JPH03244391A - 組換え蛋白質の生産方法 - Google Patents
組換え蛋白質の生産方法Info
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- JPH03244391A JPH03244391A JP2041666A JP4166690A JPH03244391A JP H03244391 A JPH03244391 A JP H03244391A JP 2041666 A JP2041666 A JP 2041666A JP 4166690 A JP4166690 A JP 4166690A JP H03244391 A JPH03244391 A JP H03244391A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、組換えＤＮＡ技術より形質転換された大腸菌
を用いて、効率よく有用蛋白質を生産する方法に関する
。
を用いて、効率よく有用蛋白質を生産する方法に関する
。
〔従来の技術］
組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌により真核生物由来の
有用蛋白質、例えば、各種インターフェロン、インター
ロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン、ヒト血
清アルブ逅ン等を直接発現法により大量に生産させたい
場合、それらの発現プラスくド自体の改良の他、生産菌
の培養方法の改良による高生産法が考えられる。特に、
目的としている有用蛋白質を医薬品として使用する時な
どは、大腸菌での遺伝子翻訳開始コドンに対応するアミ
ノ末端メチオニン残基の付加した有用蛋白質は抗原性の
もたらす可能性もあり、この観点からメチオニン残基は
可能な限り除去しておく必要があること、さらに蛋白質
の分離精製段階でのコストダウンを図るためにも、生産
菌培養段階で、大量かつアミノ末端メチオニン低含有の
目的蛋白質を生産でき得る技術を確立しておく必要があ
ると考えられる。
有用蛋白質、例えば、各種インターフェロン、インター
ロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン、ヒト血
清アルブ逅ン等を直接発現法により大量に生産させたい
場合、それらの発現プラスくド自体の改良の他、生産菌
の培養方法の改良による高生産法が考えられる。特に、
目的としている有用蛋白質を医薬品として使用する時な
どは、大腸菌での遺伝子翻訳開始コドンに対応するアミ
ノ末端メチオニン残基の付加した有用蛋白質は抗原性の
もたらす可能性もあり、この観点からメチオニン残基は
可能な限り除去しておく必要があること、さらに蛋白質
の分離精製段階でのコストダウンを図るためにも、生産
菌培養段階で、大量かつアミノ末端メチオニン低含有の
目的蛋白質を生産でき得る技術を確立しておく必要があ
ると考えられる。
一般に、組換え大腸菌の培養方法については従来、ＬＢ
（酵母エキス０．５％、バタトトリプトン１．０％、
ＮａＣ１０，５％、グルコース０．２％、 ｐＨ６、
５〜７．５ ”）培地やＭ９（０，６％ＮａＪＰＯｎ
、 ０．３％ＫＨｚＰＯａ、 ０．０５％ＮａＣｊ！、
０．１％ＮＨ，Ｃｆ、 ０．２％グルコース、 ０．
００１４７％ＣａＣ１ｚ ・２ Ｈｚｏ、 ０．０５
％Ｍｇ５Ｏ，・７ Ｈ，Ｏ）培地、さらにそれにカザミ
ノ酸、酵母エキス等を加えた半合成培地による培養が一
般に知られている。
（酵母エキス０．５％、バタトトリプトン１．０％、
ＮａＣ１０，５％、グルコース０．２％、 ｐＨ６、
５〜７．５ ”）培地やＭ９（０，６％ＮａＪＰＯｎ
、 ０．３％ＫＨｚＰＯａ、 ０．０５％ＮａＣｊ！、
０．１％ＮＨ，Ｃｆ、 ０．２％グルコース、 ０．
００１４７％ＣａＣ１ｚ ・２ Ｈｚｏ、 ０．０５
％Ｍｇ５Ｏ，・７ Ｈ，Ｏ）培地、さらにそれにカザミ
ノ酸、酵母エキス等を加えた半合成培地による培養が一
般に知られている。
しかしながら、これらの方法では取得目的の有用蛋白質
の生産性、及び生産蛋白質のアミノ末端メチオニン残基
除去の点で、まだ十分ではなく、さらなる培養条件の改
善が望まれていた。
の生産性、及び生産蛋白質のアミノ末端メチオニン残基
除去の点で、まだ十分ではなく、さらなる培養条件の改
善が望まれていた。
本発明は、大腸菌を用いて有用蛋白質を生産するに際し
、培養方法による生産物の生産量向上と同時にアミノ末
端メチオニン残基の除去効率の向上化を目的とするもの
である。
、培養方法による生産物の生産量向上と同時にアミノ末
端メチオニン残基の除去効率の向上化を目的とするもの
である。
上記の目的は、以下の本発明により達成される。
すなわち、本発明は有用蛋白質を発現生産するように組
換えＤＮＡ技術により工夫された発現プラスミドにより
形質転換された大腸菌を培養して、有用目的蛋白質を生
産するに際し、主要栄養源として、大豆加水分解物を添
加した培地で培養することを特徴とする有用蛋白質の生
産方法である。
換えＤＮＡ技術により工夫された発現プラスミドにより
形質転換された大腸菌を培養して、有用目的蛋白質を生
産するに際し、主要栄養源として、大豆加水分解物を添
加した培地で培養することを特徴とする有用蛋白質の生
産方法である。
本発明の有用蛋白質とは組換えＤＮＡ技術により生産で
きるものであれば、特に限定はなく、例えば、インター
ロイキン−２，ヒトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦと略する
）、またα−９β−１Ｔ−インターフェロン等のリンホ
カイン類、族長ホルモン。
きるものであれば、特に限定はなく、例えば、インター
ロイキン−２，ヒトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦと略する
）、またα−９β−１Ｔ−インターフェロン等のリンホ
カイン類、族長ホルモン。
インシュリン、ソマトスタチン等のホルモン、ヒト血清
アルブミン等の血液関連蛋白質などが挙げられる。尚、
ヒトＢＣ叶はヒトインターロイキン６（ＩＬ−６）とも
Ｂ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２）とも呼ばれるが、ここで
は従来より用いられているヒトＢＣ叶という名称を用い
る。
アルブミン等の血液関連蛋白質などが挙げられる。尚、
ヒトＢＣ叶はヒトインターロイキン６（ＩＬ−６）とも
Ｂ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２）とも呼ばれるが、ここで
は従来より用いられているヒトＢＣ叶という名称を用い
る。
本発明の発現プラスミドは、基本的には、有用蛋白質が
大腸菌体内で生産されるよう該蛋白質をコードするＤＮ
Ａ断片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に
組み込まれているプラスミドであり、さらには構造遺伝
子の下流にター旦ネーターが導入されていてもよい。こ
のプラスミドは公知の方法（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、
Ｄ、ｖ、ｅｔ ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５ｅｒｃｈ、８．４０５７（１９８０））により作
成することができる。
大腸菌体内で生産されるよう該蛋白質をコードするＤＮ
Ａ断片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に
組み込まれているプラスミドであり、さらには構造遺伝
子の下流にター旦ネーターが導入されていてもよい。こ
のプラスミドは公知の方法（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、
Ｄ、ｖ、ｅｔ ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５ｅｒｃｈ、８．４０５７（１９８０））により作
成することができる。
該発現プラスミドにより、大腸菌を形質転換する方法と
しては、公知の方法（例えば、Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ。
しては、公知の方法（例えば、Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ。
＆ Ｍａｇａ、Ａ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、５３．
１５４（１９７０））にて行なうことができる。
１５４（１９７０））にて行なうことができる。
宿主である大腸菌は特に種類は限定されないが、例えば
、Ｋ−１２系のＣ−６００，ＨＢＩ ０１． ＪＭｌ
０５ 、 Ｗ３１１０等が挙げられる。
、Ｋ−１２系のＣ−６００，ＨＢＩ ０１． ＪＭｌ
０５ 、 Ｗ３１１０等が挙げられる。
培地としてはグルコース、ラクトース、ソルビトール等
の炭素源、アンモニア、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム等の窒素源、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分
解物、及びペプトン等の有機栄養源、リン酸塩などの無
機塩、マグネシウム。
の炭素源、アンモニア、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム等の窒素源、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分
解物、及びペプトン等の有機栄養源、リン酸塩などの無
機塩、マグネシウム。
カリウム、その他微量金属等を適宜含有する産生培地が
使用できる。しかしながら、本発明者らは、種々の培地
を検討した結果、大豆加水分解物を上記Ｍ９培地（０，
６％ＮａｚＨＰＯ４，０，３％ＫＨ，ＰＯ，。
使用できる。しかしながら、本発明者らは、種々の培地
を検討した結果、大豆加水分解物を上記Ｍ９培地（０，
６％ＮａｚＨＰＯ４，０，３％ＫＨ，ＰＯ，。
０．０５％Ｎａ（ｆ！、０．１％ＮＨ４Ｃｆ、 ０．２
％グルコース、 ０．００１４７％ＣａＣｊ２ｚ
・２ＨｚＯ，０，０５％Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２０の組成よ
り構成される）に、カザ旦ノ酸の代わりに添加した培地
を用いることにより、有用蛋白質の生産性、及びそのア
ミノ末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上
する事を見いだした。大豆加水分解物とは例えば、総合
アミノ酸（味の素株式会社製、大豆の塩酸加水分解物）
、味液、バタトソイトン（ＤＩＦＣＯ製）等である。大
豆加水分解物の添加濃度は、基本とする培地組成、培養
条件、により多少異なるが、通常培地あたり１％から１
０（重量）％、特に２％から４（重量）％が好ましい。
％グルコース、 ０．００１４７％ＣａＣｊ２ｚ
・２ＨｚＯ，０，０５％Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２０の組成よ
り構成される）に、カザ旦ノ酸の代わりに添加した培地
を用いることにより、有用蛋白質の生産性、及びそのア
ミノ末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上
する事を見いだした。大豆加水分解物とは例えば、総合
アミノ酸（味の素株式会社製、大豆の塩酸加水分解物）
、味液、バタトソイトン（ＤＩＦＣＯ製）等である。大
豆加水分解物の添加濃度は、基本とする培地組成、培養
条件、により多少異なるが、通常培地あたり１％から１
０（重量）％、特に２％から４（重量）％が好ましい。
培養温度は２０°Ｃから４５°Ｃ１好ましくは３６°Ｃ
から３９°Ｃであり、培養中の培地のｐＨは５から９、
好ましくは６から７である。培養期間は通常約６時間か
ら約２日である。
から３９°Ｃであり、培養中の培地のｐＨは５から９、
好ましくは６から７である。培養期間は通常約６時間か
ら約２日である。
有用蛋白質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた発現
プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養し、有用
組換え蛋白質を製造する方法に於て、当該大腸菌を大豆
加水分解物を添加した培地で培養することを特徴とする
、Ｎ末端に翻訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニン
残基が効率よく除去された有用蛋白質の増収法を提供す
るものであり、本発明による培養方法は、有用蛋白質の
生産性を向上させると同時に、目的蛋白質のアミノ末端
に付加しているメチオニン残基の除去効率も向上させる
ことができる。
プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養し、有用
組換え蛋白質を製造する方法に於て、当該大腸菌を大豆
加水分解物を添加した培地で培養することを特徴とする
、Ｎ末端に翻訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニン
残基が効率よく除去された有用蛋白質の増収法を提供す
るものであり、本発明による培養方法は、有用蛋白質の
生産性を向上させると同時に、目的蛋白質のアミノ末端
に付加しているメチオニン残基の除去効率も向上させる
ことができる。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
が、これにより本発明の有用性が限定されるものではな
い。
が、これにより本発明の有用性が限定されるものではな
い。
〔実施例］
実施例１
ヒトＢｃ叶発現プラスミドを保持する大腸菌ＨＢ１０１
／ｐＢＳＦ２−５Ｄ７を３Ｌ、容ミニジャーを用いて
、従来のカザミノ酸を主要栄養源とした培地と大豆加水
分解物である総合アミノ酸（味の素株式会社製）を主要
栄養源とした培地で比較培養した。なお、プラスミドｐ
ＢｓＦ ２−５Ｄ ７はプラスミドｐＵｃ１９（Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａ
ｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ。
／ｐＢＳＦ２−５Ｄ７を３Ｌ、容ミニジャーを用いて
、従来のカザミノ酸を主要栄養源とした培地と大豆加水
分解物である総合アミノ酸（味の素株式会社製）を主要
栄養源とした培地で比較培養した。なお、プラスミドｐ
ＢｓＦ ２−５Ｄ ７はプラスミドｐＵｃ１９（Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａ
ｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ。
Ｊ、：Ｇｅｎｅ ３３（１９８５００３−１１９に記載
）上のＥＣＯＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ クローニング部位
に、ＥＣ０ＲＩ側より、ｔｒｐブｔ）モーター、ｔｒｐ
ＬのＳＤ配列、合成ＳＤ配列、ヒ）ＢＣ叶合台底伝子、
ｔｒｐＡターもネーターが組み込まれた構造をしている
。（第１図）本プラスミドを大腸菌８８１０１株へ形質
転換する事により、ヒトＢＣＤＦ生産菌を得た。大腸菌
ＨＢ １０１ ／ｐＢＳＦ ２−５Ｄ７ （ＡＪ−１２
４４８）はＦＥＲＭ Ｐ−１０７５８として、既に寄託
されている。 （特願平１−１８９２７０に記載）Ｍ９
カザミノ酸培地組成は、カザミノ酸１．０ ｇ／ｄ１．
酵母エキス０．２ｇ／ｄｆｆｉ、塩化アンモニウム０．
５ｇ／ｄｆ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／ｄ
ｆ、塩化カルシウム三水和物０．００５ ｇ／ ｃＲｌ
、 Ｌ−ロイシン４０ｍｇ／ｄｆ、Ｌ−プロリン４０
ｍｇ／ｄ ｆ 。
）上のＥＣＯＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ クローニング部位
に、ＥＣ０ＲＩ側より、ｔｒｐブｔ）モーター、ｔｒｐ
ＬのＳＤ配列、合成ＳＤ配列、ヒ）ＢＣ叶合台底伝子、
ｔｒｐＡターもネーターが組み込まれた構造をしている
。（第１図）本プラスミドを大腸菌８８１０１株へ形質
転換する事により、ヒトＢＣＤＦ生産菌を得た。大腸菌
ＨＢ １０１ ／ｐＢＳＦ ２−５Ｄ７ （ＡＪ−１２
４４８）はＦＥＲＭ Ｐ−１０７５８として、既に寄託
されている。 （特願平１−１８９２７０に記載）Ｍ９
カザミノ酸培地組成は、カザミノ酸１．０ ｇ／ｄ１．
酵母エキス０．２ｇ／ｄｆｆｉ、塩化アンモニウム０．
５ｇ／ｄｆ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／ｄ
ｆ、塩化カルシウム三水和物０．００５ ｇ／ ｃＲｌ
、 Ｌ−ロイシン４０ｍｇ／ｄｆ、Ｌ−プロリン４０
ｍｇ／ｄ ｆ 。
ビタミンＢＩ ０．４＋ｗｇ／ｄｆ、グルコース２．
０ｇ／ｄＩ２゜リン酸−カリ０．１ｇ／ｄｉ！、、であ
り、一方、Ｍ９総合アミノ酸培地組成は、上記組成のう
ちカザミノ酸、ロイシン、プロリンの代わりに総合アミ
ノ酸（味の素株式会社製）を用いた組成の培地となって
いる。また培養時には両培地に抗生物質であるアンピシ
リン１００Ｄｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン２５μｇ／
ｍ ｆｌを添加した。
０ｇ／ｄＩ２゜リン酸−カリ０．１ｇ／ｄｉ！、、であ
り、一方、Ｍ９総合アミノ酸培地組成は、上記組成のう
ちカザミノ酸、ロイシン、プロリンの代わりに総合アミ
ノ酸（味の素株式会社製）を用いた組成の培地となって
いる。また培養時には両培地に抗生物質であるアンピシ
リン１００Ｄｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン２５μｇ／
ｍ ｆｌを添加した。
再生産培地３１．を５１．容ミニジャーに仕込み、Ｌブ
ロス（酵母エキス０．５％、バタトトリプトン１．０％
Ｎａ（／！０．５％、グルコース０．２％。
ロス（酵母エキス０．５％、バタトトリプトン１．０％
Ｎａ（／！０．５％、グルコース０．２％。
ｐＨ６，５〜７．５）培地にて一晩培養した大腸菌）Ｉ
Ｂｌ ０１ ／ｐＢＳＦ ２−３Ｄ ７ ’（ＦＥＲＭ
Ｐ−１０７５８）を１５０ｍ１ずつ各々のミニジャー
に加え、攪拌数７０Ｏｒｐｍ、通気量Ｑ、５ ｖｖｍ、
培養温度３７°Ｃ１制御ｐＨ６，７にて運転した。培養
開始後、３〜５時間で培養液の０Ｄ６６０ ｎｍが４〜
５に達したので、ｔｒｐプロモーターの誘導剤であるイ
ンドールアクリル酸整、及びフィード培地加えた。フィ
ード培地としてはＭ９カザミノ酸培地培養には、カザミ
ノ酸１．０ｇ／ｄｆｆｉ、Ｌ−ｔ］イシン４０ｍｇ７ｄ
ｌ、Ｌ−プロリン４０ｍｇ／ｄ ｌ 、 ビタミン８
１ ０．４ ｍｇ／ｄｉ 、 （ｐＨ６，７）の組成の
ちのを、そして総合アミノ酸培地培養には総合アミノ酸
１．０ｇ／ｄＩ２．ビタミンＢＩ ０．４ｍｇ／ｄｆ
ｆ。
Ｂｌ ０１ ／ｐＢＳＦ ２−３Ｄ ７ ’（ＦＥＲＭ
Ｐ−１０７５８）を１５０ｍ１ずつ各々のミニジャー
に加え、攪拌数７０Ｏｒｐｍ、通気量Ｑ、５ ｖｖｍ、
培養温度３７°Ｃ１制御ｐＨ６，７にて運転した。培養
開始後、３〜５時間で培養液の０Ｄ６６０ ｎｍが４〜
５に達したので、ｔｒｐプロモーターの誘導剤であるイ
ンドールアクリル酸整、及びフィード培地加えた。フィ
ード培地としてはＭ９カザミノ酸培地培養には、カザミ
ノ酸１．０ｇ／ｄｆｆｉ、Ｌ−ｔ］イシン４０ｍｇ７ｄ
ｌ、Ｌ−プロリン４０ｍｇ／ｄ ｌ 、 ビタミン８
１ ０．４ ｍｇ／ｄｉ 、 （ｐＨ６，７）の組成の
ちのを、そして総合アミノ酸培地培養には総合アミノ酸
１．０ｇ／ｄＩ２．ビタミンＢＩ ０．４ｍｇ／ｄｆ
ｆ。
（ｐＨ６，７）の組成のものを用いた。
両培養は１６時間行なった。各々の培養経過図を第２図
に示す。また、菌体濃度は最終的に０Ｄ６６０ｒ＋＋＋
＋でＭ９−カザミノ酸培地では１６、Ｍ９−総合アミノ
酸培地では２１に達した。
に示す。また、菌体濃度は最終的に０Ｄ６６０ｒ＋＋＋
＋でＭ９−カザミノ酸培地では１６、Ｍ９−総合アミノ
酸培地では２１に達した。
次に、両端養液より菌体を遠心分離により集め、２０ｗ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５） 、 ３０ｍＭ
ＮａＣ１にて懸濁後、リゾチーム、ＥＤＴＡをそれぞ
れ終濃度０．２１１ｇ／ｌｌｌ、Ｏ，１Ｍとなるよう添
加し、０℃で１時間処理した。その後、超音波破砕機に
て菌体液を７０Ｗ、２０ａ＋ｉｎで破砕し、６０００ｒ
ｐａａ 、 １０ｍ１ｎの低速遠心にてヒ） ＢＣＤ
Ｆを含む菌体内封入体を回収した。その封入体を上記緩
衝液２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、
３０ＤＭ ＮａＣ１で３回洗浄した後、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ６，０）にて懸濁し、ヒトＢＣ叶封人体懸濁
液を得た。
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５） 、 ３０ｍＭ
ＮａＣ１にて懸濁後、リゾチーム、ＥＤＴＡをそれぞ
れ終濃度０．２１１ｇ／ｌｌｌ、Ｏ，１Ｍとなるよう添
加し、０℃で１時間処理した。その後、超音波破砕機に
て菌体液を７０Ｗ、２０ａ＋ｉｎで破砕し、６０００ｒ
ｐａａ 、 １０ｍ１ｎの低速遠心にてヒ） ＢＣＤ
Ｆを含む菌体内封入体を回収した。その封入体を上記緩
衝液２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、
３０ＤＭ ＮａＣ１で３回洗浄した後、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ６，０）にて懸濁し、ヒトＢＣ叶封人体懸濁
液を得た。
続いて、その封入体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２
（ｐ）１８．３） 、 １０ｎ＋Ｍ ＥＤＴＡ、６Ｍ
塩酸グアニジン溶液にて室温１時間で可溶化し、その可
溶化溶液を逆相ＨＰＬＣ（ＹＭＣＣ８カラム４．６％ｍ
ｍＸ ２５０ ｍｍ）にかけ、ヒ）ＢＣ叶画分を単離精
製した。
（ｐ）１８．３） 、 １０ｎ＋Ｍ ＥＤＴＡ、６Ｍ
塩酸グアニジン溶液にて室温１時間で可溶化し、その可
溶化溶液を逆相ＨＰＬＣ（ＹＭＣＣ８カラム４．６％ｍ
ｍＸ ２５０ ｍｍ）にかけ、ヒ）ＢＣ叶画分を単離精
製した。
両培養で得られたヒ）ＢＣ叶の生産量はＵＶ２８０ｎ−
の吸収量により、算出した。またＮ末端ア稟ノ酸配列は
、上記サンプルをプロテインシークエンサー（ＡＢ１社
製４７０Ａ）にかけることにより検定した。結果を下記
の第１表に示した。
の吸収量により、算出した。またＮ末端ア稟ノ酸配列は
、上記サンプルをプロテインシークエンサー（ＡＢ１社
製４７０Ａ）にかけることにより検定した。結果を下記
の第１表に示した。
以上のように、大豆加水分解物である総合アミノ酸を主
要栄養源として用いることで、従来のＭ９−カザミノ酸
培地に比べ、ヒトＢＣＤＦの生産量は約２倍に、またア
ミノ末端のメチオニン除去率が８５％から９８％に向上
した。このように、総合アミノ酸培地による培養の結果
、アミノ末端メチオニンが効率よく除去できたヒ）ＢＣ
叶を大量に取得することができた。
要栄養源として用いることで、従来のＭ９−カザミノ酸
培地に比べ、ヒトＢＣＤＦの生産量は約２倍に、またア
ミノ末端のメチオニン除去率が８５％から９８％に向上
した。このように、総合アミノ酸培地による培養の結果
、アミノ末端メチオニンが効率よく除去できたヒ）ＢＣ
叶を大量に取得することができた。
第 １ 表
実施例２
ヒトインターロイキン２発現プラスミドを保持する大腸
菌ＨＢ １０１ ／ ｐＴ１３ｓＮｃｏを３Ｌ、容ミニ
ジャーを用いて実施例１と同様に比較培養した。
菌ＨＢ １０１ ／ ｐＴ１３ｓＮｃｏを３Ｌ、容ミニ
ジャーを用いて実施例１と同様に比較培養した。
ヒトインターロイキン２生産用のプラスミドｐＴ１３ｓ
Ｎｃｏ （Ｔｏｎｏｕｃｈｉら、、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ
、１０４．３Ｏ−３４（１９８８） ）はｔｒｐプロモ
ーターの制御下にヒトインターロイキン２が発現するよ
うに設計された発現プラスミドであり、本プラスミドを
大腸菌８８１０１株に形質転換したヒトインターロイキ
ン２生産菌ＨＢ １０１ ／１）Ｔ１３ＳＮｃｏ （Ａ
Ｊ １２４４７）ＦＥＲＭ Ｐ １０７５７として
既に寄託されている。
Ｎｃｏ （Ｔｏｎｏｕｃｈｉら、、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ
、１０４．３Ｏ−３４（１９８８） ）はｔｒｐプロモ
ーターの制御下にヒトインターロイキン２が発現するよ
うに設計された発現プラスミドであり、本プラスミドを
大腸菌８８１０１株に形質転換したヒトインターロイキ
ン２生産菌ＨＢ １０１ ／１）Ｔ１３ＳＮｃｏ （Ａ
Ｊ １２４４７）ＦＥＲＭ Ｐ １０７５７として
既に寄託されている。
培地組成、培養条件は、実施例１と同しである。
インターロイキン２の場合もＢＣ叶と同様に、大腸菌体
内にインターロイキン２の封入体が形成されていた。生
産量、Ｎ末端アミノ酸配列を実施例１と同様に検定した
結果、下記の第２表に示したようにインターロイキン２
の場合も、Ｍ９−カザミノ酸培地を用いた培養に比べ、
Ｍ９−総合アミノ酸培地による培養により、ヒトインタ
ーロイキン２の生産量は約１．５倍となり、Ｎ末端メチ
オニン除去率も５７％から９２％に向上した。このよう
に、アミノ末端メチオニンが効率よく除去できたヒトイ
ンターロイキン２を大量に取得することができた。尚、
第２表のヒトＩＬ−２はヒトインターロイキン２の略称
である。
内にインターロイキン２の封入体が形成されていた。生
産量、Ｎ末端アミノ酸配列を実施例１と同様に検定した
結果、下記の第２表に示したようにインターロイキン２
の場合も、Ｍ９−カザミノ酸培地を用いた培養に比べ、
Ｍ９−総合アミノ酸培地による培養により、ヒトインタ
ーロイキン２の生産量は約１．５倍となり、Ｎ末端メチ
オニン除去率も５７％から９２％に向上した。このよう
に、アミノ末端メチオニンが効率よく除去できたヒトイ
ンターロイキン２を大量に取得することができた。尚、
第２表のヒトＩＬ−２はヒトインターロイキン２の略称
である。
第２表
第２図
第１図はヒトＢＣＤＦの生産プラスミドであるｐＢＳＦ
ニーＳＤ７の構造を示す。 第２図は総合アミノ酸培地を用いた時とカザミノ酸培地
の時の、ヒ） ＢＣＤＦ生産菌の培養経過を示す。 培養時間（時間）
ニーＳＤ７の構造を示す。 第２図は総合アミノ酸培地を用いた時とカザミノ酸培地
の時の、ヒ） ＢＣＤＦ生産菌の培養経過を示す。 培養時間（時間）
Claims (4)
- （１）有用蛋白質をコードするＤＮＡが組み込まれた発
現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して有
用蛋白質を生産するに際し、大豆加水分解物を添加した
培地で培養することを特徴とする組換え蛋白質の生産方
法。 - （２）大豆加水分解物が、培地あたり１％から１０（重
量）％の濃度範囲で添加されることを特徴とする請求項
（１）記載の生産方法。 - （３）有用蛋白質がヒトＢ細胞分化因子である請求項（
１）記載の生産方法。 - （４）有用蛋白質がヒトインターロイキン２である請求
項（１）記載の生産方法。
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|---|---|---|---|
| JP2041666A JP2844484B2 (ja) | 1990-02-22 | 1990-02-22 | 組換え蛋白質の生産方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2041666A JP2844484B2 (ja) | 1990-02-22 | 1990-02-22 | 組換え蛋白質の生産方法 |
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|---|---|
| JPH03244391A true JPH03244391A (ja) | 1991-10-31 |
| JP2844484B2 JP2844484B2 (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=12614712
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|---|---|---|---|
| JP2041666A Expired - Lifetime JP2844484B2 (ja) | 1990-02-22 | 1990-02-22 | 組換え蛋白質の生産方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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-
1990
- 1990-02-22 JP JP2041666A patent/JP2844484B2/ja not_active Expired - Lifetime
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