JPH03264596A - ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 - Google Patents
ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法Info
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- JPH03264596A JPH03264596A JP2064620A JP6462090A JPH03264596A JP H03264596 A JPH03264596 A JP H03264596A JP 2064620 A JP2064620 A JP 2064620A JP 6462090 A JP6462090 A JP 6462090A JP H03264596 A JPH03264596 A JP H03264596A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、良好な保存安定性を有するα−アミラーゼ活
性測定用基質として用いることができる新規なガラクト
シル−マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびそれを
用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
性測定用基質として用いることができる新規なガラクト
シル−マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびそれを
用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
ヒトの体液、例ば唾液、膵液、血液、尿等に含まれるα
−アミラーゼの活性を測定することは、臨床診断上極め
て重要である。例ば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎の際には
、血液や尿中のα−アミラーゼ活性が著るしく上昇する
ことが知られており、α−アミラーゼ活性が臨床診断上
の重要な指標となっている。
−アミラーゼの活性を測定することは、臨床診断上極め
て重要である。例ば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎の際には
、血液や尿中のα−アミラーゼ活性が著るしく上昇する
ことが知られており、α−アミラーゼ活性が臨床診断上
の重要な指標となっている。
α−アミラーゼ活性測定の方法としては、各種の方法が
知られているが、近年では構造の明確なマルトオリゴ糖
またはマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いる方法が
主流になりつつある。
知られているが、近年では構造の明確なマルトオリゴ糖
またはマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いる方法が
主流になりつつある。
この方法では、マルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘
導体を基質として用い、α−アミラーゼの共役酵素であ
るα−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダー
ゼの存在下に、α−アミラーゼを含有する検体を反応さ
せ、生成するグルコースまたはオリゴ糖等の還元末端か
ら遊離するアグリコン（例えばｐ−二トロフェノール等
）の吸収スペクトルを測定することによって、α−アミ
ラーゼ活性を測定する。
導体を基質として用い、α−アミラーゼの共役酵素であ
るα−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダー
ゼの存在下に、α−アミラーゼを含有する検体を反応さ
せ、生成するグルコースまたはオリゴ糖等の還元末端か
ら遊離するアグリコン（例えばｐ−二トロフェノール等
）の吸収スペクトルを測定することによって、α−アミ
ラーゼ活性を測定する。
しかしながら、α−グルコシダーゼ等の共役酵素は、α
−アミラーゼの反応に関係なく、少しずつ基質を分解す
るという欠点を有している。したがって、このような共
役酵素法は、測定液が不安定でブランク値が上昇するた
め、調製した測定液の保存が困難であった。この共役酵
素法の欠点を解決するため、マルトオリゴ糖またはマル
トオリゴ糖の非還元末端のグルコースを修飾し、共役酵
素の作用受けないようにした基質を用いることが試みら
れている。
−アミラーゼの反応に関係なく、少しずつ基質を分解す
るという欠点を有している。したがって、このような共
役酵素法は、測定液が不安定でブランク値が上昇するた
め、調製した測定液の保存が困難であった。この共役酵
素法の欠点を解決するため、マルトオリゴ糖またはマル
トオリゴ糖の非還元末端のグルコースを修飾し、共役酵
素の作用受けないようにした基質を用いることが試みら
れている。
非還元末端のグルコース残基を置換基によってブロック
することにより、α−グルコシダーゼ等の共役酵素の作
用を受けない安定な基質となり、このような基質を用い
ると、ブランク値の上昇が殆ど見られない安定なα−ア
ミラーゼ活性測定試液を調製することができる。
することにより、α−グルコシダーゼ等の共役酵素の作
用を受けない安定な基質となり、このような基質を用い
ると、ブランク値の上昇が殆ど見られない安定なα−ア
ミラーゼ活性測定試液を調製することができる。
例えば、非還元末端のグルコースをカルボキシメチル基
あるいはアミノピリジル基で修飾したマルトオリゴ糖を
基質として用いる方法が知られている（特開昭５９−３
１６９９、同５９−５１８００および同６ｌ−８３１Ｌ
５）。しかし、これらの基質の調製法は、極めて複雑な
工程を必要とする。
あるいはアミノピリジル基で修飾したマルトオリゴ糖を
基質として用いる方法が知られている（特開昭５９−３
１６９９、同５９−５１８００および同６ｌ−８３１Ｌ
５）。しかし、これらの基質の調製法は、極めて複雑な
工程を必要とする。
例えばデキストリンやアミロースを構成するグルコース
を部分的に化学修飾した後、液化型アミラーゼとグルコ
アミラーゼを作用させて非還元末端のグルコースが修飾
されたマルトオリゴ糖の混合物を得、この混合物をカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、非還元末端が修飾
された所望の重合度のマルトオリゴ糖誘導体を得る。さ
らに、このようにして得られた非還元末端が修飾された
マルトオリゴ糖誘導体とｐ−ニトロフェニルグルコシド
等にサイクロデキストリングルカノランスフェラーゼを
作用させ、次いでカラムクロマ１〜グラフイーを行い、
非還元末端が修飾され、還元末端に発色団が結合した目
的とする重合度のマルトオリゴ糖誘導体を分取する。こ
のため、非還元末端を修ｆｉｓ＋ シたマルトオリゴ糖
誘導体の収率が低く実用的でなかった。
を部分的に化学修飾した後、液化型アミラーゼとグルコ
アミラーゼを作用させて非還元末端のグルコースが修飾
されたマルトオリゴ糖の混合物を得、この混合物をカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、非還元末端が修飾
された所望の重合度のマルトオリゴ糖誘導体を得る。さ
らに、このようにして得られた非還元末端が修飾された
マルトオリゴ糖誘導体とｐ−ニトロフェニルグルコシド
等にサイクロデキストリングルカノランスフェラーゼを
作用させ、次いでカラムクロマ１〜グラフイーを行い、
非還元末端が修飾され、還元末端に発色団が結合した目
的とする重合度のマルトオリゴ糖誘導体を分取する。こ
のため、非還元末端を修ｆｉｓ＋ シたマルトオリゴ糖
誘導体の収率が低く実用的でなかった。
また、発色団の結合したマルトオリゴ糖誘導体の非還元
末端のグルコースを化学修飾する方法が知られている（
特開昭６０−５４３９５、同６０８７２９７、同６０−
２３７９９８、同６１６３２９９、同６３−３０１８９
２、特開平１１５７９９６）。これらはマルトオリコ゛
専唐言秀導体の非還元末端のグルコースに、例えばベン
ジリデン基、エチリデン基、イソプロピリデン基、ハロ
ゲン、アルキル基、フェニル基、ベンジル基、ケトブチ
リデン基等の置換基を導入した基質を用いるものである
。しかし、これらの非還元末端を特異的に修飾する化学
的合成法は、例えばアセチル化、脱アセチル化等の工程
が必要となる等、工程が複雑で収率が低いという欠点が
あった。
末端のグルコースを化学修飾する方法が知られている（
特開昭６０−５４３９５、同６０８７２９７、同６０−
２３７９９８、同６１６３２９９、同６３−３０１８９
２、特開平１１５７９９６）。これらはマルトオリコ゛
専唐言秀導体の非還元末端のグルコースに、例えばベン
ジリデン基、エチリデン基、イソプロピリデン基、ハロ
ゲン、アルキル基、フェニル基、ベンジル基、ケトブチ
リデン基等の置換基を導入した基質を用いるものである
。しかし、これらの非還元末端を特異的に修飾する化学
的合成法は、例えばアセチル化、脱アセチル化等の工程
が必要となる等、工程が複雑で収率が低いという欠点が
あった。
このように非還元末端が修飾されたマルトオリゴ糖誘導
体を調製することは容易ではなく、このためこれらの基
質を用いたα−アミラーゼ活性の測定法を実用化するこ
とも容易ではなかった。
体を調製することは容易ではなく、このためこれらの基
質を用いたα−アミラーゼ活性の測定法を実用化するこ
とも容易ではなかった。
そこで本発明の目的は、共役酵素を用いるαアミラーゼ
測定法に基質として用いた場合に、共役酵素によって分
解されることがなく、かつ製造が容易な新規なマルトオ
リゴ糖誘導体を提供することにある。
測定法に基質として用いた場合に、共役酵素によって分
解されることがなく、かつ製造が容易な新規なマルトオ
リゴ糖誘導体を提供することにある。
さらに本発明の目的は、上記新規なマルトオリゴ糖誘導
体の製造法及びこの誘導体を用いたαアミラーゼ活性測
定法を提供することにある。
体の製造法及びこの誘導体を用いたαアミラーゼ活性測
定法を提供することにある。
本発明の新規マルトオリゴ糖誘導体は、一般式（１）
（式中、ＸＩ及びＸ２の少なくとも一方はガラクトシル
基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または
置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の
整数を示す。）で示されるガラクトシル−マルトオリゴ
糖誘導体である。
基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または
置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の
整数を示す。）で示されるガラクトシル−マルトオリゴ
糖誘導体である。
以下本発明について詳説する。
一般式（１）中、Ｘ、及びＸ２は、いずれか一方がガラ
クトシル基であるか、あるいは両方ともがガラクＩ・シ
ル基である。Ｘｌ及びＸ２の一方のみがガラクトシル基
である場合、他方は水素原子である。又、Ｒで示される
置換フェニル基は、αアミラーゼの共役酵素であるグル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼまたはβ−グルコシ
ダーゼによって色素を遊離するものであればいずれでも
よい。例えば４−ニトロフェニル基、２−クロロ４−ニ
トロフェニル基、２．４−ジクロロフェニル基等を挙げ
ることができる。これらの配糖体のアグリコン部の結合
様式はα体、β体いずれでも良い。
クトシル基であるか、あるいは両方ともがガラクＩ・シ
ル基である。Ｘｌ及びＸ２の一方のみがガラクトシル基
である場合、他方は水素原子である。又、Ｒで示される
置換フェニル基は、αアミラーゼの共役酵素であるグル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼまたはβ−グルコシ
ダーゼによって色素を遊離するものであればいずれでも
よい。例えば４−ニトロフェニル基、２−クロロ４−ニ
トロフェニル基、２．４−ジクロロフェニル基等を挙げ
ることができる。これらの配糖体のアグリコン部の結合
様式はα体、β体いずれでも良い。
一般式（１）中のｎは２〜５のいずれの整数でもよい。
ただし、基質として使用する場合の氷解様子を考慮する
と、ｎは３又は５であることが特に好ましい。
と、ｎは３又は５であることが特に好ましい。
上記の本発明の新規なマルトオリゴ糖は、酵素の転移反
応を利用した新規な方法により得られる。
応を利用した新規な方法により得られる。
この方法はガラクトシル残基をもつ糖をドナーとし、マ
ルトオリゴ糖誘導体をアクセプターとする糖転移反応を
α−またはβ−ガラクトシダーゼを用いて行うことによ
り、目的とする新規マルトオリゴ糖誘導体を合成するも
のである。
ルトオリゴ糖誘導体をアクセプターとする糖転移反応を
α−またはβ−ガラクトシダーゼを用いて行うことによ
り、目的とする新規マルトオリゴ糖誘導体を合成するも
のである。
以下この方法について説明する。
［ガラクトシル残基を持つ糖」は以下の一般式％式％
残基またはガラクトースの重合体を示す）「ガラクトシ
ル残基をもっ糖」としては、例えばラクトース、メリビ
オース、ラフィノース、スタキオース、ガラクタン等を
挙げることができる。
ル残基をもっ糖」としては、例えばラクトース、メリビ
オース、ラフィノース、スタキオース、ガラクタン等を
挙げることができる。
好ましくは三糖であるラクトース、メリビオース等を挙
げることができ、特に工業的生産を考慮した場合、安価
で入手可能なラクトースが適当である。
げることができ、特に工業的生産を考慮した場合、安価
で入手可能なラクトースが適当である。
アクセプターとして用いられるマルトオリゴ糖誘導体は
、以下の一般式（２）で表わされる。
、以下の一般式（２）で表わされる。
（式中のＲ及びｎは一般式（１）のそれと同義である）
式（２）で示される化合物の具体例としては、マルトオ
リゴ糖（Ｒ＝Ｈ）として、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス等を例示できる。
リゴ糖（Ｒ＝Ｈ）として、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス等を例示できる。
Ｒがフェニル基であるものとして、フェニル−α−マル
トシド、フェニル−α−トリオシト、フェニル−α−テ
トラオシド、フェニル−α−ペンタオシド、フェニル−
α−へキサオシド、フェニル−α−へブタオシドを例示
できる。Ｒが置換フェニル基であるものとして、ｐ−ニ
トロフェニル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル−
α−トリオシト、ｐ−ニトロフェニル−α−ペンタオシ
ド、ｐ−ニトロフェニル−α−へキサオシド、ｐニトロ
フェニル−α−へブタオシドを例示できる。
トシド、フェニル−α−トリオシト、フェニル−α−テ
トラオシド、フェニル−α−ペンタオシド、フェニル−
α−へキサオシド、フェニル−α−へブタオシドを例示
できる。Ｒが置換フェニル基であるものとして、ｐ−ニ
トロフェニル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル−
α−トリオシト、ｐ−ニトロフェニル−α−ペンタオシ
ド、ｐ−ニトロフェニル−α−へキサオシド、ｐニトロ
フェニル−α−へブタオシドを例示できる。
本発明において使用されるα−またはβ−ガラクトシダ
ーゼはガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離
する酵素として知られでいる。本発明ではドナーとして
ラクトース等のβ−ガラクトシドを用いる場合はβ−ガ
ラクトシダーゼを、ドナーとしてメリビオースまたラフ
ィノース等の１ ２ α−ガラクトシドを用いる場合はα−ガラクトシダーゼ
を使用する。本発明では、いずれの起源のβ−ガラクト
シダーゼを用いてもよいが、具体的には旧ｏ１ａｃｔａ
（大和化成■） 、Ｌａｃｔａｓｅ Ｆ “アマノ
″ （人好製薬＠） 、Ｌａｃｔａｓｅ Ｙ−ＡＯ（＠
ヤクル）） 、Ｌａｃｔａｓｅ Ｐ （ケト・アイ化
成■）等を用いることができる。また、α−ガラクトシ
ダーゼも、いずれの起源のものを用いてもよい。具体的
にはモルチェレラ ビナセア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ｖｉｎａｃｅａ）またはアブシディア レフレキア（
＾ｂｓｉｄｉａｒｅｆ Ｉｅｘａ）起源α−ガラクトシ
ダーゼ（北海道糖果■）、グリーンコーヒー豆（Ｇｒｅ
ｅｎ Ｃｏｆｆｅｅ Ｂｅａｎｓ）由来α−ガラクトシ
ダーゼ（Ｓｉｇｍａ側）等を用いることができる。
ーゼはガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離
する酵素として知られでいる。本発明ではドナーとして
ラクトース等のβ−ガラクトシドを用いる場合はβ−ガ
ラクトシダーゼを、ドナーとしてメリビオースまたラフ
ィノース等の１ ２ α−ガラクトシドを用いる場合はα−ガラクトシダーゼ
を使用する。本発明では、いずれの起源のβ−ガラクト
シダーゼを用いてもよいが、具体的には旧ｏ１ａｃｔａ
（大和化成■） 、Ｌａｃｔａｓｅ Ｆ “アマノ
″ （人好製薬＠） 、Ｌａｃｔａｓｅ Ｙ−ＡＯ（＠
ヤクル）） 、Ｌａｃｔａｓｅ Ｐ （ケト・アイ化
成■）等を用いることができる。また、α−ガラクトシ
ダーゼも、いずれの起源のものを用いてもよい。具体的
にはモルチェレラ ビナセア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ｖｉｎａｃｅａ）またはアブシディア レフレキア（
＾ｂｓｉｄｉａｒｅｆ Ｉｅｘａ）起源α−ガラクトシ
ダーゼ（北海道糖果■）、グリーンコーヒー豆（Ｇｒｅ
ｅｎ Ｃｏｆｆｅｅ Ｂｅａｎｓ）由来α−ガラクトシ
ダーゼ（Ｓｉｇｍａ側）等を用いることができる。
本発明の酵素を用いた糖転移反応は、好ましくは溶媒中
で行う。溶媒としては水及び親水性有機溶媒との混合溶
媒を例示できる。特に、水と親水性有機溶媒との混合溶
媒中で反応を行うことにより、目的物質の収率を高める
ことができるので好ましい。親木有機溶媒としては特に
限定はなく、水親和性の有機溶媒であれば良い。親木有
機溶媒の例としては、ジメチルスルホキサイド、ジメチ
ルホルムアミド、ｎ−プロパツール、イソプロパツール
、アセトン、メタノール、エタノール、エチレングリコ
ール、プロピレングリコール等が挙げられる。これらの
溶媒は単独で使用しても良く、また２種以上を混合して
使用しても良い。
で行う。溶媒としては水及び親水性有機溶媒との混合溶
媒を例示できる。特に、水と親水性有機溶媒との混合溶
媒中で反応を行うことにより、目的物質の収率を高める
ことができるので好ましい。親木有機溶媒としては特に
限定はなく、水親和性の有機溶媒であれば良い。親木有
機溶媒の例としては、ジメチルスルホキサイド、ジメチ
ルホルムアミド、ｎ−プロパツール、イソプロパツール
、アセトン、メタノール、エタノール、エチレングリコ
ール、プロピレングリコール等が挙げられる。これらの
溶媒は単独で使用しても良く、また２種以上を混合して
使用しても良い。
水との混合溶媒における親水性有機溶媒の含有率は、溶
媒の種類等によっても異なるが約１０〜７０％好ましく
は２０〜６０％が適当である。
媒の種類等によっても異なるが約１０〜７０％好ましく
は２０〜６０％が適当である。
本発明の糖転移反応において、ガラクトシル残基を持つ
糖の基質濃度は１０〜４０％、マルトオリゴ糖誘導体（
２）の基質濃度は１０〜４０％とすることが適当である
。反応時間は５〜４０時間程度、反応温度は２０〜６０
℃の範囲で行うことが適当である。反応終了後、ｐＨ調
整または加熱により酵素反応を停止し、例えばカラムク
ロマトグラフィーにより分画を行い、本発明のマルトオ
リゴ糖誘導体（１）を得ることができる。カラムクロマ
トグラフィーには例えば、トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ）３ ４ １１Ｗ−４ＯＳゲルを充填したカラムに２５％メタノー
ルを移動相として用いる方法やＯＤＳカラムに１０％メ
タノールを移動相として用いる方法を挙げることができ
る。また、分画の際に未反応のアクセプターであるマル
トオリゴ糖またマルトオリゴ糖誘導体画分を回収し、く
り返し再使用することにより収率を著じるしく高めるこ
とができる。
糖の基質濃度は１０〜４０％、マルトオリゴ糖誘導体（
２）の基質濃度は１０〜４０％とすることが適当である
。反応時間は５〜４０時間程度、反応温度は２０〜６０
℃の範囲で行うことが適当である。反応終了後、ｐＨ調
整または加熱により酵素反応を停止し、例えばカラムク
ロマトグラフィーにより分画を行い、本発明のマルトオ
リゴ糖誘導体（１）を得ることができる。カラムクロマ
トグラフィーには例えば、トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ）３ ４ １１Ｗ−４ＯＳゲルを充填したカラムに２５％メタノー
ルを移動相として用いる方法やＯＤＳカラムに１０％メ
タノールを移動相として用いる方法を挙げることができ
る。また、分画の際に未反応のアクセプターであるマル
トオリゴ糖またマルトオリゴ糖誘導体画分を回収し、く
り返し再使用することにより収率を著じるしく高めるこ
とができる。
このようにして得られる本発明のマルトオリゴＢＭ ’
Ｌ体（１）は、α−アミラーゼ活性測定用基質として使
用することができる。測定検体としては、α−アミラー
ゼを含有するものであればよく、例えばヒ１への血液、
血清、尿、唾液等が挙げられる。
Ｌ体（１）は、α−アミラーゼ活性測定用基質として使
用することができる。測定検体としては、α−アミラー
ゼを含有するものであればよく、例えばヒ１への血液、
血清、尿、唾液等が挙げられる。
また共役酵素としては、グルコアミラーゼ、α−グルコ
シダーゼ、β−グルコシダーゼを一種または必要に応じ
て二種以上組み合わせて使用する。
シダーゼ、β−グルコシダーゼを一種または必要に応じ
て二種以上組み合わせて使用する。
これらの共役酵素の起源は、微生物、植物等いずれのも
のも使用することができる。本発明のαアミラーゼ活性
の測定条件は、従来より使用されているマルトオリゴ糖
誘導体を基質とする条件をそのまま採用することができ
る。例えば基質の濃度は約０１〜１０ｍＭの範囲とする
ことが好ましく、反応温度は約２５〜４０°Ｃとするこ
とが好ましい。
のも使用することができる。本発明のαアミラーゼ活性
の測定条件は、従来より使用されているマルトオリゴ糖
誘導体を基質とする条件をそのまま採用することができ
る。例えば基質の濃度は約０１〜１０ｍＭの範囲とする
ことが好ましく、反応温度は約２５〜４０°Ｃとするこ
とが好ましい。
反応時間は測定の目的により自由に選定できるが、通常
約３〜３０分間とする。至適ｐＨは約６〜８であり、各
種緩衝剤を使用してｐＨを維持することが好ましい。
約３〜３０分間とする。至適ｐＨは約６〜８であり、各
種緩衝剤を使用してｐＨを維持することが好ましい。
以下実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１
ラクトース２０９．５ ｍｇ （１２２，４ｍＭ）とｐ
−−−トロフェニル−α−マルトペンタオシド（ｐＮＰ
ａ−Ｇ５） ２９０．５ｍｇ （８１，２ｍＭ）を２０
％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキサイドを含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）ｌ−に溶解し、これにβ−グ
ルコシダーゼ（商品名： ＢＩＯＬＡＣＴＡ、大和化成
■）を１■添加し、４０°Ｃで静置して反応を行ったと
ころ、１８時間に基質であるｐＮＰ−α−６５の１６％
をｐ−ニトロフェニル−α−ガラクトシル−マルトペン
タオシド（ｐＮ Ｐ −ａ −Ｇ ５ （Ｇａｌ）■）
に変換することができた。反応終了後、トヨ５ ６ パール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＨＷ−４ＯＳゲルを充填
したカラム（φ２．２Ｘ９５ｃｍ）を用い、移動相：２
５％メタノール、流速： ０．８ ｍｆｆ／ｌｌ１ｉｎ
、、室温という条件で分画し、目的とする区分を分取し
、凍結乾燥品として粉末４０■を得た。これはガラクト
シル残基がｐＮＰ−α−Ｇ５の非還元末端のグルコシル
残基にβ−１，４結合したものとβ−１，６結合したも
のとの混合物（生成比はβ−１，４：β−１６−約４：
１）であった。さらにＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ
ＡＱ−３２３）を用い、移動相：１０％メタノール、
流速： ３．８ ｍｌ ／ｍｉｎ、、室温という条件で
、この混合物を分画したところｐＮＰ−αＧ５の非還元
末端のグルコシル残基にβ−１，４結合したものを凍結
乾燥品として２５ｍｇを得ることができた。構造確認の
ため■３Ｃ核磁気共鳴スペクトルの測定を行い、非還元
末端のグルコシル残基にガラクトシル基の結合している
ことを確認した。この測定結果を第１図に示す。
−−−トロフェニル−α−マルトペンタオシド（ｐＮＰ
ａ−Ｇ５） ２９０．５ｍｇ （８１，２ｍＭ）を２０
％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキサイドを含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）ｌ−に溶解し、これにβ−グ
ルコシダーゼ（商品名： ＢＩＯＬＡＣＴＡ、大和化成
■）を１■添加し、４０°Ｃで静置して反応を行ったと
ころ、１８時間に基質であるｐＮＰ−α−６５の１６％
をｐ−ニトロフェニル−α−ガラクトシル−マルトペン
タオシド（ｐＮ Ｐ −ａ −Ｇ ５ （Ｇａｌ）■）
に変換することができた。反応終了後、トヨ５ ６ パール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＨＷ−４ＯＳゲルを充填
したカラム（φ２．２Ｘ９５ｃｍ）を用い、移動相：２
５％メタノール、流速： ０．８ ｍｆｆ／ｌｌ１ｉｎ
、、室温という条件で分画し、目的とする区分を分取し
、凍結乾燥品として粉末４０■を得た。これはガラクト
シル残基がｐＮＰ−α−Ｇ５の非還元末端のグルコシル
残基にβ−１，４結合したものとβ−１，６結合したも
のとの混合物（生成比はβ−１，４：β−１６−約４：
１）であった。さらにＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ
ＡＱ−３２３）を用い、移動相：１０％メタノール、
流速： ３．８ ｍｌ ／ｍｉｎ、、室温という条件で
、この混合物を分画したところｐＮＰ−αＧ５の非還元
末端のグルコシル残基にβ−１，４結合したものを凍結
乾燥品として２５ｍｇを得ることができた。構造確認の
ため■３Ｃ核磁気共鳴スペクトルの測定を行い、非還元
末端のグルコシル残基にガラクトシル基の結合している
ことを確認した。この測定結果を第１図に示す。
実施例２
試薬ブランク値の経時変化を調べるため、０．０４ＭＣ
ａＣｎを含有する０、１Ｍ３．３−ジメチルグルタリッ
クアシッド−５Ｍ ＮａＯＨ緩衝液（ｐｌ＋ ６．８
）］、 Ｏｍｅに、酸素由来のα−グルコシダーゼ１０
０Ｕ／−と基質５■を加え、３０℃に保持し、経時的に
４０５ｎｍの吸光度を測定した。なお、基質としては実
施例１で得られた本発明のｐＮＰ−αＧ ５ （Ｇａｌ
） １と比較のためにｐＮＰ−α−Ｇ５を用いた。この
結果を第１表に示した。
ａＣｎを含有する０、１Ｍ３．３−ジメチルグルタリッ
クアシッド−５Ｍ ＮａＯＨ緩衝液（ｐｌ＋ ６．８
）］、 Ｏｍｅに、酸素由来のα−グルコシダーゼ１０
０Ｕ／−と基質５■を加え、３０℃に保持し、経時的に
４０５ｎｍの吸光度を測定した。なお、基質としては実
施例１で得られた本発明のｐＮＰ−αＧ ５ （Ｇａｌ
） １と比較のためにｐＮＰ−α−Ｇ５を用いた。この
結果を第１表に示した。
第１表
実施例３
α−アミラーゼによる吸光度変化を調べるため、１０ｍ
Ｍ ＮａＣ７！を含有する５０ｍＭリン緩衝液（ｐ１１
７．０）１−に基質５■と酵素由来のα−グルコシダー
ゼ４０ Ｕ ／ ｍｌ、と、これにブタ膵臓のα−アミ
ラーゼを加え３７℃で２０分間、経時的に４０５ｒｕｎ
の吸光度を測定した。なお、基質としては実施例１で得
られた本発明のｐＮＰ−α−Ｇ ５ （Ｇａｌ）１とｐ
ＮＰ−α−Ｇ５を用いた。また、ブタ膵臓のα−アミラ
ーゼはＩＵ／ｍｆｆ、２Ｕ／ｄ、３Ｕ／ｍ２．４ Ｕ
／ ｗｄｌの各濃度になるように添加した。この結果を
第２図に示した。この図からα−アミラーゼ活性とは吸
光度との間には明かな相関関係が認められた。また、ｐ
Ｎ Ｐ −ｃｘ −０５（Ｇａｌ） １とｐＮＰ−α
−Ｇ５の吸光度変化には大差がないことも確認された。
Ｍ ＮａＣ７！を含有する５０ｍＭリン緩衝液（ｐ１１
７．０）１−に基質５■と酵素由来のα−グルコシダー
ゼ４０ Ｕ ／ ｍｌ、と、これにブタ膵臓のα−アミ
ラーゼを加え３７℃で２０分間、経時的に４０５ｒｕｎ
の吸光度を測定した。なお、基質としては実施例１で得
られた本発明のｐＮＰ−α−Ｇ ５ （Ｇａｌ）１とｐ
ＮＰ−α−Ｇ５を用いた。また、ブタ膵臓のα−アミラ
ーゼはＩＵ／ｍｆｆ、２Ｕ／ｄ、３Ｕ／ｍ２．４ Ｕ
／ ｗｄｌの各濃度になるように添加した。この結果を
第２図に示した。この図からα−アミラーゼ活性とは吸
光度との間には明かな相関関係が認められた。また、ｐ
Ｎ Ｐ −ｃｘ −０５（Ｇａｌ） １とｐＮＰ−α
−Ｇ５の吸光度変化には大差がないことも確認された。
本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を基質と
して用いるとα−アミラーゼの測定時に、上述のように
共役酵素であるα−グルコシダーゼによるブランク値の
上昇を押えることができ、しかも従来の測定試薬と同様
の方法で測定が可能である。また、基質溶解液とα−グ
ルコシダーゼ、９ ０ グルコアミラーゼ等の共役酵素溶解液との一液化が可能
となるなどα−アミラーゼの活性測定法においてきわめ
て有用である。
して用いるとα−アミラーゼの測定時に、上述のように
共役酵素であるα−グルコシダーゼによるブランク値の
上昇を押えることができ、しかも従来の測定試薬と同様
の方法で測定が可能である。また、基質溶解液とα−グ
ルコシダーゼ、９ ０ グルコアミラーゼ等の共役酵素溶解液との一液化が可能
となるなどα−アミラーゼの活性測定法においてきわめ
て有用である。
さらに、本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体
の製造方法は、特に安価に入手可能なラクトースを用い
ることができ、比較的簡単な酵素的合成法であり、収率
も良いことから有効な工業的生産方法となり得る。また
本発明のα−アミラーゼ測定法は、従来のこの種の測定
法と同様、ヒト体液のα−アミラーゼの活性測定に広く
使用することができる。
の製造方法は、特に安価に入手可能なラクトースを用い
ることができ、比較的簡単な酵素的合成法であり、収率
も良いことから有効な工業的生産方法となり得る。また
本発明のα−アミラーゼ測定法は、従来のこの種の測定
法と同様、ヒト体液のα−アミラーゼの活性測定に広く
使用することができる。
第１図は、本発明で得られたｐＮＰ−α−Ｇ５（Ｇａｌ
） １のＩ３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す。第２図は
、ｐ Ｎ Ｐ −ｃｔ −Ｇ ５ （Ｇａｌ） １およ
びｐＮＰα−Ｇ５を用いた試薬のα−アミラーゼによる
吸光度変化を示す。 １
） １のＩ３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す。第２図は
、ｐ Ｎ Ｐ −ｃｔ −Ｇ ５ （Ｇａｌ） １およ
びｐＮＰα−Ｇ５を用いた試薬のα−アミラーゼによる
吸光度変化を示す。 １
Claims (4)
- （１）下記一般式（１）で表わされるガラクトシル−マ
ルトオリゴ糖誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ＿１及びＸ＿２の少なくとも一方はガラクト
シル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子ま
たは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜
５の整数を示す。） - （２）ガラクトシル残基をもつ糖と、一般式（２）▲数
式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェ
ニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す）で示されるマ
ルトオリゴ精読導体とにα−ガラクトシダーゼ又はβ−
ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とする請求項
１記載のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造法
。 - （３）α−ガラクトシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ
を水又は親水性有機溶媒と水との混合溶媒中で作用させ
る請求項２記載の製造法。 - （４）グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼおよびβ
−グルコシダーゼのうち少なくとも１種の存在下に、マ
ルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼを含有する検体と
反応させ、生成するグルコースまたはオリゴ糖の還元末
端から遊離するアグリコンの吸収スペクトルを測定する
α−アミラーゼ活性測定法において、上記マルトオリゴ
糖誘導体として請求項１記載のガラクトシル−マルトオ
リゴ糖誘導体を用いることを特徴とするα−アミラーゼ
活性測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064620A JP2886249B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 |
| US07/941,302 US5378831A (en) | 1990-03-14 | 1992-09-04 | Galactosyl maltooligosaccharide derivatives |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064620A JP2886249B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 |
| US07/941,302 US5378831A (en) | 1990-03-14 | 1992-09-04 | Galactosyl maltooligosaccharide derivatives |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03264596A true JPH03264596A (ja) | 1991-11-25 |
| JP2886249B2 JP2886249B2 (ja) | 1999-04-26 |
Family
ID=26405707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2064620A Expired - Fee Related JP2886249B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5378831A (ja) |
| JP (1) | JP2886249B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4338375A1 (de) * | 1992-11-10 | 1994-06-23 | Toyo Boseki | Reagens zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität und Verfahren zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität |
| EP1008853A2 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent compositions for measuring electrolyte using alpha-amylase |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3124435B2 (ja) * | 1993-10-20 | 2001-01-15 | キッコーマン株式会社 | α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法 |
| JPH0770165A (ja) * | 1993-06-28 | 1995-03-14 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 非還元性オリゴ糖とその製造方法並びに用途 |
| JPH11299498A (ja) | 1998-02-19 | 1999-11-02 | Toyobo Co Ltd | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
| JP3087891B2 (ja) | 1998-03-31 | 2000-09-11 | 東洋紡績株式会社 | 電解質測定用試薬組成物 |
| DE19954233A1 (de) * | 1999-11-11 | 2001-05-31 | Nutricia Nv | Diabetikernahrung |
| WO2018167259A1 (en) * | 2017-03-16 | 2018-09-20 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Production of glycoconjugates and multivalent carbohydrate structures and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4521592A (en) * | 1981-10-23 | 1985-06-04 | Svenska Sockerfabriks Ab | Compounds for therapeutic or diagnostic use, a process and intermediates for their preparation |
| DE3323245A1 (de) * | 1983-06-28 | 1985-01-10 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und reagenz zur bestimmung von (alpha)-amylase |
| US4963479A (en) * | 1986-10-07 | 1990-10-16 | Hoechst Celanese Corporation | Reagent system for an alpha-amylase assay containing aromatic substituted glycoside |
-
1990
- 1990-03-14 JP JP2064620A patent/JP2886249B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-09-04 US US07/941,302 patent/US5378831A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4338375A1 (de) * | 1992-11-10 | 1994-06-23 | Toyo Boseki | Reagens zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität und Verfahren zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität |
| US5393660A (en) * | 1992-11-10 | 1995-02-28 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent for Determining α-amylase activity and method for determining α-amylase activity |
| DE4338375C2 (de) * | 1992-11-10 | 2000-05-31 | Toyo Boseki | Verwendung eines Maltooligosaccharidderivats zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität |
| EP1008853A2 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent compositions for measuring electrolyte using alpha-amylase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5378831A (en) | 1995-01-03 |
| JP2886249B2 (ja) | 1999-04-26 |
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