JPH03244395A - 微生物生細胞の計数方法 - Google Patents
微生物生細胞の計数方法Info
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- JPH03244395A JPH03244395A JP3837190A JP3837190A JPH03244395A JP H03244395 A JPH03244395 A JP H03244395A JP 3837190 A JP3837190 A JP 3837190A JP 3837190 A JP3837190 A JP 3837190A JP H03244395 A JPH03244395 A JP H03244395A
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Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は微生物生細胞の計測方法に関し、特に食品プラ
ント、医薬品製造プラントにおける原料や製品の品質管
理や殺菌性能評価等に適用される生細胞の計数方法に関
する。
ント、医薬品製造プラントにおける原料や製品の品質管
理や殺菌性能評価等に適用される生細胞の計数方法に関
する。
食品製造、医薬品製造プラントでは原料や製品の品質管
理、殺菌性能評価のため、微生物検査・計測が行われて
おり、これに多大な労力、時間が費やされている。従来
、微生物検査法として最も広く用いられているのは寒天
培養法であり、この方法は微生物の栄養源を溶かし込ん
だ寒天に試料を分散・地墨し、寒天にコロニを形成させ
て、このコロニー数を計数して生細胞を測定するもので
ある。しかし、この方法は培養操作を伴うため通常１〜
数日と長時間の検査時間が必要であり、品質管理、殺菌
管理に支障をきたす場合が多い。
理、殺菌性能評価のため、微生物検査・計測が行われて
おり、これに多大な労力、時間が費やされている。従来
、微生物検査法として最も広く用いられているのは寒天
培養法であり、この方法は微生物の栄養源を溶かし込ん
だ寒天に試料を分散・地墨し、寒天にコロニを形成させ
て、このコロニー数を計数して生細胞を測定するもので
ある。しかし、この方法は培養操作を伴うため通常１〜
数日と長時間の検査時間が必要であり、品質管理、殺菌
管理に支障をきたす場合が多い。
従来法の最も大きな問題点では培養操作を伴うため、検
査・計測に長時間必要とすることである。
査・計測に長時間必要とすることである。
本発明は上記従来法の問題点を解決し、短時間にかつ、
高感度に生細胞を計測できる方法を提供することにある
。
高感度に生細胞を計測できる方法を提供することにある
。
そこで、特別な培養操作を必要とせず、生菌を検知する
方法について種々検討を行った結果、フルオレセイン誘
導体の一種であるフルオレセインジアセテート（以下、
ＦＤＡと略す）を特別な条件で試料に作用させることに
より生菌を短時間で高感度に検出する方法を見い出した
。
方法について種々検討を行った結果、フルオレセイン誘
導体の一種であるフルオレセインジアセテート（以下、
ＦＤＡと略す）を特別な条件で試料に作用させることに
より生菌を短時間で高感度に検出する方法を見い出した
。
ＦＤＡは酵素の一種であるエステラーゼは反応し、蛍光
物質であるフルオレセインを生成することは従来より知
られており、この性質を利用して動物細胞にＦＤＡを′
作用させ、細胞内に生成するフルオレセインの偏光度か
ら細胞質の流動性を求めて診断に利用されたり、植物細
胞のプロトプラスト細胞壁再生確認にＦＤＡが用いられ
た例がある。しかしながら、微生物細胞生細胞の計測に
適用された例は極めて少なく、ＦＤＡの使用条件、効果
の有無についてはほとんどわかっていない。
物質であるフルオレセインを生成することは従来より知
られており、この性質を利用して動物細胞にＦＤＡを′
作用させ、細胞内に生成するフルオレセインの偏光度か
ら細胞質の流動性を求めて診断に利用されたり、植物細
胞のプロトプラスト細胞壁再生確認にＦＤＡが用いられ
た例がある。しかしながら、微生物細胞生細胞の計測に
適用された例は極めて少なく、ＦＤＡの使用条件、効果
の有無についてはほとんどわかっていない。
本発明者等はＦＤＡを用いた微生物生細胞の計測可能性
を検討するため、ＦＤＡの使用条件、蛍光発光特性に関
する実験を行った結果、試料にＦＤＡを作用させると、
細胞内に生成した蛍光物質（フルオレセイン）が細胞外
に徐々に流動して、バックグラウンドの蛍光も高くなり
細胞の蛍光とバックグラウンドの蛍光との差が小さくな
って正確な計測ができないという問題のあることを知っ
た。
を検討するため、ＦＤＡの使用条件、蛍光発光特性に関
する実験を行った結果、試料にＦＤＡを作用させると、
細胞内に生成した蛍光物質（フルオレセイン）が細胞外
に徐々に流動して、バックグラウンドの蛍光も高くなり
細胞の蛍光とバックグラウンドの蛍光との差が小さくな
って正確な計測ができないという問題のあることを知っ
た。
本発明はこの問題点を解決し、精度よく生細胞を計測す
る方法を提供しようとするものである。
る方法を提供しようとするものである。
本発明の第１の発明は、
（１）測定対象試料にフルオレセイン誘導体を作用させ
、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞から
発する蛍光を検−出することにより、微生物生細胞数を
測定する方法□において、溶媒で溶解したフルオレセイ
ン誘゛導体を試料に添加し、一定温度、一定時間保持し
た後、酸を作用させてｐＨを低下させた後、当該試料に
励起光を照射し、細胞の発子る蛍光を検出することを特
徴とする微生物生細胞の計数方法。（以下、第１発明と
いう） また、上記第１発明において、溶媒１こ溶解したフルオ
レセイン誘導体は一般的には更にリン酸バッファで数十
倍に希釈して試料に所定濃度で作用させているが、この
ようにするとＦＤ”’Ａの劣化が著しく早く、調製後１
〜２時間経過した試薬では細胞の蛍光発光量が短時間で
低下□してしまう不具合がある。その解決法として本発
明の第２発明は次構成を採ることにする。
、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞から
発する蛍光を検−出することにより、微生物生細胞数を
測定する方法□において、溶媒で溶解したフルオレセイ
ン誘゛導体を試料に添加し、一定温度、一定時間保持し
た後、酸を作用させてｐＨを低下させた後、当該試料に
励起光を照射し、細胞の発子る蛍光を検出することを特
徴とする微生物生細胞の計数方法。（以下、第１発明と
いう） また、上記第１発明において、溶媒１こ溶解したフルオ
レセイン誘導体は一般的には更にリン酸バッファで数十
倍に希釈して試料に所定濃度で作用させているが、この
ようにするとＦＤ”’Ａの劣化が著しく早く、調製後１
〜２時間経過した試薬では細胞の蛍光発光量が短時間で
低下□してしまう不具合がある。その解決法として本発
明の第２発明は次構成を採ることにする。
（２）測定対象試料にフルオレセイン誘導体を作用させ
、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞から
発する蛍光を検出することにより、微生物生細胞数を測
定する方法において、溶媒で溶解し、リン酸バッファで
希釈しない□フルオレセイン誘導体を試料に添加し、一
定温度、一定時間保持した後、酸を作用させてｐＨを低
下させた後、当該試料に励起光を照射し、細胞の発する
蛍光を検出することを特□徴とする微生物生細胞の計数
方法。（以下、第２発明という） 本発明において使用されるフルオレセイン誘導体として
は、ＦＤＡのほかフルオレ上インナトリ１ウム（ウラニ
ン）や、フルオレセイン−（β−Ｄ−ガラクトフィラノ
シド）のが使用できる。
、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞から
発する蛍光を検出することにより、微生物生細胞数を測
定する方法において、溶媒で溶解し、リン酸バッファで
希釈しない□フルオレセイン誘導体を試料に添加し、一
定温度、一定時間保持した後、酸を作用させてｐＨを低
下させた後、当該試料に励起光を照射し、細胞の発する
蛍光を検出することを特□徴とする微生物生細胞の計数
方法。（以下、第２発明という） 本発明において使用されるフルオレセイン誘導体として
は、ＦＤＡのほかフルオレ上インナトリ１ウム（ウラニ
ン）や、フルオレセイン−（β−Ｄ−ガラクトフィラノ
シド）のが使用できる。
〔第１発明゛の作用〕
微生物生細胞でも動・植物細胞と同様、生細胞には酵素
エステラーゼが存在すると考えられ、死細胞では酵素が
失活しているので酵素は存在しない。従らて、微生物試
料にＦＤＡを作用させると生細胞だけがＦＤＡと反応し
細胞中にフルオレセインを生成する。この時、反応を促
進させるためには温度、時間といった条件が必須となる
。温度に関しては３５〜３７℃が最適であり１０℃以下
、又は４５℃以上では反応は起こらない。
エステラーゼが存在すると考えられ、死細胞では酵素が
失活しているので酵素は存在しない。従らて、微生物試
料にＦＤＡを作用させると生細胞だけがＦＤＡと反応し
細胞中にフルオレセインを生成する。この時、反応を促
進させるためには温度、時間といった条件が必須となる
。温度に関しては３５〜３７℃が最適であり１０℃以下
、又は４５℃以上では反応は起こらない。
また、迅速計測の目的からは反応時間は短かいほど望ま
しいが細胞内に計測可能となるだけの蛍光物質を生成さ
せる必要があり、このだめの反応時間は酵母の場合、５
〜１０分、大腸菌、枯草菌などのバクテリアやカビ等の
胞子では１０〜２０分必要とする。
しいが細胞内に計測可能となるだけの蛍光物質を生成さ
せる必要があり、このだめの反応時間は酵母の場合、５
〜１０分、大腸菌、枯草菌などのバクテリアやカビ等の
胞子では１０〜２０分必要とする。
そこで、一定の温度、一定時間、ＦＤＡと試料を作用さ
せると細胞内に蛍光物質が生成するが、時間と共に細胞
内に生成した蛍光物質が細胞外にも流出を始杓、生細胞
の蛍光発光量とバックグラウンドとの蛍光発光量との差
が小さくなり計測を難しくする欠点のあることがわかっ
た。そこで、この対策について種々検討した結果、試料
に酸を添加し、ｐＨを４以下に調整することにより、バ
ックグラウンドの蛍光発光を消滅させるのである。なお
細胞には細胞壁、細胞膜といった防御機能があるため、
酸は細胞内に侵入するのに時間がかかり、細胞の蛍光発
光は消滅しないことがわかった。
せると細胞内に蛍光物質が生成するが、時間と共に細胞
内に生成した蛍光物質が細胞外にも流出を始杓、生細胞
の蛍光発光量とバックグラウンドとの蛍光発光量との差
が小さくなり計測を難しくする欠点のあることがわかっ
た。そこで、この対策について種々検討した結果、試料
に酸を添加し、ｐＨを４以下に調整することにより、バ
ックグラウンドの蛍光発光を消滅させるのである。なお
細胞には細胞壁、細胞膜といった防御機能があるため、
酸は細胞内に侵入するのに時間がかかり、細胞の蛍光発
光は消滅しないことがわかった。
この第１発明の方法により、生細胞とバックグラウンド
との蛍光発光量の差は大きくなり、感度よく、生細胞を
計測できるようになる。
との蛍光発光量の差は大きくなり、感度よく、生細胞を
計測できるようになる。
生細胞中に生成する蛍光物質を励起させるためには、特
定波長域を含む光を照射する必要があるが、この励起ス
ペクトルは第２図に示すように４９０ｎｍ付近にピーク
を有する比較的ブロードな曲線である。また、４９０ｎ
ｍの波長で励起させると、細胞内の蛍光物質は第３図に
示すように５１０〜５１５ｎｍ付近にピークを有する蛍
光スペクトルを出す。
定波長域を含む光を照射する必要があるが、この励起ス
ペクトルは第２図に示すように４９０ｎｍ付近にピーク
を有する比較的ブロードな曲線である。また、４９０ｎ
ｍの波長で励起させると、細胞内の蛍光物質は第３図に
示すように５１０〜５１５ｎｍ付近にピークを有する蛍
光スペクトルを出す。
従って、このような細胞内に生成した蛍光物質を励起す
るに必要な波長を有する光を照射することにより、個々
の細胞は蛍光を発し、これを光の点として計測すること
により、生細胞を精度良く、計測できるわけである。
るに必要な波長を有する光を照射することにより、個々
の細胞は蛍光を発し、これを光の点として計測すること
により、生細胞を精度良く、計測できるわけである。
〔第２発明の作用〕
アセトンに溶解したＦＤＡを一旦、リン酸バッファ液で
希釈してしまうと、ＦＤＡが変質、分解されやすくなり
、効果が急速に低下してしまうことが実験により判明し
た。そこで、従来、植物細胞等で行われていた方法とは
異なり、アセトンに溶解したＦＤＡをリン酸バッファ液
で希釈することなく、直接、微生物試料に作用させた結
果、ＦＤＡの効果はアセトンに溶解後、１０時間以上経
過しても安定して維持できることがわかり、微生物生細
胞に対して大きな効果が得られた。
希釈してしまうと、ＦＤＡが変質、分解されやすくなり
、効果が急速に低下してしまうことが実験により判明し
た。そこで、従来、植物細胞等で行われていた方法とは
異なり、アセトンに溶解したＦＤＡをリン酸バッファ液
で希釈することなく、直接、微生物試料に作用させた結
果、ＦＤＡの効果はアセトンに溶解後、１０時間以上経
過しても安定して維持できることがわかり、微生物生細
胞に対して大きな効果が得られた。
試験に用いた生細胞計測装置の構成を第１図に示す。
第１図において、１は励起光源であり出力１００Ｗの水
銀ランプ、２は水銀光を集光するためのコレクターレン
ズ、３は励起フィルタであり生細胞中に生成した蛍光物
質を励起するに必要な波長だけを通過させるフィルタで
ある。
銀ランプ、２は水銀光を集光するためのコレクターレン
ズ、３は励起フィルタであり生細胞中に生成した蛍光物
質を励起するに必要な波長だけを通過させるフィルタで
ある。
この実験では４５０〜４９０ｎａ＋の波長領域を通過す
る励起フィルタを用いた。
る励起フィルタを用いた。
４はミラー ５は対物レンズで倍率が２０倍のものを使
用している。ＦＤＡと反応させＰＨを低下させた微生物
試料をスライドグラスの上に滴下し、カバーグラスでお
おった後、試料台６にのせ、励起光を照射すると生細胞
から５１０〜５１５ｎｍを主波長とする蛍光を発する。
用している。ＦＤＡと反応させＰＨを低下させた微生物
試料をスライドグラスの上に滴下し、カバーグラスでお
おった後、試料台６にのせ、励起光を照射すると生細胞
から５１０〜５１５ｎｍを主波長とする蛍光を発する。
７は吸収フィルタで５１０ｎｍ以上の波長の光を通過さ
せ、レンズ８を介してテレビカメラ９により発光細胞を
撮像する。１０は任意に設定可能な輝度レベル内に存在
する発光細胞の画像を出力することができる画像処理装
置で、画像処理された画像はモニタ１２に写し出される
。１１はパーティクルカウンタで任意の輝度範囲にある
細胞数を計測する。１３はデータ処理解析装置で、所定
の輝度範囲にある細胞数、細胞の輝度分布がアウトプッ
トされ、生細胞数を正確に求めることができる。
せ、レンズ８を介してテレビカメラ９により発光細胞を
撮像する。１０は任意に設定可能な輝度レベル内に存在
する発光細胞の画像を出力することができる画像処理装
置で、画像処理された画像はモニタ１２に写し出される
。１１はパーティクルカウンタで任意の輝度範囲にある
細胞数を計測する。１３はデータ処理解析装置で、所定
の輝度範囲にある細胞数、細胞の輝度分布がアウトプッ
トされ、生細胞数を正確に求めることができる。
次に、上記装置を用いた試験実施例を示す。
（１）試験に用いた細胞
ポテトデキストロース寒天培地で約１週間地墨した黒カ
ビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇａｒ）から胞子を
回収し、生理食塩水（ｐＨ７，０）に、約１０’個／−
の濃度に懸濁させたものを試料とした。
ビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇａｒ）から胞子を
回収し、生理食塩水（ｐＨ７，０）に、約１０’個／−
の濃度に懸濁させたものを試料とした。
（２） ＦＤＡ溶液
アセトンにＦＤＡを溶解し１■／−の濃度とした。
（３）作用温度、 ｐＨ
温度、９Ｈは各々３７℃、７．０に設定し、細胞懸濁液
１−を試験管にとりＦＤＡ溶液を添加した後、一定時間
反応を行わせた。
１−を試験管にとりＦＤＡ溶液を添加した後、一定時間
反応を行わせた。
（４） 実 験
■ アセトンにＦＤＡに溶解し１■／ｒｎｌの濃度とし
たものを、ｐＨ７，０のリン酸バッファで５倍に希釈し
、細胞懸濁液に対し１：１−（ＦＤＡ濃度として０．１
■／ｍｌ）の割合で添加したものと、希釈することなく
細胞懸濁液に直接０．１ｍｇ／ｒｎｌになるように添加
した試料について、所定時間毎に２０分間反応を行わせ
細胞の輝度計測を行った。
たものを、ｐＨ７，０のリン酸バッファで５倍に希釈し
、細胞懸濁液に対し１：１−（ＦＤＡ濃度として０．１
■／ｍｌ）の割合で添加したものと、希釈することなく
細胞懸濁液に直接０．１ｍｇ／ｒｎｌになるように添加
した試料について、所定時間毎に２０分間反応を行わせ
細胞の輝度計測を行った。
第４図に、細胞の平均輝度と時間の関係を示す。これか
られかるように、リン酸バッファで希釈したものは時間
が経過すると細胞輝度が急速に低下するのに対し、ＦＤ
Ａを溶解したアセトン液を直接添加した場合には長時間
にわたり安定した発光が得られることがわかる。
られかるように、リン酸バッファで希釈したものは時間
が経過すると細胞輝度が急速に低下するのに対し、ＦＤ
Ａを溶解したアセトン液を直接添加した場合には長時間
にわたり安定した発光が得られることがわかる。
このことは、第２発明−によれば頻繁にＦＤＡ溶液を作
り変えることなく信頼性のあるデータが得られることを
意味し、作業効率上、極めて好都合であることがわかる
。
り変えることなく信頼性のあるデータが得られることを
意味し、作業効率上、極めて好都合であることがわかる
。
■ 次に、細胞懸濁液１ｍｌ！に０．１■／−の濃度に
なるように、ＦＤＡ溶解アセトン液を直接添加し、反応
時間を変化させて細胞の輝度、バックグラウンドを計測
した結果を第５図に示す。横軸は細胞の発光量（輝度）
、縦軸は□所定輝度範囲、・にある全細胞数Ｎｏに対す
る計測された発光細胞数の割合を示す。
なるように、ＦＤＡ溶解アセトン液を直接添加し、反応
時間を変化させて細胞の輝度、バックグラウンドを計測
した結果を第５図に示す。横軸は細胞の発光量（輝度）
、縦軸は□所定輝度範囲、・にある全細胞数Ｎｏに対す
る計測された発光細胞数の割合を示す。
この結果から、反応時間５分では細胞の発光量も全体的
に低いレベルにあり、バックグラウンド以下の細胞も全
体の約４０％存在・するが、反応時間１０分では発光量
が全体、的に高くなるもののまだ、約１０％がバックグ
ラウンド以下の発光量で計測されない。
に低いレベルにあり、バックグラウンド以下の細胞も全
体の約４０％存在・するが、反応時間１０分では発光量
が全体、的に高くなるもののまだ、約１０％がバックグ
ラウンド以下の発光量で計測されない。
反応時間２０分、３０分と時間が長くなるに従って、細
胞内の生成された蛍光物質が細胞外に流出し、バックグ
ラウンドの値が高くなると共に、バックグラウンド以下
の細胞数も全体の２５％、４０％と増加する。
胞内の生成された蛍光物質が細胞外に流出し、バックグ
ラウンドの値が高くなると共に、バックグラウンド以下
の細胞数も全体の２５％、４０％と増加する。
第６図は本発明法であり、同様に、各時間毎に試料を試
験管から一定量取り出した後１ ＝Ｎ塩酸によりｐＨを
３〜４に調整した後発光細胞の計測を行ったものである
。この結果から明らかなように、反応時間１０分以上で
はいづれの条件もバックグラウンドの値が低下し、・・
。
験管から一定量取り出した後１ ＝Ｎ塩酸によりｐＨを
３〜４に調整した後発光細胞の計測を行ったものである
。この結果から明らかなように、反応時間１０分以上で
はいづれの条件もバックグラウンドの値が低下し、・・
。
全細胞数の１００％が計測されてい゛ることがわかる。
ただし、本発明法では酸を添加した後長時間をおくと添
加した酸が細胞内にまで侵入し、細胞内の蛍光物質の発
光を阻害するので注意を要する。本発明法は黒カビ胞子
のほか、酵母、枯草菌胞子、大腸菌に対しても適用され
る。
加した酸が細胞内にまで侵入し、細胞内の蛍光物質の発
光を阻害するので注意を要する。本発明法は黒カビ胞子
のほか、酵母、枯草菌胞子、大腸菌に対しても適用され
る。
従来法では、微生物生細胞の計測時間が１〜数日と長時
間必要であったが、本発明方法では約、１０分、と格段
に早く、かつ感度よく計測できることか゛ら、、食品く
医薬品分野における原料、製品の迅速な品質管理、殺菌
性能評価が可能となり、生産コストの低減に対し著大な
効果を奏する。
間必要であったが、本発明方法では約、１０分、と格段
に早く、かつ感度よく計測できることか゛ら、、食品く
医薬品分野における原料、製品の迅速な品質管理、殺菌
性能評価が可能となり、生産コストの低減に対し著大な
効果を奏する。
第１図は本発明の一実施例を行うに際して使用した装置
の概略図、第２図は生細胞の蛍光発光に必要な励起波長
スペクトルのグラフ、第３図は生細胞の発する蛍光スペ
クトルのグラフ、第４図は本発明の実施例に係るＦＤＡ
溶液作成時からの時間経過に伴う細胞輝度の変化を示す
グラフ１．・第５図は従来法に係る輝度と細胞数比の関
係グラフ、 第６図は本発明の実施例に係る 輝度と細胞数比の関係グラフである。
の概略図、第２図は生細胞の蛍光発光に必要な励起波長
スペクトルのグラフ、第３図は生細胞の発する蛍光スペ
クトルのグラフ、第４図は本発明の実施例に係るＦＤＡ
溶液作成時からの時間経過に伴う細胞輝度の変化を示す
グラフ１．・第５図は従来法に係る輝度と細胞数比の関
係グラフ、 第６図は本発明の実施例に係る 輝度と細胞数比の関係グラフである。
Claims (2)
- （１）測定対象試料にフルオレセイン誘導体を作用させ
、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞から
発する蛍光を検出することにより微生物生細胞数を測定
する方法において、溶媒で溶解したフルオレセイン誘導
体を試料に添加し、一定温度、一定時間保持した後、酸
を作用させてｐＨを低下させた後、当該試料に励起光を
照射し、細胞の発する蛍光を検出することを特徴とする
微生物生細胞の計数方法。 - （２）測定対象試料にフルオレセイン誘導体を作用させ
、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞から
発する蛍光を検出することにより微生物生細胞数を測定
する方法において、溶媒で溶解しリン酸バッファで希釈
してないフルオレセイン誘導体を試料に添加し、一定温
度、一定時間保持した後、酸を作用させてｐＨを低下さ
せた後、当該試料に励起光を照射し、細胞の発する蛍光
を検出することを特徴とする微生物生細胞の計数方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3837190A JP2680713B2 (ja) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | 微生物生細胞の計数方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3837190A JP2680713B2 (ja) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | 微生物生細胞の計数方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03244395A true JPH03244395A (ja) | 1991-10-31 |
| JP2680713B2 JP2680713B2 (ja) | 1997-11-19 |
Family
ID=12523425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3837190A Expired - Fee Related JP2680713B2 (ja) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | 微生物生細胞の計数方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2680713B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2434446A (en) * | 2006-01-25 | 2007-07-25 | Pentax Corp | Method for fluorescently staining tissue |
| US8298514B2 (en) | 2006-06-15 | 2012-10-30 | Hoya Corporation | Agent for enhancing contrast of image of fluorescent staining of lumen of digestive tract |
| WO2014192565A1 (ja) * | 2013-05-29 | 2014-12-04 | 株式会社サタケ | 微生物の検査方法 |
-
1990
- 1990-02-21 JP JP3837190A patent/JP2680713B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2434446A (en) * | 2006-01-25 | 2007-07-25 | Pentax Corp | Method for fluorescently staining tissue |
| JP2007197350A (ja) * | 2006-01-25 | 2007-08-09 | Pentax Corp | 組織の蛍光染色方法 |
| GB2434446B (en) * | 2006-01-25 | 2010-09-01 | Pentax Corp | Method for fluorescently staining tissue |
| DE102007003873B4 (de) * | 2006-01-25 | 2015-08-06 | Hoya Corp. | Verfahren zur Fluoreszenzfärbung und zur Untersuchung von Gewebe |
| US8298514B2 (en) | 2006-06-15 | 2012-10-30 | Hoya Corporation | Agent for enhancing contrast of image of fluorescent staining of lumen of digestive tract |
| WO2014192565A1 (ja) * | 2013-05-29 | 2014-12-04 | 株式会社サタケ | 微生物の検査方法 |
| JP2014230514A (ja) * | 2013-05-29 | 2014-12-11 | 株式会社サタケ | 微生物の検査方法 |
| US9856506B2 (en) | 2013-05-29 | 2018-01-02 | Satake Corporation | Method for examining microorganisms |
| AU2014272067B2 (en) * | 2013-05-29 | 2020-01-30 | Satake Corporation | Method for examining microorganisms |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2680713B2 (ja) | 1997-11-19 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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