JPH03259083A - 生体触媒の固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体触媒を水分散性光硬化性樹脂を用いて粒
状成形物として固定化する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

固定化される生体触媒として動物細胞、植物細胞、微生
物菌体、酵素等・が挙げられる。特に動物細胞への適用
が好ましい。

従来から、生体触媒を種々高分子で固定化し、有用物質
を生産する試みがなされてきたが、生体触媒との親和性
の高い固定化用高分子が少なく、実用化する事が困難で
あった。

以下、動物細胞を一例として、従来の技術を説明する。

動物細胞を液体培地中で培養し、多くの有用物質を生産
しようとする動きが活発で一部工業化されはじめた。

動物細胞の培養方法としては、動物細胞を液体培地中に
単純に懸濁しておこなう培養法の他に、水性ゲル中に動
物細胞を包括固定化し、これを液体培地中で培養してゲ
ル中で増殖させる、いわゆるゲル包括固定化培養法が知
られている。後者の方法は、培養中、機械的にあるいは
液性の変化に脆弱な動物細胞をゲル層により保護できる
し、かつ、培地の交換または培養後の目的生産物の分離
精製に際して必要な細胞と液との固液分離が極ｔで有利
になる等、多くの利点を有すると共に、バイオリアクタ
ーに充填して連続的に目的物質を生産することが可能に
なるなど、工業的な生産システム化が容易になる。この
ため、動物細胞の固定化材や固定化方法の研究が大いに
進められている。

動物細胞が脆弱なため、この細胞を固定化するゲルにア
ルギン酸、カラギーナン、マンナン、ゼラチンなどの天
然物が多く用いられているけれどもゲル強度の持続性に
乏しいことから未だ工業的な利用に至らず、持続性向上
を目指す研究が盛んにおこなわれている。例えばアルギ
ン酸で動物細胞を包括固定する際の塩類を変えてゲル強
度の持続性を向上させること、動物細胞固定化ゲルがリ
アクター内で流動して破損するのを防止すること、アル
ギン酸ゲルで動物細胞を包括後、ゲル表面に合成高分子
膜を形成して強度を保つこと、などがその例である。そ
こで、動物細胞を工業的に可能な単純な方法で包括固定
でき、かつ、使用上安定なゲルを形成する方法が待ち望
まれていた。

〔発胡が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、上記従来法の問題点を解決し、ゲル中
で増殖して形成される動物細胞集落中の細胞を失活させ
ずに収率よく、かつ長期に目的物を生産するゲル包括固
定化法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

しかして、本発明に従えば、スチルバゾリウム基を光架
橋性基として有する天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化
物とのグラフト化物および生体触媒を含んでなる液状組
成物を塩類を含有する水性媒体に滴下して該液状組成物
を粒状にゲル化させ、次いで得られる粒状ゲルに活性光
線を照射して天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化物との
グラフト化物を硬化させることを特徴とする動物細胞の
粒状固定化法が提供される。

以下、本発明の詳細な説明する。

液状組成物の調製 本発明に用いるスチルバゾリウム系光硬化性樹脂の主骨
格は天然高分子とボｒノ酢酸ビニルケン化物とのグラフ
ト化物であり、天然高分子の導入率は、ポリ酢酸ビニル
ケン化物１００重量部に対して、天然高分子が１〜２０
００重量部である事が好ましい。

天然高分子として、コラーゲン、ゼラチン、カゼイン、
澱粉、セルロース、アラビアゴム、タラカントガム、カ
ラギーナン、マンナン、デキストリン、アルギン酸、お
よび、これら天然高分子誘導体を例示する事ができる。

これ等のうち、ゼラチン、コラーゲン等は動物由来であ
るので好ましい。

天然高分子は、本来、生体触媒との親和性が良く、ポリ
酢酸ビニルケン化物に天然高分子をグラフトさせる事に
よって、生体触媒固定化時の細胞が受ける損傷を少なく
できると共に、培養することによりゲル担体内での細胞
の増殖を著しく改善することができる。

従って、天然高分子の導入率を余り小さくするとその効
果が小さくなり、また導入率が２０００重量部を越える
とポリ酢酸ビニルケン化物含量が相対的に低下すること
になり、ポリ酢酸ビニルケン化物に付加可能なスチルバ
ゾリウム基の濃度が減少するため、光照射してゲルを形
成せしめる際の光官能基密度が低下するので強度の大き
い生体触媒包括ゲルを得難い。

天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化物とをグラフト化し
て一体化する方法は、天然高分子とポリ酢酸ビニルケン
化物の水酸基、カルボキシル基、アミン基等の官能基を
利用して直接結合させてもよいし、グルタルアルデヒド
などの架橋剤を用いて結合させてもよいし、あるいは、
天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化物との混合物を保護
コロイド剤として、酢酸ビニル等の重合性モノマーを重
合する事によって、簡接的に一体化してもよい。

本光硬化性樹脂に付加される光架橋性のスチルバゾリウ
ム基は、光硬化性樹脂の主骨格である天然高分子とポリ
酢酸ビニルケン化物とのグラフト化物中に含まれるポリ
酢酸ビニルケン化物１００重量部当り５〜１００重量部
が好ましい。スチルバゾリウム基の付加率が小さくなる
と光照射による反応率が低下するため、ゲル強度が小さ
くなると共に、未反応の低分子樹脂組成物がゲル中に残
存するため、包括固定した生体触媒に悪影響をおよぼす
。また、余り多く付加させると光硬化性樹脂の性質も変
化するし、経済性を損うことにもなる。

このようにして合成したスチルバゾリウム系光硬化性樹
脂は、溶剤分別などの手法を用いて精製してもよいし、
そのま−生体触媒固定化に供してもよい。溶剤分別など
の手法を用いた場合は、その溶剤が光硬化性樹脂中に残
存しないように十分除去して、生体触媒に悪影響を及ぼ
さないようにする必要がある。

本発胡の方法により固定化しうる生体触媒の種類には特
に制約はないが、生体触媒としては、動物および植物の
細胞、微生物菌体、酵素などがあげられる。このうち動
物および植物の細胞としては、正常ｍ胞、腫瘍細胞であ
ってもよいし、細胞融合法、細胞工学的手法、遺伝子操
作法などの方法により細胞自身の物質生産能を増強した
ハイブリドーマであってもよい。微生物菌体としては、
酵母、細菌、かび、放線菌、担子菌などすべての微生物
があげられるが、特に、酵母において、パン酵母、ワイ
ン酵母、清酒酵母、シゾサツカロミセス・ボンベ、ロド
トルラ・グルチニスなどが具体的にあげられる。

また酵素としては、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ
、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペクチナー
ゼ、リゾチーム、ナリンジナーゼ、ヘスペリジナーゼ、
アントシアナーゼ、アミノアシラーゼ、ウレアーゼ、イ
ンベルターゼ、メリビアーゼ、デキストラーゼ、ベプチ
ターゼ、リボヌクレアーゼ、ラクターゼのような加水分
解酵素、グルコースオキシターゼ、ウリカーゼ、カタラ
ーゼ、リポキシゲナーゼ、チトクロムＣ１ペルオキシダ
ーゼのような酸化還元酵素、グルコースイソメラーゼの
ような異性化酵素、シクロデキストリングルコ−ジルト
ランスフェラーゼ、トランスアミナーゼのような転移酵
素、アスパルターゼ、ヒアロウロンダーゼ、コンドロイ
チナーゼ、ペクチンエリミナーゼのような脱離酵素など
があげられる。

これらの生体触媒と上記したスチルバゾリウム系光硬化
性樹脂液を混合して液状組成物が調製される。該液状組
成物には、さらに、アルギン酸ナトリウム水溶液を加え
ることができ、それによって塩類水性媒体に滴下した際
の粒状成形性向上の効果を得ることができる。アルギン
酸ナトリウムの添加量は光硬化性樹脂に対して固形分基
準で１〜５０％が好ましい。かくして得られる液状組成
物中の初期生体触媒の細胞濃度は１０４〜ＩＱ’ｃｅｌ
ｌｓ／−が好ましい。

粒状化 スチルバゾリウム基を光架橋性基として導入した天然高
分子とポリ酢酸ビニルケン化物とのグラフト化物と生体
触媒で調製された液状組成物は、次いで、無機塩あるい
は有機塩を含有する水性媒体に滴下することにより粒状
にゲル化される。

上記水性媒体中に含ませうる無機塩あるいは有機塩とし
ては、０．００１〜５モル／β、好まシ＜ハ０．０５〜
０．５モル／ｌの濃度範囲で水性媒体中に存在すれば、
塩類の価数等に制限されることなくいずれの塩類であっ
てもよい。

具体的には、無機塩として、アルカリ金属系のナトリウ
ム、カリウム、アルカリ土類金属系のカルシウム、バリ
ウム、その他アルミニウム、第２鉄等とのハロゲン化物
、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、あるいは硝酸塩などを
挙げることができ、これらの中で好適なものはアルカリ
金属系の塩である。また、これら無機塩は１種類で用い
てもよいし、２種類以上の混合液として用いても良く、
天然海水、人工海水も使用することができる。

また、有機塩としては、臭化テトラ−ｎ−ブチルアンモ
ニウムなどのオニウム塩や、塩酸アニリン、塩酸ピペリ
ジン、硫酸ヒドラジン、硫酸フェニルヒドラジンなどを
挙げることができる。

また、光架橋性の天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化物
とのグラフト化物、アルギン酸ナトリウムおよび生体触
媒を含んでなる液状組成を無機塩を含有する水性媒体に
滴下することにより粒状にゲル化させる場合は、上記無
機塩を含有する水性媒体を用いろるけれども、これらの
中で好適なものはアルカリ土類金属系の塩類である。

か５る無機塩あるいは有機塩を含有する水性媒体中への
前記液状組成物の滴下は、例えば、注射針のような先の
細い管の先端から該液状組成物を滴下する方法、遠心力
を利用して該液状組成物を粒状に飛散させる方法、スプ
レーノズル先端から、該液状組成物を霧化して粒状とし
て滴下する方法などによりおこなうことができる。滴下
する液滴の大きさは、最終の粒状固定化物に望まれる粒
径に応じて変えることができるが、通常は前記した理由
により直径が０．５〜５ｍｍの範囲が好ましい。

以上、生体触媒を粒状化固定担体に固定する方法の他に
、本発明のスチルバゾリウム基を光架橋性基として有す
る天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化物とのグラフト化
物を利用した膜に、生体触媒を固定化する方法も有用で
ある。

光硬化 上記の如くして生成せしめた粒状ゲルは、そのま５水性
媒体中に分散させた状態で、あるいは水性媒体から分離
した状態で活性光線を照射することにより、該粒状ゲル
中の天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化物とのグラフト
化物に付加したスチルバゾリウム基によって架橋硬化せ
し約る。これにより粒状ゲルは水に不溶な粒状固定化物
となる。

上記の光硬化に使用する活性光線の波長は、生体触媒に
悪影響を与える波長領域、つまり約３２０ｎｍ以下の光
を除くことが望ましい。そのような光源の例としては、
低圧水銀灯、高圧水銀灯、蛍光灯、キセノンランプ、太
陽光等が上げられる。光照射時間は光源の光の強さ、光
源からの距離等に応じて変える必要があるが、一般には
１〜５分間の範囲内とすることができる。そして、生成
せしめた全粒状ゲルに活性光線が出来るだけ満遍なく行
きわたるようにすべきである。

このように照射処理が終った粒状ゲルは水あるいは、緩
衝水溶液で洗浄し、そのま５保存に供したり、あるいは
、たゾちに培養に供したりすることができる。

実施例１ ゼラチン［ゼリー強度（６，６６％水溶液）２５９　ｇ
、粘度（６，６６％水溶液）４２ｍｐｓ、分子量１０万
コとポリ酢酸ビニルケン化物（ケン化度８８モル％、重
合度１４００）との混合物を保護コロイドとして常法通
り酢酸ビニルを重合して得られるポリ酢酸ビニルエマル
ジョン水溶液（ゼラチン／ポリ酢酸ビニルケン化物の重
量比：　１５／８５、固形分中の保護コロイド剤の固形
分重量比率：５０％、固形分濃度＝１５％）１００ｇに
Ｎ−メチル−４−（Ｐ−ホルミルスチリル）ピリジニウ
ムメト硫酸塩２ｇを溶解し、常法通り付加縮合させるこ
とによって感光性エマルジョンを合成した。前記感光性
エマルジョン２０重量部にヒト白血球由来のＲＰＭＩ８
２０４細胞懸濁液を１０重量部加えて、細胞濃度７ＸＩ
Ｏ’セル／ｒｄの混合液とした。該混合液を注射器に入
れ、注射器を振動させながら０．０５モル食塩水中に滴
下して粒状化し、これに３００〜４００ｎｍを主波長と
する光を２分間照射して、粒径１．５　ｍｍの粒状ゲル
を得た。この固定化動物細胞を２０個とり、ＲＰＭｆ１
６４０培ｍ＋：１０％Ｆｃｓ添加した培地１０ｄに加え
て３７℃で培養した。培養２日間で培地中のグルコース
は１．８ｇ／Ａより０．８ｇ／βに減少した。

実施例２ 実施例１で示した感光性エマルジョン２０重量部に１％
アルギン酸ナトリウム４０重量部を加えてよく混合する
。この混合樹脂液にモノクロナール抗体生産性のマウス
ハイブリドーマ１６−３Ｆ株を加えて混合し、細胞濃度
２Ｘ１０６セル／ｍｌの混合液とした。該混合液を注射
器より０．１モル塩什カルシウム水溶液中に滴下して粒
状化し、これに３００〜４００ｎｍを主波長とする光を
３分照射した。生成した粒状固定化細胞を０．１Ｍクエ
ン酸す）　ＩＪウムに移し、−夜冷蔵置保存した。この
粒状固定化細胞を２４個とり、ＤＦ　−ＩＴＥＳ培地８
培地８加ｆて２日毎に培地交換をおこなった。培養２２
日で粒状ゲル中のセル濃度はｌＸｌＯ７個／ｒｎｌゲル
となり、生成した培養液の抗体価は２００であった。

比較例１ ポリ酢酸ビニルケン化物（ケン化度８８モル％、重合度
１４００）を保護コロイドとして常法通り酢酸ビニルを
重合して得られるポリ酢酸ビニルエマルジョン水溶液（
固形分中の保護コロイド剤の固形分重量比率：５０％、
固形分濃度：１５％ＨＯＯ，ｇにＮ−メチル−４−（Ｐ
−ホルミルスチリル）ピリジニウムメト硫酸塩２ｇを溶
解し、常法通り付加縮合させることによって感光性エマ
ルジョンを合成した。前記感光性エマルジョン２０重量
部にヒト白血球由来のＲＰＭＩ８２０４細胞懸濁液を１
０重量部加えて、細胞濃度７Ｘ１０５セル／−の混合液
とした。該混合液を注射器に入れ、注射器を振動させな
がら０．０５モル食塩水中に滴下して粒状化し、これに
３００〜４００ｎｌＴｌを主波長とする光を２分間照射
して、粒径１．５ｍ＋ｎの粒状ゲルを得た。この固定化
動物細胞を２０個とり、ＲＰＭ１１６４０培地に１０％
ＦＣ３添加した培地１０ｍ１に加えて３７℃で培養した
。培養２日間で培地中のグルコースは当初の１８ｇ／ｌ
からほとんど変化しなかった。

比較例２ 実施例１で使用したゼラチンを保護コロイドとして常法
通り酢酸ビニルを重合して得られるポリ酢酸ビニルエマ
ルジョン水溶液（固形分中の保護コロイド剤の固形分重
量比率＝５０％、固形分濃度：１５％ＨＯＯｇにＮ−メ
チル−４−（Ｐ−ホルミルスチリル）ピリジニウムメト
硫酸塩２ｇを溶解し、常法通りの付加縮合反応操作を行
った。しかし、同反応液には、光架橋性はなかった。

比較例３ ２％アルギン酸ナトリウムを１％塩化カルシウムからな
る水性媒体に注射針から滴下し、径が約２ｍｍの粒状ゲ
ルを作成した。底部より無菌空気を通気しうる内容積１
００＋ｄ！のバイオリアクターにＢＭＥ培地７０ｍ１を
入れておき、上記粒状ゲルを約１〇−添加して通気流動
させた。温度３７℃で２４時間流動させたところ、粒状
ゲルがＢＭＥ培地に溶解した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スチルバゾリウム基を光架橋性基として有する天然
   高分子とポリ酢酸ビニルケン化物とのグラフト化物およ
   び生体触媒を含んでなる液状組成物を無機塩類あるいは
   有機塩類を含有する水性媒体に滴下して前記液状組成物
   を粒状にゲル化させ、次いで得られる粒状ゲルに活性光
   線を照射して天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化物との
   感光性グラフト化物を硬化させることを特徴とする生体
   触媒の粒状固定化法。 ２、前記液状組成物がスチルバゾリウム基を光架橋性基
   として有する天然高分子とポリ酢酸ビニルケン化物との
   グラフト化物、アルギン酸ナトリウムおよび生体触媒を
   含有することを特徴とする請求項１記載の生体触媒の粒
   状固定化法。