JPH03280882A - 魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は魚類病原菌の種決定遺伝子ＤＮＡに関するも
のであり、さらに詳細にはエロモナス・ハイドロフィラ
あるいはエロモナス・サルモニシダ種、非溶血性ストレ
プトコッカス　ｓｐ３種およびエドワジエラ・タルダ種
の種決定遺伝子ＤＮＡおよびそれらを含有する該菌種の
同定試薬に関するものである。

従来の技術： 魚類病原菌による感染症が養殖場で発生したとき、その
原因菌を究明することは魚病の予防・治療にとって重要
なことである。

従来、魚類病原菌を問わず一般細菌の分類、同定はその
形態や生化学的性状あるいは免疫学的手法を用いた生物
学的性状で行われてきた。最近、生化学あるいは分子遺
伝学の進歩により、その菌の持つ染色体ＤＮＡやＲＮＡ
、菌体物質および菌が生産する物質を比較することによ
る、いわゆる化学的性状による分類が行われるようにな
ってきた。

発明が解決しようとする問題点： しかしながら、生物学的性状あるいは化学的性状による
分類法は、最近の分類学にとっては重要であるが、各々
の手法は複雑で時間を費やすために、病魚の原因菌を簡
便かつ迅速に同定するには適していない。

問題点を解決するための手ｇ１： 生物は種によって形態やそれを構成する成分が異なる。

これらの特徴はその生物の持つ遺伝子によって規定され
ている。細菌においても同様で、種によって生化学的性
状が異なる。即ち性状が異なることはそれを規定する遺
伝子も異なる。

このような観点から、この発明者等は養殖場で流行が絶
えず、経涜的に損失が大きいエロモナス病くせっそう病
および出血性敗血症）、連鎖球菌症およびエドワジェラ
感染症について、それらの病原菌である、遺伝子的に等
しいと考えられるため区別できないエロモナス・サルモ
ニシダ（＾ｅｒｏｓｏｎａｓ　５ａｌｓｏｎｉｃｉｄａ
）および工０モナスーハイドロフイラ（＾ｅ　ｒ　ｏ　
ｍ　ｏ　ｎ　ａ　ｓ　Ｌ紅肚■］）、非溶血性ストレプ
トコッカス　ｓｐ、（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓ
ｐ、）およびエドワジエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉ
ｅｌｌａ尤士）のみが持つ種特定遺伝子をそれぞれ見出
し、さらにこれらのＤＮＡをプローブ（標識した検出試
料）として菌種未知の魚病の病ぶ菌のＤＮＡとハイブリ
ダイゼーションすることにより、該菌がエロモナス・ハ
イドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダ種、非
溶血性ストレプトコッカス　ｉｐ、１ｍまたはエドワジ
エラ・タルダ種であるが否がを簡易かつ迅速に同定でき
るという新知見を得、この発明を完成した。

以下に、エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナ
ス・サルモニシダ種の種決定遺伝子ＤＮＡ、非溶血性ス
トレプトコッカス　ｓｐ、種の種決定遺伝子ＤＮＡおよ
びエドワジエラ・タルダ種の種決定遺伝子ＤＮＡの一般
的な製造法を示す。

第４図に示すように、せっそう病の起因菌、たとえばエ
ロモナス・サルモニシダＡＴＣＣ１４１７４、連鎖球菌
症の起因薗　ストレプトコッカス　ｓｐ。

ＮＧ３２０Ｂおよびバラコロ病等の起因菌エドワジエラ
・タルダ　Ｅｄｋ−１それぞれの染色体ＤＮＡを常法、
例えばマーマー（Ｍａｒｓ＋ｕｒ）法により抽出する。

ここで用いるエロモナス番すルモニシダＡＴＣＣ１４１
７４はアメリカン会タイプ・カルチュアー・コレクショ
ンに寄託されていて一般に入手できる菌株であり、スト
レプトコッカスＳρ、　ＮＧ３２０６および　エドワジ
エラ・タルダ　Ｅｄｋ−１も工業技術院微生物工業技術
研究所にそれぞれ受託番号微工研菌寄第　１１３７１号
　および　１１３７２号として寄託されている。

得られるＤＮＡ断片のそれぞれについて、　ＤＮＡをそ
れぞれエロモナス・サルモニシダ＾丁ＣＣｌ４１７４は
制限酵素ＢａｍＨＩで、非溶血性ストレプトコッカスｓ
ｐ、　ＮＧ３２０６およびエドワジエラ・タルクＥｄｋ
−１は制御Ｉ酵素船す県３＾■で切断し、得られるＤＮ
Ａ断片それぞれについてベクタープラスミドＰＵＣ１１
９にショットガンクローニングを行う。

ここで使用するベクタープラスミド　ρυＣ１１９は、
例えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ第
１５３巻　（１９８７年）（ＡＣＡＤＥＭＩＣＰＲＥＳ
Ｓ、　ＩＮＣ，）に記載されている公知のプラスミドで
ある。

このようにして得られるリコンとナンドプラスミドをそ
れぞれエスシェリヒア・コリ　ＮＶ１１８４株（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ、　Ｊ、、　ｉｌ、ｃｒｅａ、　ａｎｄ　ｐ、
　Ｈ，５ｅｅｂｕｒ＆。

１９８１、　Ａ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｓｈｏｔｇｕ
ｎ　ＤＮＡ　ｓｅｑｅｎｅｉｎｇ−Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：３０９　＠　＠　）に形質
転換を行い、得られるエロモナス・サルモニシダＡＴＣ
Ｃ１４１７４、ストレプトコッカス　ｓｐ、　ＮＧ３２
０６およびエドワジエラ・タルク　Ｅｄｋ−１の染色体
ＤＮＡ断片を含むリコンビナントプラスミドＤＮＡをア
ルカリ５ＤＳｔ（Ｐｌａｓｍｉｄｉ　　（ＩＲＬ　　Ｐ
ＲＥＳＳ）−ａ　　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　ａｐｐｒｏ
ａｃｈに記載の方法）により抽出し、そのＤＮＡをそれ
ぞれエロモナス・サルモニシダＡ丁ＣＣｌ４１７４は制
限酵素Ｂａ■ＩＩで、非溶血性ストレプトコッカスｉｐ
、ＮＧ３２０６およびエドワジエラ・タルクＥｄｋ−１
は制限酵素５ａｕ３Ａ　Ｉで切断し、電気泳動によりこ
れらのクローン化されたＤＮＡの分子量を求め、エロモ
ナス・サルモニシダＡＴＣＣ１４１７４についてはアガ
ロース電気泳動法により測定した分子量０゜３５ｋｂｐ
附近のクローンを、非溶血性ストレプトコッカス　Ｓｐ
。

ＮＧ３２０６に就いては、同様の測定法により測定した
分子量　０．４５　ｋｂｐｊｌｔ近のクローンを、エド
ワジエラ・タルクＥｄｋ−１についても分子量０．６５
ｋｂｐ附近のクローンをそれぞれ選択し、単離する。

このようにして得られるエロモナス・サルモニシダ＾丁
ＣＣｌ４１７４の分子量　ｏ、３５ｋｂｐ附近のＤＮＡ
断片をそれぞれプローブとして、これらとエロモナス・
サルモニシダの染色体ＤＮＡのＢａ５ＨＩ消化断片とサ
ザン　プロット　ハイブリダイゼーションを行い、かつ
エロモナス・サルモニシダの増殖したコロニーとコロニ
ーハイブリダイゼーションを行い、エロモナス・サルモ
ニシダおよびエロモナス・ハイドロフィラとのみハイブ
リッドを形成し、他の細菌とハイブリッドを形成しない
ものを探索することにより、目的とするエロモナス・ハ
イドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダ種の決
定遺伝子ＤＮＡが得られる。

同様にして、非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ。

ＮＧ３２０６の分子量　０．４５ｋｂｐ附近のＤＮＡ断
片をそれぞれプローブとして、これらと非溶血性ストレ
プトコッカス　ｓｐ、の染色体ＤＮＡの５ａｕ３Ａ　Ｉ
消化断片とサザン　プロット　ハイブリダイゼーション
を行い、かつ非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、の増
殖したコロニーとコロニーハイブリダイゼーションを行
い、非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、とのみハイブ
リッドを形成し、他の細菌とハイブリッドを形成しない
ものを探索することにより、目的とする非溶血性ストレ
プトコッカス　ｓｐ、の決定遺伝子ＤＮＡが得られる。

同様にしてエドワジエラ・タルクＥｄｋ−１の分子量０
．６５ｋｂｐ［近のＤＮＡ断片をそれぞれプローブとし
て、これらとエドワジエラ・タルクの染色体ＤＮＡの５
ａｕ３Ａ　Ｉ消化断片とサザン　プロット　ハイブリダ
イゼーションを行い、かつエドワジェラ・タルクの増殖
したコロニーとコロニーハイブリダイゼーションを行い
、エドワジエラ・タルク　とのみハイブリッドを形成し
、他の細菌とハイブリッドを形成しないものを探索する
ことにより、目的とするエドワジエラ・タルクの種決定
遺伝子ＤＮＡが得られる。

このようにして得られるエロモナス・ハイドロフィラあ
るいはエロモナス・サルモニシダ種の決定遺伝子ＤＮＡ
は次のような特徴を有する。

（イ）該ＤＮＡの塩基配列は第１図に示す通りである。

（ロ）該ＤＮＡの塩基対数は３５２ｂＰである。

また、非溶血性ストレプトコッカス　Ｓｐ９の種決定遺
伝子ＤＮＡは次のような特徴を有する。

（イ）該ＤＮＡの塩基配列は第２図に示す通りである。

（ロ）該ＤＮＡの塩基対数は＜５４ｂｐである。

さらにエドワジェラ・タルクの種決定遺伝子ＤＮＡは次
のような特徴を有する。

（イ）該ＤＮＡの塩基配列は第３図に示す通りである。

（ｆｆ）該ＤＮＡの塩基対数は６６３ｂｐである。

発明の効果： この発明のエロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモ
ナス・サルモニシダ種の決定遺伝子ＤＮＡはエロモナス
・サルモニシダあるいはエロモナスハイドロフィラの同
定に、非溶血性ストレプトコッカス　Ｂｐ、の種決定遺
伝子ＤＮＡは魚類病原菌非溶血性ストレプトコッカス　
ｓｐ、の同定に、エドヮジエラ・タルクの種決定遺伝子
ＤＮＡは魚類病原菌エドワジェラ・タルクの同定にそれ
ぞれ有用である。すなわち、適当な標識物で標識したエ
ロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サルモ
ニシダ種の法定遺伝子ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ　（同様に
、適当な標識物で標識した非溶血性ストレプトコッカス
　５ｐ、の種決定遺伝子ＤＮＡの一本ｊｌ　ＤＮＡある
いはエドワジェラ・タルクの種決定遺伝子ＤＮＡの一本
鎖ＤＮＡ）と種未知の魚の病原菌のＤＮＡの一本鎖とを
ハイブリダイゼーションすることによって、該菌種未知
の魚の病原菌がエロモナス・ハイドロフィラあるいはエ
ロモナス・サルモニシダ種（同様にして、非溶血性スト
レプトコッカス　Ｓｐ、あるいはエドワジエラ・タルク
であるか否か）を同定することができる。

ここで用いられる標識物としては、通常この分野で用い
られる標識物をそのまま使用することができ、そのよう
な例としては、放射性同位元素、酵素、蛍光性化合物、
化学的発光性化合物、化学的発色性化合物、生物発光性
化合物、生物発色性化合物等が挙げられる。

この発明の、標識物で標識されたエロモナス・ハイドロ
フィラあるいはエロモナス・サルモニシダの種決定遺伝
子、非溶血性ストレプトコッカスｓｐ、の種決定遺伝子
ＤＮＡおよびエドワジエラ・タルクの種決定遺伝子ＤＮ
Ａは、それぞれの−本鎖と各種担体、希釈剤とを含有す
るエロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サ
ルモニシダ種、非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、種
およびエドワジエラ・タルダ種の同定用試薬として、ま
た、これらの＃議された種決定遺伝子ＤＮＡをそれぞれ
含有するキットとして用いることができる。

実施ｇ４： 次にこの発明を実施例により説明する。

なお、以下の実施例の説明には、下記の略号を使用した
。

１１１８　： ｌｌ中　　ポリペプトン　　　　　１０ｇビーフエクス
トラクト　　１０ｇ 食塩　　　　　　　　　　１０ｇ ｐｌ（７，５にａｌｌ整 ＩＩ＾ニハードインフュージョン寒天培地１１１１Ａ　
：　　０．５！食塩加ハートインフュージョン寒天培地 ２ＨＩＹＡ：　０．２！イーストエクストラクト添加お
よび１．５χ食塩加ハートインフュージョン寒天培地 ＭＩＧＡ：０．３χグルコース添加ハートインフユージ
ヨン寒天培地 ２ｘＹＴ： １１中　　　バクトドリプトン　　　　　　　２０ｇイ
ーストエクストラクト　　　１０ｇ 食塩　　　　　　　　　　　　　５ｇ 寒天　　　　　　　　　　　　１５ｇ ｐＨ７，５に調整 ｄＤＷ　：精製水 トリス：ヒドロキシメチル　アミノメタンＤＴＴ　ニジ
チオスレイトール ＡＴＰ　：アデノシンー５′−トリフオスフェートＢＳ
Ａ　：牛血漬アルブミン Ｘ−ｇａｌ　：　５−プロモー４−クロロ−３−インド
リ−ルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド ＴＢＥＩＩ　％液：　０．０８９Ｍ！−リス・ホウ酸塩
０、Ｏｆ１９Ｍ−ホウ酸及び０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ混
液２ＮＥ　：　２−メルカプトエタノールＫｂｐ　：キ
ロ塩基対 ＥＤＴＡ　：エチレンジアミンテトラ酢酸ＴＥ：　　　
１０ｍ１Ｍ　　　　　ト　　リ　　ス　　・　　ＨＣＩ
　　（ｐＨ８，０）１麿Ｍ　　ＥＤＴＡ　　ｆｆｌ液 ＣＴＡＢ−ＮａＣ１溶液： １０２ＣＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルニウムブロマ
イド） ０、７Ｍ　　　ＮａＣ１ 実施例１（エロモナス・サルモニシダあるいはエロモナ
ス・ハイドロフィラ種の種決定遺伝子ＤＮＡの製法） （１）エロモナス・サルモニシダの染色体ＤＮＡの抽出
： エロモナス・サルモニシダ　Ａ丁ＣＣ１４１７４株をＩ
ＮＢ培地で２５℃−夜培養した．該菌培養液から６，０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を捨て、沈殿菌
体を得た．この沈殿菌体から、ＭｅｌＩｄｅらの方法　
（　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．　１４９：１１４−１２２
．　１９８２）でエロモナス．サルモニシダＡ丁ＣＣ１
４１７４株の染色体ＤＮＡを得た．これを真空乾燥した
Ｌ１■ｌの丁Ｅ溶液に溶解させ、得られたＤＮＡを一２
０℃で保存した。

（２）ベクタープラスミドｐＬｌｃ１１９　ＯＮＡの抽
出：ベクタープラスミドＤＮＡ　ｐＵｃ１１９を保持す
るエスシェリヒア・コリ　ＭＶ１１８４株を２ｘＹＴ培
地で一晩培養し、アルカリＳＤＳ法に従ってベクタープ
ラスミド　ＤＮＡ　　ＰＵＣ　　１１９を採取した。

（３）エロモナス・サルモニシダ染色体ＤＮＡの消化：
エロモナス・サルモニシダ染色体ＤＮＡ約１μｇをＢａ
ｗｌ　　Ｉ　　　緩　衝　液　　［　　　１５０ａＭ　
　　ＮａＣ１　　、　　６ＨＭ　　　　ト　　リ　　ス
−）１ｃＩ（ｐＨ８．０）　、６ｍＭ　ＭｇＣＩ２］　
２０μｌに溶かし、用Ｈｌ約２〜４ユニットを加えて３
７℃で１時間反応させた。

反応後、常法に従ってフェノール処理を１回、ジエチル
エーテル処理を　２回行って反応を止め、Ｂａｇ）Ｉ　
ＴによるＤＮＡの消化断片液を得た。

（４）ベクタープラスミドＤＮＡ　ｐＵｃ１１９　（ｆ
）　ＢａａＨＩ　＋：　ヨる消化： ベクタープラスミド　ＤＮＡ　ｐＵｃ１１９約０．１Ｈ
ｇをＢａｓＨＩｌ１ｍ液に溶かし、ＢａａＨ　Ｉ約１ユ
ニットを加えて３７°Ｃで１時間反応させた．反応７１
ｍ法に従ってフェノール処理を１回、ジエチルエーテル
処理を　２回行って反応を止め、ＢａｍＨ　ＩによるＤ
ＮＡの消化断片液を得た。

（５）エロモナス・サルモニシダＤＮＡのｌｌａｓＨＩ
ｆｉ化断片のベクタープラスミドＤＮＡ　ｐＵｃ１１９
へのクローニング： エロモナス・サルモニシダ染色体ＤＮＡの…ＨＩ消化断
片とベクタープラスミドＤＮＡ　ｐＵｃ１１９の［１Ｈ
ｍ）ｌＩｆｉ化断片とを混合し、２倍量の９９％冷エタ
ノール（−２０°Ｃ保存）と１０分の１量の　３Ｍ酢酸
ナトリウムを加え、−７０°Ｃで１５分間静置した．こ
れを　１４，０００ｒｐｍで　５分間遠心後、アスピレ
ートし、７５％冷エタノールでリンスしたＬ乾燥させた
。

ｄｏｌｌｌ　１４μｌを入れライゲーション緩衝液［　
０．５Ｈト　リ　ス　・　ＭＣＩ　　（　　ｐＨ　　７
．４）　　、　　０．ＩＭ　　にｇＣＬ、　０．１Ｈ　
　Ｄτ丁１０ｍにスペルミジン、】０量Ｍ　ＡＴＰ、１
會ｇ／　ｍｌ　ＢＳＡＩ４μｌを加え、さらにＴ４リガ
ーゼ（エスシェリヒア・コリ　Ｃ７ｓ丁４リガーゼ）２
μｌ追加し、１５℃で一晩反応させて、環状のりコンビ
ナンドプラスミドＤＮＡを得た。

（６）エスシェリヒア・コリの形質転換にょろりコンビ
ナンドプラスミドＤＮＡの複製 連結された環状のりコンビナンドＤＮＡを用い、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｇ　（　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ）記載の
方法に従って、エスシェリヒアコリ　ＭＶ］Ｉ８４株に
形質転換した．ｍられた形質転換株をアンビシリ：／　
　１００ＡＩｇ／ＩＩＩおよび　Ｘ　−　ｇ　ａ　１　
４０ＩＪｇ／＠１含有２ｘＹＴ平板に塗抹し、３７°Ｃ
で一晩培養した。培地上に成育したアンピシリン耐性白
色のコロニーを、リコンビナントＤＮＡの複製株として
回収した。

（７）エロモナス・サルモニシダＤＮＡの消化断片クロ
ーンの選択： 得られた環状のりコンビナンドプラスミドＤＮＡ複製株
を、アルカリＳＯＳ法で抽出し、Ｂａ■Ｈｌで消化後、
０．８％アガロースゲルを用いて丁ＢＥ＄！Ｉ　ｉ液中
８０−Ａで１時間電気泳動を行った．アガロースゲルに
おけるＤＮＡバンドの検出はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ記載の方法で行った。切断ＤＮＡ断片の分子
サイズは、アガロースゲルにおけるそれらの相対移動速
度をλフアージＤＮＡのＨｊｎｄＩＩＩ消化断片の移動
度［Ｌ．Ｈ。

Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ａ．Ｌａｎｄｙ，　Ｇｅｎ
ｅ　２　　（　１９７７）　］と此較して測定し、約０
．４５ｋｂｐの…ＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。

（８）ハイブリダイゼーションによるＮａ：得られた約
０．４５ｋｂＰのＤＮＡ断片は、ニック・トランスレー
ション法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ記載の
方法）により３ｉｐで標識し、目的細菌であるエロモナ
ス・サルモニシダおよびエロモナス・ハイドロフィラの
一本鎖ＤＮＡとのみハイブリッドを形成することをサザ
ン　プロット　ハイブリダイゼーション法およびコロニ
ーハイブリダイゼーション法（第１表）により確認した
。

第　１　表　　　エロモナス・フシｆニシタ゛お　よ　
び　エロモナス・ハイドロフィラの種決定−重鎖ＯＮ＾
のコσ二−ハイフ゛リタ゛イセ゛−シ醤ンの結果ｌ［認
の涜んだ約　０．４５ｋｂｐのＤＮＡクローン断片の塩
基配列を、ニラポンジーン■の　Ｍ１３　Ｓｅｑｕｅｎ
ｃ−ｉｎｇ　Ｋｉｔ　１を用いてジデオキシ法［Ｊ、　
Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０
１．７８（１９８３）ＩＴ決定した。その結果は、第１
図に示した。

実施例２（非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、種の種
決定ＤＮＡ断片のＷ法） （＋）非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、の染色体Ｄ
ＮＡの抽出； 非溶血性ストレプトコッカス　ｉｐ、ＮＧ３２０６株を
ＩＮＢ培地２００ｍ１で一夜培養し、菌培養液を得た。

該菌培養液を６，０００ｒｐ−で１０分間４℃で遠心し
て上澄液を捨て、沈澱菌体に１０ｍＭ　トリス・ＭＣＩ
（ｐＨ８，のと１（１＋Ｍ　ＥＤ丁＾の混液を加えて攪
拌し、この液を６．０００ｒＰ−で１５分間４℃で遠心
して上澄液を捨てた。

残った菌体を２５■ｌのｌｏｍＭ　トリス・ＨＣＩ　（
ｐＨ８，０）と１０■Ｍ　ＥＤ丁Ａの混液で懸濁し、５
０■ｇのりゾチーム（和光純薬製）を加え、穏やかに混
合し、４°Ｃで２〜３時間放置した。この液を６．００
０ｒｐ■で１５分間４°Ｃで遠心して、再度　１０５Ｍ
　トリス・ＭＣＩ　（ｐＨ８，０）と１０■Ｍ　ＥＤＴ
＾のｆｉ液で懸濁し、１■ｌの２０％ＳＤＳを加えて３
７°Ｃで１時間反応させた。さらに、１■ｌの丁Ｅ飽和
フェノールを加え、５分間穏やかに振盪後ａ、ｏｏｏｒ
ｐ−で１５分間遠心した。この上澄を別の遠心チューブ
に移し、これと等量のフェノール／クロロホルム（１：
１）を加え、穏やかに振盪した後、８．００Ｏｒｐｍで
１５分間遠心した。この上澄を別の遠心チューブに移し
、１／１０量の酢酸ナトリウム溶液と２．５倍量の冷エ
タノールを加え、−８０℃で１０分間放置した。

その後、１２．００Ｏｒｐｍ１０分間４℃で遠心し、上
澄を捨て、これに７５％冷エタノールを加え、洗浄し、
真空乾燥した。最後に１■ｌのＴＥ浴溶液溶解させ、得
られたＤＮＡを一２０°Ｃで保存した。

（２）ベクタープラスミド　ＰＵＣ１１９ＯＮＡの抽出
：実施例　１−（２）と同じ方法でベクタープラスミド
ｐυＣ１１９ＤＮＡを精製した。

（３）非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、染色体ＤＮ
Ａの消化： 非溶血性ストレプトコッカス　ＳＰ、染色体ＤＮＡ約１
／Ｊｇ　を　５ａｕ３ＡＩ　　［５０ｍ１ｌ　　　Ｎａ
Ｃ１、２０ｍＭ　　　　ト　　リ　　ス　　−ＭＣＩ（
ｐＨ７，５）、１０５Ｍ　ＭｇＣ１１］緩衝液に溶かし
、５ａｕ３ＡＩ約２〜４ユニツトを加えて３７℃で１時
間反応させた。

反応し常法に従ってフェノール処理を１回、ジエチルエ
ーテル処理を　２回行って反応を止め、５ａｕ３Ａ　Ｉ
によるＤＮＡの消化断片液を得た。

（４）ベクタープラスミドＤＮＡ　ｐＬＩｃ１１９の消
化：実施例　１−（４）と同じ方法でベクタープラスミ
ドｐＵｃ１１９のＢａ＊ＨＩ消化断片ＤＮＡを得た。

（５）非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、　ＤＮＡの
用３ＡＩ消化断片とベクタープラスミド　ｐＵｃ１１９
へのクローニング： 非溶血性ストレプトコッカス　ｓＰ、染色体ＤＮＡの５
ａｕ３Ａ　Ｉの消化断片とベクタープラスミド　ＤＮＡ
ｐＵｃ１１９のＢａｍＨＩの消化断片とを混合し、これ
にフェノール／クロロホルム（＋、　：　１　）を等量
大れ良く混合した徨、１２，０ＯＯｒｐ−で５分間遠心
し、上澄を新しいチューブに移し、ジエチルエーテル処
理を２回行なった。ジエチルエーテルを完全に除いた後
、１７１０量の　３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量の９
９％冷エタノールを加え、−８０℃で２０分間静置した
。これを　１３，０００ｒｐ■で　５分間４℃で遠心を
行ない上澄を取除いた。沈殿物を７０％冷エタノールで
リンスした後、真空乾燥し、ｄＤＷ　２０μｌに溶解さ
せた。

これに　２０％ＰＥＧ６０００／　２．５Ｍ　ＮａＣ１
液　１μｍに　２ｕｌの丁、ライゲーション緩衝液と１
００ユニツトの７４１７ガーゼを混ぜて、１５℃で一晩
反応させ、環状のりコンビナンドプラスミドＤＮＡを得
た。

（６）エスシェリヒア・コリの形質転換にょろりコンビ
ナンドプラスミドＤＮＡの［１ 連結された環状のりコンビナンドＤＮＡを用い、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｇ記載の方法に従って、エス
シェリヒア・コリ　ＭＶ４１８４に形質転換した。得ら
れた形質転換株をアンピシリン　２００μｇ／−１、Ｘ
　−ｇａ１４０μｇ／■１および０．０１％チアミン含
有２ｘＹＴ平板に塗抹し、３７℃で一晩培養した。培地
上に成育したアンピシリン耐性白色のコロニーを、リコ
ンビナントＤＮＡの複製株として単離した。

（７）非溶血性ストレプトコッカス　ｉｐ、　ＤＮＡの
消化断片クローンの選択： 得られた環状のりコンビナンドプラスミドＤＮＡ複製株
を、実施例　１−（７）と同じ電気泳動法で、約０．４
５ｋｂｐの顕３＾Ｉ消化ＤＮＡ断片を得た。

（８）ハイブリダイゼーションによるＩ［Ｅ　：得られ
た約０．４５ｋｂＰのＤＮＡ断片は、実施例１−（８）
の方法で標識し、目的細菌である非溶血性ストレプトコ
ッカス　ｓｐ、の−重鎖ＤＮＡとのみハイブリッドを形
成することをサザン　プロット　ハイブリダイゼーショ
ン法およびコロニーハイブリダイゼーション法（第２表
）により確認した。

（９）塩基配列の決定： Ｍ認の涛んだ約０．４５ｋｂｐのＤＮＡクローン断片の
塩基配列を、ファルマシア社のＴ７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｊｎｇＫｉｔを用いてジデオキシ法で決定した。

その結果は、第２図に示した。

実施例３（エドワジエラ・タルダ種の種決定ＤＮＡ断片
の製法） （１）エドワジエラ・タルダ染色体ＤＮＡの抽出：エド
ワジエラ・タルダ　Ｅｄｋ−１株をＩＮＢ培地１００■
ｌで一夜培養し、菌培養液を得た。該菌培養液を６．０
ＯＯｒｐｍで１０分間４℃で遠心して上澄液を捨て、沈
澱菌体に９＋ロのＴＥ緩衝液を加え懸濁し、０．５■ｌ
の１０％ＳＤＳ溶液および５０μｌのプロテナーゼに溶
液（２０５ｇ／ｍｌ：ｄＤＷ）を加え３７℃で１時間反
応させた。

この溶液に５ＭＮａＣ１を１．８ｍｌ加え完全に混合し
、さらにＣＴＡＢ／ＮａＣ１溶液を加え混合後、６５℃
で２０分間反応させた０反応後、等量のクロロホルム／
イソアミルアルコールを加え８，０００ｒｐ−で１０分
間４℃で遠心し、上澄を新しいチューブに移し、等量の
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加
えて８，０００ｒｐ■で１０分間４℃で遠心した。上澄
を新しいチューブに移し、０．６容のイソプロパツール
を加え、１５分間放置した後、１２，０００ｒｐ■で１
０分間４°Ｃで遠心した。この上澄を捨て、７０％エタ
ノールを加えてリンスし、真空乾燥した。乾燥残漬を２
■ｌの丁ＥＩＩ衝液で溶解した。溶解した乾燥残漬に１
００μｌのエチジウムブロマイドおよび２．６ｇのＣｇ
Ｃｌを加え、１００，０００ｒｐｍで５時間２０℃で遠
心した。

紫外線照射下で遠心チューブにＤＮＡのバンドを確認し
、その部分を抜取り、イソプロパツールでエチジウムブ
ロマイドを除去した０次に、この溶液を２１の丁Ｅｌ！
衝液で一昼夜透析を行ない、ＣｇＣｌを取除き、染色体
ＤＮＡを採取した徨、トリス・ＨＣＬ　（ｐＨ７，５）
　５０■ＨとＥＤ丁Ａ１■ｈを含有する液　２■ｌを加
えて４°Ｃで保存した。

（２）ベクタープラスミドｐＬＩｃ１１９　ＤＮＡの抽
出：実施例　１−（２）と同様にしてベクタープラスミ
ドＤＮＡ　ｐＵｃ１１９を採取シた。

（３）エドワジエラ・タルク染色体ＤＮＡの消化：エド
ワジエラ・タルク染色体　ＤＮＡ約１μｇを鏡３ＡＩＭ
ＩＩ液２０１Ｊｌに溶かし、５ａｕ３Ａ　Ｉ約　３ユニ
ツトを加えて３７°Ｃで１時間反応させた０反応後、常
法に従ってフェノール処理を１回、ジエチルエーテル処
理を　２回行って反応を止め、５ａｕ３Ａ　ＩによるＤ
ＮＡの消化断片液を得た。

（４）ベクタープラスミドＤＮＡ　ｐＵｃ１１９の消化
実施例　１−（４）と同様にしてベクタープラスミドＰ
ＵＣ１１９の、…ＨＩによるＤＮＡの消化断片液を得た
。

（５）エドワジエラ・タルク　ＤＮＡの５ａｕ３Ａ　Ｉ
消化断片のベクタープラスミドｐＵｃ１１９へのクロー
ニング：エドワジエラ・タルク　染色体ＤＮＡの５ａｕ
３Ａ　Ｉ消化断片とベクタープラスミドＤＮＡ　ｐＬｌ
ｃＩＨ］の用ＨＩ消化断片を混合し、実施例　１−（５
）と同様にして、環状のりコンビナンドプラスミドＤＮ
Ａを得た。

（６）エスシェリヒア・コリの形質転換によるリコンビ
ナントプラスミドＤＮＡの複製： 連結された環状のりコンビナンドＤＮＡを用い、阿ｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｇ記載の方法に従って、エス
シェリヒア・コリ　ＮＶ１１８４株に形質転換した。

得られた形質転換株をアンピシリン　５０ｐｇ／鳳ｌお
よびＸ−ｇａｌ　４０　ｕ　ｇ／　ｍｌ含有２ｘＹＴ平
板に塗抹し、３７℃で一晩培賛した。培地上に成育した
アンピシリン耐性白色のコロニーを、リコンビナントＤ
ＮＡの複製株として回収した。

（７）エドワジエラ・タルク　ＤＮＡの消化断片クロー
ンの選択： 得られた環状のりコンビナンドプラスミドＤＮＡ複製株
を、アルカリＳＤＳ法で抽出し、３ａｕ３Ａ　Ｉで消化
後、０．８％アガロースゲルを用いてＴＢＥ！！ｌ　Ｉ
ｌｉ液中８０ｍＡで１時間電気泳動を行った。アガロー
スゲルにおけるＤＮＡバンドの検出はＭｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ記載の方法で行った。切断ＤＮＡ断
片の分子サイズは、アガロースゲルにおけるそれらの相
対移動速度をλフアージＤＮＡのＨｉｎｄｍ及びＥｃｏ
ＲＩ消化断片の移動度と比較して測定し、約ｏ、６５ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

（８）ハイブリダイゼーションによる確ト得られた約ｏ
、６５ｋｂｐのＤＮＡ断片は、ニック・トランスレーシ
ョン法により３２ｐで標識し、目的細菌であるエドワジ
エラ・タルクの一本鎖ＤＮＡとのみハイブリッドを形成
することをサザン　プロットハイブリダイゼーション法
およびコロニーハイブリダイゼーション法（第３表）に
より確認した。

第３表 エト ワン゛エラ タルク゛の種決定−重鎖ＤＮＡのコＩ］：−ハイフ゛リ
タ イセ 一ソヨンの結果 （９）塩基配列の決定： 確認の７斉んだ約０．６５ｋｂｐのＤＮＡクン断片の塩 基配列を、ファルマシア社製のＴ７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕ
ｅｎｃ−ｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてジデオキシ法で決定し
た。その結果は、第３図に示した。

実施例４（エロモナス・サルモニシダあるいはエロモナ
ス・ハイドロフィラ感染のコロニーハイブリダイゼーシ
ョンによる診断） 実施例１で得られたエロモナス・サルモニシダあるいは
エロモナス・ハイドロフィラ種を決定する３５２ｂＰの
染色体ＤＮＡ断片を、ニックトランスレーション法によ
りアイソトープ３２ｐでラベルした。

この３２ｐラベル断片で、野外から入手した新鮮病魚か
ら菌を分離し、エロモナス・サルモニシダあるいはエロ
モナス・ハイドロフィラによる感染であるか否かの診断
を行なった。

日本各地の養殖場から、明らかに感染症を疑う疾病の発
生が認められた「あまご」および「こい」の、各魚群の
魚の肝臓からＨＩＡ培地に直接釣菌した平板の送付を受
けた。この１（ＩＡ平根上に成育していたコロニーを無
作為に１枚当り３株選び、実施例１−（８）に記載の方
法で当日中にコロニーハイブリダイゼーション法による
迅速同定を行なった。

なお、細菌の生育が旺盛なため単独コロニーが得られ無
い時は、細菌の生育中心と推定される部分３点を選んだ
、同様に、初期平板上で単独コロニーが得られる場合は
そのまま、得られない場合はモノセルを反復した後、バ
ーギース（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ）マニュアル　第８版に従
って生物学的方法でも同定を行なった。但し、生物学的
方法では文献上当該魚種の疾病と認知されている菌と明
らかに異なる性質の菌であった場合には、雑菌として処
理し、最終同定まで行なわなかった。

結果は、第４表に示したように今回用いたエロモナス・
サルモニシダあるいはエロモナス・ハイドロフィラの種
決定−重鎖ＤＮＡは、単一コロニが得られなかった場合
でも、該菌が存在した時はエロモナス・サルモニシダお
よびエロモナス・ハイドロフィラともにハイブリッドを
形成し、診断までに要した日数は２日であった。一方、
生物学的方法では最長７日を要し、雑菌の繁殖のため診
断できないこともあった。実用上エロモナス・サルモニ
シダあるいはエロモナス・ハイドロフィラのいずれであ
っても、熱願に対する病原性および宿種特異性は既知で
、種を特定しなくとも診断用としては充分有益である。

また、菌の増殖確認組直ちに診断が可能であったことは
、対象魚の早期治療に資する意味が大きく、種決定遺伝
子ＤＮＡのコロニーハイブリダイゼーション法による早
期診断の有益性が示唆された。

実施例５（非溶血性ストレプトコッカス　ＳＰ、感染症
のコロニーハイブリダイゼーションによる診断）実施例
２で得られた非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、の種
を決定する４５４ｂｐの染色体ＯＮ＾断片を、ニックト
ランスレーション法によりアイソトープ３３Ｐでラベル
した。

このｓｉｐミルラベルで、野外から入手した新鮮病魚か
ら菌を分離し、非溶血性ストレプトコッカス　ＳＰ、に
よる感染であるか否かの診断を行なった。

日本各地の養殖場から、明らかに感染症を疑う疾病の発
生が認められた「はまち」の、各魚群の魚の肝臓から１
山培地に直接釣菌した平板の送付を受けた。このＩＨＩ
Ａ平板上に成育していたコロニーを無作為に１枚当り３
株選び、実施例４と同様の方法および基準で、コロニー
ハイブリダイゼーション法および生物学的方法による同
定を行なった。

結果は、第５表に示したように今回用いた非溶血性スト
レプトコッカス　ｉｐ、の種を決定する一本鎖ＤＮＡは
、単一コロニーが得られなかった場合でも、該菌が存在
した時は全てハイブリッドを形成し、診断までに要した
日数は２日であった。一方、生物学的方法では最長６日
を要し、雑菌の繁殖のため診断できないこともあった。

この、種決定−本＠　ＤＮＡのコロニーハイブリダイゼ
ーション法による診断は、菌の増殖ＷＩＨ後直ちに診断
が可能であり、精度も高いため、有益であることが示唆
された。

実施例６（エドワジエラ・タルク感染症のコロニーハイ
ブリダイゼーションによる診断）実ｔＩ１例３で得られ
たエドワジェラ・タルクの種を決定するＢＢ３ｂＰの染
色体ＤＮＡ断片を、ニックトランスレーション法により
アイソトープ３ａｐでラベルした。

この３１Ｐラベル断片で、野外から入手した新鮮病魚か
ら１を分離し、エドワジエラ・タルクによる感染である
か否かの診断を行なった。

日本各地の養殖場から、明らかに感染症を疑う疾病の発
生が認められた「ひらめ」およびｒうなぎノの、各魚群
の魚の肝臓からＩＨＩ＾およびＨＩＡ培地に直接釣菌し
た平板の送付を受けた。このＩ　Ｈ１４およびＨＩＡ平
板上に成育していたコロニーを無作為に１枚当り３株選
び、実施例４と同様の方法および基準で、コロニーハイ
ブリダイゼーション法および生物学的方法による同定を
行なった。

結果は、第６表に示したように今回用いたエドワジエラ
・タルクの種を決定する一本鎖ＤＮＡは、単一コロニー
が得られなかった場合でも、該菌が存在した時は全てハ
イブリッドを形成し、診断までに要した日数は２日であ
った。一方、生物学的方法では最長７日を要し、雑菌の
繁殖のため診断できないこともあった。即ち、実施例４
および５と同様に、種決定遺伝子の一重鎖ＤＮ＾のコロ
ニーハイブリダイゼーション法による細菌同定の有益性
が示された。

【図面の簡単な説明】

第１図はエロモナス・サルモニシダあるいはエロモナス
・ハイドロフィラの種決定遺伝子ＤＮＡの塩基配列を、
第２図は非溶血性ストレプトコッカス　ｓｐ、の種決定
遺伝子ＤＮＡの塩基配列を、第３図はエドワジエラ・タ
ルダの種決定遺伝子ＤＮＡの塩基配列を、第４図はエロ
モナス・サルモニシダあるいはエロモナス・へイドロフ
ィラの種決定遺伝子ＤＮＡ、非溶血性ストレプトコッカ
ス　ｓｐ、の種決定遺伝子ＤＮＡおよびエドワジエラ・
タルダの種決定遺伝子ＯＮへのクローニング過程を、そ
れぞれ示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のような特徴を有する魚類病原菌エロモナス・
   ハイドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダ種の
   決定遺伝子ＤＮＡ： （イ）該ＤＮＡの塩基配列は第１図に示す通りである。 （ロ）該ＤＮＡの塩基対数は３５２ｂｐである。
2. （２）次のような特徴を有する魚類病原菌非溶血性スト
   レプトコッカスｓｐ．種の決定遺伝子ＤＮＡ：（イ）該
   ＤＮＡの塩基配列は第２図に示す通りである。 （ロ）該ＤＮＡの塩基対数は４５４ｂｐである。
3. （３）次のような特徴を有する魚類病原菌エドワジエラ
   ・タルダ種の決定遺伝子ＤＮＡ： （イ）該ＤＮＡの塩基配列は第３図に示す通りである。 （ロ）該ＤＮＡの塩基対数は６６３ｂｐである。
4. （４）標識物で標識されたエロモナス・ハイドロフィラ
   あるいはエロモナス・サルモニシダ種の決定遺伝子ＤＮ
   Ａの一本鎖ＤＮＡを含有する魚類病原性エロモナス・ハ
   イドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダ種の同
   定用試薬。
5. （５）標識物で標識された非溶血性ストレプトコッカス
   ｓｐ．種の決定遺伝子ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡを含有する
   魚類病原菌非溶血性ストレプトコッカスｓｐ．種の同定
   用試薬。
6. （６）標識物で標識されたエドワジエラ・タルダ種の決
   定遺伝子ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡを含有する魚類病原菌エ
   ドワジエラ・タルダ種の同定用試薬。
7. （７）検体菌のＤＮＡの一本鎖と標識物で標識された魚
   類病原性エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナ
   ス・サルモニシダ種の決定遺伝子ＤＮＡの一本鎖プロー
   ブとをハイブリダイズすることを特徴とする該検体菌が
   エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サル
   モニシダ種であるか否かを同定する方法。
8. （８）検体菌のＤＮＡの一本鎖と標識物で標識された魚
   類病原菌非溶血性ストレプトコッカスｓｐ．種の決定遺
   伝子ＤＮＡの一本鎖プローブとをハイブリダイズするこ
   とを特徴とする該検体菌が非溶血性ストレプトコッカス
   ｓｐ．種であるか否かを同定する方法。
9. （９）検体菌のＤＮＡの一本鎖と標識物で標識された魚
   類病原菌エドワジエラ・タルダ種の決定遺伝子ＤＮＡの
   一本鎖プローブとをハイブリダイズすることを特徴とす
   る該検体菌がエドワジエラ・タルダ種であるか否かを同
   定する方法。