混合し、エ
タノール沈澱でＤＮＡを回収した後、１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＩ３ ＣＩ（ｐＨ７，５）、 ６．５ ｍＭ ＭｇＣＬ ５μ
＊に溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔのＡ液３０μｆｆ、Ｂ液５μｊ２を加え、１６℃で１
時間反応させた。この全反応液を用いて、大腸菌ＪＭ
１０９株のコンピテント細胞（全酒造製）を形質転換し
、アンピシリン耐性株を５０μｇ／ｍＡ’アンピシリン
を含むし一プレート上で選択した。得られた形質転換株
のうち任意の株からプラスミドＤＮＡをアルカリ法によ
り調製し、これらプラスミドの制限酵素地図を作製する
ことにより、目的とするプラスミドが得られていること
を確認した。このプラスミドをｐＡＦ３と命名した。
次に、２５μｇのプラスミｌ’ｐＡＦ３を２０単位のＤ
ｄｅ■と３０単位のＮｃｏＩ（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）で切断し、フェノール抽
出後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。このＤＮ
Ａを５０μｌの３０＋ｎＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６
）、 ｌｏＯｍＭ ＮａＣｌ、 １ｍＭ ＺｎＳＯ４の
反応系で１単位の８１ヌクレアーゼ（全酒造製）と３７
℃で３００分間反応せた後、フェノール抽出後エタノー
ル沈澱によりＤＮＡを回収し全ＤＮＡを５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し、１ｌｌｂｐ ＤＮＡ断
片を含むゲルを切り出し単離し、ゲルからＤＮＡを精製
した。さらに、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７，５）、６．５ｍＭ ＭｇＣｌ２５．ｃｚ １２に溶
解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔのＡ
液３０μβ、Ｂ液１０μｐを加え、１６℃で４時間反応
させた。エタノール沈澱でＤＮＡを回収し、さらに、２
０単位のＮｈｅＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ製）で切断し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収
した。このＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分離し１１１ｂｐ ＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、ゲルからＤＮＡを精製した。一方、３μｇのプラス
ミドｐＢＲ３２２（全酒造製）を１０単位のＮｈｅＩ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）で切断
し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収し、さらに１００７
ｚｊ！の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ（ｐＨ８，０）
の反応系でアルカリ性フォスファターゼ０．３５単位と
、５５℃で３００分間反応せた。フェノール抽出後エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収し、さらにその５分の１
量を、先にゲルより回収した１、１１ｂｐ Ｄ Ｎ Ａ
断片と混合しエタノール沈澱し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（Ｉ］Ｈ７，５）、６．５ｍＭ ＭｇＣｌ２μ
ｍに溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔのＡ液８ｆ、１１．Ｂ液３μβを加え、１６℃で４時
間反応させた。この全反応液を用いて、大腸菌ＪＭ １
０９株のコンピテント細胞（全酒造製）を形質転換し、
アンピシリン耐性株を５０μｇ／Ｊアンピシリンを含む
し一プレート上で選択した。得られた形質転換株のうち
任意の株からプラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製
し、これらプラスミドの制限酵素地図を作製することに
より、目的とするプラスミドが得られていることを確認
した。このプラスミドをｐＡＦ３Ｎｈと命名した。さら
に、１００μｇのプラスミドｐＡＦ３Ｎｈを５０単位の
ＮｈｅＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
製）で切断し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。こ
のＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、１１１ｂｐＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、ゲル
からＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡのうち０．５μ
ｇを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、
６．５ｍＭ ＭｇＣＬ ３２ｕ （ｌに溶解し、全酒
造製ＤＮＡ ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔのＡ液１２８μｌ
、Ｂ液２０μｌを加え、１６℃で２分間反応させた。エ
タノール沈澱でＤＮＡを回収した後、５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分離し、１ｌｌｂｐ、 ２２２
ｂｐ、３３３ｂｐおよび４４４ｂｐのＤＮＡ断片を含む
ゲルをそれぞれ切り出し、ゲルから各ＤＮＡ断片を精製
した。一方、１０μｇのプラスミドｐＡＦ３を１０単位
のＮｈｅＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ１ａ
ｂｓ製）で切断し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収し、
さらに１００μｎの １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ８，０）の反応系でアルカリ性フォスファターセ０
．３５単位と、５５℃で３０分間反応させた。フェノー
ル抽出後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、さらに
そのうち０．５μｇずつを、先にゲルより回収した１１
１ｂｐ、 ２２２ｂｐ、 ３３３ｂｐおよび４４４ｂｐ
のＤＮＡ断片とそれぞれ混合しエタノール沈澱し、ｌｏ
ＯｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐｌ（７，５）、６．５ｍＭ
ＭｇＣ１，３μｍに溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ ＫｉｔのＡ液１２μｎ、Ｂ液３７１１２を
加え、１６℃で４時間反応させた。これら全反応液を用
いて、大腸菌ＪＭ １０９株のコンピテント細胞（全酒
造製）をそれぞれ形質転換し、アンピシリン耐性株を５
０μｇ／ｉアンピシリンを含むＬ−プレート上で選択し
た。それぞれ得られた形質転換株のうち任意の株からプ
ラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製し、これらプラ
スミドの制限酵素地図を作製することにより、目的とす
るプラスミドがそれぞれ得られていることを確認した。
ｄｅ■と３０単位のＮｃｏＩ（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）で切断し、フェノール抽
出後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。このＤＮ
Ａを５０μｌの３０＋ｎＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６
）、 ｌｏＯｍＭ ＮａＣｌ、 １ｍＭ ＺｎＳＯ４の
反応系で１単位の８１ヌクレアーゼ（全酒造製）と３７
℃で３００分間反応せた後、フェノール抽出後エタノー
ル沈澱によりＤＮＡを回収し全ＤＮＡを５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し、１ｌｌｂｐ ＤＮＡ断
片を含むゲルを切り出し単離し、ゲルからＤＮＡを精製
した。さらに、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７，５）、６．５ｍＭ ＭｇＣｌ２５．ｃｚ １２に溶
解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔのＡ
液３０μβ、Ｂ液１０μｐを加え、１６℃で４時間反応
させた。エタノール沈澱でＤＮＡを回収し、さらに、２
０単位のＮｈｅＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ製）で切断し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収
した。このＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分離し１１１ｂｐ ＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、ゲルからＤＮＡを精製した。一方、３μｇのプラス
ミドｐＢＲ３２２（全酒造製）を１０単位のＮｈｅＩ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）で切断
し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収し、さらに１００７
ｚｊ！の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ（ｐＨ８，０）
の反応系でアルカリ性フォスファターゼ０．３５単位と
、５５℃で３００分間反応せた。フェノール抽出後エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収し、さらにその５分の１
量を、先にゲルより回収した１、１１ｂｐ Ｄ Ｎ Ａ
断片と混合しエタノール沈澱し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（Ｉ］Ｈ７，５）、６．５ｍＭ ＭｇＣｌ２μ
ｍに溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔのＡ液８ｆ、１１．Ｂ液３μβを加え、１６℃で４時
間反応させた。この全反応液を用いて、大腸菌ＪＭ １
０９株のコンピテント細胞（全酒造製）を形質転換し、
アンピシリン耐性株を５０μｇ／Ｊアンピシリンを含む
し一プレート上で選択した。得られた形質転換株のうち
任意の株からプラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製
し、これらプラスミドの制限酵素地図を作製することに
より、目的とするプラスミドが得られていることを確認
した。このプラスミドをｐＡＦ３Ｎｈと命名した。さら
に、１００μｇのプラスミドｐＡＦ３Ｎｈを５０単位の
ＮｈｅＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
製）で切断し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。こ
のＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、１１１ｂｐＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、ゲル
からＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡのうち０．５μ
ｇを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、
６．５ｍＭ ＭｇＣＬ ３２ｕ （ｌに溶解し、全酒
造製ＤＮＡ ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔのＡ液１２８μｌ
、Ｂ液２０μｌを加え、１６℃で２分間反応させた。エ
タノール沈澱でＤＮＡを回収した後、５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分離し、１ｌｌｂｐ、 ２２２
ｂｐ、３３３ｂｐおよび４４４ｂｐのＤＮＡ断片を含む
ゲルをそれぞれ切り出し、ゲルから各ＤＮＡ断片を精製
した。一方、１０μｇのプラスミドｐＡＦ３を１０単位
のＮｈｅＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ１ａ
ｂｓ製）で切断し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収し、
さらに１００μｎの １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ８，０）の反応系でアルカリ性フォスファターセ０
．３５単位と、５５℃で３０分間反応させた。フェノー
ル抽出後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、さらに
そのうち０．５μｇずつを、先にゲルより回収した１１
１ｂｐ、 ２２２ｂｐ、 ３３３ｂｐおよび４４４ｂｐ
のＤＮＡ断片とそれぞれ混合しエタノール沈澱し、ｌｏ
ＯｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐｌ（７，５）、６．５ｍＭ
ＭｇＣ１，３μｍに溶解し、全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ ＫｉｔのＡ液１２μｎ、Ｂ液３７１１２を
加え、１６℃で４時間反応させた。これら全反応液を用
いて、大腸菌ＪＭ １０９株のコンピテント細胞（全酒
造製）をそれぞれ形質転換し、アンピシリン耐性株を５
０μｇ／ｉアンピシリンを含むＬ−プレート上で選択し
た。それぞれ得られた形質転換株のうち任意の株からプ
ラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製し、これらプラ
スミドの制限酵素地図を作製することにより、目的とす
るプラスミドがそれぞれ得られていることを確認した。
１ｌｌｂｐ断片が挿入されたプラスミドをｐＡＦ４．２
２２ｂｐ断片が挿入されたプラスミドをｐＡＦ５．３３
３ｂｐ断片か挿入されたプラスミドをｐＡＦ６．４４４
ｂｐ断片が挿入されたプラスミドをｐＡＦ７と命名した
。
２２ｂｐ断片が挿入されたプラスミドをｐＡＦ５．３３
３ｂｐ断片か挿入されたプラスミドをｐＡＦ６．４４４
ｂｐ断片が挿入されたプラスミドをｐＡＦ７と命名した
。
２、 ４量体ＡＦＰ発現ベクターの調製１、で得られた
４量体ＡＦＰをコードする遺伝子を各種発現ベクターに
組み込んだ、４量体ＡＦＰ発現ベクターの構築方法を第
５図に示す。まず、１ｂｐｇのプラスミドｐＡＦ６を３
０単位の旧ｎｄＩＨおよび３０単位のＮｃｏＩ （全酒
造製）で切断し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。このＤＮＡを４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し１２９ ｂｐＤ Ｎ Ａ断片を含むゲルを切り
出し、ゲルからＤＮＡを精製した。また、２μｇのｔｒ
ｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ２３３−２
（ファルマシア社製）を５単位の旧ｎｄＩＩ［および
５単位のＮ９ ｃｏＩ（全酒造製）で切断し、エタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収し、さらに１ｏ０７ｚｌの１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓＨＣＩ（１）Ｈ８，０）の反応系でアルカリ性フォ
スファターセ０．３５単位と、５５℃で３０分間反応さ
せた。フェノール抽出後エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収し、得られたＤＮＡのうち半量を、先にゲルから回
収した１２９ｂｐ ＤＮＡ断片の５分の１量と混合し、
全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔのＡ液４０
７１１．Ｂ液４０μｐを加え、１６℃で２時間反応させ
た。全反応液を用いて、大腸菌ＪＭ １０９株のコンピ
テント細胞（全酒造製）を形質転換し、アンピシリン耐
性株を５０μｇ／ｍｌ！アンピシリンを含むし一プレー
ト上で選択した。得られた形質転換株のうち任意の株か
らプラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製し、これら
プラスミドの制限酵素地図を作製することにより、目的
とするプラスミドが得られていることを確認した。この
プラスミドをｐＡＦ６０１と命名した。
４量体ＡＦＰをコードする遺伝子を各種発現ベクターに
組み込んだ、４量体ＡＦＰ発現ベクターの構築方法を第
５図に示す。まず、１ｂｐｇのプラスミドｐＡＦ６を３
０単位の旧ｎｄＩＨおよび３０単位のＮｃｏＩ （全酒
造製）で切断し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。このＤＮＡを４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し１２９ ｂｐＤ Ｎ Ａ断片を含むゲルを切り
出し、ゲルからＤＮＡを精製した。また、２μｇのｔｒ
ｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ２３３−２
（ファルマシア社製）を５単位の旧ｎｄＩＩ［および
５単位のＮ９ ｃｏＩ（全酒造製）で切断し、エタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収し、さらに１ｏ０７ｚｌの１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓＨＣＩ（１）Ｈ８，０）の反応系でアルカリ性フォ
スファターセ０．３５単位と、５５℃で３０分間反応さ
せた。フェノール抽出後エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収し、得られたＤＮＡのうち半量を、先にゲルから回
収した１２９ｂｐ ＤＮＡ断片の５分の１量と混合し、
全酒造製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔのＡ液４０
７１１．Ｂ液４０μｐを加え、１６℃で２時間反応させ
た。全反応液を用いて、大腸菌ＪＭ １０９株のコンピ
テント細胞（全酒造製）を形質転換し、アンピシリン耐
性株を５０μｇ／ｍｌ！アンピシリンを含むし一プレー
ト上で選択した。得られた形質転換株のうち任意の株か
らプラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製し、これら
プラスミドの制限酵素地図を作製することにより、目的
とするプラスミドが得られていることを確認した。この
プラスミドをｐＡＦ６０１と命名した。
３、 大腸菌ＪＭ１０９Ｆ−株の取得
５ｍｌのＬ−地において３７℃で一夜培養したＪＭＩＯ
９株を、１５μｇ／７ｎｌのアクリジンオレンジを含む
５ Ｕ ｄのＬ−培地に５ ＸＩＯ’倍に希釈し、さらに３７℃
暗所で一夜培養した。得られた菌株をＨ９，Ｐｒｏ−プ
レート（０，２％グルコース、０．６％Ｎａ２ＨＰＯ＋
、 ０．３％Ｋｌ（２ＰＯ４、０，０５Ｘ ＮａＣｌ
、 ０． ＩＸ ＮＨ＋ＣＩ、 ２ｍＭ ＭｇＳＯ４，
０，１ｍＭ、 ＣａＣＬ、 ２０ ｕ ｇ／ｍｌのＰｒ
ｏ以外の１９種のアミノ酸、１．５％寒天）とＨ９，Ｐ
ｒｏ”プレート（２０μｇ／７＋７！のＰｒ。
９株を、１５μｇ／７ｎｌのアクリジンオレンジを含む
５ Ｕ ｄのＬ−培地に５ ＸＩＯ’倍に希釈し、さらに３７℃
暗所で一夜培養した。得られた菌株をＨ９，Ｐｒｏ−プ
レート（０，２％グルコース、０．６％Ｎａ２ＨＰＯ＋
、 ０．３％Ｋｌ（２ＰＯ４、０，０５Ｘ ＮａＣｌ
、 ０． ＩＸ ＮＨ＋ＣＩ、 ２ｍＭ ＭｇＳＯ４，
０，１ｍＭ、 ＣａＣＬ、 ２０ ｕ ｇ／ｍｌのＰｒ
ｏ以外の１９種のアミノ酸、１．５％寒天）とＨ９，Ｐ
ｒｏ”プレート（２０μｇ／７＋７！のＰｒ。
を含んだＨ９，Ｐｒｏ−プレート）にまき、Ｐｒｏ＋株
を選択した。得られたＰｒｏ”株のうち１株をＪＭ］０
９Ｆ株と命名した。
を選択した。得られたＰｒｏ”株のうち１株をＪＭ］０
９Ｆ株と命名した。
４、 ４量体ＡＦＰの構成的発現
ＪＭ１０９Ｆ−株をｐＡＦ６０１で形質転換しｐＡＦ６
０１／ ＪＭＩ０９ Ｆ−株を得た。この菌株とｐＡ
Ｆ６０１／ＪＭ１０９株をそれぞれ５−の５０μｇ／７
ｎｌアンピシリンを含むし一培地で一夜培養した後、６
６０ｎｍの吸光度が０．０２になるよう１００７ｎｌの
Ｌ−培地にそれぞれ植菌し、６６０ｎｍの吸光度が０．
２になるまで菌が増殖した時点でＩＰＴＧを１ｍＭにな
るよう各培養液に添加し、ｔｒｃプロモーターを誘導し
た。ＩＰＴＧ添加０．２．４時間後、それぞれ１献ずつ
集菌すると共にその時点での培養液の６６０ ｎ ｍの
吸光度を測定した。集菌した菌体を測定した６６０ ｎ
ｍの吸光度をもとにＩＯＤ／１００μＥとなるよう６０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６，８）、２％ＳＯ３
゜５％ グリセロール、５Ｘ ２−メルカプトエタノー
ル、０．０４％ ＢＰＢ にそれぞれ懸濁し、そのう
ち０．１μβずつを１２・５％ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＡｕｓｕｂｅｌらのＣｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ、ｐ
ｐｌｏ、２．１−５）の試料とした。泳動後のゲルを用
いてウェスタンブロッティング（前述Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、ｐｐｌｏ。
０１／ ＪＭＩ０９ Ｆ−株を得た。この菌株とｐＡ
Ｆ６０１／ＪＭ１０９株をそれぞれ５−の５０μｇ／７
ｎｌアンピシリンを含むし一培地で一夜培養した後、６
６０ｎｍの吸光度が０．０２になるよう１００７ｎｌの
Ｌ−培地にそれぞれ植菌し、６６０ｎｍの吸光度が０．
２になるまで菌が増殖した時点でＩＰＴＧを１ｍＭにな
るよう各培養液に添加し、ｔｒｃプロモーターを誘導し
た。ＩＰＴＧ添加０．２．４時間後、それぞれ１献ずつ
集菌すると共にその時点での培養液の６６０ ｎ ｍの
吸光度を測定した。集菌した菌体を測定した６６０ ｎ
ｍの吸光度をもとにＩＯＤ／１００μＥとなるよう６０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６，８）、２％ＳＯ３
゜５％ グリセロール、５Ｘ ２−メルカプトエタノー
ル、０．０４％ ＢＰＢ にそれぞれ懸濁し、そのう
ち０．１μβずつを１２・５％ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＡｕｓｕｂｅｌらのＣｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ、ｐ
ｐｌｏ、２．１−５）の試料とした。泳動後のゲルを用
いてウェスタンブロッティング（前述Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、ｐｐｌｏ。
８、４−６）を行った。４量体ＡＦＰの検出に用いた抗
体は、ＥＸＣＥＬＬペプチド合成機（ＭｉｌｌｊＧｅｎ
／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社）により機器操作手順書に従っ
て合成したＡＦＰを抗原とし、家兎を免疫し得られた抗
血清を一次抗体とし、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを結合した
抗ウサギＩｇＧの山羊の抗体（Ｃａｐｐｅ１社製）を二
次抗体とした。ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅの発色により４量
体ＡＦＰを検出した。その結果、ｐＡＦ６０１／ＪＭ１
０９株において誘導０時間後では検出されなかった４量
体ＡＦＰが２．４時間後では検出され、２時間後より４
時間後の方が４量体ＡＦＰの発現量は多かった。一方３ 、ｐＡＦ６０１／ＪＭ１０９ Ｆ−株においては誘導の
有無、また培養時間の長さに関係なく常に一定量の４量
体ＡＦＰか検出され、４量体ＡＦＰの構成的発現を確認
するに至った。その４Ｍ体ＡＦＰの構成的発現量は、ｐ
ＡＦ６０１／ＪＭ１０９株における誘導４時間後の４量
体ＡＦＰの発現量と差が認められなかった。
体は、ＥＸＣＥＬＬペプチド合成機（ＭｉｌｌｊＧｅｎ
／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社）により機器操作手順書に従っ
て合成したＡＦＰを抗原とし、家兎を免疫し得られた抗
血清を一次抗体とし、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを結合した
抗ウサギＩｇＧの山羊の抗体（Ｃａｐｐｅ１社製）を二
次抗体とした。ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅの発色により４量
体ＡＦＰを検出した。その結果、ｐＡＦ６０１／ＪＭ１
０９株において誘導０時間後では検出されなかった４量
体ＡＦＰが２．４時間後では検出され、２時間後より４
時間後の方が４量体ＡＦＰの発現量は多かった。一方３ 、ｐＡＦ６０１／ＪＭ１０９ Ｆ−株においては誘導の
有無、また培養時間の長さに関係なく常に一定量の４量
体ＡＦＰか検出され、４量体ＡＦＰの構成的発現を確認
するに至った。その４Ｍ体ＡＦＰの構成的発現量は、ｐ
ＡＦ６０１／ＪＭ１０９株における誘導４時間後の４量
体ＡＦＰの発現量と差が認められなかった。
５．４量体ＡＦＰの精製
５ｍｆ！の５０μｇ／−アンピシリンを含むし一培地で
一夜培養したｐＡＦ６０１／ＪＭ１０９ Ｆ−株を、６
６０ｎｍの吸光度が０．０２になるよう１．２βのＬ−
培地に植菌し、８時間培養後集菌した。菌体を２５−の
０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）に懸濁し、超
音波破砕した。１２，０００回転で１５分間遠心し、２
８艷の上滑を回収した。
一夜培養したｐＡＦ６０１／ＪＭ１０９ Ｆ−株を、６
６０ｎｍの吸光度が０．０２になるよう１．２βのＬ−
培地に植菌し、８時間培養後集菌した。菌体を２５−の
０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）に懸濁し、超
音波破砕した。１２，０００回転で１５分間遠心し、２
８艷の上滑を回収した。
この上清をＯｏＣに保ち、撹はんしながら一２０°Ｃに
冷却したエタノールを滴下し、さらにＯｏＣに保ち３０
分間撹はんした。得られた溶液を１２．０００回転で１
０分間遠心し、上清１３７−を得た。この上清を２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）の溶液に対して２
４時間透析した後、０°Ｃに保ち撹はんしながら硫酸ア
ンモニウムを５０％飽和になるよう加えた。さらに０℃
に保ち２時間撹はんした後、１２．０００回転で２０分
間遠心し沈澱を回収した。この沈澱を２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐｔ（８，０）の溶液に対して２４時間透
析した。得られた４゜８１ｎｌの蛋白溶液をＴＳＫＧＥ
Ｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（７，５ｘ７５ｍｍ） （東ソ
ー社）に添加した。ＤＥＡＥ−５ＰＷは２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐｔ（８，０）であらかじめ平衡化し、
流速は１１ｎｌ／ｍｉｎとし、２８０ｎｍの吸光度で蛋
白質の溶出を検出した。
冷却したエタノールを滴下し、さらにＯｏＣに保ち３０
分間撹はんした。得られた溶液を１２．０００回転で１
０分間遠心し、上清１３７−を得た。この上清を２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）の溶液に対して２
４時間透析した後、０°Ｃに保ち撹はんしながら硫酸ア
ンモニウムを５０％飽和になるよう加えた。さらに０℃
に保ち２時間撹はんした後、１２．０００回転で２０分
間遠心し沈澱を回収した。この沈澱を２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐｔ（８，０）の溶液に対して２４時間透
析した。得られた４゜８１ｎｌの蛋白溶液をＴＳＫＧＥ
Ｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（７，５ｘ７５ｍｍ） （東ソ
ー社）に添加した。ＤＥＡＥ−５ＰＷは２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐｔ（８，０）であらかじめ平衡化し、
流速は１１ｎｌ／ｍｉｎとし、２８０ｎｍの吸光度で蛋
白質の溶出を検出した。
ＮａＣＩの濃度勾配により蛋白質を溶出させたところ、
４量体ＡＦＰは約２５ｍＭ ＮａＣｌ濃度で溶出された
。カラムより回収された４量体ＡＦＰを含む画分は、最
終的にμｍＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８Ｃ１３
（１９ｘ１５０ （ウォーターズ社）に添加した。１ｔ
−Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅは０．１％ＴＦＡ、 ２５
％アセトニトリルであらかしめ平衡化し、流速はｌ７ｎ
ｌ／ｍｉｎとし、２１５ｎｍ （Ｄ吸光度で蛋白質の溶
出を検出した。アセトニトリルの濃度勾配により蛋白質
を溶出させたところ、４量体ＡＦＰは約５０％アセトニ
トリル濃度で溶出された。
４量体ＡＦＰは約２５ｍＭ ＮａＣｌ濃度で溶出された
。カラムより回収された４量体ＡＦＰを含む画分は、最
終的にμｍＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８Ｃ１３
（１９ｘ１５０ （ウォーターズ社）に添加した。１ｔ
−Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅは０．１％ＴＦＡ、 ２５
％アセトニトリルであらかしめ平衡化し、流速はｌ７ｎ
ｌ／ｍｉｎとし、２１５ｎｍ （Ｄ吸光度で蛋白質の溶
出を検出した。アセトニトリルの濃度勾配により蛋白質
を溶出させたところ、４量体ＡＦＰは約５０％アセトニ
トリル濃度で溶出された。
以上の精製法により４量体ＡＦＰは、完全に純化された
。純化された４量体ＡＦＰの得量は、その一部分を用い
てアミノ酸組成分析（ウォーターズ社Ｐｉｃｏ・ＴＡＧ
アミノ酸分析システム）を行い、検出されたＡｌａのモ
ル数より逆算することにより算出した。その結果、１．
２１の培養液中の菌体から得られた純化４量体ＡＦＰは
３．３ｍｇであると判明した。得られた純化４量体ＡＦ
Ｐを標準物質として、前述の方法により４量体ＡＦＰ精
製の出発材料である菌体蛋白質のウェスタンブロッティ
ングを行うことにより、ｐＡＦ６０］／ＪＭＩ０９ Ｆ
−株における４量体ＡＦＰの発現量は約８ｍｇ／ρであ
ることが判明した。
。純化された４量体ＡＦＰの得量は、その一部分を用い
てアミノ酸組成分析（ウォーターズ社Ｐｉｃｏ・ＴＡＧ
アミノ酸分析システム）を行い、検出されたＡｌａのモ
ル数より逆算することにより算出した。その結果、１．
２１の培養液中の菌体から得られた純化４量体ＡＦＰは
３．３ｍｇであると判明した。得られた純化４量体ＡＦ
Ｐを標準物質として、前述の方法により４量体ＡＦＰ精
製の出発材料である菌体蛋白質のウェスタンブロッティ
ングを行うことにより、ｐＡＦ６０］／ＪＭＩ０９ Ｆ
−株における４量体ＡＦＰの発現量は約８ｍｇ／ρであ
ることが判明した。
６．４量 ＡＦＰの単量体化
５、で得られた１３０μｇの純化４量体ＡＦＰを、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ＩＩＨ８，０）の反応溶液１
００．ｉ！中で１０μｇのアルギニルエンドペプチダー
ゼ（宝酒造製）と３７℃で６時間反応させた。１０％酢
酸溶液を１５０μβ加え反応を停止し、５．と同一条件
によりμｍＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅにより分離すること
により、３１μｇの単量体ＡＦＰと、１８μｇのＮ末に
Ｍｅｔが付加した単量体ＡＦＰを得ることができた。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ＩＩＨ８，０）の反応溶液１
００．ｉ！中で１０μｇのアルギニルエンドペプチダー
ゼ（宝酒造製）と３７℃で６時間反応させた。１０％酢
酸溶液を１５０μβ加え反応を停止し、５．と同一条件
によりμｍＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅにより分離すること
により、３１μｇの単量体ＡＦＰと、１８μｇのＮ末に
Ｍｅｔが付加した単量体ＡＦＰを得ることができた。
７．４量体ＡＦＰの凝固点降下能の測定凝固点降下能の
測定は、Ｆｉｓｋｅ社Ｏ８型のオズモメターを用い、Ｄ
、 Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ、 Ｃ，Ｌ、 Ｈｅｗの方法（
Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １１５．２１２（１９
８１））に準じて行なった。測定に用いた試料は、６で
精製した４量体ＡＦＰと、前述のペプチド合成基を用い
て合成したＣ末フリーの単量体ＡＦＰおよびＣ末アミド
の単量体ＡＦＰ （天然型）の３種類であり、それぞれ
１ｍｇ／７ｎｌ、２．５ ｍｇ ／ ｍｌ、５ｍｇ／−
の各濃度で２００ｕｌのＰＢＳ（ｉ（ＮａＣＩ ８．０
ｇ 、ＫＣＩ Ｏ，２Ｇ、ＮａＪＰＯ４０，２ｇ／ｌ）
中において、５０ｍｇのＡｇｒ存在下に測定を行なった
。測定は各３回行い、その平均値およびＳＤ値を算出し
た。それぞれのＳＤ値は、０．００５〜０．旧９℃の範
囲であり測定結果は安定していた。ＰＢＳ（）の値を差
し引いたものをその試料の凝固点降下能とし、以下の表
にまとめた。
測定は、Ｆｉｓｋｅ社Ｏ８型のオズモメターを用い、Ｄ
、 Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ、 Ｃ，Ｌ、 Ｈｅｗの方法（
Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １１５．２１２（１９
８１））に準じて行なった。測定に用いた試料は、６で
精製した４量体ＡＦＰと、前述のペプチド合成基を用い
て合成したＣ末フリーの単量体ＡＦＰおよびＣ末アミド
の単量体ＡＦＰ （天然型）の３種類であり、それぞれ
１ｍｇ／７ｎｌ、２．５ ｍｇ ／ ｍｌ、５ｍｇ／−
の各濃度で２００ｕｌのＰＢＳ（ｉ（ＮａＣＩ ８．０
ｇ 、ＫＣＩ Ｏ，２Ｇ、ＮａＪＰＯ４０，２ｇ／ｌ）
中において、５０ｍｇのＡｇｒ存在下に測定を行なった
。測定は各３回行い、その平均値およびＳＤ値を算出し
た。それぞれのＳＤ値は、０．００５〜０．旧９℃の範
囲であり測定結果は安定していた。ＰＢＳ（）の値を差
し引いたものをその試料の凝固点降下能とし、以下の表
にまとめた。
表１
凝固点降下能
その結果、５■／−の濃度における３種類のＡＦＰの活
性を比較すると、Ｃ末アミドの単量体が−０，５２℃で
あるのに対して、Ｃ末フリーの単量体は０．２１’Ｃと
アミド型の凝固点降下活性に重要な役割を果しているこ
とが示された。一方４量体は０．３８℃とアミド型の約
７３％の活性を示し、Ｃ末がフリーであることに起因す
る活性の低下を多量体化することにより大幅に改善する
ことができた。また、５．０■／７ＺＩ！での活性をモ
ル当たりに換算すると、４量体ＡＦＰはアミド型ＡＦＰ
の約３倍の活性を持つことから、多量体化により活性を
高い分子種を獲得できることが示された。
性を比較すると、Ｃ末アミドの単量体が−０，５２℃で
あるのに対して、Ｃ末フリーの単量体は０．２１’Ｃと
アミド型の凝固点降下活性に重要な役割を果しているこ
とが示された。一方４量体は０．３８℃とアミド型の約
７３％の活性を示し、Ｃ末がフリーであることに起因す
る活性の低下を多量体化することにより大幅に改善する
ことができた。また、５．０■／７ＺＩ！での活性をモ
ル当たりに換算すると、４量体ＡＦＰはアミド型ＡＦＰ
の約３倍の活性を持つことから、多量体化により活性を
高い分子種を獲得できることが示された。
第１図は本発明において創成した遺伝子とその制限酵素
地図を示す。 図中において、ＳＤはりホゾーム結合共通配列を示す。 第２図はプラスミドｐＡＦ３の構築方法を示す。 第３図はプラスミドｐＡＦ３Ｎｈの構築方法を示す。 第４図はプラスミドｐＡＦ６の構築方法を示す。 第５図はプラスミドｐＡＦ６旧の構築方法を示す。 八 第 ３ 図 （Ｎｃ） Ｎｈ ！ Ｎｃｏｌ、Ｄｄｅｌ φヌクレアーゼＳ１ ↓１１１ｂｐ単離 （Ｄ） 特開平３−２３２８９６ （１０） 第４図 ＡＦ３Ｎｈ 壷Ｎｈｅｌ ビ＝＝＝廿 ＴＡ １ｓ −＋ｒ−斗ｆ へＢａｍＨＩ （コ［コニコ ＋ ＳＡＰ
地図を示す。 図中において、ＳＤはりホゾーム結合共通配列を示す。 第２図はプラスミドｐＡＦ３の構築方法を示す。 第３図はプラスミドｐＡＦ３Ｎｈの構築方法を示す。 第４図はプラスミドｐＡＦ６の構築方法を示す。 第５図はプラスミドｐＡＦ６旧の構築方法を示す。 八 第 ３ 図 （Ｎｃ） Ｎｈ ！ Ｎｃｏｌ、Ｄｄｅｌ φヌクレアーゼＳ１ ↓１１１ｂｐ単離 （Ｄ） 特開平３−２３２８９６ （１０） 第４図 ＡＦ３Ｎｈ 壷Ｎｈｅｌ ビ＝＝＝廿 ＴＡ １ｓ −＋ｒ−斗ｆ へＢａｍＨＩ （コ［コニコ ＋ ＳＡＰ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下図に示される凝固点降下ペプチドが２個以上順方
向に結合し、さらにＮ末端にＭｅｔが付加した多量体凝
固点降下ペプチド 【遺伝子配列があります。】 ２、凝固点降下ペプチドが２個から２０個順方向に結合
した特許請求の範囲第１項記載の蛋白質 ３、凝固点降下ペプチドが４個順方向に結合した特許請
求の範囲第１項記載の蛋白質 ４、特許請求の範囲第１項記載の蛋白質をコードする構
造遺伝子 ５、凝固点降下ペプチドをコードする塩基配列が下図に
示される特許請求項第４項記載の構造遺伝子 【遺伝子配列があります。】 ６、特許請求の範囲第４項記載の構造遺伝子をプロモー
ターの下流に含有している組換えベクター７、特許請求
の範囲第６項記載の組換えベクターを保持することを特
徴とする微生物 ８、特許請求の範囲第６項記載の組換えベクターを保持
することを特徴とする大腸菌 ９、特許請求の範囲第７項記載の微生物を培養し、得ら
れる菌体から該蛋白質を分離することを特徴とする、凝
固点降下ペプチドの製造法 １０、特許請求の範囲第８項記載の製造法によって得ら
れた蛋白質を、化学的あるいは酵素的に分解し、この分
解物より単量体の凝固点降下ペプチドを分離することを
特徴とする蛋白質の製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2875790A JPH03232896A (ja) | 1990-02-07 | 1990-02-07 | 凝固点降下ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2875790A JPH03232896A (ja) | 1990-02-07 | 1990-02-07 | 凝固点降下ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03232896A true JPH03232896A (ja) | 1991-10-16 |
Family
ID=12257283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2875790A Pending JPH03232896A (ja) | 1990-02-07 | 1990-02-07 | 凝固点降下ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03232896A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996011586A1 (en) * | 1994-10-12 | 1996-04-25 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Preparation of frozen fermented foods using antifreeze polypeptide-expressing microorganisms |
-
1990
- 1990-02-07 JP JP2875790A patent/JPH03232896A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996011586A1 (en) * | 1994-10-12 | 1996-04-25 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Preparation of frozen fermented foods using antifreeze polypeptide-expressing microorganisms |
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