JPH03289955A - 胚の凍結保存法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は主に動物胚（受精卵）の凍結保存および移植に
便利な胚の凍結保存方法に関するものである。

【従来の技術］ 動物胚を凍結保存する場合、氷晶化による物理的傷害を
軽減するため、植木という操作が必要とされている。現
在市販されている胚凍結機のうち、自動植木装置が装備
されているものもあるが、高価である。近年、植木装置
を持たない胚凍結機が市販され、安価なことから普及が
進んでいる。しかし、この機種の場合、植木を人為的に
行なう必要がある。現在、−船釣に行なわれている植木
方法は、液体窒素等で冷却したピンセット等で凍結保存
容器の一部を挾む方法や、氷晶誘起剤であるヨウ化銀の
水溶液やヨウ化銀をアルギン酸ナトリウムでコーティン
グしドロプレット化したもので行なう方法がある（特開
平１−１０７７５５号、特公昭６２−９３４２号）。 【発明が解決しようとする課題） しかし、従来の植木方法には次のような不合理な点がみ
られる。 ｌ　液体窒素等で冷却したピンセット等による場合 １）人為的に植氷操作を行なうため、植木に労力と時間
がかかる。 ２）冷却槽から凍結保存容器の一部をｎ呂させ、その部
分に植木するため、容器の温度が上昇し植木が不確実と
なりやすい。 ３）ストロ−を保存容器として用いる場合、密封するだ
めに熱シールするか、あるいはポリビニルアルコール粉
末等の充填による封入を行なう必要がある。 ■　ヨウ化銀の水溶液やドロプレットによる場合１）ヨ
ウ化銀は家畜等の動物には有害であり受胚動物への影響
が考えられ、除去する必要があるため、ストロ−から胚
を取り出すことなく直接、受胚動物に移植する１段階希
釈や無希釈移植が不可能である。 ２）ヨウ化銀水溶液を用いる場合には、凍結中に凍結保
存容器内で保存液と混ざりあって保存液の浸透圧が変化
し、胚に悪影響を及ぼす危険性がある。 ３）ストロ−を保存容器とする場合、１）の方法と同様
にシーリング又はポリビニルアルコール粉末等による封
入をする必要がある。 【課題を解決するための手段】 本発明は、上記の各課題を解決するために開発されたも
ので、氷点下の−３，０℃以下で植木作用のある氷晶誘
起剤をポリビニルアルコールやその他の接着剤からなる
担体に混合したもので保存容器の口を封止することによ
り、植木と保存容器を密封する両目的に対応できる方法
と、氷晶誘起剤と接着剤を混合し保存容器の保存液と接
する内側の一部に塗布することにより植木する方法を開
発した。 また、保存容器の口を綿栓で封じる場合、綿栓の中間に
氷晶誘起剤混合物、例えばポリビニルアルコール粉末を
担体として用いたものを層状にサンドインチして封止す
る方法も有効である。 ここで、氷晶誘起剤にはヨウ化銀や硫化銅等の溶液中で
氷晶核となって氷晶形成を誘起する物質を用い、凍結保
存容器にはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビ
ニル等のプラスチックを素材とする人工授精用のストロ
−を用いるのである。 本発明方法の対象とする胚の具体例としては、主として
動物胚であり、例えば牛、馬、豚、山羊、羊、犬、猫等
各種動物の胚が挙げられる。

【作用】

氷晶誘起剤を担体により保定化して用いるために、氷晶
誘起剤が凍結保存液中へ移動することがなく、胚に悪影
響を及ぼさない。 また、ポリビニルアルコール粉末と混ぜて保定化したも
ので凍結保存容器をシールすれば、容器を熱シールする
必要がない。他の接着剤を混ぜて保定化し、容器の内壁
へ添着する場合は、熱シールと併用になるが、上記保定
化による作用は同様である。 担体としてのポリビニルアルコール粉末やその他の各種
接着剤による保定化をしても、氷晶誘起剤の性能低下は
ほとんどない。 ・（実施例１ 以下本発明の方法を具体的に実施例によって説明する。 実施例１；氷晶誘起剤の担体として、ポリビニルアルコ
ール粉末（富士乎工業株式会社製、商品名、人工授精用
ストロ−パウダー）を混合して用いる方法 第１図は凍結保存容器としてストロ−（１）を用いる場
合を示し、ストロ−（１）に培養液（２）を１次いで凍
結保存液（３）とともに胚（４）を空気層（５）を間に
充填し、更に空気層（５）を間に０．２５Ｍショ糖液（
６）を充填し、最後に氷晶誘起剤混合物（７）として氷
晶誘起剤を２０％濃度に混合したストロ−パウダーで封
止する。なお、ストロ−（１）先端には綿栓（８）をし
ておく。 このストロ−（１）をアルコールを冷媒とした単槽式プ
ログラムフリーザーで第４図に示す方法により段階的に
冷却した場合、氷晶誘起剤混合物（７）の存在により−
３，０〜−７，０℃で植木される。更にストロ−（１）
は−４０℃まで冷却され、液体窒素中で凍結保存される
。胚（４）を受胚動物に移植する場合は、　ストロ−（
１）を液体窒素中より取り出し３７℃の温水で融解した
後、　まずショ糖液層（６）と胚（４）が充填されてい
る凍結保存液Ｎ（３）を混合して５分間置き、更に培養
液層（２）と混合する。胚（４）を移植する場合は、氷
晶誘起剤混合物（７）の部分を切落し移植器にストロ−
（１）を装填して行なう。第１表は、このようにして凍
結保存した生肝の融解後の培養結果で、７９％の胚が移
植可能なものであった。 また、これらの胚を受胚牛に移植し受胎かえられたこと
から、本法が胚の凍結保存に有効なことが実証された。 第１表 の冷却中、実施例１と同様に植木されることから、胚の
凍結保存に有効であった。 第２表は実施例１と同様に冷却し、凍結保存した生肝の
融解後の生存性を培養により検討したもので、実験に供
した２０個の胚のうち、１９個の９５％にあたる胚が発
育し、高い生存性が確認された。 第２表 （個２％） 実施例２；氷晶誘起剤と接着剤を混合して用いる方法 実施例１のポリビニルアルコール粉末の氷晶誘起剤混合
物（７）でストロ−を封止する代わりに、第２図に示す
ように、　ストロ−（１）の封止部分に対してシアノア
クリレート系瞬間接着剤に２％濃度に氷晶誘起剤として
硫化銅粉末を混合したものを添着させ乾燥させた氷晶誘
起剤混合物の添着層（９）を形成させ、実施例１と同様
に各液層を充填し最後に熱シール（１０）をし封止した
。ストロ−（１）実施例３；氷晶誘起剤をポリビニルア
ルコールに混合し、綿栓で挾んで用いる方法 第３図に示したように、　ストロ−（１）に培養液（２
）を、次いで凍結保存液（３）とともに胚（４）を空気
層（５）を間に充填し、更に空気層（５）を間に０．２
５Ｍショ糖液（６）を充填し、その端部を熱シール（１
０）をし封止した。他端の容器の口を綿栓で封じるに際
して、綿栓の中間に氷晶誘起剤混合物（１１）としてヨ
ウ化銀をポリビニルアルコール粉末に混合したものを層
状に挾んで保定した。 これを用いて実験した結果、冷却によって実施例１，２
と同様に植木され、胚の凍結保存に有効であった。また
、同様に冷却し、凍結保存した生肝の融解後の生存性を
培養により検討した結果、前記実施例同様に高い確率で
胚が発育し、高い生存性が確認された。 【発明の効果） 以上説明したように、本発明による胚の凍結保存方法は
植木装置を必要としないだけでなく、胚に有害とされる
氷晶誘起剤を移植時に切り捨てられるストロ−の先端部
分にポリビニルアルコール粉末や接着剤等の担体で保定
化して用いることから、胚へ悪影響を及ぼす心配もなく
、また凍結融解後胚を取り出すことなく直接移植する１
段階希釈および無希釈移植法にも有効なことから胚の凍
結保存効果を高め、かつ、受胚動物への移植作業の省力
化に極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は凍結保存容器としてプラスチックスドローを用
い、氷晶誘起剤混合物で封止する場合の断面図である。 第２図は氷晶誘起接着剤を添着し乾燥させておいたプラ
スチックスドローを用いる場合の断面図である。第３図
は綿栓で氷晶誘起剤混合物を挾むように保定した場合の
断面図である。 第４図は動物胚の凍結の温度−時間曲線を示すグラフで
ある。 （１）ストロ−（２）培養液 （３）凍結保存液　　　　（４）胚 （５）空気層　　　　　　（６）　０．２５Ｍショ糖液
（７）（１１）氷晶誘起剤混合物　（８）綿栓（９）氷
晶誘起剤混合物の添着層 （１０）熱シール 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　胚の凍結保存に必要な植氷操作に際して、氷晶誘起
   剤を担体に混ぜ保定化した氷晶誘起剤混合物を凍結保存
   容器の口部に添着するか、又は氷晶誘起剤混合物で凍結
   保存容器の口部を封止することを特徴とする胚の凍結保
   存方法。