JPH03257367A

JPH03257367A - 血清診断法

Info

Publication number: JPH03257367A
Application number: JP5723690A
Authority: JP
Inventors: Shuichi Hashizume; 秀一橋爪; Masanori Kamei; 優徳亀井
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 1990-03-08
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1991-11-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、チトクロームＣを用いることを特徴とする血
清診断法に関づるものである。

従来の技術従来、がんの血清診断法の検査に用いられてきた腫瘍マ
ーカーとしては、ＣＥＡ　（がん胎児性抗原＞、ＡＦＰ
（α−フェトプロティン）等の胎児性タンパク質、がん
関連抗原、ホルモン、アイソエンザイム等のヒト由来物
質が挙げられる。特に肺がんにおいては、ＣＥＡ、Ｓ（
、Ｃ抗原（扁平上皮がん抗原）、Ｎ５Ｅ（神経特異的エ
ノラーゼ）などが用いられている。これらの腫瘍マーカ
ーによる検査法は、がんのスクリーニングのみならず、
がんの治療効果又は術後のモニタリングのためにも、重
要なものとなりつつある。また、この方法は、簡便であ
ること、数多くのサンプルを処理できること等の利点が
ある。

発明が解決しようとする課題しかしながら、従来の腫瘍マーカーのみでは、がんの陽
性率が未だ低く、また、偶成性率ら高かった。特に肺が
んについては、ＣＥＡ、Ｓ（、Ｃ。

ＮＳＥなどの他に較べ高い陽性率を与えるマーカーであ
ってもその陽性率は肺がん全体の３０〜４０％と低く、
また、偏陽性率は１０〜２０％程度と高い、という不利
な点があった。

これらの検査法には、標準物質としての腫瘍マーカーが
必要となるが、これらのマーカーはヒト由来物質である
ために大量に入手することが難しい。更に、これらのマ
ーカーはヒト由来物質であることから、健常人にも存在
し、偶陽性率が高くなる原因となった。

また、血液中の腫瘍マーカー量を測定する方法では、早
期がんの場合、マーカー量（抗原量）が少なく早期診断
が難しかった。

本発明は、このような従来技術における課題を解決しよ
うとして行われたものである。

課題を解決するだめの手段本発明者らは、がんの血清診断法に有効な、ヒト以外の
生物由来のマーカー物質の検索を行った結果、チトクロ
ームＣ１特に下等生物由来のものがこの目的に適合する
ことを見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成する
に至った。

本発明のがんの血清診断法のひとつの特徴は、従来のよ
うに血液中のマーカー量を測定するのではなく、そのマ
ーカーに対する抗体量を測定することである。即ち、血
液中に測定不可能な微量のマーカーしか存在しない場合
であっても、その抗体量は生体中で増幅されており、そ
の結果、その抗体量を測定することは可能で、これによ
って、がんの早期診断が行えることとなる。

以下に本発明について詳細に説明する。

（１〉　　マーカー物質の検索肺がん患者の血清及び健常人の血清を５サンプルずつ用
いて、ヒト以外の生物中に存在するマーカー物質の検索
を行った結果、特に下等生物由来のチトクロームＣが肺
がん患者の血清抗体と高率に反応することを見出した。

なお、マーカー物質の検索には、以下の測定法を用いた
。

測定法：ヒト以外の生物由来の種々の物質を０．０５％ＦＣ８（
牛胎児血清）添加炭酸ナトリウム緩衝液（０口９．５）
で５０ｐｇ／　ｄの濃度に調整する。これを９６穴イム
ノプレートに１００ｐｉずつ分注し、３７℃で１時間処
理し、該物質をプレートにコートする。ＰＢＳ（リン酸
緩衝化生理食塩水）でプレートを２回洗浄した後、非特
異的吸着を抑えるために、１０％ＦＣ３／ＰＢＳでブロ
ッキングを１時間、３７℃で行う。その後、洗浄するこ
となく、該物質とＩｑＧクラスの血清抗体との反応性を
調べる場合には５００倍に、［＋Ｍクラスの場合には５
，０００倍に希釈した血清サンプルを５０ルずつウール
に添加し、血清中の抗体と該物質との反応を３７℃で１
時間行う。該物質と反応する抗体が血清中に存在する場
合には、その抗体が該物質と結合し、ウェルに固定され
る。ＰＢＳ／トウィーン２０でプレートを３回洗浄した
後、固定された抗体量をペルオキシダーゼ標識した抗ヒ
トＩｑＧ抗体あるいは抗ヒトＩｑＭ抗体を用い通常の酵
素抗体法により測定する。すなわち、Ｉ（ＩＧクラスの
抗体の該物質との反応性を調べる場合には、ペルオキシ
ダーゼ標識の抗ヒトＩｑＧ抗体を、１ｇＭクラスの場合
には、同酵素で標識した抗ヒトＩＣＩＭ抗体を１〜１０
ｐＨ／−の濃度に０．１％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン
添加ＰＢＳ／トウィーン２０）で希釈し、これを各ウェ
ルに１００ハずつ添加し、３７℃で３０分間反応させる
。

ＰＢＳ／１〜ウィーン２０で３回洗浄した後、ＡＢＴＳ
Ｅ２．２′−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）ニアンモニウム塩］等を含む通常
の基質溶液を１００ハずつ添加し、室温で１５分間発色
反応を行う。固定された抗体量が多い場合、すなわち血
清中に該物質と反応する抗体が多量に含まれている場合
には、強く発色する。１．５％シュウ酸溶液１００ハを
添加し、反応を停止した後、４１５ｎｍで吸光度を測定
する。

上記の該物質との反応性の測定法は、下等生物由来のチ
トクロームＣを用いた本血清診断法に同様に使用するこ
とができる。

このような方法を用いて、種々の物質と肺がん患者ある
いは健常人の血清サンプルとの反応性を調べたところ、
下等生物由来のチトクロームＣが肺がん患者血清サンプ
ルと強く反応し、健常人血清サンプルとは反応しないこ
とが明らかとなった。

すなわち、下等生物由来のチトクロームＣを用いること
により、肺がんの血清診断が高い陽性率で行えるように
なった。また、偶陽性率については低い値が得られた。

尚、本発明の血清診断法を実施する際には、例えば、以
下に示すキットを用いて行なうことが好ましい。

本キットは、９６回測定用で下記の構成品からなる。

■、キッ１へ構成品構成品１、マイクロプレート２、チトクロームＣ（２ｍｙ／ｄ）３、炭酸緩衝液（０口９．５）４、リン酸塩生理食塩５衝液用粉末５、トウビーン２０溶液６、牛胎児血清７、標準血清８、西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩＯＧ又は
抗ヒトＩ（ＪＨ抗体溶液９、ウシ血清アルブミン１０、２．２’−アジノービス（３−エチルベンゾチア
ゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム塩１１、クエン酸・リン酸緩衝液１２、反応停止液（１，５％シュウ酸溶液〉付属品１３、マイクロプレー１〜用ふた１枚３７５　Ｉｄ入り１ビン１５ｄ入り１ビン１１．３ｆ？入り１ビン２−人り１ビン１〇−人り１ビン５パ入り４ビン２０成入り２ビン２０１１ｇ入り２ビンｅＲｇ入り１ビン２０ｒｄ入り１ビン１５ｄ入り１ビン１枚以上の各構成品は、当業者には公知の方法により入手な
いし製造することができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ヒト以外の生物由来の種々の物質と肺がん患者及び健常
人の血清サンプルとの反応性を調べたところ、チトクロ
ームＱ　（Ｃａｎｄｉｄａ由来〉が肺がん患者血清中の
ＩｇＧあるいはＩｑＭクラスの抗体と反応し、健常人血
清とは反応しないことが判明したく第１表）。

次いで、種々の生物由来のチ１へクロームＣとの反応性
を調べた。これらのチトクロームＣは市販されており、
例えばシグマ社製のものを、容易に入手することができ
る。第２表に示したように、Ｃａｎｄ　ｉｄａ及び酵母
のような下等生物由来のチトクロームＣが特に肺がんの
血清診断に有効であることが判明した。

肺健病が常名第１表血ん人チトクロームＣを用いた血清診断反応性（ＯＤ４１５ｏＩ１１）清ＩｇＧ１（ＩＭ０．２４００、０８７１．３４３０．２１８０．３８５０．０４９０．２０５０．０４６０．０５３０、１５１０．０６６０．０５３０．０６４０．０４４０．０３６０．０５７０．０４５０．０５９０．０４３０．０３９実施例２ん人第２表 −３に−４５に−５５ −５ −９ −１１ −４種々の生物由来チトクロームＣを用いた血清診断反応性（ＯＤ４１５ｎｍ）ｑＧｑＭｑＧ０ｇＭ１．１３４０．３９２０．４９８１．４５６１．２３６０．０６２０．０４７０．０５６０．０４８０．０６１０．０５５０．０４３０．１４３０、２３７０．９６４０．５２９０．３２１１．５８０１．３７９０．２１６０、１５３０．１２２０．１３９０９５０．１１３０．０８８２１７０．３０４０７１０．０９８０．０８７０．０９８０．０７３０．０？２０．０８９０．０５１０．０４１０．０４００、１９６０．２９４２３９０．２２３０．１２６０．１３６０．１６７０．１０９ｏ、ｉｏ。

Ｏ，０９８Ｃａｎｄｉｄａ　ＫｒｕｓｅｔのチトクロームＣを用い
て、肺がんの組織型別に陽性率を求めた。但し、健常人
の反応性（ＯＤ　　　　＞の平均＋２８．Ｄ、以上を陽
１５ｎｌ性とした。

第３表に示したように、肺扁平上皮がん患者の血清では
５６％、肺小細胞かんでは８０％、肺大細胞かんでは１
００％と、非常に高い陽性率を示した。

肺腺がんについても３７％と高い値であった。従来のＣ
ＥＡ、ＳＣＣ，ＮＳＥなどの場合と比較し、陽性率が大
きく向上した。また、偏陽性率も５％以下（１１０サン
プルで５サンプル陽性）と低い値を示した。

第３表肺がん組織型における陽性率第４表がんの血清診断組織型サンプル数陽性率（％）扁平上皮がん小細胞がん大細胞がん腺がん実施例３本血清診断法を用いて、種々のかん患者血清の陽性率を
調べた。第４表に示したように、肺がん。

胆管がん及び食道がんで高い陽性率を示した。

病名肺がん胆管がん食道がん肝がん膵がん直腸がん胃がん結腸がん乳がん良性疾患サンプル数２陽性率（％）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）チトクロームＣを用いることを特徴とする血清診
断法。
（２）該チトクロームＣが、Ｃａｎｄｉｄａあるいは酵
母由来である請求項１記載の血清診断法。
（３）該チトクロームＣと結合する血液中の抗体量を測
定することを特徴とする請求項１又は２に記載の血清診
断法。
（４）酵素抗体法を使用することを特徴とする請求項１
ないし３のいずれか一項に記載の血清診断法。