JPH03271232A - 治療用ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は治療用ペプチドに関するものである。

（従来の技術） ＡＣＴＨ類神経ペプチドは、中枢及び末梢神経系におけ
る神経の再生を促進することができる。

Ｂｉｊｌｓｍａ等のＥｕｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｎ＋、　
　１９８１年の７６巻、７３−７９ページ、及びＢｉｊ
ｌｓｍａ等のＥｕｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　１９８３
年の９２巻、２３１２３６ページには、座骨神経を押し
つぶしたラットの感覚運動機能を回復させる為、Ｈ−Ｍ
ｅｔ（０２）　−Ｇ　ｌｕ　−Ｈｉｓ　−Ｐｈｅ−Ｄ　
−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ　−０）（及びα−ＭＳＨを含むＡＣ
ＴＨ様神経ペプチドを用いたことが記載されている（本
明細書中において、Ｄ−異性体ともＬ−異性体とも表示
されていない場合は、天然型り一異性体である）。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、運動神経の損傷（例えば、運動神経が切断さ
れたり、圧迫されたりすること〉による筋肉の消耗、或
いは神経筋の変性をひき起こす遺伝病の治療法を提供す
る。

（課題を解決するための手段） 本発明の治療法には、−殻構造式： ％式％ で表わされ、その式中のＡ１がＨ或いはアセチル、Ａ２
がＡｌａ、Ｄ−Ａｌａ、　Ｎｌｅ、或いはＭｅｔ、Ａ３
がＧＩｎ或いはＧ　Ｉｎ、　Ａ　’がＨｉｓ或いはＴｙ
ｒ、Ａ５がＮ　Ｈ２、Ｇ　ｌ　ｙ　　Ｎ　Ｈ−２或いは
Ｄ　　Ａｌａ　　ＮＯ３で、さらにＡ３がＧｌｕで且つ
Ａ４がＨｉｓの時にはＡ２はＭｅｔでもＮｌｅでもあり
えないヘプタペプチド、或いは薬剤として使用可能なそ
れらの塩のいずれがを、運動神経機能が欠除した筋肉塊
を保護する為に十分な量、哺乳動物、特に人間の患者に
対して投与する処置が含まれている。

好ましい具体例としては、ヘプタペプチドが上記構造式
中、　Ａ　ＩがＨ，Ａ２がＤ−Ａｌａ、Ａ３がＧＩｎ、
Ａ’がＴｙｒ、Ａ５がＧｌｙ−ＮＯ３；を持ち、疾病が
ドゥーシェンヌ（Ｄ　ｕｃｈｅｎｎｅ）筋ジストロフィ
ーの例である。

本発明の方法は、ドゥーシェンヌ筋ジストロフィーの様
に、慢性かつ退行性の神経筋疾病の治療に、或いは神経
の損傷、すなわち神経が押しつぶされたり、切断された
りすることによる損傷に起因する筋肉の退縮、或いは、
中毒又は代謝（例えば、糖尿病又は癌）による神経の損
傷の治療或いは予防に効果がある。

本発明の他の特徴及び利点については、その好ましい具
体例に関する次の記載、及び特許請求の範囲により明ら
かとなるであろう。

まず図面について簡単に記載する。

図１は、損傷の違いによる腔部の違いについての略図を
示すもので、Ｂ　ａｉｎ等の１９８９　Ｐ　Ｉａｓｔｉ
ｃａｎｄ　　Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　　Ｓ　ｕ
ｒｇｅｒｙ、８３　：　１２９より採用したものである
。

図２は、食塩水或いは投薬量の異なるＢＩＭ２２０１５
で治療後の機能回復に関する線グラフである（１００％
＝１００％回復；平均値及びそのＳＥＭに関するデータ
）。

図３は、歩行試験を棒グラフで説明したものである（Ｓ
ＥＭは、信頼度９５％の倍率係数で調整されている〉。

図４は、給板面積の棒グラフである。

図５は、綿板周辺の長さを示すグラフである（Ｐ＜０．
０２５）。

図６は、内部分岐した綿板のグラフである。

図７は、綿板筋繊維の直径である（Ｐ＜０．０５＞。

次に、構造、合成、試験、及び本発明の好ましい具体例
の用途につき記載する。

隨り 本発明の方法に用いるヘプタペプチドは、上記した一般
構造式を持つ。それらペプチドは、総てカルボキシ末端
部にＮＯ３を有し、さらに４番目にはＰｈｅが、５番目
にはＡｒｇが、６番目にはＴｒｐがある。

このヘプタペプチドは、薬剤として使用可能な塩の形に
することもできる。好ましい塩の開としては、タンニン
酸、或いはカルボキシメチルセルロースの様な重合酸は
もちろんのこと、例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエ
ン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸
、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸
、或いはパモエ酸の様に、治療に用いることのできる有
機酸の塩、さらに、例えば塩酸の様なハロゲン化水素酸
、硫酸、リン酸といった無機酸の塩とがある。

を炙 Ｈ−Ｎｌｅ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ　−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒ
ｐ−Ｇｌｙ　　ＮＯ３の合成は次の通りである。

その他のヘプタペプチドは、次の合成法を適当に変える
ことにより調製しうる。

第１段階は、Ｎ　Ｉｅ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｈｉｓ　−Ｐ　ｈ
ｅ　−Ａ　ｒｇ　−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ベンズヒドリルア
ミン樹脂の調製であり、これは次の通りである。

ベン・ズヒドリルアミンーボリスチレン樹脂（ビーチャ
ムインコーポレーション）（１，ＯＯｙ、０．５＋ｕ＋
ｏｌｅ）を塩素イオンの形にして、ベックマン９９０Ｂ
ペプチド合戒機の反応容器に入れ、これを次の反応サイ
クルが実行てきる様にプログラムした：（ａ）ＣＨ２Ｃ
１２、（ｂ）３３％トリフルオロ酢酸ＣＨ２Ｃｌ２（そ
れぞれ１分と２５分で２回）、（ｃ）　　ＣＨ２Ｃｌ２
、（ｄ）　　エタノール、（ｅ）　　ＣＨ２Ｃｂ、（ｆ
）１０％のトリエチルアミンＣＨＣｌ、溶液、さらに（
ＥＴ）　ＣＨ２Ｃｌ２゜ 中和した樹脂をＣＨ２Ｃｆ２中、Ｂｏｃ−グリシン及び
ジイソプロピルカルボジイミド（１，５ｍｍｏｌ）と１
時間撹拌し、得られたアミノ酸樹脂を、さらに上記洗浄
プログラム中の（ａ）から（ｇ）のステップに通して循
環させた。続いて、同じ方法を用い、次のアミノ酸（１
，５ｍｍｏｌ）をカップリングさせた：Ｂｏｃ−Ｔｒｐ
、Ｂｏａ−）シル−Ａ　ｒｇ、　Ｂ　ｏｃ　−Ｐ　ｈｅ
、　Ｂ　ｏｃ−カルベンゾキシ−Ｈｉｓ、　Ｂ　ｏｃ　
−Ｇ　Ｉｎ及びＢｏｃ−Ｎｌｅ。

洗浄及び乾燥後、完成した樹脂の重量は１．６０ｇであ
った。

上記樹脂から、次の様にしてＨ−Ｎｌｅ−ＧｌｎＨｉｓ
−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｎ１２を調製した
。

上記ヘプタペプチド樹脂（１，８５ｇ、０．５ｍ１１１
ｏｌ）及び４−のアニソールと３６−のフッ化水素との
溶液による混合物を、０℃で４５分間撹拌した。過剰の
フッ化水素を乾燥窒素気流下にて直ちに留去することに
より、遊離のペプチドを沈澱させ、これをエーテルで洗
浄した。

さらにこのペプチドを最少量の５０％酢酸に溶かし、セ
ファデックスＧ−２５のカラム（２，５Ｘ１００１）上
で溶離した。紫外線吸収と薄層クロマトグラフィー（ｔ
ｉｅ）によって決定した主成分を含む部分を集め、減圧
下、少量になるまで溶媒を留去した。

この溶液をオクタデシルシラン−シリカ（ホワットマン
ＬＲＰ−１，１５−２０ｍメツシュサイズ）のカラム（
２，５Ｘ５０ｃｎ）にかけ、２０％の酢酸水溶液に溶か
した直線勾配０−４０９５のアセトニトリルで溶離した
。ｔｌｅ及び分析用高性能液体クロマトグラフィー（ｈ
ｐｌｃ）で画分を検査し、不純物が最少量になる様に集
めた。溶液の凍結乾燥を繰返して水を除くと、８１μｇ
の生成物が白い綿毛状の粉末として得られた。

この物質は、ｈｐｌｃ及びｔｌｃにより単一であること
がわかった。酸加水分解によるアミノ酸分析から、この
ヘプタペプチドの組成を確認した。

上記の方法を適当に変えることにより、同様の方法でＨ
−Ｎ　Ｉｅ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ　−Ａ
ｒｇ−ＴｒｐＧ　ｌｙ　−Ｎ　Ｈ２，Ｈ−Ｍｅｔ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｔｙｒ　−ＰｈｅＡｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−
Ｎ１２．Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−Ｔｒｐ−Ｇｌ、Ｆ−Ｎ１２．及びＨ−ＤＡｌａ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ　−Ｎ１
２を同様な収率で調製した。

ヘプ　ペプ　ドの； ヘプタペプチドは、下記の様にして神経及び筋肉の変性
に対するそれらの効果を試験することができる。

アミノ酸の構造式がＤ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｙ
ｒＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｎ１２であるヘプ
タペプチドＢＩＭ−２２０１５の効果を、押しつぶされ
た神経及び切断された神経という二つの異なるタイプの
末梢神経障害につき試験を行なった。ラットにおいて、
押しつぶされた腓骨神経、或いは切断された座骨神経の
回復につき、Ｂ　Ｉ　Ｍ　−２２０１５の投薬量の違い
による効果、及び投薬方法の違いによる効果を調べた。

ラビットて形態学的研究を行なったが、ここでは、ＢＩ
Ｍ−２２０１５による治療に先立ち、その座骨神経を切
断して縫合した。これらの研究を総合した結果、下に示
す様に、ＢＩＭ−２２０１５は軸索におけるよりも神経
筋接合部（すなわち綿板）において、より効果的である
可能性が示唆される。

次の様な形態学的研究、及び生理学的研究を用いて、ラ
ットにおける押しつぶされた腓骨神経回復へのＢＩＭ−
２２０１５の効果につき評価を行なった。ＢＩＭ−２２
０１５で治療後、押しつぶされた神経の回復が初期の段
階で、運動パターン及び綿板の形態の両方を評価した。

大人のスブラグーダウリー（Ｓ　ｐｒａｇｕｅ　−Ｄ　
ａｗｌｅｙ）雄ラット（タコニック社〉を、２２℃で１
２時間明るく、１２時間暗いサイクルに保ち、標準ラッ
ト用の餌と水とを自由に与えた。手術は全て、８％のク
ロロヒトレート（０，６ｍｆ／１００ｙ　１．Ｐ、）で
麻酔をかけて行なった。先を均一に削った＃５デュモン
ト鉗子を用いて腓骨神経を押しつぶすことで神経機能を
絶った。

この押しつぶしは、ＥＤＬ筋のほぼ近傍に１１幅の損傷
を与えた。傷口は手術用ステープルで閉じた。手術後、
直ちに次の様な投与量のいずれかで、食塩水或いはＢＩ
Ｍ−２２０１５をその動物に投与しｒ、：：（１）　　
０．９ｇ食塩水、（２＞　１０．０μ９Ｂ　Ｉ　Ｍ−２
２０１５、（３）５．０μｙＢＩＭ−２２０１５、或い
は（４）０．１μ、ＢＩＭ−２２０１５（動物当り）。

投薬は４８時毎に１回、５日間行ない、５日後、そのラ
ットを殺して形態学的分析用の組織を取り出した。総て
の注射及び手術は１０：００から正午１２：００までの
間に行なった。

運動パターンは、動物の歩行パターンを測定することに
より試験した。動物は２０°の傾斜を持つ台の上を歩か
せるようにした。通路は蛍光灯で十分に明るくし、その
通路の端には暗室を置いた。

この明暗の差が、動物に通路を歩こうという気にさせて
いる。通路は、１３．５インチ幅の連続したコンピュー
ター用紙（２０ｌｂ）を置いたものである。

ラットの後足を毒性のないインクの中にっけ、動物を自
然に歩かせる様にした。この歩行パターン試験は手術前
日、及び手術後３日目、４日目、５日目に行なった。全
ての歩行試験は、１０：ＯＯから正午１２：００の間に
行なった。つま先の開きの違いを分析する為、乱れのな
い一貫性のある歩行パターンを６つ選び出した。図１は
、可能なパターンを図示したものである。足の指の１番
目と５番目との間の距離を、精密度が±０．００５１の
調圧機械カリパス（Ｍｏｎｏｓｔａｔ　　ｍｅｃｈａｎ
ｉｃａｌｅａｌｉｐｅｒ）（タイプ６９１１）を用いて
測定した。個々の動物における大きさの差をなくす為、
対照標準として反対側の足を用いた。スチューデントＴ
試験を適用して統計的な違いを測定し、データは、６つ
の最もはっきりとした足幅の平均値、及びその平均値の
標準誤差（９５％信頼のおける公式を用いて）、標準偏
差、分散として表示した。

これらの結果は、測定したいずれのパラメーターにおい
ても、統計的には有意でない様に見えるが、これは恐ら
く、１群につき動物の数が少ないこと　及び治療による
改善の度合が小さかったことによるものであり、ＢＩＭ
−２２０１５を０．１μ９投与した場合には、非常に一
貫して回復速度を高めるという結果を得た。図２及び図
３に示したこれらの結果は、ＢＩＭ−２２０１５類縁体
の最適投薬量が０．１μｇであることを示している。他
の投薬量の場合も、はんのわずかな差であるが食塩水よ
りも効果があった。投薬量は、５．０μｇよりも０．１
μｇの方が効果が高かった。これらの結果は、運動の回
復速度に関して、ＢＩＭ−２２０１５が試験に使った最
も少ない投薬量（０，１μｇ〉の時有効であったことを
示している。

肢脹隻 押しつぶした神経の回復に関する形態学的研究は次の様
にして行なった。５日後、手術に先立ち、ラットに８％
のクロロヒドレー）　（０，６輪ｆ／１００ｇＩＰ）で
麻酔をかけた。その動物をうつ向けに寝かせ、その後肢
に、大腿部の外側上顆から足首のくるぶし外側にかけて
皮膚の切開を行なった。さらにＬ此艷旋（Ｅ　Ｄ　Ｌ　
）は、そのまわりに付いている結合組織から注意深く露
出させ、そして血液の供給が滞らない様に細心の注意を
払った。このＥＤＬはへテロ筋で、速白筋繊維と遅赤筋
繊維とから成っている。これは、その等長性単収縮（ｉ
ｓｏｍｅｔｒｉｃｔｗｉｔｃｈ）パラメーターにより連
節に分類される。

ＥＤＬ筋の起始点は大腿部の上顆で、遠位鍵（ｄｉｓｔ
ａｌ　　ｔｅｎｄｏｎ）に及んでいるが、この鍵は４つ
に分かれて第２指から第５指までの第３指骨の基部に入
いり込んでいる。これには腓骨神経が来ていて、前部（
ａｎｔｅｒｉｏｒ）脛骨動脈がら血液の供給を受けてい
る。この筋肉を、次の様な染色を行なう為に準備した。

ベコーデシャブシン（Ｐ　ｅｃｏｔ　−Ｄ　ｅｃｈａｖ
ｓｓｉｎｅ）等による銀−コリンエステラーゼ染色法（
１９７９年の５ｔａｉｎ、　Ｔｅｅｈｎｏｌ、　５４：
２５）を用いて、ＥＤＬの綿板或いは神経筋接合部を染
色した。簡単に説明すると、筋肉を生体内にある状態で
、通常のリンガ−溶液中１％の中性ホルマリンで固定し
た。さらにその筋肉を取り出し、新しい１％中性ホルマ
リン溶液中に３−４分余り置いた。綿板はカルノブスキ
ー（Ｋ　ａｒｎｏｖｓｋｙ）等によって記載された染色
（１９６４年のＪ　、　Ｈｉｓｔ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｙ
ｔｏｃｈｅｍ。

１２：２１９）を用い、目で見て調整しながら７−１５
分間部分染色した。部分染色後、そのＥＤＬを５％中性
ホルマリン溶液に２０分間浸し、さらにトリトンＸ−１
００洗浄剤で１時間洗浄した。

洗浄段階を経た後、ＥＤＬを８０％エタノール溶液で１
時間固定した。最後にその綿板を、０．５ｚブロタゴー
ル溶液を用い、−晩かけて（１２−３０時間、３７℃て
〉銀で含浸させた。

翌日、過剰の銀をボディアン（Ｂｏｄｉａｎ）現像剤で
１８分かけて還元した。その筋肉を蒸留水ですすいで、
細切して、グリコグリセロール固定ゲルを用いて固定し
た。

油浸対物レンズで倍率を１００×としたオリンパスのＢ
Ｈシリーズ双眼顕微鏡を用い、その綿板を観察した。そ
のオリンパス顕微鏡の頂上に低感光性ビデオカメラを固
定し、白黒のモニター上のスライドに映した。手動光学
マウスを備えたバイオファント（Ｂ　ｉｏ　　ｕａｎｔ
）イメージディジタイザ−を用い、次のパラメーターを
測定した。

（１）綿板パラメーター、（２）綿板面積、（３）綿板
の内部分岐及び（４）筋繊維直径。バイオファント統計
処理プログラムを用いて統計的な差を決定し、そのデー
タは、平均値とその平均値の標準誤差とで表示した。ス
チューデントのＴ試験とＡＮＯＶＡ統計試験を行なった
。ヒバラドディジタイジングパッド（ＨｉＬｉ　以ｍ刀
カカ１　囲１）（テキサス州オースチンのヒユーストン
インストルメント）にバイオファントイメージディジタ
イザ−を取付け、これをモルフオメトリーソフトウエア
ー　バイオファント■（テネシー州ナツシュビルのＲ＆
Ｍバイオメトリックス）を用いてアップルＩｃｅパーソ
ナルコンピューターに連結させた。

濯及 押しつぶした神経をＢＩＭ−２２０１５で治療したとこ
ろ、神経筋接合部において代償効果が得られ、これは最
も少ない投薬量（０，１μｇ）の時に最も顕著であった
。この結果から、綿板周辺の長さに関しては、ＢＩＭ−
２２０１５が０．１μｙ（Ｐ＜０．０２５）（図４と５
）及び５．０μｆＩ（Ｐ＜０．０５）の時、そして内部
分岐（図６と表１）はＢＩＭ−２２０１５が０．１μｇ
（Ｐ＜０．０２５）の時に有意な増加を示すことがわか
る。

綿板筋繊維の直径を測定したところ、ＢＩＭ−２２０１
５の投与量を１．０μｇ及び１０．０μｇとした時、筋
肉の肥大が有意に（ｐ＜ｏ、ｏｏｓ）高くなることが判
明した。投与量を０．１μｇ及び１０μｇとした時には
、投与量と効果との間にも関連があり、これはＭＳＨ及
びβ−エンドルフィンの様なペプチドで観察されたもの
と同様な筋肉縮少効果が高まることによるものかもしれ
ない。Ｈｕｇｈ等（１９８９年のＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ　　Ｌｅｔｔｓ　１０３　：１６９）は、例えば動
揺病、或いは筋ジストロフィーのマウスの様に、運動ニ
ューロンの疾病にかかった動物にもいて、α−ＭＳＨ及
びβ−エンドルフィンが綿板に過剰発現することを明ら
かにしている。

次の様にして、座骨神経を切断し、再び付けた後、ＢＩ
Ｍ−２２０１５の筋肉重量に関する効果を試験した。通
船が８週のそれぞれ約２００ｇのウィスター（Ｗｉｓｔ
ａｒ）ラットを８匹から１０匹含む４群につき試験を行
なった。各ラットの座骨神経を切開し、手術用はさみで
無菌的に切断した。遠い切口と近い切口とをティシュコ
ール（ｔｉｓｓｕｃｏｌ）でくっ付け、さらにＢＩＭ−
２２０１５をして手術用接着剤（すなわちティッシュコ
ール）の中へ１００　μｇ１０．５ｍ１（群２〉、１．
１μｆ１１０．５ｍ／（群３）で入れて局所的に投与す
るか、或いは５μｇ・ｋ、・ｄａｙで１８日間皮下（ｓ
、ｃ、）投与した。コントロール群（群１）はティシュ
コールでのみ処置した。切断した神経は、評価前に３５
日間再生させた。

３５日目、手術に先立ってフェノバルビタールで麻酔を
かけた。指の総括伸筋を切り離すため外側の足を手術し
て切開した。遠位鍵をかかとの高さで切った。急性の刺
激による筋肉の緊張、１００Ｈｚでの筋肉の強縮及び５
００Ｈｚで５秒間収縮させた後の筋肉の消耗を電気生理
学的に測定し、その筋肉を中装置で切断して鍵を取り去
り、乾燥させて筋肉重量を測定した。

表２に筋肉の測定結果を示した。この結果から、局所投
与（群２と３）ではほとんど無効であるのに対し、Ｓ、
　ｅ、投与（群４）では、筋肉強度の著しい改善を伴な
うといった様に、投与経路への依存性が認められる。例
えば、筋肉の重量を動物の平均体重を標準にして、換算
すると（表２．欄２）、群４（ｓ、ｃ、投与）は、対照
標準群１に対し、１５％を越える改善を示したが、群２
及び群３はほとんど改善が見られなかった。ＢＩＭ−２
２０１５のＳ、　ｅ、投与によって筋肉の重量が増加し
たのは、神経の分布繊維の数が増したこと、或いは再分
布した少数の神経繊維の体積が増したことによるものか
もしれない。又、この筋肉の増加が浮腫、或いは脂質の
浸潤によるものではないこともわかった。この実験にお
いて、動物間の変異性は大き過ぎる為、統計的な意義は
持ち得なかった。

筋肉強度に対するＢＩＭ−２２０１５の効果を表３及び
表４に示した。群４（表３）はコントロール群１（表３
．欄２〉を３０％も越える有意な（Ｐ−０，０１）改善
を示した。筋肉強度（例えば収縮性応答）も、筋肉の重
量（表３．ｍ３）当りに標準化して評価すると改善が顕
著てあった。群４（表４）は、コントロール群（族４．
欄１）を２８″％（Ｐ＝０．０５）上回る改善を示した
。しかしながら、筋肉の強度を筋肉の重量当りで示す時
には、もはやコントロール群との有意差は認められなか
った。さらに表４からは、筋肉の収縮速度（欄３〉が、
コントロール群１と比較して、群４では劇的に改善（３
００ｇ）　したこともわかり、この差は統計的に有意で
ある（Ｐ・０．０１）。弛緩速度（族４．欄４）も、群
１に比べ、群５では、劇的に改善されている。しかしな
がら、低周波（１００Ｈｚ）においても高周波（５００
Ｈｚ）においても筋肉の疲れ易さに関しては効果が認め
られなかった。

この形態学的結果は、ＢＩＭ−２２０１５をｓ、　ｃ。

投与後に筋肉の重量が増加したことを示しており、これ
は筋繊維から出る収縮性タンパク質の増加によるものと
してのみ、説明される。機能試験の結果は、筋肉の再分
布がＢＩＭ−２２０１５を用いた治療によって促進され
たことを示唆している。

これらの結果は上記で明らかにした様に、押しつぶされ
た腓骨神経の再生の実験に関し、ＢＩＭ２２０１５が筋
肉の消耗を防ぐという結論を支持している。

分断して末端から末端まで縫合したウサギの座骨神経を
、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いて調べた。

ＢＩＭ−２２０１５の効果を、新たに形成されるミニリ
ン形戒神経繊維の数、軸索の直径およびミニリン鞘の厚
さにより、次のようにして調べた。

叉　ンプルの；。１ 若い白色ニューシーラント種の雄成熟ウサギ５２羽を、
無菌条件下て、体重１ｋｆ１当たり３０μｇの量のベン
トパルビタールナトリウムを耳静脈から注射して麻酔し
た。神経手術は、左座骨神経を分断し、手術用顕微鏡の
下で神経縫合することにより行った。大腿の大転子から
ひざ関節まての間に横方向の皮膚切開を作成した。大腿
の筋系を露出して座骨神経を出現させ、これを臀筋の下
から露出している部分の１．５ｃｍ後方の部分で分断し
た。分断の位置は座骨神経が筋肉へ枝分かれしている分
離点より後方の部分である。該神経のこの枝分かれを保
持することにより、手術後にも動物は実質的に麻痺症状
を示さない。神経の二つの末端は、神経層膜および神経
上膜の周辺に、２または３針の緩い縫合によって固定で
きた。傷口を連続皮膚縫合によって閉じ、抗生物質は使
用しなかった。手術の開始１時間後から２５羽の動物に
ＢＩＭ−２２０１５を毎日投与した。１日に体重ｋｉ？
当たり１μｇの量の該物質を皮下投与により、１岬の塩
化ナトリウム溶液にして動物に投与した。

手術の後、ウサギを各々１２羽の４群に分けた（但し、
群４は１６羽からなる〉。各群の半分く６羽、但し群４
では７羽）をＢＩＭ−２２０１５で処理しくテスト群）
および残りの動物には塩化ナトリウム溶液を投与したく
コントロール群）。

ネンブタール麻酔下で動物を犠牲にし、左座骨神経を６
羽のテスト群の動物および６羽のコントロール群の動物
から、３，８．または３２日目に、そして７羽のテスト
群の動物および９羽のコントロール群の動物から、９６
日目に取り出した。各動物から、約４Ｃ輪の大きさの神
経が得られた。神経は、取り出したのち直ちに拡げてス
チロボール枠（Ｓ　ｔｙｒｏｐｏｒ　　ｆｒａｍｅ）に
重ね、５％の冷却したく４℃）カコジル酸緩衝化グルタ
ルアルデヒド溶液（ｐＨ７，２）中に１〜２時間放置し
た。

予備固定を２〜３時間行った後、次の場所から組織ブロ
ックを採った。分断箇所、この部分から４ＩＴ１ｍ前方
の部分および、３，６および１０ｍｍ後方の部分。変化
を調べる特に興味ある部位は、分断箇所およびここから
１ｃｍ後方の部分である。得られたサンプルを、特別の
ガラス容器中で、冷却した（４℃）カコジル酸Ｍ衝化グ
ルタルアルデヒド溶液でさらに２４時間固定した。次に
サンプルをカコジル酸緩衝液（ｐＨ７，２）で１〜３時
間ゆすぎ、１％四酸化オスミウムで２時間の後固定を行
った。

カコジルＨＭ衝液によるゆすぎ（４Ｘ　３０分間〉、そ
して濃度１００％規格のアルコール中での脱水（１回に
つき３０分間〉を繰り返したのち、サンプルをプロピレ
ンオキシド中に６０分間、そしてプロピレンオキシド−
Ｅｐｏｎ８１２混合物（１：１の比率）中に置いた。次
いでサンプルを包埋のために純粋なＥｐｏｎ　　８１２
　（Ｓｅｒｖａ、ハイデルブルグ）に移した。プラスチ
ック媒質の重合は、特別の重合用槽の中で、３５℃およ
び４５℃で各１日および６０℃で３日かけて行った。

ウルトラミクロトームを用いて、厚さ０．５μｍの準超
薄切片を切り出した。この切片を次に０．２５１ルイジ
ンブルーで８０℃で染色し、光学顕微鏡による組織変化
の評価およびひき続く超薄切片の調製に用いた。超薄切
片はウルトラミクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ　　ＯＭ
　　Ｕ３）を用いて得られ、銅製メツシュの顕微鏡スラ
イドに載置した。コントラスト処理は自動コントラスト
処理装置（２１６８Ｕｌｔｒａｓｔａｉｎｅｒ　　Ｃａ
ｒｌｓｂｅｒｇ　　５ｙｓｔｅｎ＋、ＬＫＢスウェーデ
ン）を用いて２工程で行った。第一工程においては、ウ
ルトラスティン（Ｕ　Ｉｔｒａｓｔａｉｎ　　１　）（
ウラニルアセテート溶液）による３０分間の処理を４０
℃で行い、洗浄を行い、そして最後に逆コントラスト処
理（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｏｔｒａｓｔ）をウルトラステ
ィン２　（Ｕ　Ｉｔｒａｓｔａｉｎ　　２　）（クエン
酸鉛溶液）で８０秒間行った。超微ｓｉ造の観察は、電
子顕微鏡ＥＭ（ツァイス、オーバーコツヘン）で６０ｋ
Ｖにおいて行った。結果は寸法安定性フィルムに文書と
して記録した。

Ｌ東生艷 再生の間におけるミニリン形戒神経繊維の形態に対する
ＢＩＭ−２２０１５の影響を分析するため、コンピュー
ター制御半自動対話式画像分析を行った。この方法にお
いては、幾何学的データを集めて分析する。用いたシス
テムは、幾何学的パラメーターを測定するプロセッサー
と電子ペン（ＭＯＲＡＭ　　０２　　ＫＯＮＴＲＯＮ、
Ｅｃｈｉｎｇ）および、ＭＯＰ　　ＡＭ　　０２からデ
ータを取り込み、そのデータを特別なプログラムで幾何
学的寸法から所望のパラメーターへと変換するためのコ
ンピューター（ＨＰ　　９８４５　　Ｂ　　Ｈｅｗｌｅ
ｔｔＰ　ａｃｋａｒｄ）を含む座標測定衣からｉ戒され
る。

測定は６，４００倍の倍率の電子顕微鏡で行った。この
拡大倍率において、構造は電子ペンで正確にトレースす
るのに十分に大きく鮮明である。さらに、この拡大率に
おいて十分に多数の神経ｍ維を観察でき、視野内の材料
の量がある程度に保たれる。

形態上の観察は、生存３２日の６羽のテスト群およびコ
ントロール群動物から、および生存９６日の７羽のテス
ト群および９羽のコントロール群動物からの画像化材料
を用いて行った。手術部位（部位２）およびこの部位が
ら１ｃｍ後方の部位（部位５〉からの各々１０顕微鏡写
真を無作為に選択した。

電子ペンでミニリン鞘の内周および外周および軸索の外
周をトレースした。大部分の場合に、これはミニリン鞘
の内周と同一であった。ＭＯＰＡＭ　　０２は次の幾何
学データを測定した：神経繊維の総面積、即ち軸索およ
びミニリン鞘の面積、軸索の面積、神経繊維の外周およ
び外形、ミニリン鞘の内周、および軸索の断面形状。こ
れらの値から、コンピュータープログラムはミニリン鞘
の厚みおよび軸索の直径（同じ面積の円の直径として〉
を計算した。第三の変数として、プログラムは完全円か
らの相違度に基づく形状ファクターを決定した。

次のステップとして、全ての試験動物およびコントロー
ル動物の各々の値を各変数に間して別々に対照させた；
各箇所および時間点についてのミニリン鞘の厚みおよび
軸索の直径、および処置および未処置動物の多値の分布
範囲を調べた。第二の統計プログラムは、各変数に関し
て各動物グループ内での平均値、標準偏差および最低お
よび最大値を、各箇所および時間点ごとに提供した。最
後に、これらのデータからデータをグラフの形で表示す
るヒストグラムが得られた。

驚艷α生掩 各動物、各箇所および時間点きたりの、二つの変数（ミ
ニリン鞘の厚みおよび軸索の直径）を先ず別々に対数に
変換した。これらの新たな値がら平均値を計算しそして
自然数に再変換した。この変数の二方向変換分析は、統
計プログラムＡＮＯＶＡ（ＮＶＡ２Ｕ）を用いて行い、
代表値を与えた。

この変数分析の目的は、時間因子および処置因子がミニ
リン鞘および軸索の成長に如何なる効果をおよぼすかを
見ることである。さらに、その効果の時間依存性も調べ
た。

虹東 手術による座骨神経の分離および顕微手術的末端−末端
縫合に続＜０．５μｍ準超薄切片の光学顕微鏡による観
察では、コントロール群と実験群の間に明確な相違を示
さなかった。光学顕微鏡観察で証明できるＢＩＭ−２２
０１５による処置の効果は、動物間に見出された変動が
大きいために、確認出来なかった。座骨神経はウサギに
おいてはあまり長くなく、そのため手術部位から１０ｖ
ｗ後方の部位までの観察のみが可能であり、成長中の神
経のスピードを調べることが困難である。神経は１日当
たり１．２〜１．４１戒長し、手術後８日目には、既に
多数の神経繊維が手術部位から１０ｍ１１後方まで達し
ていた。また、コントロール動物および実験動物の相違
は電子顕微鏡観察でも認められなかった。分離部位およ
び該部位から１ｃ＋ａ後方の部位の形態学的知見を第５
表および表６に夫々示す。

８日目にはミニリン鞘は未だ非常に薄いため、ミニリン
鞘形成繊維は電子顕微鏡でようやく観察された。しかし
ながら、その数は非常に少なく、この時点では統計学的
評価は不可能であった。この知見は、ガツトマン（Ｑ　
ｕｔｍａｎ）ら（１９４３゜Ｊ　、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、
　　１０１　：４８９）の、神経分離の後よりも神経押
しつぶし後の抹消神経繊維の再生の方が速いという報告
と一致する。初期の再生段階（手術後３および８日〉に
は、再ミニリン形戒は未だ十分に進行していないので、
神経繊維の数、軸索の直径およびミニリン鞘の厚みの統
計的分析は、光学顕微鏡で観察できるミニリン形成繊維
が多数存在するようになった時期（手術後３２および９
６日目〉に行った。

分離の領域において、処置および未処置の動物の相違は
統計的には確認出来なかったが、３２日および９６日後
のいずれにおいても、処置動物のミニリン鞘の厚みは平
均して大きかった。分離の後方１ｃ輪の領域において、
３２日後の処置動物のミニリン鞘の厚みも、未処置のも
のより僅か少し大きかった。３２日ないし９６日の期間
中に、ミニリン鞘は処置動物で２倍近く大きい速度で成
長した。９６日以後、処置動物のミニリン鞘はコントロ
ール動物より有意に太かった。即ち、３２〜９６日目の
間においてＢＩＭ−２２０１５がミニリン鞘の厚みを増
加させる効果は、統計的に確認された。軸索の直径に対
するＢＩＭ−２２０１５の統計的有意な効果は、手術後
３２日にも９６日後にも観察されなかった。統計的には
確認されなかったものの、処置動物の方が平均して多数
のミニリン形成神経繊維数を与えた。３２日目以後につ
いて、３２日および９６日目のいずれにおいても、分離
部位および該部位からＩＣ−後方の部位の方が髄鞘を持
つ神経繊維数が多かった。この相違が統計的に有意でな
かったのは、おそらく処置および未処置動物両者のグル
ープ内でのバラツキが大きかったためであろう。これら
の効果は抹消神経の再生に対するＢＩＭ−２２０１５の
効果の評価において無視されるべきではない。

コントロール動物２匹で肉芽組織の形成による分離領域
の肥大が肉眼観察されたが、両者ともに偶然の結果であ
りＢＩＭ−２２０１５処置の効果とは無関係とみなされ
る。全体として、手術後の肉芽組織の形成は少なく、神
経の再生に影響しなかった。

従って、ＢＩＭ−２２０１５は、神経外傷の後の再生の
初期段階のみならず、後期においても効果を示し、軸索
の発生数およびミニリン鞘の再ミニリン形成および厚み
に影響を及ぼした。

月ｍ 哺乳類に投与したときく例えば、経口的、局所的、経皮
的、静注、非経口的、鼻腔的または座剤として〉、本発
明のヘプタペプチドは、神経の障害に引き続く抹消およ
び中枢神経系の神経の再生を助ける効果を有し、そして
筋肉の萎縮を防止し、筋肉量の増強を助ける効果を持つ
。本発明のヘプタペプチドは、障害の直後から開始して
、１０日またはそれ以上の期間投与される。投与は毎日
または１日置きに行われる。

本発明のヘプタペプチドは、神経損傷部位を処置するた
めおよびアルコール性の、糖尿病性の、または毒性物質
に暴露されて生じた神経障害を処置するために用いるこ
とができる。本発明のヘプタペプチドはまた、分離した
神経の縫合の助けに用いることもできる。このヘプタペ
プチドは新たな神経生育過程を促進でき、神経の筋肉へ
の結合を促進し、そして筋肉の消耗を防止する。ヘプタ
ペプチドを神経外傷の治療に用いる場合には、初期用量
を神経の障害の直後に用い、その後、例えば２週間後に
それより高量の第二の用量を筋肉量を維持するために投
与することができる。退行性神経筋肉障害の場合のよう
に、筋肉の分解が既に生している時は、ヘプタペプチド
は、例えば毎日または一週間の間隔で筋肉肥大を生じる
に十分な量で投与できる。

本発明のヘプタペプチドは、１μｇ／に９／日〜２５０
μｇ／　ｋＩＩＦ／日の用量で、好ましくは５〜１００
μｇ／ｋｇ／日の用量で患者に投与できる。

他の態様は特許請求の範囲に記載されている。

ＢＩＮ　　０．１Ｍに ＢＩＮ　　１．０ＮＧ ＢＩＮ　　５．ＯＮＧ 老＝巳 の （２２３，７）　　（６，２７） ３５６２．６ （１７９，３） ２４４．３ （８，，６３）＾ （１２，１）　　（１，８８） ２６０．５　６３．６ （３９，２）＾　（２，７２） ３６７１．９　２３１．７ （１７４，７＞　　（５，２２） ２０１．６　７６．９ （１４，２＞　　（１，７０）Ｃ ２９６７，９ （１６４，９） ２０４．２ （５，９８）Ｂ ２２０．２　７４．２ （１８，７）　　（２，３５） ＾＝ｐ＜０．０２５ １３＝ｐ＜０．０５０ Ｃ＝ｐ＜０．００５ 朱ｚ１ ３２　　　　０．３９８　　　　０．３５２９６　　　
　０．５５１　　　　０．５２３軸索の直径平均値（μ
ｍ） ３２　　　１．８８８　　　２．２４１９６　　　２．
３３５　　　２．４９８ミニリン鞘が形成した軸索の数
／　０．００４ｓｑ、ｍｎ＋比歎り男し１ｕ四魁艷　コ
ン　ロール ３２　　　７８　　　　６３ ９６　　　６２　　　　６４ 老コ［ よ　１ｅａｎ　　れた　　における　　８ミニリン鞘の
厚さの平均値（μｍ） 旦４＠工■エ　試ＪＩＩＪ！！Ｉ−コントロール３２　
　　　　　０．３１０　　　　　　０．２９８９６　　
　　　　０．６００　　　　　　０．５３２軸索の直径
平均値（μｍ） ３２　　　　　　１．５４５　　　　　　１．６０１９
６　　　　　　２．０７８　　　　　　１．８８７ミエ
リン鞘が形成した軸索の数１０．００４　ｓ、ｑ、ｍｍ
比艷り吐工絞虹４１−　コン　ロール ３２　　　　６４　　　　４３ ９６　　　　８５　　　　６７

【図面の簡単な説明】

図１は損傷の違いによる腔部の違いについての略図であ
る。 図２は食塩水あるいは投薬量の異なるＢＩＭ−２２０１
５で治療後の機能回復に関する線グラフである。 図３は歩行試験での運動機能回復を説明する棒グラフで
ある。 図４は綿板面積の棒グラフである。 図５は綿板周辺の長さを示す棒グラフである。 図６は内部分岐した綿板の棒グラフである。 図７は綿板筋繊維の直径の棒グラフである。 （外４名） ８１Ｍ２２０１５Ｃ 歩行試験パターン 図面の浄書（内容に変更なし） 神経障害 足の長さ カカト 背屈曲 つま先の 開　　き 技部異常 Ａ：ｐ　ｆｏ、０２５ ａ＝ｐ＋　０．０５０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、構造式： Ａ＾１−Ａ＾２−Ａ＾３−Ａ＾４−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔ
   ｒｐ−Ａ＾５で表わされ、その式中の Ａ＾１はＨ或いはアセチル、 Ａ＾２はＡｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅ、或いはＭｅｔ、
   Ａ＾３はＧｌｕ或いはＧｌｎ、 Ａ＾４はＨｉｓ或いはＴｙｒ、 Ａ＾５はＮＨ＿２、Ｇｌｙ−ＮＨ＿２、或いはＤ−Ａｌ
   ａ−ＮＨ＿２ であり、さらにＡ＾３がＧｌｕでＡ＾４がＨｉｓの時、
   Ａ＾２はＭｅｔでもＮｌｅでもありえないヘプタペプチ
   ド、或いは薬剤として使用可能なそれらの塩を、筋肉消
   耗を予防するに十分な量哺乳動物に投与することからな
   る筋肉消耗の治療法。 ２、Ａ＾１がＨ、Ａ＾２がＤ−Ａｌａ、Ａ＾３がＧｌｎ
   、Ａ＾４がＴｙｒ、さらにＡ＾５がＧｌｙ−ＮＨ＿２で
   ある請求項１記載の方法。 ３、前記哺乳動物が人間の患者である請求項１記載の方
   法。 ４、前記ヘプタペプチドが請求項１に示す構造式を持つ
   請求項２記載の方法。 ５、前記筋肉消耗が神経外傷に起因している請求項３記
   載の方法。 ６、前記筋肉消耗が遺伝或いは代謝疾病に起因している
   請求項３記載の方法。 ７、前記疾病がドゥーシェンヌ筋ジストロフィーである
   請求項５記載の方法。 ８、前記疾病が糖尿病或いは癌である請求項７記載の方
   法。