JPH03285694A - モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの作製方法及び該抗体を有する癌診断薬 - Google Patents
モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの作製方法及び該抗体を有する癌診断薬Info
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- JPH03285694A JPH03285694A JP2086387A JP8638790A JPH03285694A JP H03285694 A JPH03285694 A JP H03285694A JP 2086387 A JP2086387 A JP 2086387A JP 8638790 A JP8638790 A JP 8638790A JP H03285694 A JPH03285694 A JP H03285694A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野１
本発明は、癌関連抗原に特異的なモノクローナル抗体、
該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの
作製方法及び該抗体を有する癌診断薬に関する。
該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの
作製方法及び該抗体を有する癌診断薬に関する。
［従来の技術］
細胞膜の構成成分である糖脂質（糖蛋白）と癌との関連
性についての研究が進む中でモノクロナル抗体の技術が
進歩し、癌に特徴的な物質（ガンマーカ〕として癌にか
なり特徴的な糖鎖抗原が見つかってきており、癌診断へ
の応用が期待されている。
性についての研究が進む中でモノクロナル抗体の技術が
進歩し、癌に特徴的な物質（ガンマーカ〕として癌にか
なり特徴的な糖鎖抗原が見つかってきており、癌診断へ
の応用が期待されている。
従来よりガンマーカとしては、ガン胎児性蛋白抗原（Ｃ
Ｅ’Ａ）、αフェトプロティン（ＡＦＰ）、消化器系癌
のガンマーカであるＣＡ１９９、卵巣癌のガンマーカで
あるＣＡ１２５、乳癌のガンマーカであるＣＡ１５−３
等多数が知られている。また、これらのガンマーカに対
するモノクローナル抗体を用いた癌診断キットが開発さ
れている。
Ｅ’Ａ）、αフェトプロティン（ＡＦＰ）、消化器系癌
のガンマーカであるＣＡ１９９、卵巣癌のガンマーカで
あるＣＡ１２５、乳癌のガンマーカであるＣＡ１５−３
等多数が知られている。また、これらのガンマーカに対
するモノクローナル抗体を用いた癌診断キットが開発さ
れている。
しかしながら、上述した癌診断キットは癌疾患なスクリ
ーニングする目的で使用されているが、その陽性率はそ
れ程高くなく、癌特異性の低いものである。また、癌に
特異的なガンマーカが非常に少なく、健常人での陽性率
も高くなるという欠点があった。特に、癌の早期発見に
有用な診断が行なえるような広い範囲の癌にガンマーカ
として使えるようなものはまだ得られていない。
ーニングする目的で使用されているが、その陽性率はそ
れ程高くなく、癌特異性の低いものである。また、癌に
特異的なガンマーカが非常に少なく、健常人での陽性率
も高くなるという欠点があった。特に、癌の早期発見に
有用な診断が行なえるような広い範囲の癌にガンマーカ
として使えるようなものはまだ得られていない。
Ｃ発明が解決しようとする課題〕
従って、本発明の目的は早期の癌を的確に診断するため
に用いることができるモノクローナル抗体及び該モノク
ローナル抗体による診断薬を提供することである。
に用いることができるモノクローナル抗体及び該モノク
ローナル抗体による診断薬を提供することである。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、鋭意研究の結果、コリステリルへミザク
シネート（以下、ＣＨＳと略す）処理したヒト胃癌細胞
株ＭＫＮ−４５を免疫原として用いて得られたモノクロ
ーナル抗体が広く癌疾患のスクリーニングに有効である
ことを見出し、この発明を完成した。
シネート（以下、ＣＨＳと略す）処理したヒト胃癌細胞
株ＭＫＮ−４５を免疫原として用いて得られたモノクロ
ーナル抗体が広く癌疾患のスクリーニングに有効である
ことを見出し、この発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記の性質を有するモノクローナ
ル抗体を提供する。
ル抗体を提供する。
（イ）ヒト肺癌由来の細胞株ＰＣ−９，Ａ５４９及びＱ
Ｋ５６と反応するが、ＰＣ−１，ＰＣ−６及びＰＣ−１
３と反応しない。
Ｋ５６と反応するが、ＰＣ−１，ＰＣ−６及びＰＣ−１
３と反応しない。
（ロ）ヒト胃癌由来の細胞株ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−４
５、ＭＫＮ−７４及びＫ Ａ Ｔ ＯＩＩＩと反応する
。
５、ＭＫＮ−７４及びＫ Ａ Ｔ ＯＩＩＩと反応する
。
（ハ）ヒト結腸腺癌由来の細胞株ＳＷ４８０及びヒト胃
癌由来の細胞株ＮＲＣ１２と反応する。
癌由来の細胞株ＮＲＣ１２と反応する。
（ニ）ヒト子宮頚部癌由来の細胞株ＨｅＬａ５３ 、
ヒト喉頭癌由来の細胞株Ｈｅｐ−２，成人肝細胞をＥＶ
ウィルスでトランスフオームして得られた細胞株Ｃｈａ
ｎｇ Ｌｉｖｅｒ 、ヒト膵癌由来の細胞株ＨＣＧ−２
５、ヒトＴ細胞白血病由来の細胞株Ｈ３Ｂ−２、ＭＯＬ
Ｔ３、ＣＣＲＦ−（：、ＥＭ、ヒトＢ細胞白血病由来の
細胞株ＲＡＪＩ及びＤＡＵＤＩ、ヒト単球性白血病由来
の細胞株Ｊ−１１１．ヒト急性前骨髄性白血病由来の細
胞株ＨＬ−６０、ヒト慢性骨髄性白血病由来の細胞株に
−５６２及びヒト正常繊維芽細胞由来の細胞株Ｆｌｏｗ
２０００と反応しない。
ヒト喉頭癌由来の細胞株Ｈｅｐ−２，成人肝細胞をＥＶ
ウィルスでトランスフオームして得られた細胞株Ｃｈａ
ｎｇ Ｌｉｖｅｒ 、ヒト膵癌由来の細胞株ＨＣＧ−２
５、ヒトＴ細胞白血病由来の細胞株Ｈ３Ｂ−２、ＭＯＬ
Ｔ３、ＣＣＲＦ−（：、ＥＭ、ヒトＢ細胞白血病由来の
細胞株ＲＡＪＩ及びＤＡＵＤＩ、ヒト単球性白血病由来
の細胞株Ｊ−１１１．ヒト急性前骨髄性白血病由来の細
胞株ＨＬ−６０、ヒト慢性骨髄性白血病由来の細胞株に
−５６２及びヒト正常繊維芽細胞由来の細胞株Ｆｌｏｗ
２０００と反応しない。
（ホ）ヒト正常末梢血細胞のリンパ球、単球、マクロフ
ァージ、顆粒球、赤血球及びフィトフェムアグルチニン
（ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によって
刺激されたヒト単核球細胞と反応しない。
ァージ、顆粒球、赤血球及びフィトフェムアグルチニン
（ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によって
刺激されたヒト単核球細胞と反応しない。
また、本発明は、上記モノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマを提供する。
イブリドーマを提供する。
さらに本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体と反
応する上記細胞の少なくともいずれかをコレステリルへ
ミサクシネイト処理する工程と、得られた細胞で動物を
免疫する工程と、該動物から得られた抗体産生細胞と自
己増殖能を有する癌細胞とを細胞融合させる工程とを含
むハイブリドーマの作製方法を提供する。
応する上記細胞の少なくともいずれかをコレステリルへ
ミサクシネイト処理する工程と、得られた細胞で動物を
免疫する工程と、該動物から得られた抗体産生細胞と自
己増殖能を有する癌細胞とを細胞融合させる工程とを含
むハイブリドーマの作製方法を提供する。
さらにまた、本発明は上記のモノクローナル抗体から成
る癌診断薬を提供する。
る癌診断薬を提供する。
［発明の効果］
本発明により、種々の癌に特徴的な抗原と特異的に反応
する新規なモノクローナル抗体及びそれから成る癌診断
薬が提供された。本発明の癌診断薬は、癌患者における
陽性率が極めて高く、方、正常人における陽性率はほと
んどない。従って、本発明の癌診断薬によれば、正確に
癌を診断することができる。さらに、後述の実施例で明
らかになるように、本発明の癌診断薬によれば、早期の
癌をも正確に診断することができる。また、本発明によ
り、上記本発明のモノクローナル抗体を作製するための
新規な方法が提供された。
する新規なモノクローナル抗体及びそれから成る癌診断
薬が提供された。本発明の癌診断薬は、癌患者における
陽性率が極めて高く、方、正常人における陽性率はほと
んどない。従って、本発明の癌診断薬によれば、正確に
癌を診断することができる。さらに、後述の実施例で明
らかになるように、本発明の癌診断薬によれば、早期の
癌をも正確に診断することができる。また、本発明によ
り、上記本発明のモノクローナル抗体を作製するための
新規な方法が提供された。
［発明の詳細な説明］
上記のように、本発明のモノクローナル抗体は次のよう
な性質を有する。
な性質を有する。
（１）ヒト肺癌由来の細胞株ＰＣ−９（免疫生物研究所
から入手可能）、Ａ５４９（大日本製薬株式会社％ （１９７３１及びＱＫ５６（大日本製薬株式会社から市
販）、ヒト胃癌由来の細胞株ＭＫＮ−１（免疫生物研究
所から人手可能 、ＭＫＮ−２８（免疫生物研究所から
人手可能 、ＭＫＮ−４５（免疫生物研究所から入手可
能 、 ＭＫｒｌ−７４（免疫生物研究所から入手可能
及びＫＡＴＯＩＩ＋（免疫生物研究所から人手可能
、ヒト結腸腺癌由来の細胞株ＳＷ４８０ （大日本製薬
株式会社から市販、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 ３６：
４５６２ （１９７６１）並びにヒト胃癌由来の細胞株
ＮＲＣ１２（免疫生物研究所から入手可能）と反応する
。
から入手可能）、Ａ５４９（大日本製薬株式会社％ （１９７３１及びＱＫ５６（大日本製薬株式会社から市
販）、ヒト胃癌由来の細胞株ＭＫＮ−１（免疫生物研究
所から人手可能 、ＭＫＮ−２８（免疫生物研究所から
人手可能 、ＭＫＮ−４５（免疫生物研究所から入手可
能 、 ＭＫｒｌ−７４（免疫生物研究所から入手可能
及びＫＡＴＯＩＩ＋（免疫生物研究所から人手可能
、ヒト結腸腺癌由来の細胞株ＳＷ４８０ （大日本製薬
株式会社から市販、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 ３６：
４５６２ （１９７６１）並びにヒト胃癌由来の細胞株
ＮＲＣ１２（免疫生物研究所から入手可能）と反応する
。
（２）ヒト肺癌由来の細胞株ＰＣ−１（免疫生物研究所
から入手可能）、ＰＣ−６（免疫生物研究所から入手可
能）及びＰＣ−１３（免疫生物研究所から入手可能）、
ヒト子宮頚部癌由来の細胞株＋１ｅ１．ａｓ ３ （大
日本製薬株式会社から市販、Ｊ。
から入手可能）、ＰＣ−６（免疫生物研究所から入手可
能）及びＰＣ−１３（免疫生物研究所から入手可能）、
ヒト子宮頚部癌由来の細胞株＋１ｅ１．ａｓ ３ （大
日本製薬株式会社から市販、Ｊ。
Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 １０３： ２７３ （１９５６１
１、ヒト喉頭癌由来の細胞株Ｈｅｐ−２（大日本製薬株
式会社から市販、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 １５： ５
９８ （１９５５１） 、成人肝細胞をＥＶウィルスで
トランスフオームして得られた細胞株Ｃｈａｎｇ Ｌｉ
ｖｅｒ （大日本製薬株式会社から市販、Ｐｒｏｃ、
Ｓｏｃ、 Ｅｘｐ、 Ｂｉｏ、 Ｍｅｄ、 ８７：
４４０（１９５４１） 、 ヒト膵癌由来の細胞株ＨＣ
Ｇ２５ （大日本製薬株式会社から市販）、ヒトＢ細胞
白血病由来の細胞株Ｈ３Ｂ−２（大日本製薬株式会社か
ら市販、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２５： ４１２１ （
１９６８１）ＭＯＬＴ３ （大日本製薬株式会社から市
販、Ｊ。
１、ヒト喉頭癌由来の細胞株Ｈｅｐ−２（大日本製薬株
式会社から市販、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 １５： ５
９８ （１９５５１） 、成人肝細胞をＥＶウィルスで
トランスフオームして得られた細胞株Ｃｈａｎｇ Ｌｉ
ｖｅｒ （大日本製薬株式会社から市販、Ｐｒｏｃ、
Ｓｏｃ、 Ｅｘｐ、 Ｂｉｏ、 Ｍｅｄ、 ８７：
４４０（１９５４１） 、 ヒト膵癌由来の細胞株ＨＣ
Ｇ２５ （大日本製薬株式会社から市販）、ヒトＢ細胞
白血病由来の細胞株Ｈ３Ｂ−２（大日本製薬株式会社か
ら市販、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２５： ４１２１ （
１９６８１）ＭＯＬＴ３ （大日本製薬株式会社から市
販、Ｊ。
Ｎａｔ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ４９： ８９１
（１９７２）ｌ 、 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（大日本製薬
株式会社から市販、（：ａｎｃｅｒ １８： ５２２（
１９６５１） 、ヒトＢ細胞白血病由来の細胞株ＲＡＪ
Ｉ（大日本製薬株式会社から市販、Ｌａｎｃｅｔ １：
２３８ （１９６４１）及びＤＡＵＤＩ （大日本製薬
株式会社から市販、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 ２８：
１３００ （１９６８）ｌ、ヒト単球性白血病由来の細
胞株Ｊ−１１１（大日本製薬株式会社から市販、Ｂｌｏ
ｏｄ １０・１０１０ （１９５５１１、ヒト急性前骨
髄性白血病由来の細胞株ＨＬ −６０（大日本製薬株式
会社から市販、Ｎａｔｕｒｅ±：３４７ （１９７７）
） 、ヒト慢性骨髄性白血病由来の細胞株に−５６２（
大日本製薬株式会社から市販、Ｂｌｏｏｄ ４５： ３
２１ （１９７５））並びにヒト正常繊維芽細胞由来の
細胞株Ｆｌｏｗ ２０００ （大日本製薬株式会社か
ら市販）と反応しない。
（１９７２）ｌ 、 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（大日本製薬
株式会社から市販、（：ａｎｃｅｒ １８： ５２２（
１９６５１） 、ヒトＢ細胞白血病由来の細胞株ＲＡＪ
Ｉ（大日本製薬株式会社から市販、Ｌａｎｃｅｔ １：
２３８ （１９６４１）及びＤＡＵＤＩ （大日本製薬
株式会社から市販、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 ２８：
１３００ （１９６８）ｌ、ヒト単球性白血病由来の細
胞株Ｊ−１１１（大日本製薬株式会社から市販、Ｂｌｏ
ｏｄ １０・１０１０ （１９５５１１、ヒト急性前骨
髄性白血病由来の細胞株ＨＬ −６０（大日本製薬株式
会社から市販、Ｎａｔｕｒｅ±：３４７ （１９７７）
） 、ヒト慢性骨髄性白血病由来の細胞株に−５６２（
大日本製薬株式会社から市販、Ｂｌｏｏｄ ４５： ３
２１ （１９７５））並びにヒト正常繊維芽細胞由来の
細胞株Ｆｌｏｗ ２０００ （大日本製薬株式会社か
ら市販）と反応しない。
（３）ヒト正常末梢血細胞のリンパ球、単球マクロファ
ージ、顆粒球、赤血球及びフィトフエムアグルチニン（
ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡ （ＣｏｎＡｌによって
刺激されたヒト単核球細胞と１反応しない。
ージ、顆粒球、赤血球及びフィトフエムアグルチニン（
ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡ （ＣｏｎＡｌによって
刺激されたヒト単核球細胞と１反応しない。
さらに、後述の実施例において得られた本発明のモノク
ローナル抗体２８６は、上記特徴に加え、以下の特徴を
有することがわかっている。
ローナル抗体２８６は、上記特徴に加え、以下の特徴を
有することがわかっている。
（１）オフタロニー法により決定したアイソタイプがＪ
ｇ Ｇ ｌである。
ｇ Ｇ ｌである。
（２）イムノプロティング法により分子量２００〜０
］、７０ｋｄの細胞膜糖蛋白質又は血清中に遊離した糖
蛋白質を認識する。
蛋白質を認識する。
（３）モノクローナル抗体２８６と反応性を有する上記
株化細胞をプロテアーゼ処理すると、該細胞に対するモ
ノクローナル抗体２Ｈ６の反応性は失われる。
株化細胞をプロテアーゼ処理すると、該細胞に対するモ
ノクローナル抗体２Ｈ６の反応性は失われる。
（４）モノクローナル抗体２８６と反応性を有する上記
株化細胞を過ヨーソ酸ナトリウムで処理すると、該細胞
に対するモノクローナル抗体２８６の反応性は失われる
。
株化細胞を過ヨーソ酸ナトリウムで処理すると、該細胞
に対するモノクローナル抗体２８６の反応性は失われる
。
（５） ＭｏｎｏＰカラムにより決定された等電点が８
．１〜７．８の抗原を認識する。
．１〜７．８の抗原を認識する。
これらのことより、本発明のモノクローナル抗体が分子
量２００〜１７０ｋｄの糖蛋白質の有する抗原基を認識
してい７ると考えられる。
量２００〜１７０ｋｄの糖蛋白質の有する抗原基を認識
してい７ると考えられる。
本発明のモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナ
ル抗体と反応性を有する上記細胞の少な（ともいずれか
をコレステリルへミサクシネ〜ト（ＣＨ３）処理したも
のを免疫原として用いたハイブリドーマ法により作製す
ることができる。
ル抗体と反応性を有する上記細胞の少な（ともいずれか
をコレステリルへミサクシネ〜ト（ＣＨ３）処理したも
のを免疫原として用いたハイブリドーマ法により作製す
ることができる。
１
次に、本発明のモノクロナール抗体の作製法の一例を詳
細に説明する。
細に説明する。
まず、免疫原を調製する。本発明のモノクローナル抗体
と反応性を有する細胞、好ましくはヒト胃癌細胞を最終
細胞濃度が好ましくは１ ｘ １．０’〜２ ｘ １０
’細胞／ｍｌ 、さらに好ましくは２５〜１００ ｕ
ｇ／ｍｌのＣＨ３を含む培地で約３７℃、１２０〜１８
０分間処理した細胞又は細胞膜成分を免疫原として用い
ることができる。また、細胞培養に使用する培地として
は、ＲＰＭＩ ｌ ６４０培地等、当該細胞の培養に通
常用いられている培地を好ましく用いることができる。
と反応性を有する細胞、好ましくはヒト胃癌細胞を最終
細胞濃度が好ましくは１ ｘ １．０’〜２ ｘ １０
’細胞／ｍｌ 、さらに好ましくは２５〜１００ ｕ
ｇ／ｍｌのＣＨ３を含む培地で約３７℃、１２０〜１８
０分間処理した細胞又は細胞膜成分を免疫原として用い
ることができる。また、細胞培養に使用する培地として
は、ＲＰＭＩ ｌ ６４０培地等、当該細胞の培養に通
常用いられている培地を好ましく用いることができる。
このようにして得られたＣＨ５処理細胞を免疫原として
用い、通常のハイブリドーマ法により本発明のモノクロ
ーナル抗体を作製することができる。
用い、通常のハイブリドーマ法により本発明のモノクロ
ーナル抗体を作製することができる。
すなわち、次に、上記免疫原を哨乳動物に免疫する。免
疫する動物は細胞融合に使用する癌細胞との適合性を考
慮して選択することが好ましく、例えば融合する相手の
細胞がマウス骨髄腫細胞で ２ ある場合にはマウスを用いることが好ましい６本発明に
おいて用いられるマウスはこの分野で通常用いられるも
のであればよく、特に限定されるものではない。免疫は
一般的方法により行なうことができる。すなわち、例え
ば上記した免疫原の溶液を腹腔内又は静脈血管内に投与
することができる。
疫する動物は細胞融合に使用する癌細胞との適合性を考
慮して選択することが好ましく、例えば融合する相手の
細胞がマウス骨髄腫細胞で ２ ある場合にはマウスを用いることが好ましい６本発明に
おいて用いられるマウスはこの分野で通常用いられるも
のであればよく、特に限定されるものではない。免疫は
一般的方法により行なうことができる。すなわち、例え
ば上記した免疫原の溶液を腹腔内又は静脈血管内に投与
することができる。
免疫動物から採取した牌細胞は自己増殖能を有する癌細
胞、例えばマウス骨髄腫細胞と融合させることができる
。骨髄腫細胞としては既に公知の種々の細胞、例えばＰ
３ ｘ ６３ Ａｇ８．６５３ （大日本製薬株式会
社より市販） 、 Ｓｐ２１０−Ａｇ１４ （大日本製
薬株式会社より市販）等を用いることができる。融合方
法は、公知の手法に準じて行なうことができる。融合促
進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００
）等を用いることができる。牌細胞と骨髄腫細胞との混
合比は通常５対１〜１０対１程度が好ましい。
胞、例えばマウス骨髄腫細胞と融合させることができる
。骨髄腫細胞としては既に公知の種々の細胞、例えばＰ
３ ｘ ６３ Ａｇ８．６５３ （大日本製薬株式会
社より市販） 、 Ｓｐ２１０−Ａｇ１４ （大日本製
薬株式会社より市販）等を用いることができる。融合方
法は、公知の手法に準じて行なうことができる。融合促
進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００
）等を用いることができる。牌細胞と骨髄腫細胞との混
合比は通常５対１〜１０対１程度が好ましい。
得られた融合腫を通常の選択培地で培養することにより
ハイブリドーマを選択することができ３ る。上記した骨髄種細胞はＨＡＴ培地（ヒボキサンチン
、アミノプテリン、チミジン、牛胎児血清を含む）中で
は成育できないためＨＡＴ培地中で成育する細胞を選択
すればよい。
ハイブリドーマを選択することができ３ る。上記した骨髄種細胞はＨＡＴ培地（ヒボキサンチン
、アミノプテリン、チミジン、牛胎児血清を含む）中で
は成育できないためＨＡＴ培地中で成育する細胞を選択
すればよい。
ハイブリドーマのコロニーが充分に太き（なったところ
で、免疫原として用いた細胞に特異的な抗体の検索を行
なう。抗体の検索は一般に用いられる方法、例えば間接
蛍光抗体法により行なうことができる。さらに得られた
抗体産生細胞は上記細胞株、すなわち、ＭＫＮ−１，Ｍ
ＫＮ−２８、ＭＫＮ−７４、ＫＡＴＯＩＩｌ、Ａ５４９
、ＰＣＩ、ＰＣ６、ＰＣ９、ＰＣｌ３．ＳＷ４８０、Ｎ
ＲＣ１２、ＨｅＬａＳ３，Ｈｅ ｐ ２、ＨＣＧ２５、
Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒ 、 ＨＳ Ｂ −
２、ＭＯＬＴ３ 、 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＲＡＪＩ、
ＤＡＵＤ Ｉ、Ｊ −１１１、ＨＬ−６０、Ｋ２Ｏ２、
Ｆｌｏｗ ２０００及び正常末梢血細胞を用いて反応性
を調べ、上記本発明に規定された反応性を有する抗体を
産生ずるハイブリドーマを選択することができる。
で、免疫原として用いた細胞に特異的な抗体の検索を行
なう。抗体の検索は一般に用いられる方法、例えば間接
蛍光抗体法により行なうことができる。さらに得られた
抗体産生細胞は上記細胞株、すなわち、ＭＫＮ−１，Ｍ
ＫＮ−２８、ＭＫＮ−７４、ＫＡＴＯＩＩｌ、Ａ５４９
、ＰＣＩ、ＰＣ６、ＰＣ９、ＰＣｌ３．ＳＷ４８０、Ｎ
ＲＣ１２、ＨｅＬａＳ３，Ｈｅ ｐ ２、ＨＣＧ２５、
Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒ 、 ＨＳ Ｂ −
２、ＭＯＬＴ３ 、 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＲＡＪＩ、
ＤＡＵＤ Ｉ、Ｊ −１１１、ＨＬ−６０、Ｋ２Ｏ２、
Ｆｌｏｗ ２０００及び正常末梢血細胞を用いて反応性
を調べ、上記本発明に規定された反応性を有する抗体を
産生ずるハイブリドーマを選択することができる。
得られたハイブリドーマは限界希釈法によりり ４
ローニングを行ないモノクローン化されたハイブリドー
マを得ることができる。
マを得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体はハイブリドーマをマウス
腹腔内に投与し、その腹水中より回収する方法により得
ることができる。さらに−数的な方法、例えば硫安沈殿
、ゲル濾過、カラムクロマトグラフィー等により精製す
ることもできる。
腹腔内に投与し、その腹水中より回収する方法により得
ることができる。さらに−数的な方法、例えば硫安沈殿
、ゲル濾過、カラムクロマトグラフィー等により精製す
ることもできる。
本発明のモノクローナル抗体を用いて癌診断を行なうこ
とができる。診断は、通常、血清又は血漿を検査するこ
とにより行なわれるがこれに限定されるものではない。
とができる。診断は、通常、血清又は血漿を検査するこ
とにより行なわれるがこれに限定されるものではない。
スクリーニングの方法としては、例えば次のような手順
で行なうことができる。
で行なうことができる。
ａ）被験者の全血を採取し、血清を分取する。血清（例
えば５０μｍ）を予め本発明のモノクロナル抗体で固相
化した酵素免疫測定用（ＥＬＩＳＡ）９６穴イムノプレ
ートに入れ十分に反応させ、その後洗浄する。この際、
試料中の抗原の濃度を決定するために、標準抗原として
本発明のモノクローナル抗体と反応性を有する細胞を可
溶化５ した膜抗原（アッセイバッファーで２０倍希釈した抗原
量）５０μｍを加える。標準抗原としては例えば２ ｘ
１０’個の培養細胞ＭＫＮ４５を可溶化した膜抗原５
０μｍを１０００単位とし、以下５００．２５０．１２
５．６２．５．３１．２５．１５，６２５．７．８１２
５単位を５０μｍずつ９６穴イムノプレートに入れてお
（ことができる。
えば５０μｍ）を予め本発明のモノクロナル抗体で固相
化した酵素免疫測定用（ＥＬＩＳＡ）９６穴イムノプレ
ートに入れ十分に反応させ、その後洗浄する。この際、
試料中の抗原の濃度を決定するために、標準抗原として
本発明のモノクローナル抗体と反応性を有する細胞を可
溶化５ した膜抗原（アッセイバッファーで２０倍希釈した抗原
量）５０μｍを加える。標準抗原としては例えば２ ｘ
１０’個の培養細胞ＭＫＮ４５を可溶化した膜抗原５
０μｍを１０００単位とし、以下５００．２５０．１２
５．６２．５．３１．２５．１５，６２５．７．８１２
５単位を５０μｍずつ９６穴イムノプレートに入れてお
（ことができる。
ｂ）ビオチン化することにより標識した本発明のモノク
ローナル抗体（例えば１００μｍ）をイムノプレートの
各ウェルに加えて十分に反応させ、その後洗浄する。
ローナル抗体（例えば１００μｍ）をイムノプレートの
各ウェルに加えて十分に反応させ、その後洗浄する。
Ｃ）パーオキシダーゼで標識したストレプトアビジン（
例えば１００μｌ）を各ウェルに加え反応させた後、洗
浄する。
例えば１００μｌ）を各ウェルに加え反応させた後、洗
浄する。
ｄ）基質（オルトフェニレンジアミン）を各ウェルに加
えて（例えば２００μｍ）発色させた後、５Ｎ硫酸５０
μｍを加えて発色を停止する。
えて（例えば２００μｍ）発色させた後、５Ｎ硫酸５０
μｍを加えて発色を停止する。
ｅ）イムノリーダーにて吸光度を測定する。
癌疾患のスクリーニングは上記の方法に限定されるもの
ではなく、上記以外のこの分野において６ 周知な酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定
法等の方法により行なうことができる。
ではなく、上記以外のこの分野において６ 周知な酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定
法等の方法により行なうことができる。
スクリーニングにおいて本発明のモノクローナル抗体を
標識するための標識物質としては、放射免疫測定法（Ｒ
ＩＡ）では各種放射性同位元素を、蛍光免疫測定法では
蛍光物質を用いることができる。また、発色団物質を用
いる代表的な例として酵素免疫測定法、特にサンドイッ
チ酵素測定法が有用である。
標識するための標識物質としては、放射免疫測定法（Ｒ
ＩＡ）では各種放射性同位元素を、蛍光免疫測定法では
蛍光物質を用いることができる。また、発色団物質を用
いる代表的な例として酵素免疫測定法、特にサンドイッ
チ酵素測定法が有用である。
酵素免疫測定法の場合、例えば、モノクローナル抗体と
標識用酵素との結合法は中框ら（ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍ
、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 ｖｏｌ、２２．凹、 １９７
４）の方法に準じて行なうことができる。標識用酵素と
しては、ホースラデイツシュペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、グルコースオキシダゼ、β−ガラク
トシグーゼ、グルコアミラーゼ等を挙げることができる
。有用な酵素免疫測定法の一つとして、本発明のモノク
ローナル抗体にサルツー１−Ｎ−ハイドロキシサフシニ
ミドビオヂンを結合させビオチン化した本発明のモノク
ローナル ７ 抗体とペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用い
る方法が、抗体の免疫特異性に影響を及ば好ましい。し
かし、本発明のモノクローナル抗体と酵素、例えばペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラト
シターゼで標識することもできる。 また、特に組織染
色用として用いる時はアビジン−ビオチン又はパーオキ
シダーゼがその他の使用試薬との関係で好ましい。
標識用酵素との結合法は中框ら（ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍ
、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 ｖｏｌ、２２．凹、 １９７
４）の方法に準じて行なうことができる。標識用酵素と
しては、ホースラデイツシュペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、グルコースオキシダゼ、β−ガラク
トシグーゼ、グルコアミラーゼ等を挙げることができる
。有用な酵素免疫測定法の一つとして、本発明のモノク
ローナル抗体にサルツー１−Ｎ−ハイドロキシサフシニ
ミドビオヂンを結合させビオチン化した本発明のモノク
ローナル ７ 抗体とペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用い
る方法が、抗体の免疫特異性に影響を及ば好ましい。し
かし、本発明のモノクローナル抗体と酵素、例えばペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラト
シターゼで標識することもできる。 また、特に組織染
色用として用いる時はアビジン−ビオチン又はパーオキ
シダーゼがその他の使用試薬との関係で好ましい。
またさらに、発色団を用いた酵素免疫測定法において、
発色物質としてユーロビエム（アマ−ジャム社製）を用
いることが抗体標識を安定化でき、かつ高感度に測定す
ることができるので好ましい。
発色物質としてユーロビエム（アマ−ジャム社製）を用
いることが抗体標識を安定化でき、かつ高感度に測定す
ることができるので好ましい。
上述した酵素測定法で実際に癌患者の血清を用いてスク
リーニングを行なったところ、下記実施例で具体的に示
されるように本発明のモノクローナル抗体に対する抗原
濃度は１８５例中１例を除き１００単位以下で陽性率は
約０．５％（１／１８５例）と低いものである。
リーニングを行なったところ、下記実施例で具体的に示
されるように本発明のモノクローナル抗体に対する抗原
濃度は１８５例中１例を除き１００単位以下で陽性率は
約０．５％（１／１８５例）と低いものである。
８
また、下記実施例において具体的に示されるように、癌
患者の血清の陽性率は非常に高く、症患外の良性疾患患
者の陽性率は４０％であった。特に、早期癌患者の陽性
率は高率であった。これらの結果は悪性疾患特に早期癌
疾患において高率に反応し、また、従来の臨床的所見と
よく対応するものである。
患者の血清の陽性率は非常に高く、症患外の良性疾患患
者の陽性率は４０％であった。特に、早期癌患者の陽性
率は高率であった。これらの結果は悪性疾患特に早期癌
疾患において高率に反応し、また、従来の臨床的所見と
よく対応するものである。
このことから本発明のモノクローナル抗体は癌の早期発
見を行なう上で優れた診断薬であることは明らかである
。
見を行なう上で優れた診断薬であることは明らかである
。
［実施例］
本発明について実施例により具体的に説明するが、本発
明の実施例はこれらに限定されるものではない。
明の実施例はこれらに限定されるものではない。
ヒト胃癌ＭＫＮ−４５細胞（大日本製薬（株）製）１×
１０８個をＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄後、最終濃度
で５０ Ｉｉｇ／ｍｌのＣＨ３を含むＲＰＭＩ ］、］
６４０−ＰＶＰ培地３．５％ポリビニル ９ ピロリドン、１％牛血清アルブミン、０．５％グルコー
スを含有するＲＰＭ１１６４０培地）で３７°Ｃ，１５
０分間放置した。反応後、遠心、洗浄し、再びＲＰＭＩ
１６４０培地に浮遊させ、ＣＨ３処理ヒト胃癌ＭＫＮ
−４５細胞を得た。
１０８個をＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄後、最終濃度
で５０ Ｉｉｇ／ｍｌのＣＨ３を含むＲＰＭＩ ］、］
６４０−ＰＶＰ培地３．５％ポリビニル ９ ピロリドン、１％牛血清アルブミン、０．５％グルコー
スを含有するＲＰＭ１１６４０培地）で３７°Ｃ，１５
０分間放置した。反応後、遠心、洗浄し、再びＲＰＭＩ
１６４０培地に浮遊させ、ＣＨ３処理ヒト胃癌ＭＫＮ
−４５細胞を得た。
び 胞６ 人
上記のようにして得られたＣＨ５処理ヒト胃癌ＭＫＮ−
４５細胞ｌＸｌ０’個を８〜１２週令の雌Ｂ Ａ Ｌ
Ｂ ／ ｃマウスに１４〜２１間隔で３〜４回腹腔内投
与し、融合３日前にＣＨ５処理ヒト胃癌ＭＫＮ−４５細
胞１×１０７個を静注した。
４５細胞ｌＸｌ０’個を８〜１２週令の雌Ｂ Ａ Ｌ
Ｂ ／ ｃマウスに１４〜２１間隔で３〜４回腹腔内投
与し、融合３日前にＣＨ５処理ヒト胃癌ＭＫＮ−４５細
胞１×１０７個を静注した。
最終免疫から３日後にマウス肺臓を摘出し、ＲＰＭＩ］
、６４０培地で遠心、洗浄して牌細胞の浮遊液を得た。
、６４０培地で遠心、洗浄して牌細胞の浮遊液を得た。
一方、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３ （
大日本製薬Ｃ株）製）をＲＰＭ１１６４０培地で３回遠
心、洗浄し浮遊液とした。
大日本製薬Ｃ株）製）をＲＰＭ１１６４０培地で３回遠
心、洗浄し浮遊液とした。
マウス肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを混合比５１〜１
０：１で混合した後遠心して培地を除去した。混合細胞
はよくほぐしてから４５％ポリエチレングリコール４０
００を含有したＲＰＭ１１６０ ４０培地１ｍｌを加え細胞融合を行なった。さらに、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地１５ｍ１をゆっくりと滴下して細胞
融合を停止させた。遠心した後、上清をきれいに取り除
き、１５％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で牌
細胞としてＩ Ｘ １０’／１００μｍになるように細
胞浮遊液を作製した後、９６六マイクロプレートに１穴
当たり１００ ｕ、 ｌずつ分注した。翌日、ＨＡＴ培
地（ヒポキサンチン、アミノブリテリン、チミジン及び
１５％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地）１０
０μｍずつ各ウェルに加えた。各ウェルの培地は、さら
に−日毎に半量ずつＨＡＴ培地に交換した。培養７〜１
１日目に殆どのウェルにバイブリドーマの生育が認めら
れた。
０：１で混合した後遠心して培地を除去した。混合細胞
はよくほぐしてから４５％ポリエチレングリコール４０
００を含有したＲＰＭ１１６０ ４０培地１ｍｌを加え細胞融合を行なった。さらに、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地１５ｍ１をゆっくりと滴下して細胞
融合を停止させた。遠心した後、上清をきれいに取り除
き、１５％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で牌
細胞としてＩ Ｘ １０’／１００μｍになるように細
胞浮遊液を作製した後、９６六マイクロプレートに１穴
当たり１００ ｕ、 ｌずつ分注した。翌日、ＨＡＴ培
地（ヒポキサンチン、アミノブリテリン、チミジン及び
１５％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地）１０
０μｍずつ各ウェルに加えた。各ウェルの培地は、さら
に−日毎に半量ずつＨＡＴ培地に交換した。培養７〜１
１日目に殆どのウェルにバイブリドーマの生育が認めら
れた。
ハイブリドーマの′
ハイブリドーマ培養上清の抗体の検索は、抗原として胃
癌ＭＫＮ−４５細胞を用いて間接蛍光抗体法により行な
った。
癌ＭＫＮ−４５細胞を用いて間接蛍光抗体法により行な
った。
ハイブリドーマ培養上清１００μｌを取りテストデユー
プにそれぞれ分注した。これにヒト胃癌１ ＭＫＮ−４５細胞浮遊液１×１０５個／１０口μｌを加
え４℃、４５分間−次反応させた。反応後、０．５％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。さらに抗マウスグ
ロブリン（ダコ社製、４０倍希釈したもの）を１００μ
ｍ加えて４°Ｃ１４５分間二次反応を行なった。反応後
、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で３回遠心洗浄し、ス
ペクトラムＩＩＩ（オルソ−社製）で検索した。抗原と
結合力のある抗体が４１ウエルに検出された６ ヒト胃癌ＭＫＮ−４５細胞と反応する抗体が検出された
培養上清についてさらに細胞株ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−２
８、ＭＫＮ−７４、Ｋ Ａ Ｔ ＯＩＩＩ、Ａ５４９、
ＰＣｌ、ＰＣ６、ＰＣ，９、ＰＣｌ３．ＳＷ４８０、Ｎ
ＲＣ１２，０ＧＦ−１（慈恵医大より入手） 、ＨｅＬ
ａＳ３，Ｈｅｐ２、ＨＣＧ２５、Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅ
ｒ 、 ＨＳ Ｂ −２、ＨＵＴ７８ （自治医科大学
より入手）、ＭＯＬＴ３、ＣＣＲＦＣＥＭ、ＲＡＪｌ、
ＤＡＵＤＩ、Ｊ−１１１，ＨＬ −６０、Ｋ５６２、Ｆ
ｌｏｗ ２０００及び正常末梢血細胞を用いて反応性を
上記の方法で調べた。この ２ うちＭＫＮ−１、ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−７４、ＫＡＴ
ＯＩＩｌ、 Ａ５４９ 、 ＰＯ２、ＱＫ５６ 、Ｓ
Ｗ４８０、ＮＲＣ１２、ＯＧＦ ｌに反応し、かつ細胞
株ＰＣ１、ＰＯ６、ＰＣｌ３、ＨｅＬａＳ３，ＨｅＰ２
、 ＨＣＧ２５、（：ｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒ 、
ＨＳ Ｂ −２、ＨＵＴ７８ 、 ＭＯＬＴ３ 、
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＲＡＪＩ 、 ＤＡＵＤ Ｉ
、 Ｊ−１１１、８Ｌ−６０、Ｋ５６２、Ｆｌｏｗ
２０００ 、正常末梢血細胞には反応しない抗体が１ウ
エルに認められた。
プにそれぞれ分注した。これにヒト胃癌１ ＭＫＮ−４５細胞浮遊液１×１０５個／１０口μｌを加
え４℃、４５分間−次反応させた。反応後、０．５％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。さらに抗マウスグ
ロブリン（ダコ社製、４０倍希釈したもの）を１００μ
ｍ加えて４°Ｃ１４５分間二次反応を行なった。反応後
、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で３回遠心洗浄し、ス
ペクトラムＩＩＩ（オルソ−社製）で検索した。抗原と
結合力のある抗体が４１ウエルに検出された６ ヒト胃癌ＭＫＮ−４５細胞と反応する抗体が検出された
培養上清についてさらに細胞株ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−２
８、ＭＫＮ−７４、Ｋ Ａ Ｔ ＯＩＩＩ、Ａ５４９、
ＰＣｌ、ＰＣ６、ＰＣ，９、ＰＣｌ３．ＳＷ４８０、Ｎ
ＲＣ１２，０ＧＦ−１（慈恵医大より入手） 、ＨｅＬ
ａＳ３，Ｈｅｐ２、ＨＣＧ２５、Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅ
ｒ 、 ＨＳ Ｂ −２、ＨＵＴ７８ （自治医科大学
より入手）、ＭＯＬＴ３、ＣＣＲＦＣＥＭ、ＲＡＪｌ、
ＤＡＵＤＩ、Ｊ−１１１，ＨＬ −６０、Ｋ５６２、Ｆ
ｌｏｗ ２０００及び正常末梢血細胞を用いて反応性を
上記の方法で調べた。この ２ うちＭＫＮ−１、ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−７４、ＫＡＴ
ＯＩＩｌ、 Ａ５４９ 、 ＰＯ２、ＱＫ５６ 、Ｓ
Ｗ４８０、ＮＲＣ１２、ＯＧＦ ｌに反応し、かつ細胞
株ＰＣ１、ＰＯ６、ＰＣｌ３、ＨｅＬａＳ３，ＨｅＰ２
、 ＨＣＧ２５、（：ｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒ 、
ＨＳ Ｂ −２、ＨＵＴ７８ 、 ＭＯＬＴ３ 、
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＲＡＪＩ 、 ＤＡＵＤ Ｉ
、 Ｊ−１１１、８Ｌ−６０、Ｋ５６２、Ｆｌｏｗ
２０００ 、正常末梢血細胞には反応しない抗体が１ウ
エルに認められた。
得られたハイブリドーマは限界希釈法を用いて３回クロ
ーニングを行ない安定なハイブリドーマ２Ｈ６を得た。
ーニングを行ない安定なハイブリドーマ２Ｈ６を得た。
ハイブリドーマ２Ｈ６は微生物工業技術研究所に寄託さ
れ、その受託番号は微工研菌寄第１１１７７号である。
れ、その受託番号は微工研菌寄第１１１７７号である。
モノクロナール の産生
ハイブリドーマ２Ｈ６は１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ
Ｉ ｌ ６４０培地で９６穴マイクロプレート、２４穴
プレート、１２穴プレート、７５ｃｍ”フラスコとスケ
ールアップしながら大量培養し、３ その細胞をブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン）投与したＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃマ
ウスに腹腔的投与した。投与後１０〜１５日間で腹水腫
瘍を形成した。腹水は５０％飽和硫安分画後、プロティ
ンＧカラム（溶出溶媒・０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９
，（１１、［１，ＩＭグリシン緩衝液ｆｐＨ２，２）で
精製し、高純度のモノクローナル抗体２Ｉ］６を得た。
Ｉ ｌ ６４０培地で９６穴マイクロプレート、２４穴
プレート、１２穴プレート、７５ｃｍ”フラスコとスケ
ールアップしながら大量培養し、３ その細胞をブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン）投与したＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃマ
ウスに腹腔的投与した。投与後１０〜１５日間で腹水腫
瘍を形成した。腹水は５０％飽和硫安分画後、プロティ
ンＧカラム（溶出溶媒・０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９
，（１１、［１，ＩＭグリシン緩衝液ｆｐＨ２，２）で
精製し、高純度のモノクローナル抗体２Ｉ］６を得た。
支五亘ノ 抗原特異性
モノクローナル抗 の標識
実施例１で得られたモノクローナル抗体２８６を濃度１
ｍｇ／ｍｌにＯ，］Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８，３１で調
整した後、０．１Ｍ ＮａＨＣＯａ溶液で透析した。得
られた抗体溶液１０容量に対して改良ビオチン化剤”５
ＵＬＦＯ−ＮＨ３−ＢＩＯＴＩＮ （フナコシ薬品株式
会社製）”ｌ容量を加え室温で４時間反応させた。反応
終了後、ＰＢＳで透析して得られたビオチン化抗体２Ｈ
６は一８０℃で保存した。
ｍｇ／ｍｌにＯ，］Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８，３１で調
整した後、０．１Ｍ ＮａＨＣＯａ溶液で透析した。得
られた抗体溶液１０容量に対して改良ビオチン化剤”５
ＵＬＦＯ−ＮＨ３−ＢＩＯＴＩＮ （フナコシ薬品株式
会社製）”ｌ容量を加え室温で４時間反応させた。反応
終了後、ＰＢＳで透析して得られたビオチン化抗体２Ｈ
６は一８０℃で保存した。
１泉策凰工１１
ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−４５の細胞２ Ｘ １０’個
４ を１％膜膜蛋白質可溶化上モノラウレート含有トリス塩
酸緩衝液０．１５Ｍ、 ＮａＣ１含有）と混合し、細胞
膜表面抗原を抽出した。抽出液は直ちにＥｘｔｒａｔｉ
−Ｇｅｌ Ｄ（ピアス社製）で可溶化剤を除去し、標準
抗原を得た。
４ を１％膜膜蛋白質可溶化上モノラウレート含有トリス塩
酸緩衝液０．１５Ｍ、 ＮａＣ１含有）と混合し、細胞
膜表面抗原を抽出した。抽出液は直ちにＥｘｔｒａｔｉ
−Ｇｅｌ Ｄ（ピアス社製）で可溶化剤を除去し、標準
抗原を得た。
この標準抗原をトリス塩酸緩衝液で１０倍希釈したもの
を１０００単位と設定した。測定は１０００〜７．８単
位の範囲で可能であった。
を１０００単位と設定した。測定は１０００〜７．８単
位の範囲で可能であった。
註皇］
本発明のモノクローナル抗体２Ｈ６を予め１０μｇ／ｍ
ｌの濃度に炭酸水素ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ
９，５）に溶解させＥＬＩ ＳＡ用９６穴イムノプレー
トに１００ＪＪ、ｌずっ添加し、室温で一晩放置して固
相を作製した。
ｌの濃度に炭酸水素ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ
９，５）に溶解させＥＬＩ ＳＡ用９６穴イムノプレー
トに１００ＪＪ、ｌずっ添加し、室温で一晩放置して固
相を作製した。
次に、上記抗体を捨て、ウェルを０．０５％ツイーン２
０含有のＰＢＳで３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブ
ミン含有トリス塩酸緩衝液２００ ｕ １を加え室温で
１〜２時間静置し、抗体の結合していない部位をウシ血
清アルブミンでブロックした。
０含有のＰＢＳで３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブ
ミン含有トリス塩酸緩衝液２００ ｕ １を加え室温で
１〜２時間静置し、抗体の結合していない部位をウシ血
清アルブミンでブロックした。
５
１％ウシ血清アルブミン含有トリス塩酸緩衝液を０．０
５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した後、表１に
示す細胞株の培養液５０μｍ又は所定の濃度に調整した
標準抗原溶液ｆ１０００．２５０．１２５．６２．５．
３１．２５．１５．６２５．７．８１２５．０単位）を
５０μｍずつ加えて室温で２〜３時間放置し、０．０５
％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。次にビオチ
ン化標識抗体２）＋６を１０μｍずっ加えて室温で１〜
２時間放置し、０，０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３
回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジ
ンを１００μｌずっ加えて室温で１〜２時間放置し００
５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。次に酵素
基質オルトフェニレンジアミンを２００μｍずつ加えて
発色させた後、５Ｎ硫酸５０μｍずつ加えて反応を停止
した。反応混合液はイムノリーダを用いて波長４９２
ｎｍで吸光度を測定した。
５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した後、表１に
示す細胞株の培養液５０μｍ又は所定の濃度に調整した
標準抗原溶液ｆ１０００．２５０．１２５．６２．５．
３１．２５．１５．６２５．７．８１２５．０単位）を
５０μｍずつ加えて室温で２〜３時間放置し、０．０５
％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。次にビオチ
ン化標識抗体２）＋６を１０μｍずっ加えて室温で１〜
２時間放置し、０，０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３
回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジ
ンを１００μｌずっ加えて室温で１〜２時間放置し００
５％ツイーン２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。次に酵素
基質オルトフェニレンジアミンを２００μｍずつ加えて
発色させた後、５Ｎ硫酸５０μｍずつ加えて反応を停止
した。反応混合液はイムノリーダを用いて波長４９２
ｎｍで吸光度を測定した。
各種細胞株と本発明のモノクローナル抗体２Ｈ６との反
応性を間接蛍光抗体法により調べた。反応性の有無は次
のようにして判定した。す ６ なわち、対照（Ｐ３ｘ６８Ａｇ８．６５３細胞の培養上
清を各種細胞株及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体）
の反応性から陽性部分、陰性部分を設定した（通常陽性
部分は５％以下にする）。その結果を表１に示す。
応性を間接蛍光抗体法により調べた。反応性の有無は次
のようにして判定した。す ６ なわち、対照（Ｐ３ｘ６８Ａｇ８．６５３細胞の培養上
清を各種細胞株及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体）
の反応性から陽性部分、陰性部分を設定した（通常陽性
部分は５％以下にする）。その結果を表１に示す。
本発明のモノクローナル抗体は細胞株ＭＫＮ１、、ＭＫ
Ｎ−２８、ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ７４、ＫＡＴＯＩ］１
．Ａ５４９、ＰＣ９、ＱＫ５６．ＳＷ４８０、ＮＲＣ１
２、ＯＧＦ ］に反応し、高い陽性率を示した。また、
細胞株ＰＣＩ、ＰＣ６、ＰＣｌ３、ＨｅＬａＳ３，Ｈｅ
Ｐ２、ＨＣＧ２５、Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒ 、 ＨＳ
Ｂ −２、ＨＵＴ７８、ＭＯＬＴ３、ＣＣＲＦ−ＣＥ
Ｍ、ＲＡＪ工、ＤＡＵＤ Ｉ、Ｊ−１１１、ＨＬ−６０
、Ｋ５６２、Ｆｌｏｗ ２０００とは反応性が殆どなく
、陽性率も非常に低いものであった。
Ｎ−２８、ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ７４、ＫＡＴＯＩ］１
．Ａ５４９、ＰＣ９、ＱＫ５６．ＳＷ４８０、ＮＲＣ１
２、ＯＧＦ ］に反応し、高い陽性率を示した。また、
細胞株ＰＣＩ、ＰＣ６、ＰＣｌ３、ＨｅＬａＳ３，Ｈｅ
Ｐ２、ＨＣＧ２５、Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒ 、 ＨＳ
Ｂ −２、ＨＵＴ７８、ＭＯＬＴ３、ＣＣＲＦ−ＣＥ
Ｍ、ＲＡＪ工、ＤＡＵＤ Ｉ、Ｊ−１１１、ＨＬ−６０
、Ｋ５６２、Ｆｌｏｗ ２０００とは反応性が殆どなく
、陽性率も非常に低いものであった。
７
１嵐勇旦 抗原特異性
健常人１０人の末梢血細胞と本発明のモノクローナル抗
体との反応性を実施例２と同様にして調べた。その結果
を表２に示す。
体との反応性を実施例２と同様にして調べた。その結果
を表２に示す。
本発明のモノクローナル抗体は正常末梢血細胞とは反応
しないことがわかる。
しないことがわかる。
９
１凰愚Ａ 血清診断
癌患者、非癌患者及び健常人の血清を用いて本発明のモ
ノクローナル抗体との反応性を実施例２と同様にして調
べた。血清診断の陽性判定は次のようにして行なった。
ノクローナル抗体との反応性を実施例２と同様にして調
べた。血清診断の陽性判定は次のようにして行なった。
すなわち、抗原濃度１００単位以」二が検出されたもの
について陽性とした。
について陽性とした。
その結果を表３に示す。
健常人１８５例については、−例を除いて抗原濃度は１
００単位以下であり陽性率は５％と低いものであった。
００単位以下であり陽性率は５％と低いものであった。
また、各種癌患者の血清例では全て陽性を示し、その抗
原濃度は一例を除き１００単位以上の高い値を示した。
原濃度は一例を除き１００単位以上の高い値を示した。
表３
１
実施例５ 血清診断
胃癌患者の血清についてその病期別での陽性率を実施例
４と同様にして調べた。病期別ステージ■（胃癌１１例
）、ステージＩＩ （胃癌３例）、ステージｍ （胃癌
３例）、ステージＩＶ （胃癌３例〕での陽性率は実施
例４と同様にして判定した。
４と同様にして調べた。病期別ステージ■（胃癌１１例
）、ステージＩＩ （胃癌３例）、ステージｍ （胃癌
３例）、ステージＩＶ （胃癌３例〕での陽性率は実施
例４と同様にして判定した。
２
その結果を表４に示す。各ステージ共に陽性率は１００
％と高値を示した。特に、ステージエでも陽性率１００
％であるので、本発明のモノクローナル抗体は癌の早期
診断に有効であることがわかる。
％と高値を示した。特に、ステージエでも陽性率１００
％であるので、本発明のモノクローナル抗体は癌の早期
診断に有効であることがわかる。
表４
Claims (7)
- （１）下記の性質を有するモノクローナル抗体。 （イ）ヒト肺癌由来の細胞株ＰＣ−９、Ａ５４９及びＱ
Ｋ５６と反応するが、ＰＣ−１、ＰＣ−６及びＰＣ−１
３と反応しない。 （ロ）ヒト胃癌由来の細胞株ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−４
５、ＭＫＮ−７４及びＫＡＴＯIIIと反応する。 （ハ）ヒト結腸腺癌由来の細胞株ＳＷ４８０及びヒト腎
癌由来の細胞株ＮＲＣ１２と反応する。 （ニ）ヒト子宮頚部癌由来の細胞株ＨｅＬａＳ３，ヒト
喉頭癌由来の細胞株Ｈｅｐ−２，成人肝細胞をＥＶウィ
ルスでトランスフォームして得られた細胞株Ｃｈａｎｇ
Ｌｉｖｅｒ、ヒト膵癌由来の細胞株ＨＣＧ−２５、ヒ
トＴ細胞白血病由来の細胞株ＨＳＢ−２、ＭＯＬＴ３、
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ヒトＢ細胞白血病由来の細胞株ＲＡ
ＪＩ及びＤＡＵＤＩ、ヒト単球性白血病由来の細胞株Ｊ
−１１１、ヒト急性前骨髄性白血病由来の細胞株ＨＬ−
６０、ヒト慢性骨髄性白血病由来の細胞株Ｋ−５６２及
びヒト正常繊維芽細胞由来の細胞株Ｆｌｏｗ ２０００
と反応しない。 （ホ）ヒト正常末梢血細胞のリンパ球、単球、マクロフ
ァージ、顆粒球、赤血球及びフィトフェムアグルチニン
（ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によって
刺激されたヒト単核球細胞と反応しない。 - （２）モノクローナル抗体２Ｈ６である請求項１記載の
モノクローナル抗体。 - （３）請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ。 - （４）ハイブリドーマ２Ｈ６である請求項３記載のハイ
ブリドーマ。 - （５）請求項１記載のモノクローナル抗体と反応する請
求項１に記載された細胞をコレステリルヘミサクシネイ
ト処理する工程と、得られた細胞で動物を免疫する工程
と、該動物から得られた抗体産生細胞と自己増殖能を有
する癌細胞とを細胞融合させる工程とを含むハイブリド
ーマの作製方法。 - （６）コレステリルヘミサクシネイト処理される前記細
胞はヒト胃癌由来の細胞株ＭＫＮ−４５である請求項５
記載の方法。 - （７）請求項１又は２記載のモノクローナル抗体から成
る癌診断薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2086387A JPH03285694A (ja) | 1990-03-31 | 1990-03-31 | モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの作製方法及び該抗体を有する癌診断薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2086387A JPH03285694A (ja) | 1990-03-31 | 1990-03-31 | モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの作製方法及び該抗体を有する癌診断薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03285694A true JPH03285694A (ja) | 1991-12-16 |
Family
ID=13885466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2086387A Pending JPH03285694A (ja) | 1990-03-31 | 1990-03-31 | モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの作製方法及び該抗体を有する癌診断薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03285694A (ja) |
-
1990
- 1990-03-31 JP JP2086387A patent/JPH03285694A/ja active Pending
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