JPH03282367A - 遊離アミノ酸類の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮呈上色肌■光豊 本発明は、ペプチド類と遊離アミノ酸類とを含む溶液中
の遊離アミノ酸類の含量を迅速、かつ高精度に定量する
方法に関する。

従】団ｌ支拵 従来、成分栄養剤の窒素源としては、アミノ酸混合物や
ジペプチド及びトリペプチドを中心とするペプチド類が
用いられている。更に、小腸におけるアミノ酸吸収とペ
プチド吸収との違いを基に、特定量のアミノ酸混合物と
ペプチド類とを窒素源とした持続性及び吸収性の良好な
栄養剤も提案されている（特開昭６３−２７９７６５号
公報）。

これら栄養剤に用いる窒素源の多くは、蛋白質酵素加水
分解物である。これらは、蛋白質を酵素で加水分解する
過程において、ジペプチド及びトリペプチドなどのペプ
チド類と共に遊離アミノ酸類が生成してくる。従って、
蛋白質酵素加水分解物の製造に際しては、蛋白質の分解
率と共に遊離アミノ酸類の含有率も製品の規格上、重要
な測定項目となっている。しかし、蛋白質の分解率を迅
速に測定することは出来るものの、遊離アミノ酸類の含
有率を迅速、かつ高精度で測定することは共存するペプ
チド類の妨害があるために出来ないのが現状である。

従って、遊離アミノ酸の正確な定量には、測定前に、ア
ミノ酸とペプチド相互の分離が必要であった。

各種アミノ酸類とペプチド類を分離する方法としては、
スルホサリチル酸やトリクロル酢酸等の除蛋白試薬によ
る方法、ＵＦ膜処理法、セファデックス樹脂によるゲル
濾過法などがある。しかし、これらの方法では、アミノ
酸は、分子量が十分大きいペプチドとは分離可能である
が、ジおよびトリペプチド等の低分子ペプチドとは十分
分離できない欠点があった。一方、アミノ酸類とペプチ
ド類の吸着性の違いを利用し、二価の銅イオンと市販の
多糖類ゲルであるセファデックスＧ−２５ゲルをアルカ
リ条件下でキレート結合させた担体を充填したカラム（
以下、銅キレートカラムと称する）を用いてクロマトグ
ラフに付す方法が提案されてイル、　　［ＡＮＡＬＹＴ
ＩＣＡＬ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　９７．３６７−
３７５（１９７９）　） ＜”しよ゛と　る量 本発明者らは、上述した状況に鑑み、遊離アミノ酸類と
ペプチド類を含む溶液、特に、蛋白質酵素加水分解物の
溶液やペプチドを合成した反応溶液中の遊離アミノ酸類
の含普を迅速、かつ高精度で測定する方法を鋭意検討し
た結果、多糖類と銅とをキレート結合させた担体を用い
ることにより、遊離アミノ酸類とペプチド類とを迅速、
かつほぼ安全に分離することができ、その結果遊離アミ
ノ酸類の量を高精度で測定することができることを見出
し、本発明を完成するに至った。

従って、本発明では遊離アミノ酸類とペプチド類とを含
む溶液中の遊離アミノ酸類の量を迅速、かつ高精度で測
定する方法を提供することを課題とする。

なお、この方法を応用し、遊離アミノ酸類とペプチド類
を含む溶液中から多ＩＩ類と銅をキレート結合させた担
体を用いて遊離アミノ酸を分離する装置とその分離した
遊離アミノ酸を分析する装置を一体化した遊離アミノ酸
類の量を迅速、かつ高精度に定量出来る装置も試作する
に至っている。

ｉ　　　”　　るための すなわち、本発明は、ペプチド類と遊離アミノ酸類とを
含む溶液を多１類ゲルと銅とをキレート結合させた担体
と接触させてペプチド類と遊離アミノ酸類とを分離させ
、この分離された遊離アミノ酸類の量を定量するこさよ
りなる遊離アミノ酸類の定量方法である。

本発明の方法について、まず、遊離アミノ酸類とペプチ
ド類とを分離するために用いる多１１１１と銅とをキレ
ート結合させた担体の調製方法を説明する。

使用できる多Ｉｉ類には、セファロース、セファデック
ス等の市販クロマト用多糖頻ゲルがある。

しかし、短時間に高精度でペプチド類とアミノ酸類を分
離するためには、セファデックスＧ−１５，Ｇ２５およ
びＧ−５０の樹脂が好ましい。

市販クロマト用多Ｗ１ゲル、例えばセファデックス　（
ファルマシア製）を銅溶液中で膨潤させた後、アルカリ
溶液を撹拌しながら加えて多ｖａ類ゲルと銅とをキレー
ト結合させる。銅溶液には、硫酸銅や塩化銅等の溶液が
例示でき、溶解後、溶液中で２価の銅イオン（Ｃｕ”）
となるものが使用できる。アルカリ溶液には、水酸化ナ
トリウム、炭酸カリウム等の溶液が例示でき、溶液中で
のｐＨが７以上、好ましくはｐＨ１１以上になるものが
使用できる。この多糖類ゲルと銅とがキレート結合した
担体は緑青色ないしは青色を呈している。このようにし
て得られるセファデックス−銅キレート担体に緩衝液を
加えて撹拌、静置及び上澄液を除去することによって担
体の洗浄及び平衡化を行う。

緩衝液には、はう酸緩衝液、りん酸緩衝液等の緩衝液が
例示できる。また、そのｐＨは７以上、好ましくはｐＦ
１１１以上のものが使用できる。また、同し９Ｈのアル
カリ溶液でも使用できる。

このさい用いる銅溶液中の銅濃度は０，１０〜２．０モ
ル程度がキレート化させるアルカリ溶液の濃度は０．１
〜１．０規定程度が、また多Ｉｌ類−銅キレート担体を
平衡化させる緩衝液の濃度は、０．０１〜０．１モル程
度のものを使用することが望ましい。

多糖類にキレート結合する銅量は、多糖類の種類により
異なるが、結合能以上の過剰の銅添加は、アルカリ性に
した際、水酸化銅の沈澱物生成が起こり、分離が悪くな
るので、多ＩＩ類に結合し得る以下の銅量を添加するか
、キレート結合させる前に過剰の銅を除いた方がよい。

本発明におけるペプチド類と遊離アミノ酸とを含む溶液
としては、蛋白質の加水分解液、例えばカゼインのプロ
テアーゼ分解液、ペプチド合成の反応液等の種々の溶液
を挙げることができる。

ペプチド類と遊離アミノ酸類とを含む溶液（試料液）と
多ＩＩ類ゲル銅とをキレート結合させた担体との接触は
、担体をカラム充填し、これに該試料液を流入して行う
こともできるし、また試料液と担体とをバッチ式に混合
して行うこともできる。

このようにすると、上記の多ＩＩ類ゲルと銅がキレート
結合した担体と試料液とが接触することによって、遊離
アミノ酸類は担体の銅とキレート結合して吸着され、一
方、ペプチド類は担体から銅を奪った形で銅とキレート
結合して吸着されない。

従って、通常のカラムを用いた分離方法で遊離アミノ酸
類とペプチド類とを完全に分離することができる。そし
て、担体に吸着された遊離アミノ酸類を溶出させる。担
体に吸着された遊離アミノ酸類の溶出は通常用いられる
種々の方法があるが、塩酸溶液を用いることにより、結
合している銅から遊離させ、溶出させることが好ましい
。

このようにして溶出させた遊離アミノ酸は通常のアミノ
酸の定量方法によってその含量を測定する。このような
アミノ酸定量方法には、例えばケルプール法による窒素
定量法、ニンヒドリンやＴＮＢＳ（１−リニトロベンゼ
ンスルホン酸）によるアミノ基の定量法、アミノ酸自動
分析計を用いる方法等がある。特に、アミノ酸自動分析
計を用いるとアミノ酸含量を自動的に迅速かつ高精度に
定量することができるので好ましい。

光里Ω盈見 本発明の定量方法を用いると、ペプチド類と遊離アミノ
酸類とを含有する溶液中のアミノ酸含量を迅速、かつ高
精度で測定することができるので、蛋白質酵素加水分解
物の製造成いは合成ペプチドの製造過程で、反応を遊離
アミノ酸類含有率により制御することができる。

従って、目的にあった量の遊離アミノ酸類及びペプチド
類を含有する製品を容易に製造することが出来る。

また、ペプチド類についても本方法を用いて遊離アミノ
酸から分離できるので、ペプチド類の含有量や各種の分
析にも遊離アミノ酸の妨害なしに行なうことが可能であ
る。

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する
。

（実施例１） ペプチド標準品として、Ｇｕｙ−Ｇｕｙ（和光純薬工業
製）　、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（和光純薬工業製）　、Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（和光純薬工業製）　、Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ（ペプチド研究断裂）を用い、アミノ酸標準品として
、ＡＳＩ）、　Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、Ａｓｎ、　Ｇｌｕ、
、Ｇｉｎ、　Ｐｒｏ、、Ｇｌｙ、　Ａｌａ、　Ｖａｔ、
、Ｃｙｓ、　Ｍｅｔ。

ｌｉｅ、　Ｌｅｕ、　Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ、　
Ｌｙｓ、　Ｈｉｓ、、Ａｒｇ、　　（和光純薬工業製）
を用いた。

それぞれの標準品を０．０５Ｍはう酸緩衝液で溶解し、
ペプチド標準品は１０μｍｏ１２／１ｔｄｌの濃度、ア
ミノ酸標準品は１μｍｏｆ２７ｍｌの濃度となるよう混
合溶液を調製した。このようにして調製した混合溶液１
ａｉ！をセファデックス−銅キレート担体を充填したカ
ラムに付した。そして、２５ｄ／ｈの流速で０．０５Ｍ
はう酸緩衝液１２１１１ｆを通液した後、同じ＜２５ｍ
ｅ／ｈの流速で０．２Ｎ塩酸溶液１２０ｄを通液した。

第１図に示したように、このクロマト処理によってアミ
ノ酸とペプチドは完全に分離できることが判った。なお
、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙと同じ位
置に溶出された。

次に溶出されたアミノ酸標準品及びペプチド標準品をア
ミノ酸自動分析計（日立製作所製、８３５型）で定量し
た。を第１表に示すように高い回収率で迅速に回収する
ことができた。

以下余白 アミノ酸 回収率（χ） （実施例２） 蛋白質酵素加水分解物として、乳蛋白質のカゼインにバ
チルス属由来の微生物プロテアーゼとバンクレアチンを
同時に作用させて調製したものを使用した。この平均ペ
プチド鎖長は２．０であった。

この蛋白質酵素加水分解物を０．０５Ｍはう酸緩衝液に
溶解し、３重量／容量％（窒素含量４．７■／１ＮＬ１
）の濃度となるように溶液を調製した。この調製溶液ｌ
ａｄをセファデックス−銅キレート担体を充填したカラ
ム（直径１．５Ｃ１１１、長さ３０Ｃ１１）に付した。

そして、２５ｄ／ｈの流速で０．０５Ｍはう酸緩衝液１
２ｄを通液した後、同じ＜２５ｆｆｉｌ！／ｈの流速で
０．２Ｎ塩酸溶液１２０　ｄを通液した。この結果、第
２図に示すように、このクロマト処理によって遊離アミ
ノ酸類とペプチド類はほぼ完全に分離することができた
。

次に溶出された遊離アミノ酸画分について、アミノ酸自
動分析計（日立製作所製、８３５型）を用い定量した。

結果第２表に示すが、アミノ酸溶出画分へのペプチドの
溶出はほとんどなく、しかもその遊離のアミノ酸組成を
迅速かつ高精度に定量することができた。

第２表

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１のアミノ酸類及びペプチド類を含む
標準混合液の銅−セファデックスキレートカラムからの
溶出の状況を示す。 第２図は、実施例２のカゼイン加水分解液の銅−セファ
デックスキレートからの溶出の状況を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペプチド類と遊離アミノ酸類とを含む溶液中の遊
   離アミノ酸含量を定量するに際して、まず該溶液を多糖
   類ゲルと銅とをキレート結合させた担体と接触させてペ
   プチド類と遊離アミノ酸類とを分離し、その後に遊離ア
   ミノ酸類の含量を測定することを特徴とする遊離アミノ
   酸類の定量方法。
2. （２）ペプチド類と遊離アミノ酸類とを含む溶液が蛋白
   質加水分解物溶液である請求項（１）に記載の遊離アミ
   ノ酸類の定量方法。