JPH03258728A - 蛋白質製剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は医療用蛋白質製剤の製造法に関する。

より詳細には、夾雑ウィルスが実質的に除去された医療
用蛋白質製剤の製造法に関する。

［従来の技術］ ウィルスの混入している恐れのある原料から医薬品を製
造する場合があり、その製造工程中にウィルスを不活化
するか、除去するための工程を組み込むことが必要であ
る。ウィルス不活化の方法としては、液状または乾燥状
態で加熱処理を行って不活化する方法、紫外線照射によ
って不活化する方法、β−プロピオラクトン等で化学修
飾して不活化する方法等が知られている。また、ウィル
スを除去する方法としては、ウィルス粒子の大きさに着
目し、一定のポアサイズをもった膜で除去する方法、ポ
リエチレングリコールのように分子量の大きなもので沈
澱除去させることによって除去する方法がある。

［発明が解決しようとする課題］ ところで、現在医療上特に問題となっているウィルスは
、ＨＩＶ　（エイズウィルス）、ＨＢウィルス、非Ａ非
Ｂ肝炎ウィルス等の脂質膜を有するウィルスであり、こ
れらウィルスはいずれも蛋白質製剤、特に血漿蛋白質製
剤、尿由来製剤においてその夾雑が危惧され、上記の処
理によっては当該ウィルスは十分に不活化ないしは除去
することができないのが実情である。

従って、本発明の目的は当該ウィルスを蛋白質製剤から
、効率的に、かつ有効に除去することによって安全な医
療用蛋白質製剤を提供することである。

［課題を解決するための手段］ 上記目的は本発明、すなわち医療用蛋白質製剤の製造に
際して、ウィルスを夾雑する可能性がある蛋白質を陽イ
オン交換体によって処理することによって達成される。

以下、本発明をより詳細に説明する。

（１）出発原料 本発明が適用される出発原料は、当該ウィルスの夾雑が
危惧される蛋白質であり、例えば人血漿蛋白質、尿由来
蛋白質等が例示される。人血漿蛋白質としては、例えば
血液凝固因子、免疫グロブリン、トロンビン、プラスミ
ノーゲン等が例示され、尿由来蛋白質としては、例えば
、ウロキナーゼ、ウロキナーゼ前駆体、リゾチーム等が
例示されるが、本発明の処理対象はこれら蛋白質に限定
されるものではなく、広く当該ウィルスの夾雑が危惧さ
れる蛋白質である。

本発明の処理は、蛋白質製剤の製造工程の任意の工程に
おいて実施すればよいが、効率上、最終工程付近で行う
ことが好ましい。

■対象とされるウィルス 本発明において除去の対象とされるウィルスは、具体的
にはＶＳＶ、ヘルペスシンプレックス、ＣＨＶ、シンド
ビス、ムンプス、ワクチニア、Ｍｅａｓｌｅ％Ｒｕｂｅ
ｌｌａ　ｓインフルエンザ、ヘルペスシスター、サイト
メガロ、パラ−インフルエンザ、ＥＢ、ＨＩ　Ｖ、ＨＡ
ＳＨＢ、ＮＡＮＢＳＡＴＬ。

ＥＣＨＯ，バルポ等が例示される。

Ｇ）陽イオン交換体 本発明で使用される陽イオン交換体は、陽イオン交換基
をリガントとして有する担体であれば特に限定されない
。

陽イオン交換基としては、スルホン酸プロピル（ＳＰ）
、カルボキシメチル（ＣＭ）等が例示される。また、担
体としては、デキストラン（商品名セファデックス等）
、アガロース（商品名セファロース等）等が例示される
。陽イオン交換体の具体的な例としては、例えばＳＰ−
セファデックス■、ＣＭ−セファデックス＠（いずれも
ファルマシア社製）、５Ｐ−）ヨバール０、ＴＳＫｇｅ
ＩｓＰ−５ＰＷ■（いずれも東ソー社製）等が挙げられ
る。

（４）処理条件 （ａｌ前処理 本発明の陽イオン交換体による処理を行うに際しては、
当該処理前に、陽イオン交換体に対して前処理が行われ
ていることが好ましい。当該前処理としては、通常、緩
衝液による処理が例示される。前処理緩衝液としては、
具体的には食塩水、リン酸緩衝液等が例示され、より具
体的には前記緩衝液にて０．０１〜０．５Ｍ、特に好ま
しくは０．０５〜０．２Ｍの濃度で、ｐＨ５〜８、好ま
しくはｐＨ５，５〜７にて前もって平衡化された陽イオ
ン交換体が使用される。

（ｂ）処理条件 処理対象である蛋白質は上記（田と同様の緩衝液にて調
整し、（ａ）の平衡化処理した陽イオン交換体にアプラ
イする。次いで、（ａｌと同様の緩衝液で洗浄する。

その後、塩濃度０．０１〜０．５Ｍ、好ましくは０．０
５〜０．２Ｍ、ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ６，７〜
８．５の緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム、リン酸緩
衝液、トリス緩衝液等で目的とする蛋白質を溶出し、回
収する。なお、溶出条件は目的とする蛋白質に応じて適
宜設定することができる。

また、本発明の陽イオン交換体による処理はバッチ法、
カラム法のいずれの方法にても行うことができる。

（５）精製 回収された蛋白質は、必要に応じて、さらに公知の方法
により精製を行ってもよい。かかる精製方法としては、
例えばアフィニティークロマト処理等が例示される。

斯くして処理された蛋白質は、常套手段により製剤化さ
れ、蛋白質製剤に調製される。

［効果］ 本発明の方法は簡便であり、また本発明の処理により、
蛋白質製剤からウィルスが効率的にかつ、有効に除去さ
れる。

従って、本発明によれば安全な医療用蛋白質製剤が提供
される。

［実施例コ 本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、
本発明はこれらによって同等限定されるものではない。

実施例１ 正常人血漿から、塩化バリウム吸着法とＤＥＡＥ−セフ
ァデックス　カラムクロマトグラフィー法［バジャ、ニ
ス、ピーら、ジャーナル　オブバイオロジカル　ケミス
トリー（Ｂａｊａｊ、　Ｓ、　Ｐ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、）　２
４８．７７２９　（１９７３）］によりプロトロンビン
を精製し、このプロトロンビンに人胎盤より調製したト
ロンボプラスチン、人血漿及び塩化カルシウム液を加え
、トロンビン変換して、粗製トロンビン（１ｍｇ蛋白当
たりのトロンビン活性ＩＯ単位）を得た。この粗製トロ
ンビンを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で調整し
た。

一方、ｓｐ−セファデックス（ゲル容量：１．０Ｉｆ）
も同じ緩衝液で平衡化した後に粗製トロンビン溶液（１
０１ｆ）をアプライした。同じ緩衝液で洗浄した後に０
．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６，７）でトロンビン
を溶出し、回収した。

各画分におけるＶＳＶ及びＥＣＨＯウィルスの量を測定
した。ウィルス量は感染価を指標とした。

ｖＳｖは宿主としてＦＬ細胞を用い、プラーク形成法に
より、またＥＣＨＯウィルスは宿主としてＨｅ１ａ細胞
を用い、細胞変性効果観察法により感染価を測定した。

その結果を第１表に示す。第１表に示されるように、溶
出画分中のウィルス量は著しく減少していることが判明
した。

実施例２ 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をｐＨ５，５
に調整した後、ＣＭ−セファデックスＣ〜５０に接触さ
せた。０．１８Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，５）でカラム
を洗浄した後、０．１１３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，５
）で吸着していたウロキナーゼ前駆体を溶出させた。

本ウロキナーゼ前駆体中のＶＳＶ及びＥ　Ｃ）（Ｏウィ
ルスの夾雑量は検出限界以下であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 医療用蛋白質製剤の製造法において、ウィルスを夾雑す
   る可能性がある蛋白質を陽イオン交換体によって処理す
   る工程を含むことを特徴とするウィルスの実質的に除去
   された医療用蛋白質製剤の製造法。