JPH03236399A - ワクチン - Google Patents
ワクチンInfo
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- JPH03236399A JPH03236399A JP2234331A JP23433190A JPH03236399A JP H03236399 A JPH03236399 A JP H03236399A JP 2234331 A JP2234331 A JP 2234331A JP 23433190 A JP23433190 A JP 23433190A JP H03236399 A JPH03236399 A JP H03236399A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
虹飢辿り並■■に対するワクチンに関する。
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ 他色■ｓｉｓは、ヒトにおけ
る百日咳の病原体であるが、本病気の発生は、その関連
病原微生物 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｒａ ｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ−と関連づけられている。Ｂｏｒｄｅｔｔｅ
ｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ ｔｉｃａは、主として動
物の病原体であるが、百日咳様症状をもつ子供から巣離
されたことがある。旦。
る百日咳の病原体であるが、本病気の発生は、その関連
病原微生物 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｒａ ｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ−と関連づけられている。Ｂｏｒｄｅｔｔｅ
ｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ ｔｉｃａは、主として動
物の病原体であるが、百日咳様症状をもつ子供から巣離
されたことがある。旦。
匹旦ｕ紅りの全細胞ワクチンでの免疫処置プログラムは
、本疾病を制御するのに比較的効果があったが、ワクチ
ン接種に関連する副作用原性のために、現在では、ある
先進諸国においての使用度は低い、子供では、１万人に
１人の割合で副作用で苦しむことが認かめられた。臨床
症状のなかには、絶えず金切声で叫び続けることや、発
熱及び局所反応がある。
、本疾病を制御するのに比較的効果があったが、ワクチ
ン接種に関連する副作用原性のために、現在では、ある
先進諸国においての使用度は低い、子供では、１万人に
１人の割合で副作用で苦しむことが認かめられた。臨床
症状のなかには、絶えず金切声で叫び続けることや、発
熱及び局所反応がある。
副作用原性と関連して、全細胞ワクチン中に存在する収
骨を含まないが、依然として防御エピトープは含んでい
る新しいｐｅｒｔｕｓｓｉｓの非細胞性ワクチンが必要
である。防御性成分に対する探索は、多数の外膜関連抗
原に的を絞って進められた。これらの抗原には、ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ ）キシン（ｐｔｘリンパ球増加促進因
子（ＬＰＥ）） 、フィラメント状赤血球凝集素（ＰＨ
八）、細胞毒性アデニル酸シクラーゼ（ｃ’ｙｔｏｔｏ
ｘｉｃ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ 、 Ａ
ｄｃａｓｅ） 、皮膚壊死トキシン（ｄｅｒ＋ｗｏｎｅ
ｃｒｏｔｉｃ ｔｏｘｉｎ 、 ＤＮＴ）、気管細胞毒
素（ｔｒａｃｈｅａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ） 、凝集
原類（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎｓ）（Ａｇｇ ２ ＊
Ａｇｇ ３ ）、 ６９ｋＤａの外膜タンパク質（ｏ
＊ｐ）、（Ｐ、６９）、及びリポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ）が含まれる。
骨を含まないが、依然として防御エピトープは含んでい
る新しいｐｅｒｔｕｓｓｉｓの非細胞性ワクチンが必要
である。防御性成分に対する探索は、多数の外膜関連抗
原に的を絞って進められた。これらの抗原には、ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ ）キシン（ｐｔｘリンパ球増加促進因
子（ＬＰＥ）） 、フィラメント状赤血球凝集素（ＰＨ
八）、細胞毒性アデニル酸シクラーゼ（ｃ’ｙｔｏｔｏ
ｘｉｃ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ 、 Ａ
ｄｃａｓｅ） 、皮膚壊死トキシン（ｄｅｒ＋ｗｏｎｅ
ｃｒｏｔｉｃ ｔｏｘｉｎ 、 ＤＮＴ）、気管細胞毒
素（ｔｒａｃｈｅａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ） 、凝集
原類（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎｓ）（Ａｇｇ ２ ＊
Ａｇｇ ３ ）、 ６９ｋＤａの外膜タンパク質（ｏ
＊ｐ）、（Ｐ、６９）、及びリポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ）が含まれる。
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ）キシン（ＬＰＦ）については多
くの仕事がなされてきており、それは、多くの人々によ
ってへ非細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンすべてのうち
で、最も重要な部分であると信じられている（Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＋ １９８４ 、 Ｃ
ｈａｐｔｅｒ ３ 。
くの仕事がなされてきており、それは、多くの人々によ
ってへ非細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンすべてのうち
で、最も重要な部分であると信じられている（Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＋ １９８４ 、 Ｃ
ｈａｐｔｅｒ ３ 。
Ｍａｎｃｌａｒｋら、Ｅｄ：Ｇｅｒ＋ｗａｉｎｅｒ）
、ＬＰＦ／ＦＨＡワクチンについてのスエーデンにおけ
る最近の臨床試験の結果により、このようなワクチンは
、約６９％の防御しか提供しないことが示された（Ｌａ
ｎｃｅｔ土。
、ＬＰＦ／ＦＨＡワクチンについてのスエーデンにおけ
る最近の臨床試験の結果により、このようなワクチンは
、約６９％の防御しか提供しないことが示された（Ｌａ
ｎｃｅｔ土。
９９５．１９８８）。これは、全細胞ワクチンによって
提供された防御について期待された結果よりも低く、そ
の結果、ＬＰＦ／ＦＨＡワクチンは、スエーデンの厚生
省（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｅａｌｔｈ Ａｕｔｈｏｒｉｔ
ｙ）によって認可されないことになった。
提供された防御について期待された結果よりも低く、そ
の結果、ＬＰＦ／ＦＨＡワクチンは、スエーデンの厚生
省（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｅａｌｔｈ Ａｕｔｈｏｒｉｔ
ｙ）によって認可されないことになった。
ＢＰ−Ａ−０１６２６３９は、医薬として認め得るその
ための担体とともに、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣＡＰ
）に関連したタンパク質様物質を含む旦、肚ｄ用１Ｌか
ら由来した抗原調製物を含む旦、４匹お４１０−に対す
る防御のためのワクチン製剤を明らかにするものである
。分子１６９ｋＤａのＡＣＡＰが明らかになっている。
ための担体とともに、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣＡＰ
）に関連したタンパク質様物質を含む旦、肚ｄ用１Ｌか
ら由来した抗原調製物を含む旦、４匹お４１０−に対す
る防御のためのワクチン製剤を明らかにするものである
。分子１６９ｋＤａのＡＣＡＰが明らかになっている。
Ｐ、６９抗原と名付けられたこのＡＣＡＰのいずれの領
域が、防御のために重要であるかを特徴づけるために、
タンパク質をコードしている遺伝子のクローニングを行
い、配列を決定した（ｃｈａｒｌｅｓら、ＰＮＡＳ 、
Ｖｏ１８６．３５５４ ３５５８ 、１９８９ ）。
域が、防御のために重要であるかを特徴づけるために、
タンパク質をコードしている遺伝子のクローニングを行
い、配列を決定した（ｃｈａｒｌｅｓら、ＰＮＡＳ 、
Ｖｏ１８６．３５５４ ３５５８ 、１９８９ ）。
Ｂ、弘狂力穏王Ｏユから抽出されたＰ、６９は、プリカ
ーサ−９３ｋＤａ （Ｐ、９３）がプロセッシングを
受けた形のように思われる。
ーサ−９３ｋＤａ （Ｐ、９３）がプロセッシングを
受けた形のように思われる。
本発明は、
（ａ） 旦１世扛ｌ拝１ｌ−ＣＮ２９９２（７）Ｐ、
６９遺伝子のヌクレオチド１８８５から１９０２によ
ってコードされるアミノ酸配列、 あ）Ｂ、匹吐■５ｉｓＯ別の菌株、または、旦、 ａ
ｒａ−ｅｒｔｕｓｓｉｓ 、または旦、ｂｒｏｎｃｈｉ
ｓｅ ｔｉｃａの菌株の相当するアミノ酸配列；または
（ｃ） 改変された配列が、該配列（ａ）またはい）
の抗原性と実質的に同じ抗原性を持つように改変された
該配列（ａ）または（ロ）を含むエピトープを提出する
ワクチンにおいて使用されるのに適したあるポリペプチ
ドを提供している。該ポリペプチドは、５゜こ未満のア
ミノ酸残基の長さであるか、キャリヤータンパク質の配
列と、該エピトープの該配列を含む５０こ未満のアミノ
酸の外来配列からなるアミノ酸配列をもつキメラ状のタ
ンパク質である。
６９遺伝子のヌクレオチド１８８５から１９０２によ
ってコードされるアミノ酸配列、 あ）Ｂ、匹吐■５ｉｓＯ別の菌株、または、旦、 ａ
ｒａ−ｅｒｔｕｓｓｉｓ 、または旦、ｂｒｏｎｃｈｉ
ｓｅ ｔｉｃａの菌株の相当するアミノ酸配列；または
（ｃ） 改変された配列が、該配列（ａ）またはい）
の抗原性と実質的に同じ抗原性を持つように改変された
該配列（ａ）または（ロ）を含むエピトープを提出する
ワクチンにおいて使用されるのに適したあるポリペプチ
ドを提供している。該ポリペプチドは、５゜こ未満のア
ミノ酸残基の長さであるか、キャリヤータンパク質の配
列と、該エピトープの該配列を含む５０こ未満のアミノ
酸の外来配列からなるアミノ酸配列をもつキメラ状のタ
ンパク質である。
本発明のポリペプチドは、明確化された抗原的に効果を
もつ配列をもつ。この配列は、Ｃｈａｒｌｅｓら（１９
８９）によって明らかにされた、旦。
もつ配列をもつ。この配列は、Ｃｈａｒｌｅｓら（１９
８９）によって明らかにされた、旦。
肚旦■江５ＣＮ２９９２のＰ、６９遺伝子配列と、アミ
ノ酸に対する１文字コード（Ｅｕｒ＋Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ａ＋。
ノ酸に対する１文字コード（Ｅｕｒ＋Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ａ＋。
１該．９−３７．１９８４）を用いることに基いたＰＧ
ＰＱＰＰである。それゆえ、配列は、旦。
ＰＱＰＰである。それゆえ、配列は、旦。
弘圧幻４１匈−ＣＮ２９９２のＰ、６９タンパク質の５
４７番目から５５２番目のアミノ酸残基から威立ってい
る。旦０匹匹［吐りの他の菌株及び、旦。
４７番目から５５２番目のアミノ酸残基から威立ってい
る。旦０匹匹［吐りの他の菌株及び、旦。
ａｒａ ｅｒｔｕｓｓｉｓ及びＢ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ
ｔｉｃａの菌株についての相当する配列は、Ｃｈａｒ
ｌｅｓら（１９８９）によって示されたＰ、６９抗原と
Ｐ、７０抗原またはＰ、６８抗原を、それぞれ並べあわ
せることによって容易に決定することが出来る。
ｔｉｃａの菌株についての相当する配列は、Ｃｈａｒ
ｌｅｓら（１９８９）によって示されたＰ、６９抗原と
Ｐ、７０抗原またはＰ、６８抗原を、それぞれ並べあわ
せることによって容易に決定することが出来る。
より好ましくは、エピトープは、
（ａｔ ） Ｂ ｅｒｔｕｓｓｉｓ ＣＮ２９９２の
Ｐ、６９遺伝子のヌクレオチド１８７６から１９４４迄
によってコードされるアミノ酸配列、 （ｂ１）ｓ−匹色吐１Ｌの別棟、または、１゜ａｒａ
ｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＢ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ ｔ
ｉｃａの菌株の相当するアごノ酸配列：または （ｃ１）改変された配列が該配列（ａ１）または（ｂｌ
）の抗原性と実質的に同じ抗原性をもつように改変さ
れた該配列（ａ１）または（ｂｌ ）のを含む。
Ｐ、６９遺伝子のヌクレオチド１８７６から１９４４迄
によってコードされるアミノ酸配列、 （ｂ１）ｓ−匹色吐１Ｌの別棟、または、１゜ａｒａ
ｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＢ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ ｔ
ｉｃａの菌株の相当するアごノ酸配列：または （ｃ１）改変された配列が該配列（ａ１）または（ｂｌ
）の抗原性と実質的に同じ抗原性をもつように改変さ
れた該配列（ａ１）または（ｂｌ ）のを含む。
配列（ａ１）は、それゆえ：
ＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥＡＰＡＰＱＰであ
る。
る。
本配列は、旦１匹ｄ魁紅５ＣＮ２９９２のＰ。
６９タンパク質の５４４番目から５６６番目の残基を示
す。本配列と旦、蝕王耳Ｊ」±４０−のＰ、７０抗原と
旦、紅並はｎ飢且聾の抗原Ｐ、６８に対する相当する配
列（ｂ１）は、以下のように並べあわせることができる
。 ＰＧＰＱＰＰのエピトープは、下線がひいである。
す。本配列と旦、蝕王耳Ｊ」±４０−のＰ、７０抗原と
旦、紅並はｎ飢且聾の抗原Ｐ、６８に対する相当する配
列（ｂ１）は、以下のように並べあわせることができる
。 ＰＧＰＱＰＰのエピトープは、下線がひいである。
Ｐ、７０ ＡＰＱＰＧＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＰ
ＱＰＰＱＰＰＱＰＰＱＲＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰ、６８
ＡＰ（ＩＰＧＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＰＱＰ−−−
−−−ＰＱＲＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰ、６９ ＡＰＱ剋月
ＩＰ−ＰＱＰＰＱＰＰ−−−−−−−一−−−−−−Ｑ
ＰＥＡＰＡＰＱＰ本配列は、改変を加えた配列が、未改
変の配列と実質的に同じ抗原性を示すように改変するこ
とができる。したがって、改変配列は相当する未改変配
列と同じか、より大きい程度の効果をＫｅｎｄｒｉｃｋ
試験において示すべきである。改変配列は、未改変配列
と実質的に同じアミノ酸配列をもつが、１こ以上のアミ
ノ酸の置換、挿入または消去を含んでいる。
ＱＰＰＱＰＰＱＰＰＱＲＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰ、６８
ＡＰ（ＩＰＧＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＰＱＰ−−−
−−−ＰＱＲＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰ、６９ ＡＰＱ剋月
ＩＰ−ＰＱＰＰＱＰＰ−−−−−−−一−−−−−−Ｑ
ＰＥＡＰＡＰＱＰ本配列は、改変を加えた配列が、未改
変の配列と実質的に同じ抗原性を示すように改変するこ
とができる。したがって、改変配列は相当する未改変配
列と同じか、より大きい程度の効果をＫｅｎｄｒｉｃｋ
試験において示すべきである。改変配列は、未改変配列
と実質的に同じアミノ酸配列をもつが、１こ以上のアミ
ノ酸の置換、挿入または消去を含んでいる。
上記の如く、配列（ａ）、 （ａｔ ） 、 （ｂ）
または（ｂ１）は、エピトープの抗原性に影響すること
なく、１こ以上の他のアミノ酸残基によって置換するこ
とができる。その結果、荷！密度、親水性／親油性、大
きさと立体配置によって物理化学的性質を保ち、したが
って、免疫学的構造を保持する１こ以上の別のアミノ酸
によって置換することができる。候補となる置換は、Ｇ
の代りにＡ及びＡの代りにＧ；ｖの代りにＡ、Ｌまたは
Ｇ；にの代りにＲ；Ｓの代りにＴ及びＴの代りに５ＡＤ
Ｏ代りにＥそしてＥの代りにＤ：そして、Ｑの代りにＮ
及びＮの代りにＱである。
または（ｂ１）は、エピトープの抗原性に影響すること
なく、１こ以上の他のアミノ酸残基によって置換するこ
とができる。その結果、荷！密度、親水性／親油性、大
きさと立体配置によって物理化学的性質を保ち、したが
って、免疫学的構造を保持する１こ以上の別のアミノ酸
によって置換することができる。候補となる置換は、Ｇ
の代りにＡ及びＡの代りにＧ；ｖの代りにＡ、Ｌまたは
Ｇ；にの代りにＲ；Ｓの代りにＴ及びＴの代りに５ＡＤ
Ｏ代りにＥそしてＥの代りにＤ：そして、Ｑの代りにＮ
及びＮの代りにＱである。
本発明によれば、第１の型のポリペプチドは、上記の如
くエピトープを提出するところの、例えば４０まで、ま
たは３０まで、または２０までの、５０までのアミノ酸
から構成されている。それゆえ、エピトープの両端にさ
らにアミノ酸を加えることができる。１，２．３または
４つの追加残基を定義づけられたエピトープのＮ末端、
またはＣ末端または両端において、加えることができる
。
くエピトープを提出するところの、例えば４０まで、ま
たは３０まで、または２０までの、５０までのアミノ酸
から構成されている。それゆえ、エピトープの両端にさ
らにアミノ酸を加えることができる。１，２．３または
４つの追加残基を定義づけられたエピトープのＮ末端、
またはＣ末端または両端において、加えることができる
。
さらに、追加の残基がエピトープのいずれかの末端か両
端に加えられる場合には、これらは、天然の残基である
方が望ましい。これらは、旦、鱈お…■ＬのＰ、６９抗
原の配列、旦、肚旦４■山＋５ｓｉｓ−のＰ、７０抗原
または旦、垣」担魁ｌ狙−ｔｉｃａのＰ、６３抗原の配
列から導き出すことができる。それゆえ、エピトープの
ためのより好ましい隣接配列は、例えば、Ｐ、６９．Ｐ
、７０またはＰ、６８のタンパク質の全体の配列におい
て、場合によりエピトープ配列のいずれかの側に存在す
る自然の隣接配列であってよい、またシスティン残基は
、Ｎ−末端またはＣ−末端に加えられてよい、特にシス
ティン残基は、Ｃ−末端のみに加えられてよい。これは
、キャリヤーの結合を容易にし、そして／または、ポリ
ペプチドの免疫原性を増強するためである。
端に加えられる場合には、これらは、天然の残基である
方が望ましい。これらは、旦、鱈お…■ＬのＰ、６９抗
原の配列、旦、肚旦４■山＋５ｓｉｓ−のＰ、７０抗原
または旦、垣」担魁ｌ狙−ｔｉｃａのＰ、６３抗原の配
列から導き出すことができる。それゆえ、エピトープの
ためのより好ましい隣接配列は、例えば、Ｐ、６９．Ｐ
、７０またはＰ、６８のタンパク質の全体の配列におい
て、場合によりエピトープ配列のいずれかの側に存在す
る自然の隣接配列であってよい、またシスティン残基は
、Ｎ−末端またはＣ−末端に加えられてよい、特にシス
ティン残基は、Ｃ−末端のみに加えられてよい。これは
、キャリヤーの結合を容易にし、そして／または、ポリ
ペプチドの免疫原性を増強するためである。
ポリペプチドは、Ｃ−末端遊離カルボキシル基をもって
いてよい。代替として、Ｃ−末端アミドの形であってよ
い、医薬的に容認できるポリペプチドの塩が使用される
ことができる。ポリペプチドは、抗原性的に活性である
抗原を創出すために、キャリヤーに結合することができ
る。適切な生理学的に容認できるキャリヤーならどれで
も使用できる。ポリペプチドとキャリヤーの間の結合体
を形成することができる。キャリヤーは、例えば、ウシ
血清アルブミン、チグロプリンオボアルブミン、キーホ
ールリンベット（カサガイの１種、Ｆｉｓｓｕｒｅｌｌ
ａ属）のヘモシアニン（ＫＬＨ）または肝炎Ｂのコア抗
原であってよい。
いてよい。代替として、Ｃ−末端アミドの形であってよ
い、医薬的に容認できるポリペプチドの塩が使用される
ことができる。ポリペプチドは、抗原性的に活性である
抗原を創出すために、キャリヤーに結合することができ
る。適切な生理学的に容認できるキャリヤーならどれで
も使用できる。ポリペプチドとキャリヤーの間の結合体
を形成することができる。キャリヤーは、例えば、ウシ
血清アルブミン、チグロプリンオボアルブミン、キーホ
ールリンベット（カサガイの１種、Ｆｉｓｓｕｒｅｌｌ
ａ属）のヘモシアニン（ＫＬＨ）または肝炎Ｂのコア抗
原であってよい。
本発明による２番目の型のペプチドは、定義づけられた
エピトープを提供するところのキメラ状タンパク質であ
る。キメラ状タンパク質は、典型的には、望まれるエピ
トープの配列を含むところの５０までのアごノ酸の外来
配列を、そのアミノ酸配列が含むように改変されたキャ
リヤータンパク質である。タンパク質のあるアミノ酸配
列によって置換されることができる。代替として、外来
アミノ酸はタンパク質に融合される。例えば、５こまで
のアミノ酸でもよい、１０こまでのアミノ酸の介在リン
ガ−は、エピトープとキャリヤーの間に供給されること
がある。外来アミノ酸配列は、本発明によれば、第１の
ポリペプチドについて記述されたように、長さにおいて
変動することがある。
エピトープを提供するところのキメラ状タンパク質であ
る。キメラ状タンパク質は、典型的には、望まれるエピ
トープの配列を含むところの５０までのアごノ酸の外来
配列を、そのアミノ酸配列が含むように改変されたキャ
リヤータンパク質である。タンパク質のあるアミノ酸配
列によって置換されることができる。代替として、外来
アミノ酸はタンパク質に融合される。例えば、５こまで
のアミノ酸でもよい、１０こまでのアミノ酸の介在リン
ガ−は、エピトープとキャリヤーの間に供給されること
がある。外来アミノ酸配列は、本発明によれば、第１の
ポリペプチドについて記述されたように、長さにおいて
変動することがある。
エピトープは、それが免疫系に提出されるように、キメ
ラ状のタンパク質の表面に露出される。
ラ状のタンパク質の表面に露出される。
キメラ状のタンパク質は、粒子の形または粒子が凝集し
た形をとることがある。このような凝集は、キメラタン
パク賞の複数を含むか、そして／またはウィルスの粒子
であることがある。エピトープを含む外来アミノ酸配列
が、融合していることがあるタンパク質は、Ｂ型肝炎表
面抗原（ＨＢｓＡｇ 。
た形をとることがある。このような凝集は、キメラタン
パク賞の複数を含むか、そして／またはウィルスの粒子
であることがある。エピトープを含む外来アミノ酸配列
が、融合していることがあるタンパク質は、Ｂ型肝炎表
面抗原（ＨＢｓＡｇ 。
ＥＰ−Ａ−０１７５２６１）またはＢ型肝炎コアー抗原
（ＨＢｃＡｇ 、 ＴＰ−Ａ−６３１９６２９９）のよ
うな粒子形成タンパク質であってよい。外来配列は、ウ
ィルス（ＧＢ−Ａ−２１２５０６５）の表面上に露出し
たウィルスタンパク質の配列に挿入されることがある。
（ＨＢｃＡｇ 、 ＴＰ−Ａ−６３１９６２９９）のよ
うな粒子形成タンパク質であってよい。外来配列は、ウ
ィルス（ＧＢ−Ａ−２１２５０６５）の表面上に露出し
たウィルスタンパク質の配列に挿入されることがある。
ウィルスタンパク質は、ウィルスのキャプシドタンパク
質であることがある。
質であることがある。
配列は、それゆえ、ポリオウィルス（ＥＰ−Ａ−０３０
２８０１）のようなピコルナ料のウィルスの抗原部位の
１つにおいて供給されることがある。本エピトープは、
１型ポリオウイルスの弱毒化株のキャプシドタンパク賃
上の、例えば、１．２または３の抗原部位の１つにおい
て、または２型、もしくは３型ポリオウイルスの抗原部
位において提供されることがある０例えば、ウシエンテ
ロウィルス属のような、適切に改変された他のピコルナ
ウイルスが使用されることがある。
２８０１）のようなピコルナ料のウィルスの抗原部位の
１つにおいて供給されることがある。本エピトープは、
１型ポリオウイルスの弱毒化株のキャプシドタンパク賃
上の、例えば、１．２または３の抗原部位の１つにおい
て、または２型、もしくは３型ポリオウイルスの抗原部
位において提供されることがある０例えば、ウシエンテ
ロウィルス属のような、適切に改変された他のピコルナ
ウイルスが使用されることがある。
ピコルナウィルスの抗原部位のアミノ酸配列は、外来ア
ミノ酸配列によって完全に、もしくは部分的に置換える
ことがある。外来アミノ酸配列は、ｌ型ポリオウィルス
の弱毒化株の抗原部位１の若干またはすべての代りに提
供されることがより好ましい。弱毒化株は典型的には、
５ａｂｉｎ １ワクチン株である。１型ポリオウイルス
の抗原部位の１はＶＰＩキャプシドタンパク質の９１番
目から１０２番目のアミノ酸残基から威立っている。
ミノ酸配列によって完全に、もしくは部分的に置換える
ことがある。外来アミノ酸配列は、ｌ型ポリオウィルス
の弱毒化株の抗原部位１の若干またはすべての代りに提
供されることがより好ましい。弱毒化株は典型的には、
５ａｂｉｎ １ワクチン株である。１型ポリオウイルス
の抗原部位の１はＶＰＩキャプシドタンパク質の９１番
目から１０２番目のアミノ酸残基から威立っている。
本発明のポリペプチドは、合成ポリペプチドである。そ
れらは、特に５０こまでのアミノ酸残基の長さをもつ最
初の型のポリペプチドは、合成によって調製することが
できる。固相または溶液法ペプチド合成を用いることが
できる。それゆえ、ポリペプチドは、単独アミノ酸そし
て／または、でき上ったペプチドまたは２こ以上のアミ
ノ酸を、発明のポリペプチド中でアごノ酸の存在する順
序にしたがって縮合することからなる工程によって構築
することができる０本ポリペプチドは、遊離のＣ−末端
カルボキシル基またはＣ末端アミド基をもつように合成
することができる。望ましければ、ポリペプチドは医薬
として容認できる塩に変換することができる。
れらは、特に５０こまでのアミノ酸残基の長さをもつ最
初の型のポリペプチドは、合成によって調製することが
できる。固相または溶液法ペプチド合成を用いることが
できる。それゆえ、ポリペプチドは、単独アミノ酸そし
て／または、でき上ったペプチドまたは２こ以上のアミ
ノ酸を、発明のポリペプチド中でアごノ酸の存在する順
序にしたがって縮合することからなる工程によって構築
することができる０本ポリペプチドは、遊離のＣ−末端
カルボキシル基またはＣ末端アミド基をもつように合成
することができる。望ましければ、ポリペプチドは医薬
として容認できる塩に変換することができる。
固相合成においては、望むポリペプチドのアミノ酸配列
は、不溶の樹脂に結合しているＣ−末端アミノ酸から順
番に構築される。望むポリペプチドができ上ったときは
、それは、樹脂から開裂される。溶液相合成法が使用さ
れるときは、ポリペプチドは、Ｃ−末端アミノ酸から再
び合成することができる。この酸のカルボキシル基は、
適切な保護基によって、全体を通じて保護されたままで
あり、合成の終りに除去される。
は、不溶の樹脂に結合しているＣ−末端アミノ酸から順
番に構築される。望むポリペプチドができ上ったときは
、それは、樹脂から開裂される。溶液相合成法が使用さ
れるときは、ポリペプチドは、Ｃ−末端アミノ酸から再
び合成することができる。この酸のカルボキシル基は、
適切な保護基によって、全体を通じて保護されたままで
あり、合成の終りに除去される。
固相または溶液相のいずれの技術が使用されるにせよ、
反応系に与えられる各アミノ酸は、保護されたα−アご
ノ基と活性化されたカルボキシル基をもっている。アミ
ノ基は、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｐ
ｓ＋ｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基
によって保護することができる。カルボキシル基は、ペ
ンタフルオロフェニルまたは１−オキソ−２−ハイドロ
キシ−ジヒドロベンゾトリアジンエステルとして活性化
できる。各縮合段階は、ダイサイクロへキシルカルボジ
イミドまたは１−ハイドロキシトリアゾールの存在にお
いて行うことができる。
反応系に与えられる各アミノ酸は、保護されたα−アご
ノ基と活性化されたカルボキシル基をもっている。アミ
ノ基は、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｐ
ｓ＋ｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基
によって保護することができる。カルボキシル基は、ペ
ンタフルオロフェニルまたは１−オキソ−２−ハイドロ
キシ−ジヒドロベンゾトリアジンエステルとして活性化
できる。各縮合段階は、ダイサイクロへキシルカルボジ
イミドまたは１−ハイドロキシトリアゾールの存在にお
いて行うことができる。
例えば、リジンの側鎖アミノ基、スレオニンの側鎖ハイ
ドロキシル基またはシスティンのＳＨ基（スルフヒドリ
ル基）のような側鎖の官能基も典型的に保護される０合
成における各段階の後、αアミノ保護基は除去される。
ドロキシル基またはシスティンのＳＨ基（スルフヒドリ
ル基）のような側鎖の官能基も典型的に保護される０合
成における各段階の後、αアミノ保護基は除去される。
しかし、一般に側鎖の保護基は、必要であれば保持され
るが合成の終りにおいてのみ除去される。
るが合成の終りにおいてのみ除去される。
ポリペプチドは、望まれるように、Ｃ−末端カルボキシ
ルまたはアミド基をもった状態で調製される。固相ペプ
チド合成においては、これはＣ−末端が樹脂支持体にど
のように結合されているか、そして／または、最終ペプ
チドが樹脂からどのように開裂されるかによって決定さ
れることとなる。
ルまたはアミド基をもった状態で調製される。固相ペプ
チド合成においては、これはＣ−末端が樹脂支持体にど
のように結合されているか、そして／または、最終ペプ
チドが樹脂からどのように開裂されるかによって決定さ
れることとなる。
典型的には、樹脂は、スチレン、そして／またはジウイ
ニルベンゼンボリマーである。Ｃ−末端ア５ノ酸は、ト
リフルオロ酢酸中のＨＢｒまたはＨＦのような強酸によ
って開裂することができ、Ｃ−末端カルボキシル基を与
えることができるところのエステル結合によって樹脂に
結合することができる。アンモニア分解によって、その
代りに相当するアミドを与えることができる。
ニルベンゼンボリマーである。Ｃ−末端ア５ノ酸は、ト
リフルオロ酢酸中のＨＢｒまたはＨＦのような強酸によ
って開裂することができ、Ｃ−末端カルボキシル基を与
えることができるところのエステル結合によって樹脂に
結合することができる。アンモニア分解によって、その
代りに相当するアミドを与えることができる。
固相合成によって、ポリペプチドアミドを得る代替法は
、ポリペプチドのＣ−末端アミノ基が、ペプチドアミノ
ベンツヒドリル結合を介して、樹脂に結合されるよう処
置をとることである。これは、ダイサイクロへキシルカ
ルボジイミドでカップリングを行うことによって形成す
ることができる。そして、ＩＦで典型的には低温で開裂
することができる。溶液相合成については、Ｃ−末端カ
ルボキシル基またはアミド基が存在するかどうかは、Ｃ
−末端アミノ酸のカルボキシル基がいかに保護されてお
り、そして合成の終了時に保護基がいかに取除かれるか
によることがある。Ｃ−末端カルボキシル基をもったポ
リペプチドは、Ｃ−末端アミド基をもったポリペプチド
に交換することができ、その逆も行うことができる。
、ポリペプチドのＣ−末端アミノ基が、ペプチドアミノ
ベンツヒドリル結合を介して、樹脂に結合されるよう処
置をとることである。これは、ダイサイクロへキシルカ
ルボジイミドでカップリングを行うことによって形成す
ることができる。そして、ＩＦで典型的には低温で開裂
することができる。溶液相合成については、Ｃ−末端カ
ルボキシル基またはアミド基が存在するかどうかは、Ｃ
−末端アミノ酸のカルボキシル基がいかに保護されてお
り、そして合成の終了時に保護基がいかに取除かれるか
によることがある。Ｃ−末端カルボキシル基をもったポ
リペプチドは、Ｃ−末端アミド基をもったポリペプチド
に交換することができ、その逆も行うことができる。
本発明による両方の型のポリペプチドは、組換え体ＤＮ
Ａ方法論によって、特に （ｉ）該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込
み、適当な宿主中に提供されたとき、該ポリペプチドを
発現することができる発現ベクターを調製し、そして、 （ｉｉ ） Ｅ’Ｓポリペプチドの発現が起ることがで
きるようにする該宿主において、該ベクターを供給する
ことによって調製することができる。
Ａ方法論によって、特に （ｉ）該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込
み、適当な宿主中に提供されたとき、該ポリペプチドを
発現することができる発現ベクターを調製し、そして、 （ｉｉ ） Ｅ’Ｓポリペプチドの発現が起ることがで
きるようにする該宿主において、該ベクターを供給する
ことによって調製することができる。
このようにして、望むポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列が提供される０問題のＤＮＡ配列を組込み、適切な
宿主に提供されるとき、問題のポリペプチドを発現する
ことができるところの発現ベクターが調製される。問題
のＤＮＡ配列は、ベクター中において翻訳開始部位と停
止部位の間に存在する。適切な転写及び翻訳調節要素、
特にそのＤＮＡ配列のためのプロモーターと転写停止部
位も提供される０問題のＤＮＡ配列は、ポリペプチドの
発現がベクターと適合性の宿主中で起ることができるよ
うにするような正しい枠組みにおいて提供される。
配列が提供される０問題のＤＮＡ配列を組込み、適切な
宿主に提供されるとき、問題のポリペプチドを発現する
ことができるところの発現ベクターが調製される。問題
のＤＮＡ配列は、ベクター中において翻訳開始部位と停
止部位の間に存在する。適切な転写及び翻訳調節要素、
特にそのＤＮＡ配列のためのプロモーターと転写停止部
位も提供される０問題のＤＮＡ配列は、ポリペプチドの
発現がベクターと適合性の宿主中で起ることができるよ
うにするような正しい枠組みにおいて提供される。
キメラ状のタンパク質の場合は、外来のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ断片は、問題のエピトープが、タンパ
ク質の表面上に露出したキメラ状タンパク質の部分とし
て発現されることができるようにする位置において挿入
される。そうすれば、キメラ状のタンパク質が発現され
る。ベクターを宿している細胞は、発現が起るよう培養
される。
コードするＤＮＡ断片は、問題のエピトープが、タンパ
ク質の表面上に露出したキメラ状タンパク質の部分とし
て発現されることができるようにする位置において挿入
される。そうすれば、キメラ状のタンパク質が発現され
る。ベクターを宿している細胞は、発現が起るよう培養
される。
キメラ状タンパク質の型によって、タンパク質は、粒子
となって自ら集合することがある。
となって自ら集合することがある。
適切な宿主−ベクター系は、すべて使用することができ
る。ベクターは、プラスミドであってよい。その場合は
、例えばＥ、 ｃｏｌｉや−３，ｃｅｒｅｖｉｓｉ−肚
のようなバクテリアや酵母を使用することができる。代
替として、ベクターはウィルスベクターであってもよい
。これは、ポリペプチドの発現を起させるために、ＣＨ
Ｏ細胞のような哺乳動物の細胞系の細胞を形質転換する
のに使用される。
る。ベクターは、プラスミドであってよい。その場合は
、例えばＥ、 ｃｏｌｉや−３，ｃｅｒｅｖｉｓｉ−肚
のようなバクテリアや酵母を使用することができる。代
替として、ベクターはウィルスベクターであってもよい
。これは、ポリペプチドの発現を起させるために、ＣＨ
Ｏ細胞のような哺乳動物の細胞系の細胞を形質転換する
のに使用される。
本発明にしたがうエピトープは、１こ以上のヘルパーＴ
細胞（Ｔｈ−細胞）のエピトープに結合させることがで
きる。Ｔｈ−細胞エピトープは、抗体産生のための援助
を引出すことができる部位である。 Ｔｈ−細胞のエピ
トープは、宿主抗原提示細胞の表面において、クラス■
の主要組織適合（ＭＨＣ）分子と結合することができ、
その後、Ｂ−細胞は、Ｂ−細胞の分化と増殖を誘発する
ために、Ｔ−細胞の受容体と３分子複合体の形で相互作
用する。
細胞（Ｔｈ−細胞）のエピトープに結合させることがで
きる。Ｔｈ−細胞エピトープは、抗体産生のための援助
を引出すことができる部位である。 Ｔｈ−細胞のエピ
トープは、宿主抗原提示細胞の表面において、クラス■
の主要組織適合（ＭＨＣ）分子と結合することができ、
その後、Ｂ−細胞は、Ｂ−細胞の分化と増殖を誘発する
ために、Ｔ−細胞の受容体と３分子複合体の形で相互作
用する。
Ｔｈ−細胞エピトープは、本発明のポリペプチドの最初
の型と、種々の方法で結合することができる。グルタル
アルデヒド重合を使用することができる。そして、その
中では、発明のポリペプチドは、それらのアミノ基を介
して、Ｔｈ−細胞エピトープを提供するポリペプチドと
共重合される。本発明のポリペプチド及びＴｈ−細胞エ
ピトープを提示するポリペプチドは、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ハイドロキシーサクシリミドエステル（
ＭＢＳ）のようなヘテロ２官能性架橋結合剤を介して、
−緒に結合させることができる。
の型と、種々の方法で結合することができる。グルタル
アルデヒド重合を使用することができる。そして、その
中では、発明のポリペプチドは、それらのアミノ基を介
して、Ｔｈ−細胞エピトープを提供するポリペプチドと
共重合される。本発明のポリペプチド及びＴｈ−細胞エ
ピトープを提示するポリペプチドは、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ハイドロキシーサクシリミドエステル（
ＭＢＳ）のようなヘテロ２官能性架橋結合剤を介して、
−緒に結合させることができる。
本発明のポリペプチドは、代替策として、ペプチド結合
を介してＴｈ−細胞エピトープを提示するポリペプチド
に対して、そのＣ−末端またはＮ−末端において結合さ
せてよい。これは、本発明のポリペプチドとＴｈ−細胞
エピトープを提出するポリペプチドとの共直線状合成ま
たは２つのポリペプチドが、−緒に融合している融合タ
ンパク質を発現するために、上記の如くの組換え体ＤＮ
Ａの技術を使用することによって達成される。いずれの
方法においても、適切なＴｈ−細胞エピトープは、いず
れも使用することができる。
を介してＴｈ−細胞エピトープを提示するポリペプチド
に対して、そのＣ−末端またはＮ−末端において結合さ
せてよい。これは、本発明のポリペプチドとＴｈ−細胞
エピトープを提出するポリペプチドとの共直線状合成ま
たは２つのポリペプチドが、−緒に融合している融合タ
ンパク質を発現するために、上記の如くの組換え体ＤＮ
Ａの技術を使用することによって達成される。いずれの
方法においても、適切なＴｈ−細胞エピトープは、いず
れも使用することができる。
Ｔｂ−細胞エピトープを提供するより好ましいポリペプ
チドは、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である。
チドは、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である。
本発明の最初の型のポリペプチドは、Ｉ（ＢｃＡｇに化
学的に結合させることができる。そのアミノ末端に、本
発明のポリペプチドが結合しているＨＢｃＡｇを含むと
ころの本発明の２番目の型のポリペプチドにしたがって
、融合タンパク質を作るためには、組換え体ＤＮＡ技術
を使用することができる。問題のエピトープは、ＨＢｃ
Ａｇのアミノ末端に直接融合することができる。代替と
して、その配列は、介在リンカ−を介してＨＢｃＡｇに
融合させることができる。このようなリンカ−は、１こ
以上、例えば１０こまでのアミノ酸残基から構成するこ
とができる。
学的に結合させることができる。そのアミノ末端に、本
発明のポリペプチドが結合しているＨＢｃＡｇを含むと
ころの本発明の２番目の型のポリペプチドにしたがって
、融合タンパク質を作るためには、組換え体ＤＮＡ技術
を使用することができる。問題のエピトープは、ＨＢｃ
Ａｇのアミノ末端に直接融合することができる。代替と
して、その配列は、介在リンカ−を介してＨＢｃＡｇに
融合させることができる。このようなリンカ−は、１こ
以上、例えば１０こまでのアミノ酸残基から構成するこ
とができる。
本発明のポリペプチドは、−迂−１４１懸互ロー、ｆｌ
。
。
ａｒａ ｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＢ ｂｒｏｎｃｈｉ
ｓｅ ｔｉｃａに対するワクチンとして有用である。ポ
リペプチドの効果的な量が、ワクチン接種が必要なとき
に、宿主に投与される。ポリペプチドは、経口または非
経口、例えば、皮下または筋肉注射で投与されることが
できる。本ポリペプチドは、ＦＨＡとともに与えてもよ
い。この方法で、百日咳に対する免疫は、ヒトにおいて
誘導することができる。
ｓｅ ｔｉｃａに対するワクチンとして有用である。ポ
リペプチドの効果的な量が、ワクチン接種が必要なとき
に、宿主に投与される。ポリペプチドは、経口または非
経口、例えば、皮下または筋肉注射で投与されることが
できる。本ポリペプチドは、ＦＨＡとともに与えてもよ
い。この方法で、百日咳に対する免疫は、ヒトにおいて
誘導することができる。
Ｂ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ ｔｉｃａに対する免疫は、
哺乳動物において誘導することができる。
哺乳動物において誘導することができる。
典型的には、ポリペプチドは、投与あたり１乃至１００
０μｇの量、より好ましくは、投与あたり１０から１０
０μｇの量において、経口または非経口投与される。単
回投与を行うことができ、または複数投与量を、ある期
間にわたって投与することもできる。ＦＨＡが投与され
るときは、それは、投与あたり２０から７５μｇの量に
おいて使用することができる。ＦＨＡは、典型的な場合
には、本発明のポリペプチドと同じワクチン製剤として
投与される。
０μｇの量、より好ましくは、投与あたり１０から１０
０μｇの量において、経口または非経口投与される。単
回投与を行うことができ、または複数投与量を、ある期
間にわたって投与することもできる。ＦＨＡが投与され
るときは、それは、投与あたり２０から７５μｇの量に
おいて使用することができる。ＦＨＡは、典型的な場合
には、本発明のポリペプチドと同じワクチン製剤として
投与される。
本発明のワクチンは、発明のポリペプチド、随意に添加
してもよいＦＨＡ及び医薬的に容認し得るキャリヤーま
たは希釈剤から戒っている。担体または希釈剤は、例え
ば、等侵食塩水溶液のような抗原を患者に導入する媒体
として使用するのに適した液体媒体ならなんでもあって
もよし〕、また、ポリペプチドは、免疫応答を刺戟し、
その際、ワクチンの効果を増強するためのアジュバント
とともに提供されることができる。適切な生理学的に容
認できるアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリ
ン酸アルミニウムである。
してもよいＦＨＡ及び医薬的に容認し得るキャリヤーま
たは希釈剤から戒っている。担体または希釈剤は、例え
ば、等侵食塩水溶液のような抗原を患者に導入する媒体
として使用するのに適した液体媒体ならなんでもあって
もよし〕、また、ポリペプチドは、免疫応答を刺戟し、
その際、ワクチンの効果を増強するためのアジュバント
とともに提供されることができる。適切な生理学的に容
認できるアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリ
ン酸アルミニウムである。
ワクチン製剤は、抗原性ポリペプチドの０．０１から５
■／ｍｌ、望ましくは、０．０３から２■／ｍｌ、最も
望ましくは、０．３■／ａｉｌ範囲内における最終濃度
を含むように提供されるのが便利である。製剤化後、ワ
クチンは無菌容器に入れ、容器を封じ、低温、たとえば
、４℃で貯蔵することもあれば、あるいは凍結乾燥する
こともある。
■／ｍｌ、望ましくは、０．０３から２■／ｍｌ、最も
望ましくは、０．３■／ａｉｌ範囲内における最終濃度
を含むように提供されるのが便利である。製剤化後、ワ
クチンは無菌容器に入れ、容器を封じ、低温、たとえば
、４℃で貯蔵することもあれば、あるいは凍結乾燥する
こともある。
このような製剤の１つ以上の用量を免疫を誘導するため
に宿主に投与することができる。各投与量は、０．１か
ら０．２−２、好ましくは、０．２から１■２１最も好
ましくは、約０．５ｍｊ！のワクチンであることが推奨
される。それゆえ、ワクチン製剤の効果的な量の投与に
よって免疫を誘導することができる。
に宿主に投与することができる。各投与量は、０．１か
ら０．２−２、好ましくは、０．２から１■２１最も好
ましくは、約０．５ｍｊ！のワクチンであることが推奨
される。それゆえ、ワクチン製剤の効果的な量の投与に
よって免疫を誘導することができる。
以下の例は、本発明を具体的に説明する。それらに付随
している図においては： 第１図は、ベクターｐＷＹＧ７の構築を示す。
している図においては： 第１図は、ベクターｐＷＹＧ７の構築を示す。
第２図は、ＧＡＬ７プロモーター領域のヌクレオチド配
列を示す。合成されたプロモーターは、ＸｈｏｌからＢ
ａｇ Ｈ１断片に相当する、Ｂａ−旧の下流の領域は、
ＲＮＡの開始部位（↓）とイニシエイティングＡＴＧ
（下線が引いである）を含む天然のＧＡＬＴ中に存在し
ている。Ｂａｇ ＩＩ部位を与えるために変更された２
つの塩基対に下線が引いである。
列を示す。合成されたプロモーターは、ＸｈｏｌからＢ
ａｇ Ｈ１断片に相当する、Ｂａ−旧の下流の領域は、
ＲＮＡの開始部位（↓）とイニシエイティングＡＴＧ
（下線が引いである）を含む天然のＧＡＬＴ中に存在し
ている。Ｂａｇ ＩＩ部位を与えるために変更された２
つの塩基対に下線が引いである。
第３図（その１．２及び３）は、ｐ−χＧ７ＨＢＰの構
築を示す。
築を示す。
第４図（その１）は、ＧＡＬ７の翻訳されないリーダー
配列とＨＢｃＡｇ遺伝子の５゛領域を含む合成オリゴＡ
のヌクレオチド配列を示す。
配列とＨＢｃＡｇ遺伝子の５゛領域を含む合成オリゴＡ
のヌクレオチド配列を示す。
第４図（その２）は、想定されたＢＢＯ５のエビドーム
をコードしている合成オリゴＢのヌクレオチド配列を示
す。
をコードしている合成オリゴＢのヌクレオチド配列を示
す。
第５図は、（１）ｐＨＹＧ７ｔｌＢＦ （Ｆ Ｍ Ｄペ
プチド−ＨＢｃＡｇ融合を発現する） 、（２）ＰＷＹ
Ｇ７ＨＢＦ、（３）プラスミドなし、及び（４）ｐＷＹ
Ｇ７ＨＢＣ（ＨＢｃＡｇを発現する）で形質転換された
誘導酵母細胞からの例２（６）における可溶性タンパク
賞のウェスターンプロットの結果を示す。プロットは、
ウサギ抗−ＨＢｃＡｇ血清とヒツジ抗ラビットＩｇＧと
ペルオキシダーゼ結合体を用いて展開した。ゲル中に、
３０に、２１．５に、及び１４．３ Ｋ Ｄ ａＯサイ
ズマーカーの位置が示されている。
プチド−ＨＢｃＡｇ融合を発現する） 、（２）ＰＷＹ
Ｇ７ＨＢＦ、（３）プラスミドなし、及び（４）ｐＷＹ
Ｇ７ＨＢＣ（ＨＢｃＡｇを発現する）で形質転換された
誘導酵母細胞からの例２（６）における可溶性タンパク
賞のウェスターンプロットの結果を示す。プロットは、
ウサギ抗−ＨＢｃＡｇ血清とヒツジ抗ラビットＩｇＧと
ペルオキシダーゼ結合体を用いて展開した。ゲル中に、
３０に、２１．５に、及び１４．３ Ｋ Ｄ ａＯサイ
ズマーカーの位置が示されている。
第６図は、例２（７）中のＨＢＰ融合タンパク質の蔗糖
密度勾配遠心分離の後のドツトプロット分析の結果を示
しである０分画１は最底部の分画であり、分画２０が最
高部の分画である。抗−ＨＢｃＡｇ血清と反応する物質
はすべて、真中の分画にあり、ＨＢＰが完全に粒子とし
て集合していることを示している。
密度勾配遠心分離の後のドツトプロット分析の結果を示
しである０分画１は最底部の分画であり、分画２０が最
高部の分画である。抗−ＨＢｃＡｇ血清と反応する物質
はすべて、真中の分画にあり、ＨＢＰが完全に粒子とし
て集合していることを示している。
第７図は、ＨＢＰ融合タンパク賞によって提供されたペ
プチド６８３．６８４と６８５及びエピトープが、そこ
から由来しているところのＰ、６９の領域を示す。ＢＢ
Ｏ５／コアーは、ＢＢＯ５と結合する。ペプチド６８３
は、ＢＢＯ５，ＢＢＯ７。
プチド６８３．６８４と６８５及びエピトープが、そこ
から由来しているところのＰ、６９の領域を示す。ＢＢ
Ｏ５／コアーは、ＢＢＯ５と結合する。ペプチド６８３
は、ＢＢＯ５，ＢＢＯ７。
Ｅ４Ａ８とＥ４Ｄ７と結合する。ペプチド６８４：は結
合しない。ペプチド６８５は、ＰＢＥ３と結合する。ア
ミノ酸配列の番号づけは、成熟した（すなわち、シグナ
ル配列がプロセッシングを受けた後の）Ｐ、６９の残基
を指している。
合しない。ペプチド６８５は、ＰＢＥ３と結合する。ア
ミノ酸配列の番号づけは、成熟した（すなわち、シグナ
ル配列がプロセッシングを受けた後の）Ｐ、６９の残基
を指している。
第８図は、旦、４■１υｓｉｓユのＰ、６９タンパク賞
の残基５０５から６０３をカバーしているペプチドのモ
ノクローナル抗体での分析を示している。
の残基５０５から６０３をカバーしているペプチドのモ
ノクローナル抗体での分析を示している。
１：ペブチ゛の−
以下に示すペプチドは、Ｈｕｎｇｈｔｅｎ （Ｈｕｎｇ
ｈｔｅｎ 。
ｈｔｅｎ 。
ＰＮＡＳ 、□、５１３１−５１３５．１９８５）によ
って記述されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ 。
って記述されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ 。
ＪＡＣ３，８５，２１４９−２１５４，１９６３）の変
法を使用して台底された。
法を使用して台底された。
ペプチド６８３：
ＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰＡ
ＧＲＥＬＳＣ（本発明のペプチド） ペプチド６８４： ＡＧＲＥＬＳＡＡＡＮＡＡＶＮＴＧＧＶＧＬＡＳＴＬＷ
ＹＡＥＣペプチド６８５： ＴＬＷＹＡＥＳＮＡＬＳＫＲＬＧＥＬＲＬＮＰＤＡＧＧ
ＡＷＧＲＧＣペプチド６８３は、Ｐ、６９遺伝子のヌク
レオチド１８７６から１９６２によってコードされてい
るア短ノ酸で構成されていて、カルボキシル末端に１つ
の追加の非天然システィン残基をもっている。ペプチド
６８４は、Ｐ、６９遺伝子のヌクレオチド１９４８から
２０３１によってコードされているアミノ酸で構成され
ている。そして、カルボキシル末端に１つの追加の非天
然システィン残基をもっている。ペプチド６８５は、Ｐ
、６９遺伝子の２０１４から２１００のヌクレオチドに
よってコードされたアミノ酸で構成されていて、カルボ
キシル末端に、１つの追加の非天然システィン残基をも
っている。
ＧＲＥＬＳＣ（本発明のペプチド） ペプチド６８４： ＡＧＲＥＬＳＡＡＡＮＡＡＶＮＴＧＧＶＧＬＡＳＴＬＷ
ＹＡＥＣペプチド６８５： ＴＬＷＹＡＥＳＮＡＬＳＫＲＬＧＥＬＲＬＮＰＤＡＧＧ
ＡＷＧＲＧＣペプチド６８３は、Ｐ、６９遺伝子のヌク
レオチド１８７６から１９６２によってコードされてい
るア短ノ酸で構成されていて、カルボキシル末端に１つ
の追加の非天然システィン残基をもっている。ペプチド
６８４は、Ｐ、６９遺伝子のヌクレオチド１９４８から
２０３１によってコードされているアミノ酸で構成され
ている。そして、カルボキシル末端に１つの追加の非天
然システィン残基をもっている。ペプチド６８５は、Ｐ
、６９遺伝子の２０１４から２１００のヌクレオチドに
よってコードされたアミノ酸で構成されていて、カルボ
キシル末端に、１つの追加の非天然システィン残基をも
っている。
各ペプチドは、ｐ−メチル−ベンツヒドリルアミンジビ
ニルベンゼン樹脂上で台底された。各アミノ酸上のα−
アミノ保護基は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で
あった、各カップリングのサイクルは、以下の通りであ
る： １、ジクロロメタンで樹脂を１０分間洗う。
ニルベンゼン樹脂上で台底された。各アミノ酸上のα−
アミノ保護基は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で
あった、各カップリングのサイクルは、以下の通りであ
る： １、ジクロロメタンで樹脂を１０分間洗う。
２．５％ジイソプロピルエチルアミンを含むジクロロメ
タンで２分間ずつ３回洗う。
タンで２分間ずつ３回洗う。
３、ジクロロメタンで１分間ずつ２回洗う。
４、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸のジクロロメタン
溶液を、０．３Ｍジイソプロビルカルボジイξドで６０
分間カップリングを行わせる。ＮとＱについては、カッ
プリングは、ジメチルホルムアミド中で、０．３ Ｍジ
イソプロピルカルボジイミドと、０．１２５ Ｍ ）リ
ハイドロキシベンゾトリアゾールによって行った。
溶液を、０．３Ｍジイソプロビルカルボジイξドで６０
分間カップリングを行わせる。ＮとＱについては、カッ
プリングは、ジメチルホルムアミド中で、０．３ Ｍジ
イソプロピルカルボジイミドと、０．１２５ Ｍ ）リ
ハイドロキシベンゾトリアゾールによって行った。
５．３と同じ。
６、ジクロロメタン中５０％トリフルオロ酢酸で脱保護
基を２０分かけて行う。
基を２０分かけて行う。
７、ジクロロメタン洗滌１分間を６回。
８．２に戻る。
カップリングのサイクルが完了したときは、ペプチドは
、スカベンジャーとしてのアニソールの１０％の存在下
で、１時間、弗化水素処理して、レジンから開裂させて
遊離とした。この方法では、ペプチドは、カルボキシ末
端がアミド基として得られた。それは、次にエーテルで
洗い、乾燥し、１５％酢酸に溶かして凍結乾燥した。
、スカベンジャーとしてのアニソールの１０％の存在下
で、１時間、弗化水素処理して、レジンから開裂させて
遊離とした。この方法では、ペプチドは、カルボキシ末
端がアミド基として得られた。それは、次にエーテルで
洗い、乾燥し、１５％酢酸に溶かして凍結乾燥した。
１、総論
Ｐ、６９の遺伝子のヌクレオチド１８５５から１９４４
に相当するアミノ酸配列を、ＨＢｃＡｇのアミノ−末端
に遺伝的に融合させた。その結果得られた融合タンパク
賞は、酵母において効率的に発現され、Ｂ ｂｒｏｎ
ｃｈ’ｓｅ ｔｉｃａの６８ｋＤａのタンパク質に対し
て作られたモノクローナル抗体（Ｍａｂ） Ｂ Ｂ Ｏ
５と反応したが、−比一王彰１替互崩−のＰ、６９と交
差反応する。融合タンパク質は、コアー粒子の中に集合
し、ＦＨＡと一緒にして使用したとき、Ｋｅｎｄｒｉｃ
ｋ試験における一色一」髪りぢ刷１ｕ−による誘発に対
して保護を与えた。
に相当するアミノ酸配列を、ＨＢｃＡｇのアミノ−末端
に遺伝的に融合させた。その結果得られた融合タンパク
賞は、酵母において効率的に発現され、Ｂ ｂｒｏｎ
ｃｈ’ｓｅ ｔｉｃａの６８ｋＤａのタンパク質に対し
て作られたモノクローナル抗体（Ｍａｂ） Ｂ Ｂ Ｏ
５と反応したが、−比一王彰１替互崩−のＰ、６９と交
差反応する。融合タンパク質は、コアー粒子の中に集合
し、ＦＨＡと一緒にして使用したとき、Ｋｅｎｄｒｉｃ
ｋ試験における一色一」髪りぢ刷１ｕ−による誘発に対
して保護を与えた。
２ ベタ −ＷＹＧ７の
調節されているＧＡＬ７プロモーターを担っていた複数
コピーベクターｐｗｙｃ７から、Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、融合タンパ
ク質が発現された。Ｗｅｌ ｌｃｏｍｅにおいて構築さ
れたベクターｐＷＹＧ７は、ＨＢＰ、すなわち、ＨＢｃ
Ａｇのアミノ末端に融合した主要エピトープからなる融
合タンパク質の発現のために使用された。ベクターｐＷ
ＹＧ７は、カナマイシン抵抗性マーカー（Ｋａｎ’ ）
及び酵母ガラクトース調節性ＧＡＬ７プロモーターを含
むように改変された２μベクターｐ ＪＤＢ２１９ （
Ｂｅｇｇｓ 、 Ｎａｔｕｒｅ２７５．１０４−１０９
、１９７８）から誘導されている。
コピーベクターｐｗｙｃ７から、Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、融合タンパ
ク質が発現された。Ｗｅｌ ｌｃｏｍｅにおいて構築さ
れたベクターｐＷＹＧ７は、ＨＢＰ、すなわち、ＨＢｃ
Ａｇのアミノ末端に融合した主要エピトープからなる融
合タンパク質の発現のために使用された。ベクターｐＷ
ＹＧ７は、カナマイシン抵抗性マーカー（Ｋａｎ’ ）
及び酵母ガラクトース調節性ＧＡＬ７プロモーターを含
むように改変された２μベクターｐ ＪＤＢ２１９ （
Ｂｅｇｇｓ 、 Ｎａｔｕｒｅ２７５．１０４−１０９
、１９７８）から誘導されている。
ｐＷＹＧ７の構築は、第１図中に概要がまとめられであ
る。まず、Ｋａｎ’マーカー（ｐＵＣ４ＫからのＨｉｎ
ｃＩＩ断片； Ｖｉｅｉｒａ とＭｅｓｓｉｎｇ 、
Ｇｅｎｅエエ。
る。まず、Ｋａｎ’マーカー（ｐＵＣ４ＫからのＨｉｎ
ｃＩＩ断片； Ｖｉｅｉｒａ とＭｅｓｓｉｎｇ 、
Ｇｅｎｅエエ。
２５９．１９８２）をｐＪＤＢ２１９の独特な５Ｉｌａ
１部位につなげ、Ｋａｎ ’虱ｒベクターｐＪＤ８
２１９Ｋを与えた。第２に、合成ＧＡＬ１プロモーター
断片（Ｘｈｏ ｌ−Ｂａ−旧断片、配列が第２図に示し
である）が、ｐＪＤ８２１９にの独特なＳａｔ ＩとＢ
ａｓ＋旧部位にクローニングされた。
１部位につなげ、Ｋａｎ ’虱ｒベクターｐＪＤ８
２１９Ｋを与えた。第２に、合成ＧＡＬ１プロモーター
断片（Ｘｈｏ ｌ−Ｂａ−旧断片、配列が第２図に示し
である）が、ｐＪＤ８２１９にの独特なＳａｔ ＩとＢ
ａｓ＋旧部位にクローニングされた。
その結果得られたベクター、ｐＷＹＧ７は、酵母２μプ
ラス逅ドのＦＬＰ遺伝子転写ターミネータ−（Ｓｕｔｔ
ｏｎとＢｒｏａｃｈ 、 Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
、 ｉ、 ２７７０−２７８０ 、１９８５ ）の上流
に独特なりａｇ ＨＩとＢｃｌＩＩ部位をもったＧＡＬ
７プロモーターをもっている。
ラス逅ドのＦＬＰ遺伝子転写ターミネータ−（Ｓｕｔｔ
ｏｎとＢｒｏａｃｈ 、 Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
、 ｉ、 ２７７０−２７８０ 、１９８５ ）の上流
に独特なりａｇ ＨＩとＢｃｌＩＩ部位をもったＧＡＬ
７プロモーターをもっている。
ｐＷＹＧ７から発現されるべき外来遺伝子は、Ｂａ１１
旧とＢｃｌ １部位の間に挿入される。ＧＡＬ７プロモ
ーター断片のデザインは、以下に論議されている。
旧とＢｃｌ １部位の間に挿入される。ＧＡＬ７プロモ
ーター断片のデザインは、以下に論議されている。
完全なプロモーター活性を示すＧＡＬ７遺伝子のＤＮＡ
上流の最小の断片は、欠失地図作成（Ｔａ ｊ ｉｎ＋
ａら、Ｙｅａｓｔ １，６フー７７．１９８５）によ
って明確化された。この知識に基いて、２６０ｂｐのＧ
ＡＬ７プロモーター断片が合成された（配列については
第２図参照）。２６０ｂｐプロモーターは、４つの重な
り合ったオリゴヌクレオチドとして、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ （プロトコルは、
Ｐｈａｒｍａｃｉａから提供された）を使用して合成さ
れた。これらのオリゴヌクレオチドは、標準的技術を使
用して、リン酸化され、アニーリングを行ってからＸｈ
ｏ ｌ−Ｂａｌ１ｌ旧で切断したｐＩＣ−２０Ｈ（Ｍａ
ｒｓｈ ら、Ｇｅｎｅ３２． ４８１−４８５．１９
８４）につなげた。陽性のクローンを同定し、それらの
ＤＮＡは、ユニバーサル及びリバースシーケンシングプ
ライ？ −（ｌｏｎｇ 、 Ｂｉｏｓｃｉ 、 Ｒｅｐ
ｏｒｔ ２ ＋９０７．１９８２）を用いた２重鎖ＤＮ
Ａ配列決定法を使用して決定された。ＧＡＬ７挿入部分
の配列が確認され、そして、次に、Ｘｈｏ Ｉ −Ｂａ
ｇ ＨＩＧＡＬ７挿入部が切出され、上述の如＜ＰＴ、
ＤＢ２１９の中へクローニングされた。
上流の最小の断片は、欠失地図作成（Ｔａ ｊ ｉｎ＋
ａら、Ｙｅａｓｔ １，６フー７７．１９８５）によ
って明確化された。この知識に基いて、２６０ｂｐのＧ
ＡＬ７プロモーター断片が合成された（配列については
第２図参照）。２６０ｂｐプロモーターは、４つの重な
り合ったオリゴヌクレオチドとして、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ （プロトコルは、
Ｐｈａｒｍａｃｉａから提供された）を使用して合成さ
れた。これらのオリゴヌクレオチドは、標準的技術を使
用して、リン酸化され、アニーリングを行ってからＸｈ
ｏ ｌ−Ｂａｌ１ｌ旧で切断したｐＩＣ−２０Ｈ（Ｍａ
ｒｓｈ ら、Ｇｅｎｅ３２． ４８１−４８５．１９
８４）につなげた。陽性のクローンを同定し、それらの
ＤＮＡは、ユニバーサル及びリバースシーケンシングプ
ライ？ −（ｌｏｎｇ 、 Ｂｉｏｓｃｉ 、 Ｒｅｐ
ｏｒｔ ２ ＋９０７．１９８２）を用いた２重鎖ＤＮ
Ａ配列決定法を使用して決定された。ＧＡＬ７挿入部分
の配列が確認され、そして、次に、Ｘｈｏ Ｉ −Ｂａ
ｇ ＨＩＧＡＬ７挿入部が切出され、上述の如＜ＰＴ、
ＤＢ２１９の中へクローニングされた。
ｐＷＹＧ７中のＧＡＬ７プロモーター断片のデザインは
、ＧＡＬ７メツセンジヤーＲＮＡの開始部位の上流にＢ
ａ１１旧クロ一ニング部位を作るために、天然のＧＡＬ
ＴＤＮＡ配列が、僅かに修正（２ｂｐ改変された）され
たものである。発現されるべき合成りＮＡは次にＧＡＬ
７上流の非翻訳配列とともにＧＡＬ７ｍＲＮＡ開始部位
が導入されるようにＢａｇ Ｈ１部位へ、合成ＤＮＡで
連結される。
、ＧＡＬ７メツセンジヤーＲＮＡの開始部位の上流にＢ
ａ１１旧クロ一ニング部位を作るために、天然のＧＡＬ
ＴＤＮＡ配列が、僅かに修正（２ｂｐ改変された）され
たものである。発現されるべき合成りＮＡは次にＧＡＬ
７上流の非翻訳配列とともにＧＡＬ７ｍＲＮＡ開始部位
が導入されるようにＢａｇ Ｈ１部位へ、合成ＤＮＡで
連結される。
このようにして、プロモーターの下流の最初の非酵母Ｄ
ＮＡは、外来遺伝子のイニシエイティングＡＴＧのコド
ンであり、生産された転写体は、翻訳の効率を減少する
可能性がある外来のリーダーよりも、むしろ酵母のＧＡ
ＬＴリーダーをもつ。
ＮＡは、外来遺伝子のイニシエイティングＡＴＧのコド
ンであり、生産された転写体は、翻訳の効率を減少する
可能性がある外来のリーダーよりも、むしろ酵母のＧＡ
ＬＴリーダーをもつ。
ＨＢＰについてのＢａ−旧−Ｂａｇ ＩＩ発現ユニット
は、中間体ベクターｐＫＧＣ−６９に中に組立てられた
。イニシエーターＡＴＧコドンの上流にＧＡＬ７配列を
含むこのベクターは、最初に、イニシエータ−ＡＴＧに
おいて、遺伝子操作したＮｃｏ Ｉ （ｃＣＡＴＧＧ）
部位でＨＢｃＡｇベクター、 ｐＫＧＣを構築すること
によって造られた。予知されたＢ−剋り罰８七Ｌエピト
ープをコードしているＤＮＡは、次に合ｔｃＮｃｏ Ｉ
−Ｎｅｏ Ｉオリゴヌクレオチドリンカーとして挿入
された。ＰＫＧＣとｐＫＧＣ−６９Ｋ、そして最終的発
現ベクターｐＷＹＧ７ＨＢＰの構築についての全体的ス
キームは、第３図（そのｌ。
は、中間体ベクターｐＫＧＣ−６９に中に組立てられた
。イニシエーターＡＴＧコドンの上流にＧＡＬ７配列を
含むこのベクターは、最初に、イニシエータ−ＡＴＧに
おいて、遺伝子操作したＮｃｏ Ｉ （ｃＣＡＴＧＧ）
部位でＨＢｃＡｇベクター、 ｐＫＧＣを構築すること
によって造られた。予知されたＢ−剋り罰８七Ｌエピト
ープをコードしているＤＮＡは、次に合ｔｃＮｃｏ Ｉ
−Ｎｅｏ Ｉオリゴヌクレオチドリンカーとして挿入
された。ＰＫＧＣとｐＫＧＣ−６９Ｋ、そして最終的発
現ベクターｐＷＹＧ７ＨＢＰの構築についての全体的ス
キームは、第３図（そのｌ。
２及び３）において示されている。
（ｉ） ＫＧＣ（７）４染
ＨＢｃＡｇの３°末端配列（ＡＶａ１部位から停止コド
ンまで）を含むＳａｌ Ｉ −ＥｃｏＲＩ リンカ−が
、ｐｕｃ１８のＳａｌ ＩとＥｃｏＲＩ部位（Ｖｉｅｉ
ｒａとＭｉｓｓｉｎｇ ＋１９８２）の間でつながれ、
プラスもドｐＫＧＦを与えた。 ＨＢｃＡｇ遺伝子の残
りは、次に、ｐＫＧｐにおいて、３方向の連絡において
組立てられた。
ンまで）を含むＳａｌ Ｉ −ＥｃｏＲＩ リンカ−が
、ｐｕｃ１８のＳａｌ ＩとＥｃｏＲＩ部位（Ｖｉｅｉ
ｒａとＭｉｓｓｉｎｇ ＋１９８２）の間でつながれ、
プラスもドｐＫＧＦを与えた。 ＨＢｃＡｇ遺伝子の残
りは、次に、ｐＫＧｐにおいて、３方向の連絡において
組立てられた。
ｐＫＧＦの２．７ Ｋ ｂのＩ（ｉｎｄ［［−Ａｖａ
Ｉ断片が単離され、（ｉ）酵母のＧＡＬＴの上流配列と
ＨＢｃＡｇ遺伝子の５”末端を含んでいる８７ｂｐの合
成（リン酸化された） ＨｉｎｄＩ［［−Ｍａｅ ｍ断
片（オリゴＡ。
Ｉ断片が単離され、（ｉ）酵母のＧＡＬＴの上流配列と
ＨＢｃＡｇ遺伝子の５”末端を含んでいる８７ｂｐの合
成（リン酸化された） ＨｉｎｄＩ［［−Ｍａｅ ｍ断
片（オリゴＡ。
第４図（その１））、そして、（ｉｉ）遺伝子の中心部
分の多くを含んでいるｐ ＥＢ ２０８ （ｃ１ａｒｋ
ら、Ｎａｔｕｒｅ１１血、 該１−該４． １９８７
）からの５００ ｂｐ ＭａｅＩ［−Ａｖａ Ｉ断片へ
と連結された。
分の多くを含んでいるｐ ＥＢ ２０８ （ｃ１ａｒｋ
ら、Ｎａｔｕｒｅ１１血、 該１−該４． １９８７
）からの５００ ｂｐ ＭａｅＩ［−Ａｖａ Ｉ断片へ
と連結された。
その結果生じたプラスミド、ｐＫＧＣは、ｐＷＹＧ７か
らのＨＢｃＡｇの発現のための中間体ベクターである。
らのＨＢｃＡｇの発現のための中間体ベクターである。
ｐＫＧＣの台底された領域の配列は、ユニバーサル及び
リバースシーケンシングプライマーでの２重鎮法を用い
て確認された（Ｈｏｎｇ。
リバースシーケンシングプライマーでの２重鎮法を用い
て確認された（Ｈｏｎｇ。
１９Ｂ２）。
ｉｉ ＫＧＣ−６９にの
ｐＫＧＣ中のｌ（ＢｃＡｇ遺伝子は、イニシエターＡＴ
Ｇにおいて、特異なＮｃｏ Ｉ （ｃＣＡＴＧＧ）部位
をもつように改変された。それゆえ、Ｎ末端ペプチド融
合は、この部位にＮｃｏ Ｉ −Ｎｃｏ Ｉ ＤＮＡ
断片を挿入することによって作ることができた。Ｐ。
Ｇにおいて、特異なＮｃｏ Ｉ （ｃＣＡＴＧＧ）部位
をもつように改変された。それゆえ、Ｎ末端ペプチド融
合は、この部位にＮｃｏ Ｉ −Ｎｃｏ Ｉ ＤＮＡ
断片を挿入することによって作ることができた。Ｐ。
６９抗原のエピトープは、プロリンに冨んだ繰返し部分
に存在することが予知されていたので、適当なオリゴヌ
クレオチドの対が、このエピトープをコードするために
台底された。作られたオリゴヌクレオチドと相当するア
ミノ酸配列が、第４図（その２）に与えられている；
Ｂ ｅｒｔｕｓｓｉｓＤＮＡは、酵母の最適コドンを
与えるために改変された。ｐＫＧＣは、Ｎｃｏ Ｉで消
化され、アニーリングされた、リン酸化されていないオ
リゴヌクレオチドは、リンカ−ティリング法（Ｌａｔｂ
ｅら、ＢＲＬ Ｆｏｃｕｓ ｆ）−、１ｓＳｕｅ ４
、 １９８４ ）を用いて、中にクローニングされた。
に存在することが予知されていたので、適当なオリゴヌ
クレオチドの対が、このエピトープをコードするために
台底された。作られたオリゴヌクレオチドと相当するア
ミノ酸配列が、第４図（その２）に与えられている；
Ｂ ｅｒｔｕｓｓｉｓＤＮＡは、酵母の最適コドンを
与えるために改変された。ｐＫＧＣは、Ｎｃｏ Ｉで消
化され、アニーリングされた、リン酸化されていないオ
リゴヌクレオチドは、リンカ−ティリング法（Ｌａｔｂ
ｅら、ＢＲＬ Ｆｏｃｕｓ ｆ）−、１ｓＳｕｅ ４
、 １９８４ ）を用いて、中にクローニングされた。
挿入部をもった、その結果生じたプラスミドから、必要
とされた配置をもったものを、挿入体の２重鎖配列決定
によって選択した。その結果生じたベクターｐＫＧＣ−
６９には、ｐＷＹＧ７への転移のためのＢａｍ ＨＩ
−Ｂａ■旧断片の源として使用することができた。
とされた配置をもったものを、挿入体の２重鎖配列決定
によって選択した。その結果生じたベクターｐＫＧＣ−
６９には、ｐＷＹＧ７への転移のためのＢａｍ ＨＩ
−Ｂａ■旧断片の源として使用することができた。
ＷＹＧ７）（ＢＰの
ｐＫＧＣ−６９ＫからのＢａｇ旧−Ｂａｇ Ｈ１断片が
単離され、Ｂａｇ ＨｒとＢｃｌ Ｉで消化され、コウ
ジの小腸のアルカリ性ホスファターゼで処理されたとこ
ろのｐＷＹＧ７ （鉦ｍ−ＤＮＡ）ヘクローンされた。
単離され、Ｂａｇ ＨｒとＢｃｌ Ｉで消化され、コウ
ジの小腸のアルカリ性ホスファターゼで処理されたとこ
ろのｐＷＹＧ７ （鉦ｍ−ＤＮＡ）ヘクローンされた。
形質転換の後、■ｎｒコロニーは、正しい方向配置の挿
入体につき試験を行い、これらのプラスミドをｐＷＹＧ
７ＨＢＰと呼んだｐＷＹＧ７ＨＢＰを含むＥ、 ｃｏｌ
ｉ ＭＣ１０６１を、１９８９年７月２８日に、受入れ
番号ＮＣＩＭＢ４０１７６の下にＮａｔｉｏ−ｎａｌ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ａｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ （ＮＣＩＭＢ
）に寄託した。
入体につき試験を行い、これらのプラスミドをｐＷＹＧ
７ＨＢＰと呼んだｐＷＹＧ７ＨＢＰを含むＥ、 ｃｏｌ
ｉ ＭＣ１０６１を、１９８９年７月２８日に、受入れ
番号ＮＣＩＭＢ４０１７６の下にＮａｔｉｏ−ｎａｌ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ａｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ （ＮＣＩＭＢ
）に寄託した。
４、 ＷＹＧ７ＨＢＰでの の
ベクターｐＷＹＧ７ＨＢＦを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ ｌ ５０−２８ （ａ
、 お狙」＝、 ｈｉｓ３ 、 ｕｒａ ３ ＋ 江Ｌ
Ｌ、 ＭｃＣｌｅｏｄ ら、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ
、土９． ７７９−７８７゜１９８４）に、Ｉｔｏらの
リチウム形質変換操作（Ｊ、Ｂａｃｔ、土ｎ、１６３−
１６８．１９８３）を使用して導入した。形質変換した
酵母の細胞を、ＹＰＤブロス（ＳｈｅｒｍａＨら＋ Ｍ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ 、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ 。
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ ｌ ５０−２８ （ａ
、 お狙」＝、 ｈｉｓ３ 、 ｕｒａ ３ ＋ 江Ｌ
Ｌ、 ＭｃＣｌｅｏｄ ら、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ
、土９． ７７９−７８７゜１９８４）に、Ｉｔｏらの
リチウム形質変換操作（Ｊ、Ｂａｃｔ、土ｎ、１６３−
１６８．１９８３）を使用して導入した。形質変換した
酵母の細胞を、ＹＰＤブロス（ＳｈｅｒｍａＨら＋ Ｍ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ 、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ 。
１９８３）中、３０°Ｃで一夜インキュベート後、選択
培地上で、ブレーティングアウトを行った（ＹＰＤ＋５
００μｇ／＋／！０４１８）。これにより０４１８−抵
抗性の発現ができるようになり、形質転換頻度を増加す
る。Ｇ４１８’として出現したコロニーは、ロイシンを
欠いている最少必須培地上で、やはりｐＷＹＧ７ＨＢＰ
によっては付与されているＬｅｕ ”表数型についてチ
エツクするためにチ、ｚ７りを行った（Ｙ Ｎ Ｂ ＋
ｇｌｕｃｏｓｅ ＋ｈｆｓｔｉｄｉｎｅ ＋ｕｒａｃｉ
ｌ＋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ 、 Ｓｈｅｒｍａｎら、１
９８３）、正の形質転換体（Ｇ４１８’＋Ｌｅｕ” ）
は、発現分析のために使用された。
培地上で、ブレーティングアウトを行った（ＹＰＤ＋５
００μｇ／＋／！０４１８）。これにより０４１８−抵
抗性の発現ができるようになり、形質転換頻度を増加す
る。Ｇ４１８’として出現したコロニーは、ロイシンを
欠いている最少必須培地上で、やはりｐＷＹＧ７ＨＢＰ
によっては付与されているＬｅｕ ”表数型についてチ
エツクするためにチ、ｚ７りを行った（Ｙ Ｎ Ｂ ＋
ｇｌｕｃｏｓｅ ＋ｈｆｓｔｉｄｉｎｅ ＋ｕｒａｃｉ
ｌ＋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ 、 Ｓｈｅｒｍａｎら、１
９８３）、正の形質転換体（Ｇ４１８’＋Ｌｅｕ” ）
は、発現分析のために使用された。
５ ＨＢＰの のガータ −ス歩
形質転換体は、２％ラフィノースと５００μｇ／１ｍｌ
のＧ４１８を含むＹＰ培養中で３０℃で軌道式シェーカ
ーで、中期一対数増殖期（１０７細胞／ｖａｎ）まで培
養した。４０％ガラクトースの部分量を最終濃度２％ま
で加え、さらに、４８時間インキュベートした。細胞は
、次に低速の遠心分離で収穫し、１回蒸留水で洗い、氷
冷した細胞破壊用バッファー（２０ｍＭナトリウムホス
フェートｐＨ７，０、０，１％トリートンＸｌ００．４
ｍＭフェニル、メタンスルフォニルフロオライド、４ｍ
ＭＥＧＴＡ及びそれぞれ２μｇ／ｍｌのペプスタチン、
アンチパイン、リューベプチンとキモトリプシン；２５
０■ｌの培養液からの細胞に対して５ｍＡ）中に再懸濁
した。酸で洗ったガラス球（０，４５ｍ）を加え、そし
て、細胞は、激しくＶｏｒｔｅｘ上で混和することによ
って破壊した。粗溶菌液を１５分間１０．０００ｇで遠
心分離し、澄明にした。澄明にした上清のタンパク質濃
度を、Ｂｉｏ Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて定量
した（Ｂｉｏ Ｒａｄ。
のＧ４１８を含むＹＰ培養中で３０℃で軌道式シェーカ
ーで、中期一対数増殖期（１０７細胞／ｖａｎ）まで培
養した。４０％ガラクトースの部分量を最終濃度２％ま
で加え、さらに、４８時間インキュベートした。細胞は
、次に低速の遠心分離で収穫し、１回蒸留水で洗い、氷
冷した細胞破壊用バッファー（２０ｍＭナトリウムホス
フェートｐＨ７，０、０，１％トリートンＸｌ００．４
ｍＭフェニル、メタンスルフォニルフロオライド、４ｍ
ＭＥＧＴＡ及びそれぞれ２μｇ／ｍｌのペプスタチン、
アンチパイン、リューベプチンとキモトリプシン；２５
０■ｌの培養液からの細胞に対して５ｍＡ）中に再懸濁
した。酸で洗ったガラス球（０，４５ｍ）を加え、そし
て、細胞は、激しくＶｏｒｔｅｘ上で混和することによ
って破壊した。粗溶菌液を１５分間１０．０００ｇで遠
心分離し、澄明にした。澄明にした上清のタンパク質濃
度を、Ｂｉｏ Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて定量
した（Ｂｉｏ Ｒａｄ。
製造業者の使用説明にしたがって）。そして、材料は、
小部分にわけて一２０℃で保存した。
小部分にわけて一２０℃で保存した。
６、 について″の
誘発された酵母溶菌液中のタンパク質を、５ＯＳ−ポリ
アクリルア藁ドゲル中で分離することによって解析した
（Ｌａｅｍｓｌｉ Ｎａｔｕｒｅ２２７ 、 ６８０−
６８５．１９７０）、各列毎に５０μｇの可溶性タンパ
ク質をのせ、負の対照として、誘発した５１５０−２Ｂ
の抽出物をのせた。ｐＷＹＧ７ＨＢＰ−形質転換細胞抽
出物において、２４．０００ｋ Ｄ ａ （示していな
い）に移動する新しいタンパク質のバンドが、クーマシ
ーブルー染色によって検出された。このポリペプチドが
、ＨＢＰであることは、ＨＢｃＡｇまたはＢＢＯ５抗血
清でウェスターンプロット分析を行うことによって確認
した（第５図、ＨＢｃＡｇ血清での結果） 、 ＥＬＩ
Ｓ＾定量のデータにより、１０−３０％の細胞タンパク
質の発現の水準が示された。
アクリルア藁ドゲル中で分離することによって解析した
（Ｌａｅｍｓｌｉ Ｎａｔｕｒｅ２２７ 、 ６８０−
６８５．１９７０）、各列毎に５０μｇの可溶性タンパ
ク質をのせ、負の対照として、誘発した５１５０−２Ｂ
の抽出物をのせた。ｐＷＹＧ７ＨＢＰ−形質転換細胞抽
出物において、２４．０００ｋ Ｄ ａ （示していな
い）に移動する新しいタンパク質のバンドが、クーマシ
ーブルー染色によって検出された。このポリペプチドが
、ＨＢＰであることは、ＨＢｃＡｇまたはＢＢＯ５抗血
清でウェスターンプロット分析を行うことによって確認
した（第５図、ＨＢｃＡｇ血清での結果） 、 ＥＬＩ
Ｓ＾定量のデータにより、１０−３０％の細胞タンパク
質の発現の水準が示された。
酵母中てま作られたＨＢＰタンパク質がコアー粒子とし
て存在するかどうかを試験するため、誘発した細胞抽出
物を、１５％−４５％のｗ／ｖ蔗糖密度勾配（リン酸バ
ッファーを加えた食塩水中）の上に重ね、ベックマン５
Ｗ２８０−ター中で遠心分Ｎ （２８，０００ｒｐ園、
４時間）した。グレーデイエンドを分画し、各分画から
のその小部分を、ニトロセルローズ格子上にスポットし
、フィルターをウェスターンプロット操作にかけること
によって、各画分を、ＨＢｃＡｇ−または−比−１４１
展１０一エヒトープ反応性物質の存在について分析した
（ドツトプロットは第６図に示しである）。
て存在するかどうかを試験するため、誘発した細胞抽出
物を、１５％−４５％のｗ／ｖ蔗糖密度勾配（リン酸バ
ッファーを加えた食塩水中）の上に重ね、ベックマン５
Ｗ２８０−ター中で遠心分Ｎ （２８，０００ｒｐ園、
４時間）した。グレーデイエンドを分画し、各分画から
のその小部分を、ニトロセルローズ格子上にスポットし
、フィルターをウェスターンプロット操作にかけること
によって、各画分を、ＨＢｃＡｇ−または−比−１４１
展１０一エヒトープ反応性物質の存在について分析した
（ドツトプロットは第６図に示しである）。
最大の反応性は、勾配の中央の分画に検出され、勾配の
頂点には、なんら検出されなかった。このことは、酵母
中で造られたＨＢＰタンパク質のすべては、会合して、
蔗糖勾配中で沈澱するところのコアー粒子を形成してい
ることを示している。
頂点には、なんら検出されなかった。このことは、酵母
中で造られたＨＢＰタンパク質のすべては、会合して、
蔗糖勾配中で沈澱するところのコアー粒子を形成してい
ることを示している。
確認のため、ピークの勾配分画からの一部分が電子顕微
鏡（ホスホタングステン酸染色）検査のため送付された
。多数のウィルスコアー粒子が明らかに見られた（示さ
れていない）。
鏡（ホスホタングステン酸染色）検査のため送付された
。多数のウィルスコアー粒子が明らかに見られた（示さ
れていない）。
３： ゛ −プロ バイブ
例１（２■／ｓｊりにおいて調製された３つのペプチド
の水溶液と例２において調製されたＨＢＰの融合タンパ
ク質を、ドツトプロット抗体ハイブリッド形成実験に使
用した。手短かに記すと、１０μｌのペプチドまたは融
合タンパク質を、ニトロセルローズ膜に適用し、乾燥さ
せた。モノクローナル抗体でのフィルターハイブリッド
形成実験は、正常の方法によって行われた（例えば、“
＾ｎｔｉｂｏ−ｄｉ６３ 、 Ｂ １ａｂＯｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ″ｐ、 １７ Ｂ 、 Ｅｄ、Ｅ。
の水溶液と例２において調製されたＨＢＰの融合タンパ
ク質を、ドツトプロット抗体ハイブリッド形成実験に使
用した。手短かに記すと、１０μｌのペプチドまたは融
合タンパク質を、ニトロセルローズ膜に適用し、乾燥さ
せた。モノクローナル抗体でのフィルターハイブリッド
形成実験は、正常の方法によって行われた（例えば、“
＾ｎｔｉｂｏ−ｄｉ６３ 、 Ｂ １ａｂＯｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ″ｐ、 １７ Ｂ 、 Ｅｄ、Ｅ。
Ｍａｒｌｏ−とり、Ｌａｎｅ編、 １９８８ 、 Ｃ
ｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙを参照）。
ｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙを参照）。
モノクローナル抗体は：
且、−廿ｙ溢駄社叫１鏡からの６８ｋＤａタンパク質に
対して作られたが、Ｂ０辺■山４１Ｄ工からのＰ。
対して作られたが、Ｂ０辺■山４１Ｄ工からのＰ。
６９と交差反応するＢＢＯ５及びＢＢＯ７，そして、旦
、４■ｔｕｓｓｉｓ−に対して作られた一連の７種のモ
ノクローナル抗体であった。
、４■ｔｕｓｓｉｓ−に対して作られた一連の７種のモ
ノクローナル抗体であった。
その結果は、表１と第７図に示されている。第７図は、
ペプチドがその周辺から作られたＰ、６９の領域を示し
ている。３種の化学的に台底されたペプチドは、追加の
非天然カルボキシル末端システィン残基をもっている。
ペプチドがその周辺から作られたＰ、６９の領域を示し
ている。３種の化学的に台底されたペプチドは、追加の
非天然カルボキシル末端システィン残基をもっている。
ＨＢＰ融合タンパク賞は、Ｎ−末端メチオニン残基をも
っている。その結果から、問題としているエピトープは
、以下の配列をもった領域にすることが確立された。
っている。その結果から、問題としているエピトープは
、以下の配列をもった領域にすることが確立された。
ＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥＡＰＡＰＱＰ表１
゜ ペプチド モノクローナル 融合抗体 旦
旦１旦旦杢旦旦旦 タンパク質Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ＢＢＯ５＋ −−＋敗並仙鎚亜且勉
ＢＢＯ７＋ ＢＰＥ３ − − ＋ＰＩ１８ ＰＥ８ Ｂｏｒｄｅｔｅｌ ｌａ Ｄ５Ｅ９凶ｄ益鮭ｓ
Ｆ６Ｅ５ Ｅ４Ａ８ ＋ Ｅ４Ｄ７ 十 ４：にｅｎｄｒｉｃｋの 例１のペプチドは、Ｎ−マレイξドベンゾイルーＮ−ハ
イドロキシスルホサクシニ旦ドエステル（ＭＢＳ）を、
ヘテロ２官能性架橋−リンカ−（Ｌｉｕ ＋ Ｆ、ら＋
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ上８． ６９０．１９７９
）として使用して、付加されたＣ−末端システィン残基
を通じて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
）に結合させた。手短かに述べると、透析したＫＬＨを
、室温でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＭ
ＢＳと反応させ、次にＧ−２５カラムを通す、ＫＬＨの
タンパク質ピークをプールし、遊離ペプチドに加えた。
゜ ペプチド モノクローナル 融合抗体 旦
旦１旦旦杢旦旦旦 タンパク質Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ＢＢＯ５＋ −−＋敗並仙鎚亜且勉
ＢＢＯ７＋ ＢＰＥ３ − − ＋ＰＩ１８ ＰＥ８ Ｂｏｒｄｅｔｅｌ ｌａ Ｄ５Ｅ９凶ｄ益鮭ｓ
Ｆ６Ｅ５ Ｅ４Ａ８ ＋ Ｅ４Ｄ７ 十 ４：にｅｎｄｒｉｃｋの 例１のペプチドは、Ｎ−マレイξドベンゾイルーＮ−ハ
イドロキシスルホサクシニ旦ドエステル（ＭＢＳ）を、
ヘテロ２官能性架橋−リンカ−（Ｌｉｕ ＋ Ｆ、ら＋
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ上８． ６９０．１９７９
）として使用して、付加されたＣ−末端システィン残基
を通じて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
）に結合させた。手短かに述べると、透析したＫＬＨを
、室温でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＭ
ＢＳと反応させ、次にＧ−２５カラムを通す、ＫＬＨの
タンパク質ピークをプールし、遊離ペプチドに加えた。
ｐＨは、次に７と７．５の間に調節し、室温で３時間
攪拌した後結合したペプチドを一２０℃で貯蔵した。Ｋ
ＬＨ濃度は、２０ｇ／ｍｊ！を越えてはならず、ＭＢＳ
／ＫＬＨのモル比は４０：１であり、そして、反応にお
いては、ＤＭＦの最終濃度は３０％以下であるべきであ
る。ペプチド６８３．６８４及び６８５は、５■ペプチ
ドあたり、２．５■のＫＬＨ（１：２重量／重量の比）
を使用して結合された。
攪拌した後結合したペプチドを一２０℃で貯蔵した。Ｋ
ＬＨ濃度は、２０ｇ／ｍｊ！を越えてはならず、ＭＢＳ
／ＫＬＨのモル比は４０：１であり、そして、反応にお
いては、ＤＭＦの最終濃度は３０％以下であるべきであ
る。ペプチド６８３．６８４及び６８５は、５■ペプチ
ドあたり、２．５■のＫＬＨ（１：２重量／重量の比）
を使用して結合された。
２、 −メン ＦＨＡＦＨＡは、こ
の分野の技術においてよく知られている方法によって調
製できる（＾ｒａｃｈとＭｕｎｏｚＪ、Ｊ、 （１９７
０） 、 Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ２５
７６４ ７６７ ； Ａｓｈｗｏｒｔｈら（１９８２）
Ｉｎｆｅｃｔ。
の分野の技術においてよく知られている方法によって調
製できる（＾ｒａｃｈとＭｕｎｏｚＪ、Ｊ、 （１９７
０） 、 Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ２５
７６４ ７６７ ； Ａｓｈｗｏｒｔｈら（１９８２）
Ｉｎｆｅｃｔ。
Ｉｍｍｕｎ、 ３工 １２７８−１２８１参照）。ただ
し、以下の操作手順においては、ＦＨＡは以下のプロト
コルに従って調製された。
し、以下の操作手順においては、ＦＨＡは以下のプロト
コルに従って調製された。
ヱ旦人生園盟：旦−肚旦旦虹ｓ Ｔｏｍａｈａ ＋また
はＢＰ３５７ （ＬＰＦを分泌しないＡ、Ａ、Ｗｅｉｓ
ｓら（１９８３）のＴｈ５１−ランスボゾン変異株〕は
、６５０ｍｆのＣｏｓ ｔａｒフラスコ中で、５ｔａｉ
ｎｅｒと５ｃｈｏｔｅの培地中で（各１５０＋＋／！を
入れる）、３７℃、５日間培養した（Ｓａｔｏら、 Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎとｌｍ５ｕ−ｎｉｔｙ土工、３１３−
３２０．１９８３）、遠心分離（３０分、６０００Ｘｇ
）の前に、タンパク加水分解阻害剤として、５０μＭの
１．１０−フェナンスロリン１加水物を培養物に加えた
。無細胞上清は、３０Ｘ１５０ｍのハイドロキシアパタ
イト（ＢＯ２）カラムに加え、順次ｐＨ８の１０ｍＭホ
スフェートバッファー、ｐＨ７，１の１００ｍＭホスフ
ェートバッファーで、基線が安定するまで洗滌した（す
べて室温、そして５００ａ＋ｆ／時間のポンプによる送
液速度を用いた）。
はＢＰ３５７ （ＬＰＦを分泌しないＡ、Ａ、Ｗｅｉｓ
ｓら（１９８３）のＴｈ５１−ランスボゾン変異株〕は
、６５０ｍｆのＣｏｓ ｔａｒフラスコ中で、５ｔａｉ
ｎｅｒと５ｃｈｏｔｅの培地中で（各１５０＋＋／！を
入れる）、３７℃、５日間培養した（Ｓａｔｏら、 Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎとｌｍ５ｕ−ｎｉｔｙ土工、３１３−
３２０．１９８３）、遠心分離（３０分、６０００Ｘｇ
）の前に、タンパク加水分解阻害剤として、５０μＭの
１．１０−フェナンスロリン１加水物を培養物に加えた
。無細胞上清は、３０Ｘ１５０ｍのハイドロキシアパタ
イト（ＢＯ２）カラムに加え、順次ｐＨ８の１０ｍＭホ
スフェートバッファー、ｐＨ７，１の１００ｍＭホスフ
ェートバッファーで、基線が安定するまで洗滌した（す
べて室温、そして５００ａ＋ｆ／時間のポンプによる送
液速度を用いた）。
保持された物質は、１００ｍＭホスフェートバッファー
に加えた０、５ＭＮａＣＪｌ！で溶出し、アヒルの赤血
球細胞を凝集させるピーク分画をプールした。プールし
た分画を、４°Ｃで２５−３０倍容量（７）０．０２５
Ｍビス−トリス／塩酸バッファーに対して一夜透析した
。沈澱したＦＨＡは、遠心分離して集めた（２０分、８
０００Ｘｇ）、次ノ段階は、ＦＨＡ （ＬＰＦと同様に
）が、４０ｍＭβ−アラニンバッファー、ｐ）［３，５
に溶解することを見出したＣｏｗｅ １１ら（■巻の中
、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ＋３７１−３７
９ 、 Ｓｅ＋ｗｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎｓ Ｄｉｓｅ−ａｓｅ 、 Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ と
Ｆｉｅｌｄｓ＠ ： Ｔｈ１ｅｓ＋ｅ Ｖｅｒｌａｇ
。
に加えた０、５ＭＮａＣＪｌ！で溶出し、アヒルの赤血
球細胞を凝集させるピーク分画をプールした。プールし
た分画を、４°Ｃで２５−３０倍容量（７）０．０２５
Ｍビス−トリス／塩酸バッファーに対して一夜透析した
。沈澱したＦＨＡは、遠心分離して集めた（２０分、８
０００Ｘｇ）、次ノ段階は、ＦＨＡ （ＬＰＦと同様に
）が、４０ｍＭβ−アラニンバッファー、ｐ）［３，５
に溶解することを見出したＣｏｗｅ １１ら（■巻の中
、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ＋３７１−３７
９ 、 Ｓｅ＋ｗｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎｓ Ｄｉｓｅ−ａｓｅ 、 Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ と
Ｆｉｅｌｄｓ＠ ： Ｔｈ１ｅｓ＋ｅ Ｖｅｒｌａｇ
。
Ｎｅ５ｖ Ｙｏｒｋ 、 Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ ＋ １
９８２ ）によって示唆を受けたものであった。沈澱し
たＦＨＡは、可能な最小容量の３−アラニンバッファー
（１１，中３．５７ｇ３−アラニンと０．３５ ｇの蟻
酸）に溶解し、不溶物を遠心分離によって除去し、そし
て透明な上滑を、同じバッファーで平衡に達したＵｌｔ
ｒｏｇｅｌ ＡＣＡ３４のカラム（２５Ｘ５０ｍ）に適
用し、同じバッファーで溶出した。
９８２ ）によって示唆を受けたものであった。沈澱し
たＦＨＡは、可能な最小容量の３−アラニンバッファー
（１１，中３．５７ｇ３−アラニンと０．３５ ｇの蟻
酸）に溶解し、不溶物を遠心分離によって除去し、そし
て透明な上滑を、同じバッファーで平衡に達したＵｌｔ
ｒｏｇｅｌ ＡＣＡ３４のカラム（２５Ｘ５０ｍ）に適
用し、同じバッファーで溶出した。
赤血球凝集物質は、鋭いピークとなって現れ、続いて肩
が現れた。肩の物質は捨て、鋭いピークからの分画をプ
ールし、凍結保存し、０．０２５ Ｍビス−トリスバッ
ファーに対して透析を行うことによって再沈澱させ、さ
らに小容量の３−アラニンバッファーに溶解した。溶解
度は、約２．５■Ｆｌ（Ａ／ｓ／！である。酸性ｐＨで
凍結（−２０℃または一４０℃）した物質は、そのＥＬ
ｒＳ＾反応性と５ＤＳ−［ＩＡＧＥゲルにおける外観か
ら判断して、安定と思われた。それは１５０−１００Ｋ
Ｄに優勢に、３つの強いバインドを形成した。
が現れた。肩の物質は捨て、鋭いピークからの分画をプ
ールし、凍結保存し、０．０２５ Ｍビス−トリスバッ
ファーに対して透析を行うことによって再沈澱させ、さ
らに小容量の３−アラニンバッファーに溶解した。溶解
度は、約２．５■Ｆｌ（Ａ／ｓ／！である。酸性ｐＨで
凍結（−２０℃または一４０℃）した物質は、そのＥＬ
ｒＳ＾反応性と５ＤＳ−［ＩＡＧＥゲルにおける外観か
ら判断して、安定と思われた。それは１５０−１００Ｋ
Ｄに優勢に、３つの強いバインドを形成した。
３、■Ｕム吐立跋簾
これは・ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンについての−、Ｈ
，Ｏ。
，Ｏ。
の必要事項にしたがって、体重１４−１６ｇのＭｌｌま
たは旧ＣＩ！、（ＯＬＡＣ，カテゴリー３゜Ｂ ｂｒ
ｏｎｃｈｉｓｅ ｔｉｃａをはじめとする大抵の病原菌
が含まれていない）を使用して遂行された。０．５１Ｉ
ｌの容量における抗原は、同時に腹腔内に接種され、最
高濃度の希釈液と３回の連続４倍希釈液から成っていた
。２週間後に、マウスは推奨された誘発株、１８ ３２
３ （１００２００ＬＤｓ。）を用いて脳内で誘発を行
った。各群における生存者の数を、平行線プロビット解
析のプログラムを使用して、Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｖａｃｃｉｎｅ６６
／８４に対する相対的力価の計算に用いた。
たは旧ＣＩ！、（ＯＬＡＣ，カテゴリー３゜Ｂ ｂｒ
ｏｎｃｈｉｓｅ ｔｉｃａをはじめとする大抵の病原菌
が含まれていない）を使用して遂行された。０．５１Ｉ
ｌの容量における抗原は、同時に腹腔内に接種され、最
高濃度の希釈液と３回の連続４倍希釈液から成っていた
。２週間後に、マウスは推奨された誘発株、１８ ３２
３ （１００２００ＬＤｓ。）を用いて脳内で誘発を行
った。各群における生存者の数を、平行線プロビット解
析のプログラムを使用して、Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｖａｃｃｉｎｅ６６
／８４に対する相対的力価の計算に用いた。
その結果は表２に示されている。
表−２
ペプチド
（μｇ）
８３
８４
８５
１０ １０ １０
３．３ ３．３ ３．３
１．１１ １．１１ １，１１
０．３７ ０．３７ ０．３７
融合タンパク質（μｇ） ＋ＦＨＡ（μｇ）１
２０ ０．３３ ６．６ ０．１１ ２．２ ０．０３７ ０．７４ 単独（μｇ） ０ ６６ ２．２ ０．７４ １、Ｕ。
２０ ０．３３ ６．６ ０．１１ ２．２ ０．０３７ ０．７４ 単独（μｇ） ０ ６６ ２．２ ０．７４ １、Ｕ。
０．２５
０．０８
０．０２Ｂ
０．００９
＋ＦＨＡ（μ紛 生存マウス
６／１６
３／１６
７／１６
５／１６
８／１６
１１／１６
４／１６
１／１６
３／１６
２／１６
３／１６
１／１６
生存マウス
１１／１６
２／１６
２／１６
３／１６
この結果から、ＦＨＡと化学的に台底された３つのペプ
チドすべてか、またはＨＢＰの融合タンパク質との併用
は、ＦＨＡ単独よりももっと強力であることが明らかに
示されている。
チドすべてか、またはＨＢＰの融合タンパク質との併用
は、ＦＨＡ単独よりももっと強力であることが明らかに
示されている。
１つのアミノ酸残基が重なっているにのアごノ酸からな
るペプチドが、Ｇｅｙｓｅｎら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ８１
゜１９８４．３９９８〜４００２）によって記述された
固相のポリエチレンビン上で台底された。Ｂ−色毬±υ
エレエのＰ、６９抗原の５０５から６０３番目のアミノ
酸残基をカバーする９４種のにのアミノ酸からなるペプ
チドを台底した。ペプスキャンペブチドｌは、Ｔｈｒ（
５０５）−Ａｓｐ（５１０）であった、ペプスキャンペ
ブチド９４は、Ａｌａ（５９Ｂ） −Ｌｅｕ（６０３）
であった。
るペプチドが、Ｇｅｙｓｅｎら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ８１
゜１９８４．３９９８〜４００２）によって記述された
固相のポリエチレンビン上で台底された。Ｂ−色毬±υ
エレエのＰ、６９抗原の５０５から６０３番目のアミノ
酸残基をカバーする９４種のにのアミノ酸からなるペプ
チドを台底した。ペプスキャンペブチドｌは、Ｔｈｒ（
５０５）−Ａｓｐ（５１０）であった、ペプスキャンペ
ブチド９４は、Ａｌａ（５９Ｂ） −Ｌｅｕ（６０３）
であった。
ペプチドのモノクローナル抗体に対する反応性は、ピン
を１−２時間、または−夜抗体中でインキュベートした
後、洗滌し、ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗体
中でインキュベートすることによって定量した。（ｍＡ
ｂ） ＢＢＯ５は、Ｂ ｂｒｏｎｃｈｎ聾且並からの
Ｐ、６８抗原に対して作られた（ＩｇＧＩ）である（Ｍ
ｏｎ ｔａｒｅｚら、Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｗｕｎ。
を１−２時間、または−夜抗体中でインキュベートした
後、洗滌し、ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗体
中でインキュベートすることによって定量した。（ｍＡ
ｂ） ＢＢＯ５は、Ｂ ｂｒｏｎｃｈｎ聾且並からの
Ｐ、６８抗原に対して作られた（ＩｇＧＩ）である（Ｍ
ｏｎ ｔａｒｅｚら、Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｗｕｎ。
ｉｔ、１９８５．６４４−７５１）。この−Ａｂは、旦
、１シｔｕｓｓ匈−からのＰ６６９と交差する中和ｓＡ
ｂである。
、１シｔｕｓｓ匈−からのＰ６６９と交差する中和ｓＡ
ｂである。
酵素活性は、ＡＢＴＳ基質溶液中（１００＊ｆのバッフ
ァ （０，１Ｍ ＮａＪＰＯ４，０，０８Ｍクエン酸
、ｐＨ４，３０μｉ過酸化水素を含む）中の５０■のア
ジノージ−３−エチル−ベンツチアゾジスルホネート（
ＡＢＴＳ））でビンをインキュベートし、１０−６０分
後、溶液の＾。。をＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉｓｃａ
ｎ ＭＣ１１００を用いて測定することにより定量した
。ピンは、０． Ｉ Ｍ ＮａｔＨＰＯ＜ 、 ０．１
％ＳＤＳ。
ァ （０，１Ｍ ＮａＪＰＯ４，０，０８Ｍクエン酸
、ｐＨ４，３０μｉ過酸化水素を含む）中の５０■のア
ジノージ−３−エチル−ベンツチアゾジスルホネート（
ＡＢＴＳ））でビンをインキュベートし、１０−６０分
後、溶液の＾。。をＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉｓｃａ
ｎ ＭＣ１１００を用いて測定することにより定量した
。ピンは、０． Ｉ Ｍ ＮａｔＨＰＯ＜ 、 ０．１
％ＳＤＳ。
０、ＯＩＭβ−メルカプトエタノール中６５℃で超音波
処理し、その後の抗体中のインキュベーションの前に結
合した抗体と染色複合体を除去した。
処理し、その後の抗体中のインキュベーションの前に結
合した抗体と染色複合体を除去した。
結果は第８図に示されている。
第８図からみることができるように、ｍＡｂ ＢＢＯ５
は、ベプスキャンペプチド４３（配列ＰＧＰＱＰＰ）の
４゜ みを認識した。これは、ペプチド６８３の認識と一致し
、ており、ＢＢＯ５エピトープを、Ｐ、６９の（Ｐｒｏ
−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ）ｓの繰返しの領域中に、その位置を
突きとめた。
は、ベプスキャンペプチド４３（配列ＰＧＰＱＰＰ）の
４゜ みを認識した。これは、ペプチド６８３の認識と一致し
、ており、ＢＢＯ５エピトープを、Ｐ、６９の（Ｐｒｏ
−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ）ｓの繰返しの領域中に、その位置を
突きとめた。
第１図は、ベクターｐＷＹＧ７の構築を示す。
第２図は、ＧＡＬ７プロモーター領域のヌクレオチド配
列を示す。 第３図（その１．２及び３）はｐＷＸＧ７ＨＢＰ １７
）構築を示す。 第４図（その１）は、ＧＡＬ７の翻訳されないリーダー
配列とＨＢｃＡｇ遺伝子の５′領域を含む合成オリゴＡ
のヌクレオチド配列を示し、第４図（その２）は、合成
オリゴＢのヌクレオチド配列を示す。 第５図は、ウェスターンプロット分析の結果を示す写真
である。 第６図は、ドツトプロット分析の結果を示す写真である
。 第７図は、Ｐ、６９領域を示す。 第８図は、モノクローナル抗体によるペプチドの分析結
果を示す。
列を示す。 第３図（その１．２及び３）はｐＷＸＧ７ＨＢＰ １７
）構築を示す。 第４図（その１）は、ＧＡＬ７の翻訳されないリーダー
配列とＨＢｃＡｇ遺伝子の５′領域を含む合成オリゴＡ
のヌクレオチド配列を示し、第４図（その２）は、合成
オリゴＢのヌクレオチド配列を示す。 第５図は、ウェスターンプロット分析の結果を示す写真
である。 第６図は、ドツトプロット分析の結果を示す写真である
。 第７図は、Ｐ、６９領域を示す。 第８図は、モノクローナル抗体によるペプチドの分析結
果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）以下からなるエピトープを提供するポリペプチド
： （ａ）￥Ｂ￥．￥ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥ＣＮ２９９２の
Ｐ．６９遺伝子のヌクレオチド１８８５から１９０２に
よってコードされているアミノ酸配列； （ｂ）￥Ｂ￥．￥ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥の別の菌株、ま
たは、￥Ｂ￥．￥ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥、また
は￥Ｂ￥．￥ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ￥の菌株の
相当するアミノ酸配列；または （ｃ）該配列（ａ）または（ｂ）の抗原性と実質的に同
じ抗原性をもつように改変された（ａ）または（ｂ）の
該配列（但し、該ポリペプチドは、５０このアミノ酸残
基より長くないか、または担体タンパク質と該エピトー
プ配列を含む５０こ未満のアミノ酸残基の外来配列とか
らなるアミノ酸配列をもつキメラ状タンパク質である）
。 ただし、該エピトープは、以下から成っている：（ａ＿
１）￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥のＣＮ２９９２Ｐ．６
９遺伝子ヌクレオチド１８７６から１９４４によってコ
ードされているアミノ酸配列； （ｂ＿１）￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥の別の菌株、ま
たは、￥Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥または、￥
Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ￥の菌株の相当する
アミノ酸配列；または （ｃ＿１）該配列（ａ＿１）また（ｂ＿１）の抗原性と
実質的に同じ抗原性をもつように改変された（ａ＿１）
または（ｂ＿１）の該配列。 （３）５０こ未満のアミノ酸で構成され、Ｎ−末端、そ
して／またはＣ−末端にシステイン残基が備っている特
許請求の範囲第１項または第２項によるポリペプチド。 （４）３０こまでのアミノ酸残基から構成されている特
許請求の範囲の第１項から第４項までのいずれか１つに
よるポリペプチド。 （５）そのアミノ末端に、該外来配列が連結されている
Ｂ型肝炎コアー抗原から成る融合タンパク質である特許
請求の範囲第１項または第２項によるポリペプチド。 （６）アミノ酸配列 ＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰＡ
ＧＲＥＬＳＣまたはＰＧＰＱＰＰ；またはＢ型肝炎コア
ー抗原のアミノ末端に融合したアミノ酸配列 ＭＡＰＰＡＰＫＰＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥ
ＡＰＡＰＱＰをもっている特許請求の範囲第１項による
ポリペプチド。 （７）その製造法が、該ポリペプチド中にアミノ酸が存
在する順番に、単一アミノ酸そして／または２こ以上の
アミノ酸からなるでき上ったペプチドを縮合させること
からなる特許請求の範囲第１項に記載されたポリペプチ
ドの製造法。 （８）その製造法が、 （ｉ）該ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を組
込み、適切な宿主中に提供されるとき、該ポリペプチド
を発現することができる発現ベクターを調製すること；
そして、 （ｉｉ）該ポリペプチドの発現が起ることを可能ならし
めるような該宿主中に該ベクターを供給することからな
る特許請求の範囲第１項において記載されたポリペプチ
ドの製造法。 （９）生理学的に容認できる担体に連結された特許請求
の範囲第１項において記載されたポリペプチドからなる
結合体。 （１０）医薬として容認できる担体または希釈剤、特許
請求の範囲第１項において記載されたポリペプチド、そ
して、任意的に添加してもよいフィラメント状赤血球凝
集素からなるワクチン。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8919940.0 | 1989-09-04 | ||
| GB898919940A GB8919940D0 (en) | 1989-09-04 | 1989-09-04 | Vaccines |
| GB909011358A GB9011358D0 (en) | 1990-05-21 | 1990-05-21 | Vaccines |
| GB9011358.0 | 1990-05-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03236399A true JPH03236399A (ja) | 1991-10-22 |
| JP3060504B2 JP3060504B2 (ja) | 2000-07-10 |
Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2234331A Expired - Lifetime JP3060504B2 (ja) | 1989-09-04 | 1990-09-04 | ワクチン |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5976544A (ja) |
| EP (1) | EP0425082B1 (ja) |
| JP (1) | JP3060504B2 (ja) |
| AT (1) | ATE121754T1 (ja) |
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| EP0565794A1 (en) * | 1992-04-14 | 1993-10-20 | British Biotech Pharmaceuticals Limited | Induction of CTL responses |
| WO1995009649A1 (en) | 1993-10-05 | 1995-04-13 | Medeva Holdings B.V. | Vaccine compositions |
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| NZ512456A (en) | 1998-11-30 | 2003-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Ordered molecular presentation of antigens |
| CA2407897A1 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays and vaccines |
| US7537772B1 (en) | 2000-10-02 | 2009-05-26 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Chlamydia protein, gene sequence and the uses thereof |
| US7731980B2 (en) * | 2000-10-02 | 2010-06-08 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Chlamydia PMP proteins, gene sequences and uses thereof |
| US7264810B2 (en) | 2001-01-19 | 2007-09-04 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| US7094409B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
| US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
| EP2351770A1 (en) | 2002-07-17 | 2011-08-03 | Cytos Biotechnology AG | Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the ap205 coat protein |
| NZ537003A (en) | 2002-07-18 | 2008-03-28 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof |
| SI1524994T1 (sl) | 2002-07-19 | 2011-08-31 | Cytos Biotechnology Ag | Sestavki cepiv, ki vsebujejo amiloidne beta 1-6 antigenske mreĹľe |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8412207D0 (en) * | 1984-05-12 | 1984-06-20 | Wellcome Found | Antigenic preparations |
| EP0338170A1 (en) * | 1988-04-19 | 1989-10-25 | Institut Pasteur | Immunoprotective antigenic protein against pathogenic bacteria |
| US5000952A (en) * | 1988-08-02 | 1991-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Jr. University | Polypeptide pertussis toxin vaccine |
-
1990
- 1990-09-03 EP EP90309614A patent/EP0425082B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-03 DE DE69018926T patent/DE69018926T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-03 DK DK90309614.7T patent/DK0425082T3/da active
- 1990-09-03 AT AT90309614T patent/ATE121754T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-04 JP JP2234331A patent/JP3060504B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/474,386 patent/US5976544A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3060504B2 (ja) | 2000-07-10 |
| DE69018926D1 (de) | 1995-06-01 |
| US5976544A (en) | 1999-11-02 |
| ATE121754T1 (de) | 1995-05-15 |
| DE69018926T2 (de) | 1995-08-24 |
| EP0425082A1 (en) | 1991-05-02 |
| DK0425082T3 (da) | 1995-07-03 |
| EP0425082B1 (en) | 1995-04-26 |
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