JPH03290184A - スカベンジャーレセプター産生動物細胞 - Google Patents
スカベンジャーレセプター産生動物細胞Info
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- JPH03290184A JPH03290184A JP2090274A JP9027490A JPH03290184A JP H03290184 A JPH03290184 A JP H03290184A JP 2090274 A JP2090274 A JP 2090274A JP 9027490 A JP9027490 A JP 9027490A JP H03290184 A JPH03290184 A JP H03290184A
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- Japan
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- scavenger receptor
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- cell
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はヒトスカベンジャーレセプターＩ型又は■型を
発現することができる動物細胞及び該細胞を用いるヒト
スカベンジヤーレセプターＩ型又は■型の製造方法に関
する。
発現することができる動物細胞及び該細胞を用いるヒト
スカベンジヤーレセプターＩ型又は■型の製造方法に関
する。
（１）
（２）
〔従来の技術〕
動脈硬化は、コレステロールとリポ蛋白質との複合体で
ある低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）の変性体を取り込んだ
マクロファージが泡沫細胞に変化して血管内裏細胞下に
蓄積することにより惹起されると考えられている。スカ
ベンジャーレセプターはマクロファージの細胞膜に存在
し、変性したＬＤＬと結合してそれを細胞内に取込む際
に機能する蛋白質である。更にスカベンジャー受容体は
、生体内で種々の変性物、ウィルス等の異物、エンドト
キシンなどの生理活性物質の除去に関与している。従っ
て、スカベンジャーレセプターの構造及び作用機作を解
明することは動脈硬化の発症機構を解明し、さらにその
診断、予防及び治療法、並びにそれらのための試薬や医
薬を開発するために重要であると考えられる。また、マ
クロファージ及び網内系の機能の解明に重要である。
ある低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）の変性体を取り込んだ
マクロファージが泡沫細胞に変化して血管内裏細胞下に
蓄積することにより惹起されると考えられている。スカ
ベンジャーレセプターはマクロファージの細胞膜に存在
し、変性したＬＤＬと結合してそれを細胞内に取込む際
に機能する蛋白質である。更にスカベンジャー受容体は
、生体内で種々の変性物、ウィルス等の異物、エンドト
キシンなどの生理活性物質の除去に関与している。従っ
て、スカベンジャーレセプターの構造及び作用機作を解
明することは動脈硬化の発症機構を解明し、さらにその
診断、予防及び治療法、並びにそれらのための試薬や医
薬を開発するために重要であると考えられる。また、マ
クロファージ及び網内系の機能の解明に重要である。
Ｔ、 Ｋｏｄａｍａら（Ｎａｔａｒｅ、 ３４３ ：５
３２−５３５．１９９０；及びＮａｔｕｒｅ、 ３４３
：５７０−５７２． １９９０）によりウシスカベン
ジャーレセプターの遺伝子がクローニングされ、その塩
基配列からレセプターのアミノ酸配列が推定され、さら
にその構造が推定された。それによればウシスカベンジ
ャーレセプターには■型及び■型が存在し、■型はＩ型
のＣ−末端が短縮された構造を有し、いずれも三量体と
して存在する。
３２−５３５．１９９０；及びＮａｔｕｒｅ、 ３４３
：５７０−５７２． １９９０）によりウシスカベン
ジャーレセプターの遺伝子がクローニングされ、その塩
基配列からレセプターのアミノ酸配列が推定され、さら
にその構造が推定された。それによればウシスカベンジ
ャーレセプターには■型及び■型が存在し、■型はＩ型
のＣ−末端が短縮された構造を有し、いずれも三量体と
して存在する。
ヒト単核白血病細胞株ＴＨＰ−１を２００ｎＭのホルボ
ール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）
の存在下で培養して分化させたマクロファージ様細胞か
ら抽出されたＰｏ１ｙ （Ａ） ”ＲＮＡがウシスカベ
ンジャーレセプターｃＤＮＡ断片とハイブリダイズする
ことが知られている（Ｔ、Ｋｏｃｌａｍａら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ３４３ ：５３１−５３５．１９９０＞。しか
しながら、ヒトスカベンジャーレセプター遺伝子のクロ
ーニング、及びクローニングされた遺伝子によりヒトス
カベンジャーレセプターの発現については公表されてい
ない。
ール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）
の存在下で培養して分化させたマクロファージ様細胞か
ら抽出されたＰｏ１ｙ （Ａ） ”ＲＮＡがウシスカベ
ンジャーレセプターｃＤＮＡ断片とハイブリダイズする
ことが知られている（Ｔ、Ｋｏｃｌａｍａら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ３４３ ：５３１−５３５．１９９０＞。しか
しながら、ヒトスカベンジャーレセプター遺伝子のクロ
ーニング、及びクローニングされた遺伝子によりヒトス
カベンジャーレセプターの発現については公表されてい
ない。
従って、本発明は、ヒトスカベンジャーレセプターを発
現することができる動物細胞及び該細胞を用いるヒトス
カベンジャーレセプターの製造方（３） 法を提供しようとするものである。
現することができる動物細胞及び該細胞を用いるヒトス
カベンジャーレセプターの製造方（３） 法を提供しようとするものである。
上記の課題は、ヒトスカベンジャーレセプターを発現す
る細胞から該レセプターをコードする遺伝子を得、これ
を動物細胞中で機能し得るプロモーターの制御下に連結
することによりベクターを作製し、このベクターにより
動物細胞を形質転換し、そして安定に多量のヒトスカベ
ンジャーレセプターを発現することができる細胞を選択
することにより達成される。
る細胞から該レセプターをコードする遺伝子を得、これ
を動物細胞中で機能し得るプロモーターの制御下に連結
することによりベクターを作製し、このベクターにより
動物細胞を形質転換し、そして安定に多量のヒトスカベ
ンジャーレセプターを発現することができる細胞を選択
することにより達成される。
ヒト白血病細胞系ＴＨＰ−１をＰＭＡの存在下で培養す
ることによりマクロファージ様細胞が得られ、この細胞
から抽出されたｍＲＮＡがウシスカベンジャーレセプタ
ーｃＤＮＡ断片とハイブリダイズすることが知られてい
る。従って、この様にして得られたマクロファージ様細
胞からｍＲＮＡを抽出し、次にこのｍＲＮＡに基いてｃ
ＤＮＡライブラリーを作製すること（４） ができる。ｃＤＮＡライブラリーの製作はｍＲＮＡから
ｃＤＮＡライブラリーを製作するために知られている任
意の方法、例えばＯｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ法、Ｇ
ｕｂｌｅｒ ＆ｌｏｆｆｍａｎ法等により行うことがで
きる。この様にして調製されたｃＤＮＡライブラリーは
、例えばすでにクローニングされているウシスカベンジ
ャーレセプターｃＤＮＡの任意の断片、又はウシスカベ
ンジャーレセプターの推定されているアミノ酸配列に基
いて設計された合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
て用いて、常法に従ってスクリーニングすることができ
る。あるいは、このようなプローブを用いて、又は前記
のようにしてクローニングされたヒトスカベンジャーレ
セプターのｃＤＮＡｉｒ片ヲ用いて、ヒトスカベンジャ
ーレセプターを産生ずる細胞、例えばＴＨＰ−１細胞か
ら分化したマクロファージ様細胞からゲノムＤＮＡを得
ることもできる。
ることによりマクロファージ様細胞が得られ、この細胞
から抽出されたｍＲＮＡがウシスカベンジャーレセプタ
ーｃＤＮＡ断片とハイブリダイズすることが知られてい
る。従って、この様にして得られたマクロファージ様細
胞からｍＲＮＡを抽出し、次にこのｍＲＮＡに基いてｃ
ＤＮＡライブラリーを作製すること（４） ができる。ｃＤＮＡライブラリーの製作はｍＲＮＡから
ｃＤＮＡライブラリーを製作するために知られている任
意の方法、例えばＯｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ法、Ｇ
ｕｂｌｅｒ ＆ｌｏｆｆｍａｎ法等により行うことがで
きる。この様にして調製されたｃＤＮＡライブラリーは
、例えばすでにクローニングされているウシスカベンジ
ャーレセプターｃＤＮＡの任意の断片、又はウシスカベ
ンジャーレセプターの推定されているアミノ酸配列に基
いて設計された合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
て用いて、常法に従ってスクリーニングすることができ
る。あるいは、このようなプローブを用いて、又は前記
のようにしてクローニングされたヒトスカベンジャーレ
セプターのｃＤＮＡｉｒ片ヲ用いて、ヒトスカベンジャ
ーレセプターを産生ずる細胞、例えばＴＨＰ−１細胞か
ら分化したマクロファージ様細胞からゲノムＤＮＡを得
ることもできる。
次に、この様にしてクローニングされたヒトスカベンジ
ャーレセプター遺伝子を動物細胞中で機能し得るプロモ
ーターの下流に連結して、該遺伝（５） （６） 子を動物細胞に挿入するための形質転換ベクターを作製
する。このためのベクターとしては、動物細胞中で機能
し得る任意のベクターを使用することができ、例えばサ
イトメガロウィルスプロモーター、ジヒドロフオレート
還元酵素プロモーターＭＭＬＶプロモーター、メクロチ
オネインプロモーター等を使用することができる。形質
転換ベクターはさらに、該ベクターにより形質転換され
た細胞を選択するための選択マーカー遺伝子を含有して
いることが望ましく、この様な選択マーカー遺伝子とし
ては、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ＨＧＰＲＴ遺伝
子、ＤＨＰＲ遺伝子等を使用することができる。このベ
クターはさらに、動物細胞中で複製するための複製起点
、大腸菌で遺伝子操作するための大腸菌複製起点及び大
腸菌選択マーカー遺伝子をも含有することが望ましい。
ャーレセプター遺伝子を動物細胞中で機能し得るプロモ
ーターの下流に連結して、該遺伝（５） （６） 子を動物細胞に挿入するための形質転換ベクターを作製
する。このためのベクターとしては、動物細胞中で機能
し得る任意のベクターを使用することができ、例えばサ
イトメガロウィルスプロモーター、ジヒドロフオレート
還元酵素プロモーターＭＭＬＶプロモーター、メクロチ
オネインプロモーター等を使用することができる。形質
転換ベクターはさらに、該ベクターにより形質転換され
た細胞を選択するための選択マーカー遺伝子を含有して
いることが望ましく、この様な選択マーカー遺伝子とし
ては、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ＨＧＰＲＴ遺伝
子、ＤＨＰＲ遺伝子等を使用することができる。このベ
クターはさらに、動物細胞中で複製するための複製起点
、大腸菌で遺伝子操作するための大腸菌複製起点及び大
腸菌選択マーカー遺伝子をも含有することが望ましい。
この様な形質転換ベクターを作製するための出発ベクタ
ーとしてＲ，／ＣＭＶ （Ｉｎｔｒｏｇｅｎ社から入手
）を挙げることができる。このベクターはサイトメガロ
ウィルスプロモーター、マルチクローニング部位、ＣＨ
ｐｏｌｙＡ、 Ｍ１３複製起点、ＳＶ４０複製起点、ネ
、１−フィシン耐性遺伝子、ｐｏｌｙＡＳｐｔｌｃ複製
起点、アンピシリン耐性遺伝子をこの順序で含有する５
、４Ｋｂｐのシャトルベクターである。従って、この出
発ベクターのマルチクローニング部位にヒトスカベンジ
ャーレセプター遺伝子を挿入することにより、該遺伝子
をサイトメガロウィルスの制御のもとにおくことができ
、またこの出発ベクターから作製された形質転換ベクタ
ーにより形質転換された動物細胞はネオマイシン含有培
地で培養することにより選択することができる。
ーとしてＲ，／ＣＭＶ （Ｉｎｔｒｏｇｅｎ社から入手
）を挙げることができる。このベクターはサイトメガロ
ウィルスプロモーター、マルチクローニング部位、ＣＨ
ｐｏｌｙＡ、 Ｍ１３複製起点、ＳＶ４０複製起点、ネ
、１−フィシン耐性遺伝子、ｐｏｌｙＡＳｐｔｌｃ複製
起点、アンピシリン耐性遺伝子をこの順序で含有する５
、４Ｋｂｐのシャトルベクターである。従って、この出
発ベクターのマルチクローニング部位にヒトスカベンジ
ャーレセプター遺伝子を挿入することにより、該遺伝子
をサイトメガロウィルスの制御のもとにおくことができ
、またこの出発ベクターから作製された形質転換ベクタ
ーにより形質転換された動物細胞はネオマイシン含有培
地で培養することにより選択することができる。
出発ベクターにヒトスカベンジャーレセプター遺伝子を
挿入して得た形質転換プラスミド（組換プラスミド）は
、大腸菌、例えばＪＭ１０３に形質転換した後、アンピ
シリンにより選択し、さらに増幅することができる。次
に、大腸菌から常法により、例えばＣｓＣｊ２超遠心法
により精製する。
挿入して得た形質転換プラスミド（組換プラスミド）は
、大腸菌、例えばＪＭ１０３に形質転換した後、アンピ
シリンにより選択し、さらに増幅することができる。次
に、大腸菌から常法により、例えばＣｓＣｊ２超遠心法
により精製する。
本発明においては、任意の動物細胞株を用いることがで
き、例えばチャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＤ）
細胞′！？′６Ｓ細胞、ＨＥＰＧ ２細胞、培養縁（７
） 維芽細胞、培養血管内皮細胞、培養骨髄細胞等を用いる
ことができる。
き、例えばチャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＤ）
細胞′！？′６Ｓ細胞、ＨＥＰＧ ２細胞、培養縁（７
） 維芽細胞、培養血管内皮細胞、培養骨髄細胞等を用いる
ことができる。
形質転換ベクターによる動物細胞の形質転換は常法に従
って行うことができる。すなわち、動物細胞の培養に例
えばウシ胎児血清（ＦＢＳ） ７％を含有するＦ−１２
Ｎｏｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ培地（Ｈａｍ Ｆ−
１２：ＧＩＢＣＯ）等を用いて行われる。形質転換は任
意の常法に従って行うことができ、例えば陽イオンリポ
ゾーム介在形質転換法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ。
って行うことができる。すなわち、動物細胞の培養に例
えばウシ胎児血清（ＦＢＳ） ７％を含有するＦ−１２
Ｎｏｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ培地（Ｈａｍ Ｆ−
１２：ＧＩＢＣＯ）等を用いて行われる。形質転換は任
意の常法に従って行うことができ、例えば陽イオンリポ
ゾーム介在形質転換法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、 ８４ ニア４１３−７４’１７． １９８
７） 、リン酸カルシウム法、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ
ｔｉｏｎ法、レトロウィルスベクター法等により行うこ
とができる。陽イオンリポゾーム介在形質転換は、合成
陽イオン脂質Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）
プロピル〕−Ｎ、Ｎ、Ｎ−）リメチルアンモニウムクロ
リド（ＤＯＴＭＡ ）を含有するりポゾームと形質転換
ベクターＤＮＡとを混合して複合体を形成せしめ、これ
を動物細胞に添加することにより行われる。この形質転
換は、例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓ
ｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ （Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ ； ＧＩ
ＢＣＯ）培地中で行われる。
７） 、リン酸カルシウム法、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ
ｔｉｏｎ法、レトロウィルスベクター法等により行うこ
とができる。陽イオンリポゾーム介在形質転換は、合成
陽イオン脂質Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）
プロピル〕−Ｎ、Ｎ、Ｎ−）リメチルアンモニウムクロ
リド（ＤＯＴＭＡ ）を含有するりポゾームと形質転換
ベクターＤＮＡとを混合して複合体を形成せしめ、これ
を動物細胞に添加することにより行われる。この形質転
換は、例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓ
ｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ （Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ ； ＧＩ
ＢＣＯ）培地中で行われる。
（８）
形質転換処理が行われた動物細胞をスクリーニングする
ことにより実際に形質転換された細胞を選択する。この
選択方法は形質転換ベクターに含まれる選択遺伝子の種
類に依存する。例えば、形質転換ベクターがネオマイシ
ン耐性遺伝子を含む場合にはネオマイシン含有培地で細
胞のコロニーを形質せしめることによりネオマイシン耐
性コロニーを選択することができる。
ことにより実際に形質転換された細胞を選択する。この
選択方法は形質転換ベクターに含まれる選択遺伝子の種
類に依存する。例えば、形質転換ベクターがネオマイシ
ン耐性遺伝子を含む場合にはネオマイシン含有培地で細
胞のコロニーを形質せしめることによりネオマイシン耐
性コロニーを選択することができる。
次に、形質転換された動物細胞集団中から、ヒトスカベ
ンジャーレセプターを多く発現する細胞を選択する。ス
カベンジャーマクロファージは変性（例えば酸化）され
た低比重リボ蛋白質を取り込むが、変性体の実験モデル
であるアセチル化低比重リポ蛋白質（ＡｃＬＤＬ）をも
取り込む。従って、形質転換された動物細胞に標識され
たＡｃＬＤＬを取り込ませ、そして多くの標識を担持す
る細胞を選択することによりスカベンジャーレセプター
を多く発現する細胞を選択することができる。この場合
、任意の標識を用いることができ、例えば１゜１′−ジ
オクタデシル−３，３，３’、３’−テ（９） （１０） トラメチル−インドカルボシアニンペルクロリド（Ｄ
ｉ ｒ ）により標識したＡｃＬＤＬ （Ｄ ｉ Ｉ−
ＡｃＬＤＬ ）を用いる場合、Ｄｉｒ−ＡｃＬＤＬを取
り込んだ細胞を蛍光顕微鏡により直接観察することがで
きる。あるいは、コンパクチン（４０却）、メバローン
酸（１５０〜２００．／／ＩＩ＋）及びアセチルＬＤＬ
（１〜１０μｇ／ｄ）を含む選択培地でスカベンジャ
ーレセプターが存在する細胞のみが生き残こるようにし
てクローン化することができる。
ンジャーレセプターを多く発現する細胞を選択する。ス
カベンジャーマクロファージは変性（例えば酸化）され
た低比重リボ蛋白質を取り込むが、変性体の実験モデル
であるアセチル化低比重リポ蛋白質（ＡｃＬＤＬ）をも
取り込む。従って、形質転換された動物細胞に標識され
たＡｃＬＤＬを取り込ませ、そして多くの標識を担持す
る細胞を選択することによりスカベンジャーレセプター
を多く発現する細胞を選択することができる。この場合
、任意の標識を用いることができ、例えば１゜１′−ジ
オクタデシル−３，３，３’、３’−テ（９） （１０） トラメチル−インドカルボシアニンペルクロリド（Ｄ
ｉ ｒ ）により標識したＡｃＬＤＬ （Ｄ ｉ Ｉ−
ＡｃＬＤＬ ）を用いる場合、Ｄｉｒ−ＡｃＬＤＬを取
り込んだ細胞を蛍光顕微鏡により直接観察することがで
きる。あるいは、コンパクチン（４０却）、メバローン
酸（１５０〜２００．／／ＩＩ＋）及びアセチルＬＤＬ
（１〜１０μｇ／ｄ）を含む選択培地でスカベンジャ
ーレセプターが存在する細胞のみが生き残こるようにし
てクローン化することができる。
こうして得られた発現細胞からヒトスカベンジャー受容
体ｃＤＮＡは次のようにして単離することができる。す
なわち、ヒトスカベンジャー受容体発現細胞からのスカ
ベンジャー受容体ｃＤＮＡの単離は常法により発現細胞
から核ＤＮＡを調製し、ｖ！１ｉＲＩｊＭ２ｆＩｅに示
した塩基配列より適当なオリゴヌクレオチドプライマー
（２０塩基程度）を合或し、それらの組合せによって、
ｐｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｐ
ＣＲ）を用いて目的とするヒトスカベンジャー受容体Ｉ
型あるいは■型のｃＤＮＡを増幅、単離することができ
る。すなわち、発現細胞■型あるいは■型をφ１００ｍ
ｍのデイツシュで３日間培養し、トリプシン処理で細胞
を回収する（〜Ｉ Ｘ’ｌＯ７個）。細胞をＰＢＳ（ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で
洗浄後、５０ｐｇ／ｄプロテイナーゼＫを含有する０、
５％ＳＯ３、１０ｍＭＥＤＴＡ、 １５ｍＭＮａＣＬ
１０ｍＭトリス緩衝液の１−に懸だくし、６５℃で１
時間インキュベート後、フェノール抽出、クロロフォル
ム抽出、エタノール沈澱によって核ＤＮＡを調製する。
体ｃＤＮＡは次のようにして単離することができる。す
なわち、ヒトスカベンジャー受容体発現細胞からのスカ
ベンジャー受容体ｃＤＮＡの単離は常法により発現細胞
から核ＤＮＡを調製し、ｖ！１ｉＲＩｊＭ２ｆＩｅに示
した塩基配列より適当なオリゴヌクレオチドプライマー
（２０塩基程度）を合或し、それらの組合せによって、
ｐｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｐ
ＣＲ）を用いて目的とするヒトスカベンジャー受容体Ｉ
型あるいは■型のｃＤＮＡを増幅、単離することができ
る。すなわち、発現細胞■型あるいは■型をφ１００ｍ
ｍのデイツシュで３日間培養し、トリプシン処理で細胞
を回収する（〜Ｉ Ｘ’ｌＯ７個）。細胞をＰＢＳ（ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で
洗浄後、５０ｐｇ／ｄプロテイナーゼＫを含有する０、
５％ＳＯ３、１０ｍＭＥＤＴＡ、 １５ｍＭＮａＣＬ
１０ｍＭトリス緩衝液の１−に懸だくし、６５℃で１
時間インキュベート後、フェノール抽出、クロロフォル
ム抽出、エタノール沈澱によって核ＤＮＡを調製する。
ヌカベンジャ−受容体ｃＤＮＡのＰＣＲプライマーとし
てｌ） ５’ −ＧＡＧＡ八ＧＴへＧＡＴＡＡＡＴＣ
ＡＧＴＧ −３’２） ５’ −ＡＣＡＡＴＡＴＧＴ
ＧＴＧＧ八ＴＴＧＧＡＧ −３へおよび３ ） ５
’ −ＧＴＡＡＴＴＧＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧ−３
’を合成し、■型にはプライマー１）と２）の組合せ、
■型にはプライマー１）と３）の組合せで、目的とする
ｃＤＮＡ断片を増幅することができる。ＰＣＲは１００
ｐの反応系に各プライマーｌμＭ１核ＤＮＡ １ｐｇ
、 Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５単位とし、
９５℃１分、５４℃１分、７２℃３分のサイクルを３０
回繰り返した。
てｌ） ５’ −ＧＡＧＡ八ＧＴへＧＡＴＡＡＡＴＣ
ＡＧＴＧ −３’２） ５’ −ＡＣＡＡＴＡＴＧＴ
ＧＴＧＧ八ＴＴＧＧＡＧ −３へおよび３ ） ５
’ −ＧＴＡＡＴＴＧＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧ−３
’を合成し、■型にはプライマー１）と２）の組合せ、
■型にはプライマー１）と３）の組合せで、目的とする
ｃＤＮＡ断片を増幅することができる。ＰＣＲは１００
ｐの反応系に各プライマーｌμＭ１核ＤＮＡ １ｐｇ
、 Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５単位とし、
９５℃１分、５４℃１分、７２℃３分のサイクルを３０
回繰り返した。
増幅されたＤＮＡ断片は０．７％アガロースゲル電気泳
動により分離し、ゲルから常法により回収しく１１） た。得られたＤＮＡのサイズは、■型１．８キロベース
、■型は１．３キロベースである。
動により分離し、ゲルから常法により回収しく１１） た。得られたＤＮＡのサイズは、■型１．８キロベース
、■型は１．３キロベースである。
本発明のスカベンジャーレセプター発現細胞は、動脈硬
化発症に関わるスカベンジャーレセプター経路について
、この経路から細胞へ取り込まれる修飾されたＬＤＬ
（！Ｊガント）の特異性を解析するために用いることが
できる。また、物質の受容体を介した細胞への取り込み
（ｅｎｃｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）解析のためのモデルとし
て有用である。さらに、本発明の細胞は動脈硬化症の治
療薬、例えばＬＤＬ変性の抑制剤、アシルＣｏ−Ａコレ
ステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）活性
阻害剤などの開発過程における薬剤のスクリーニングに
用いることができる。また糖鎖のあるヒトスカベンジャ
ーレセプター蛋白の製造に用いることがで、きる。また
、スカベンジャーレセプターを介する異物もしくは変性
物の処理の過程の実験系、又は変性アルブミンに伴って
感染をおこすＢ型肝炎ウィルスなどの（１２） 感染実験系として用いることができる。
化発症に関わるスカベンジャーレセプター経路について
、この経路から細胞へ取り込まれる修飾されたＬＤＬ
（！Ｊガント）の特異性を解析するために用いることが
できる。また、物質の受容体を介した細胞への取り込み
（ｅｎｃｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）解析のためのモデルとし
て有用である。さらに、本発明の細胞は動脈硬化症の治
療薬、例えばＬＤＬ変性の抑制剤、アシルＣｏ−Ａコレ
ステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）活性
阻害剤などの開発過程における薬剤のスクリーニングに
用いることができる。また糖鎖のあるヒトスカベンジャ
ーレセプター蛋白の製造に用いることがで、きる。また
、スカベンジャーレセプターを介する異物もしくは変性
物の処理の過程の実験系、又は変性アルブミンに伴って
感染をおこすＢ型肝炎ウィルスなどの（１２） 感染実験系として用いることができる。
実施例１． ヒトスカベンジャーレセプターｃＤＮＡの
クローン化 ヒト単核白血病細胞系ＴＨＰ−１を１０％のウシ胎児血
清を含有するＲＰＭ１１６４０培地に培養した。ＴＨＰ
細胞を２００ｎＭのホルボール １２−ミリステリート
１３−アセテ−）（ＰＭＡ）の存在下で４時間培養する
ことによりマクロファージ様細胞に分化せしめた。
クローン化 ヒト単核白血病細胞系ＴＨＰ−１を１０％のウシ胎児血
清を含有するＲＰＭ１１６４０培地に培養した。ＴＨＰ
細胞を２００ｎＭのホルボール １２−ミリステリート
１３−アセテ−）（ＰＭＡ）の存在下で４時間培養する
ことによりマクロファージ様細胞に分化せしめた。
この細胞から、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ （Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６２ ：１５６、１９８７）の方法
に従って、チオシアン酸グアニジン／フェノール／クロ
ロホルム抽出によりｐｏｌｙ （Ａ） ”ｍＲＮＡを単
離した。６／／ｇのｍＲＮＡと５１１ｇのランダムへキ
サヌクレオチドを用いて、Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍ
ａｎ（Ｇｅｎｅ、 ２５ ：２６３．１７８３）の方法
に従って二本鎖ｃＤＮＡを台底した。このｃＤＮＡをε
ｃｏＲＩアダプターに連結し、そして５〜２０％酢酸カ
リウム勾配において、５Ｗ６００−ター（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で５０． ｏｏｏｒｐ
ｍにて３時間遠心分離することによりサイズ分画した。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６２ ：１５６、１９８７）の方法
に従って、チオシアン酸グアニジン／フェノール／クロ
ロホルム抽出によりｐｏｌｙ （Ａ） ”ｍＲＮＡを単
離した。６／／ｇのｍＲＮＡと５１１ｇのランダムへキ
サヌクレオチドを用いて、Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍ
ａｎ（Ｇｅｎｅ、 ２５ ：２６３．１７８３）の方法
に従って二本鎖ｃＤＮＡを台底した。このｃＤＮＡをε
ｃｏＲＩアダプターに連結し、そして５〜２０％酢酸カ
リウム勾配において、５Ｗ６００−ター（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で５０． ｏｏｏｒｐ
ｍにて３時間遠心分離することによりサイズ分画した。
こうして、約８００塩基対（アガロースゲル電気泳動に
よる）以上の分子量を有（１３） （１４） するｃＤＮＡ画分を得、これをＢｃｏＲＩにより消化し
たλＺＡＰ ｎ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手）ベ
クターに連結し、パッケージし、そしてＸＬ−Ｉ Ｂｌ
ｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより人手）に感染させ
た。ｃＤＮＡを含有するλ２ＡＰ ｎを増幅してｃＤＮ
Ａライブラリーを得た。
よる）以上の分子量を有（１３） （１４） するｃＤＮＡ画分を得、これをＢｃｏＲＩにより消化し
たλＺＡＰ ｎ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手）ベ
クターに連結し、パッケージし、そしてＸＬ−Ｉ Ｂｌ
ｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより人手）に感染させ
た。ｃＤＮＡを含有するλ２ＡＰ ｎを増幅してｃＤＮ
Ａライブラリーを得た。
ウシスカベンジャーレセプターｃＤＮＡを含有するプラ
スミドｐＢＳＲ７（Ｔ、Ｋｏｄａｍａら、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ３４３ ：５３１−５３５． １９９０）から
のコラーゲン様ドメインに相当する３５４ｂｐのＸｂａ
ｌ−３ｐｈｌ 断片を得、コレを３２ｐにより放射能ラ
ベルしてハイブリダイゼーションプローブを調製した。
スミドｐＢＳＲ７（Ｔ、Ｋｏｄａｍａら、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ３４３ ：５３１−５３５． １９９０）から
のコラーゲン様ドメインに相当する３５４ｂｐのＸｂａ
ｌ−３ｐｈｌ 断片を得、コレを３２ｐにより放射能ラ
ベルしてハイブリダイゼーションプローブを調製した。
前記ヒトスカベンジャーレセプターｃＤＮＡライブラリ
ーの５×１０５プラークを前記ＤＮＡプローブによりス
クリーニングして２個の陽性クローンを得た。これをタ
イプエ及びタイプ■と称する。これらの陽性クローンの
ｃＤＮＡの塩基配列をＳａｎｇｅｒのグイデオキシ法に
より決定した。これらはいずれも長い１個のオープンリ
ーディングフレームを含み、それぞれウシスカベンジャ
ーレセプターｃＤＮＡの塩基配列との相同性を示し、■
型と■型の塩基配列は３′−末端側において異っていた
。これらの塩基配列を第１図（■型）及び第２図（■型
）に示す。これらのクローンのｃＤＮＡ部分をプローブ
として用いてさらに６ ＸＩＰ プラークのｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングしたところ■型のクローン
１４個及び■型のクローン３個を得た。■型及び■型の
代表的クローンをそれぞれｐｈＳＲＩ及びｐｈＳＲＩ［
とじその後の実験に使用した。
ーの５×１０５プラークを前記ＤＮＡプローブによりス
クリーニングして２個の陽性クローンを得た。これをタ
イプエ及びタイプ■と称する。これらの陽性クローンの
ｃＤＮＡの塩基配列をＳａｎｇｅｒのグイデオキシ法に
より決定した。これらはいずれも長い１個のオープンリ
ーディングフレームを含み、それぞれウシスカベンジャ
ーレセプターｃＤＮＡの塩基配列との相同性を示し、■
型と■型の塩基配列は３′−末端側において異っていた
。これらの塩基配列を第１図（■型）及び第２図（■型
）に示す。これらのクローンのｃＤＮＡ部分をプローブ
として用いてさらに６ ＸＩＰ プラークのｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングしたところ■型のクローン
１４個及び■型のクローン３個を得た。■型及び■型の
代表的クローンをそれぞれｐｈＳＲＩ及びｐｈＳＲＩ［
とじその後の実験に使用した。
’１例２． ヒトスカベンジャーレセプター産生細胞
の作製 前記のようにして得たプラスミドクローンｐｈＳＲＩ及
びｐｈＳＲＩＩをそれぞれ次のようにして処理した。こ
れらのプラスミドを制限酵素間ｎｄｌｌＩ及びＸｂａ
Ｉで消化し、翻訳開始コドンＡＴＧから翻訳終止コドン
ＴＡＡまでの全体（■型：４５１アミノ酸；■型：３５
８アミノ酸に相当する）を含むＤＮＡ断片を得た。
の作製 前記のようにして得たプラスミドクローンｐｈＳＲＩ及
びｐｈＳＲＩＩをそれぞれ次のようにして処理した。こ
れらのプラスミドを制限酵素間ｎｄｌｌＩ及びＸｂａ
Ｉで消化し、翻訳開始コドンＡＴＧから翻訳終止コドン
ＴＡＡまでの全体（■型：４５１アミノ酸；■型：３５
８アミノ酸に相当する）を含むＤＮＡ断片を得た。
他方、サイトメガロウィルスプロモーターの下流にマル
チクローニング部位を含む約５．４Ｋｂｐの動物細胞発
現用ベクターＲｅ ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（
１５） から市販されている）を旧ｎｄＩ［及びＸｂａ Ｉによ
り消化し線状化ベクターを得た。この線状化ベクターに
前記ＤＮＡ断片を連結することにより、サイトメガロウ
ィルスの下流の旧ｎｄ ｍ （８９５） とＸｂａ
Ｉ（９８６） との間にヒトスカベンジャーｃＤＮＡ
断片が挿入された組換え体プラスミドｐＸｈＳＲＩ及び
ｐＸｈＳＲ■をアンピシリン耐性選択により得た。この
組換え体を大腸菌ＪＭ１０３にトランスフェクトして増
幅した後、ＣｓＣＩＩ超遠心法により精製した。
チクローニング部位を含む約５．４Ｋｂｐの動物細胞発
現用ベクターＲｅ ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（
１５） から市販されている）を旧ｎｄＩ［及びＸｂａ Ｉによ
り消化し線状化ベクターを得た。この線状化ベクターに
前記ＤＮＡ断片を連結することにより、サイトメガロウ
ィルスの下流の旧ｎｄ ｍ （８９５） とＸｂａ
Ｉ（９８６） との間にヒトスカベンジャーｃＤＮＡ
断片が挿入された組換え体プラスミドｐＸｈＳＲＩ及び
ｐＸｈＳＲ■をアンピシリン耐性選択により得た。この
組換え体を大腸菌ＪＭ１０３にトランスフェクトして増
幅した後、ＣｓＣＩＩ超遠心法により精製した。
これらの組換え体を用いてチャイニーズハムスターオリ
バー（Ｃ）１０−Ｋｌ）細胞を形質転換した。すなわち
、ＣＨＯ−Ｋｌ細胞５Ｘ１０５個／Φ６０ｍｍデイツシ
ュを、７％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＦ−１２
Ｎｏｔｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ培地（Ｈａｍ Ｆ−１
２ＨＧＩＢＣＤ製）中で５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃に
て３日間培養し、８０％コンフルエントした。この培養
細胞をＯｐｔｉ−ＭεＭＩＲｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ
Ｍｅｄｉｕｍ（Ｏｐｔｉ−Ｍ［ｉＭ ； ＧＩＢＣＯ
製）により３回洗浄した。この細胞に、５にの前記組換
え体ＤＮＡ及び５０ｄのリポフェクチン試薬（ＢＲＬ）
を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地３−を加え、細胞を５％Ｃ
０２、（１６） ３７℃にて１９時間培養した。次に、１５％ＦＢＳを含
有するＨａｍ Ｆ−１２培地３−を加え、さらに−夜培
養してトランスフェクションを行った。培養物をトリプ
シン−ＥＤＴＡ溶液で処理することによりデイツシュか
ら回収した。
バー（Ｃ）１０−Ｋｌ）細胞を形質転換した。すなわち
、ＣＨＯ−Ｋｌ細胞５Ｘ１０５個／Φ６０ｍｍデイツシ
ュを、７％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＦ−１２
Ｎｏｔｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ培地（Ｈａｍ Ｆ−１
２ＨＧＩＢＣＤ製）中で５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃に
て３日間培養し、８０％コンフルエントした。この培養
細胞をＯｐｔｉ−ＭεＭＩＲｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ
Ｍｅｄｉｕｍ（Ｏｐｔｉ−Ｍ［ｉＭ ； ＧＩＢＣＯ
製）により３回洗浄した。この細胞に、５にの前記組換
え体ＤＮＡ及び５０ｄのリポフェクチン試薬（ＢＲＬ）
を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地３−を加え、細胞を５％Ｃ
０２、（１６） ３７℃にて１９時間培養した。次に、１５％ＦＢＳを含
有するＨａｍ Ｆ−１２培地３−を加え、さらに−夜培
養してトランスフェクションを行った。培養物をトリプ
シン−ＥＤＴＡ溶液で処理することによりデイツシュか
ら回収した。
組換え体の作製に用いたベクターＲｃ／ＣＭＶはネオマ
イシン耐性遺伝子を含有しているため、ネオマイシン耐
性細菌を選択することにより形質転換された細胞を選択
することができる。前記の細胞Ｉ Ｘ １０６個／Φ６
０ｍｍデイツシュを７％ＦＢＳを含有するＨａｍ Ｆ−
１２培地で６時間培養した後、Ｇ４１３（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｉｎ ； ＧＩＢＣＯ製）を最終濃度４７０．ｗ／−
となるように添加し、５％ＣＤ□、３７℃にて１２日間
培養することによりネオマイシン耐性細胞のコロニーを
選択した。この培養の間、４日毎に培地を交換した。■
型及び■型についてそれぞれ４８個ずつのコロニーを選
択し、２４−ウェル・デイツシュで培養した。
イシン耐性遺伝子を含有しているため、ネオマイシン耐
性細菌を選択することにより形質転換された細胞を選択
することができる。前記の細胞Ｉ Ｘ １０６個／Φ６
０ｍｍデイツシュを７％ＦＢＳを含有するＨａｍ Ｆ−
１２培地で６時間培養した後、Ｇ４１３（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｉｎ ； ＧＩＢＣＯ製）を最終濃度４７０．ｗ／−
となるように添加し、５％ＣＤ□、３７℃にて１２日間
培養することによりネオマイシン耐性細胞のコロニーを
選択した。この培養の間、４日毎に培地を交換した。■
型及び■型についてそれぞれ４８個ずつのコロニーを選
択し、２４−ウェル・デイツシュで培養した。
これらの形質転換細胞株からヒトスカベンジャーレセプ
クーの発現量の多い細胞を選択するため、（１７） （１８） １．１′−ジオクタデシル−３，３，３’、３’テトラ
メチル−インドカルボシアニン・ベルクロレー） （Ｄ
ｉＩ）により標識したアセチル化低比重リポ蛋白質（Ｏ
ｉｌ−ＡｃＬＤＬ）を用いて細胞へのＡｃＬＤＬの取込
み試験を行った。すなわち、前記のようにして培養した
細胞をトリプシン処理することにより回収し、各クロー
ンからの細胞約７００個／Φ７用ｍテフロンコーティン
グスライド（Ｂｏｋｕｓｕｉ Ｂｒｏｕｎ製）をネオマ
イシン４００ｇ／−含有Ｈａｍ Ｆ−１２培地中で一夜
培養し、これに０ｉｌ−ＡｃＬＤＬを最終濃度２０ｆｆ
ＬＤＬ蛋白質／ｍｌとなるように添加してさらに一夜培
養した。この細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、細胞へのＤ
ｉ ｒの取込みを蛍光顕微鏡を用いて観察し、最も蛍
光強度の強い細胞株を選択した。こウシて、ヒトスカベ
ンジャーレセプター発現細胞１１ＳＲｌ−２８（Ｉ型発
現株）及びｌｌ５ＲＩＩ−６ＣＩＩ型発現株〉を得た。
クーの発現量の多い細胞を選択するため、（１７） （１８） １．１′−ジオクタデシル−３，３，３’、３’テトラ
メチル−インドカルボシアニン・ベルクロレー） （Ｄ
ｉＩ）により標識したアセチル化低比重リポ蛋白質（Ｏ
ｉｌ−ＡｃＬＤＬ）を用いて細胞へのＡｃＬＤＬの取込
み試験を行った。すなわち、前記のようにして培養した
細胞をトリプシン処理することにより回収し、各クロー
ンからの細胞約７００個／Φ７用ｍテフロンコーティン
グスライド（Ｂｏｋｕｓｕｉ Ｂｒｏｕｎ製）をネオマ
イシン４００ｇ／−含有Ｈａｍ Ｆ−１２培地中で一夜
培養し、これに０ｉｌ−ＡｃＬＤＬを最終濃度２０ｆｆ
ＬＤＬ蛋白質／ｍｌとなるように添加してさらに一夜培
養した。この細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、細胞へのＤ
ｉ ｒの取込みを蛍光顕微鏡を用いて観察し、最も蛍
光強度の強い細胞株を選択した。こウシて、ヒトスカベ
ンジャーレセプター発現細胞１１ＳＲｌ−２８（Ｉ型発
現株）及びｌｌ５ＲＩＩ−６ＣＩＩ型発現株〉を得た。
これらの動物細胞）ＩＳＲｌ−２８及びＨ３ＲＩ［−６
はそれぞれ微工研条寄第２８３７号（ＦＯＲＭ ＢＰ−
２名力及びｉ工研条寄’ｌｚ８ｍ号（ＦＢＲＭ ８Ｐ−
２８１１１））として工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託された。
はそれぞれ微工研条寄第２８３７号（ＦＯＲＭ ＢＰ−
２名力及びｉ工研条寄’ｌｚ８ｍ号（ＦＢＲＭ ８Ｐ−
２８１１１））として工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託された。
実施例４． 動物細胞よりのスカベンジャー受容体蛋白
の精製 スカベンジャー受容体を発現させたＣＨ○細胞を５％Ｆ
Ｃ３，Ｈａｍ Ｆ１２培地中で大量培養後、ラバーポリ
スマンにて集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ＨＣ，１２ｐＨ
８）、１ｍＭｃａｃＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｊ２．１ｆ
ｌ１Ｍ ＰＭＳＦ溶液（溶液Ａ）中でホモジナイズし、
１００．０００ ｇにて１時間超遠心にて沈澱する膜面
物を回収し、これを１％Ｔｒｉｔｏｎｘ １００を含む
溶液Ａ中で、３０分可溶化する。
の精製 スカベンジャー受容体を発現させたＣＨ○細胞を５％Ｆ
Ｃ３，Ｈａｍ Ｆ１２培地中で大量培養後、ラバーポリ
スマンにて集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ＨＣ，１２ｐＨ
８）、１ｍＭｃａｃＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｊ２．１ｆ
ｌ１Ｍ ＰＭＳＦ溶液（溶液Ａ）中でホモジナイズし、
１００．０００ ｇにて１時間超遠心にて沈澱する膜面
物を回収し、これを１％Ｔｒｉｔｏｎｘ １００を含む
溶液Ａ中で、３０分可溶化する。
この７ ｒ １ｔｏｎ Ｘ １００可溶化膜蛋白を、マ
レモル化ＢＳＡアフィニティカラム（Ｔ、 Ｋｏｄａｍ
ａらＰＮＡＳ ８５゜９２３８−９２４２． １９８８
）にａｐｐｌｙ Ｌ Ｉ Ｍ ＮａＣＩ！ 、 ２０
ｍＭＴｒｉｓ−）ＩＣｌ３ ｐｔ１８．１ｍＭ ＣａＣ
ｊ！２．１％ＴｒｌｔＯｎ Ｘ１００を含む溶液中に回
収する。更にヒトスカベンジャー受容体に対する抗体を
用いた免疫アフイニティ力うム法（Ｔ、Ｋｏｄａｍａら
、ＰＮＡＳ、 ８５．９２３８−９２４２゜１９８８）
により、はぼ純回品のヒトスカベンジャー受容体をうろ
ことができる。
レモル化ＢＳＡアフィニティカラム（Ｔ、 Ｋｏｄａｍ
ａらＰＮＡＳ ８５゜９２３８−９２４２． １９８８
）にａｐｐｌｙ Ｌ Ｉ Ｍ ＮａＣＩ！ 、 ２０
ｍＭＴｒｉｓ−）ＩＣｌ３ ｐｔ１８．１ｍＭ ＣａＣ
ｊ！２．１％ＴｒｌｔＯｎ Ｘ１００を含む溶液中に回
収する。更にヒトスカベンジャー受容体に対する抗体を
用いた免疫アフイニティ力うム法（Ｔ、Ｋｏｄａｍａら
、ＰＮＡＳ、 ８５．９２３８−９２４２゜１９８８）
により、はぼ純回品のヒトスカベンジャー受容体をうろ
ことができる。
（１９）
（２０）
ヒトスカベンジャー受容体を発現した細胞を同相化又は
、実施例４にてえた細胞膜蛋白を固相化（Ｔ、Ｋｏｄａ
ｍａ ＰＮＡＳ同上）し、そこに１２５■、又はケイ光
（例えばＤｉｌ）で標識した変性ＬＤＬ （アセチルＬ
ＤＬ又は酸化ＬＤＬ）を加えると一定のプレートへの結
合がみられる。ここへ、種々の検体（例えば血清、培養
上清など）を加えることにより標識された変性ＬＤＬの
結合の抑制をみることにより、血中のスカベンジャー受
容体結合物質の量を定量することが可能となる。
、実施例４にてえた細胞膜蛋白を固相化（Ｔ、Ｋｏｄａ
ｍａ ＰＮＡＳ同上）し、そこに１２５■、又はケイ光
（例えばＤｉｌ）で標識した変性ＬＤＬ （アセチルＬ
ＤＬ又は酸化ＬＤＬ）を加えると一定のプレートへの結
合がみられる。ここへ、種々の検体（例えば血清、培養
上清など）を加えることにより標識された変性ＬＤＬの
結合の抑制をみることにより、血中のスカベンジャー受
容体結合物質の量を定量することが可能となる。
第１図はヒトスカベンジヤーレセプターＩ型をコードす
る領域を含むｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸
配列を示す。 第２図はヒトスカベンジャーレセプター■型をコードす
る領域を含むｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸
配列を示す。 （２１） ８８ 目 旨 藁 ８ 号 目 む ＜Ｅ−Ｉ Ｃ！Ｉｃ！ｌ ｓ＋ Ｌｌ＞
ｕｚ ｈｓ ＜ｌ−Ｉ Ｂ−１ｃＪ
ｈｈき 畢 翼 で 舅 さ ＣりＣり ＣりＣ！ｌ ＣＪＥ ０ｗ
Ｅ−ｎ−＋ ＣりＣ！１日 υ υ
０ ＜ トＣ！ＩＥ−１日 ０
０ −＜の Ｌｌ＞ ｕｑ Ｅ−１よ
Ｃ！ＩＬＩ ｈｈＯ０（００Ｕ ＣりＥ−１）１ｔり 日 ベＬ）Ｃ！ｌ
〇−＜ｌ−Ｉ ＣＪｌ）臼−０田Ｅ−１ｔ！ｌ
日 ＯＣ！＋ υ Ｅ−１ｃＪ ＣＪｌ） ０べ １−ＩＥ−ＩＥ−Ｉ Ｅ−４日 は 日−＜ｌ−Ｉ ＣＥｌ口 素＞目、」。 に。旨７札邑、鴎。糺 召 閤 吾 已 召 ご Ｅ−１−υｏ ＜ｌ−Ｉ Ｃ！ＩＬ） ベー
ベーＥ−１ｃＪｃＪ Φ ＜ Ｕ海
、目ｈ ３ｏ ３ｏ 号、悶２ 已エ 已エ 召ア ＄５ 旨。８゜ ｇｏ旨７ 札Ｌ ０ 臼 Ｅ”ｌ−Φト ＣＪ）ｌ ＜Ｉ−Ｉ ＣＪ田 Ｃり（Ｊ −υ ト ０４Ｅ−１
ｃＪｃＪ＜？ Ｃ！＋口 υ−＜１＋＜Ｅ−４Ｃ！ｌロ 日−考お□２
車８斃。〈８尊。 υ ＣＪ（！ｌ＜＜ＣＪ 悶ｚ ８ぺ 開目 乙−８ぺ 冒ト 閤。ｇ。礼読。玲７旨２ ０ ０ υ （！Ｉｃり（５＜ｘ ＜
子 Ｅ＋１− 〇−〇〇 −一九旬。 υ Ｕ Ｃ！Ｉｃ！ｌ ＜１−１ 旨７托４ 日 ベ ｏｑ Ｃり閲 司７ｇ。 餓 瞭 ＧＴＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＴＧ Ｇ
ＣＴ Ａ’Ｉ’Ｇ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＧＴＧＶＳＡＥＩＭＡＭＫＥＥＱＶ ０２ ３４ ＣＡＴ ＴＴＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＭ ＡＴＡ ＡＡ
Ａ ＧＧＡ ＧＭ ＧＴＧ ＡＡＡ ＧＴＡ ＣＴＧＨ
ＬＥＱＥＩＫＧＥＶＫＶＬ ４１ ４７ ＡＡＴ ＡＡＣＡＴＣＡＣＴ ＡＡＴ ＧＡＴ ＣＴＣ
ＡＧＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＧＧ ＧＡＡＮＮ
工 ＴＮＤＬＲＬＫＤＷＥＥＩＯ ６０ ＣＡＴ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＣＣＴＴＧ ＡＧＡ Ｍ
Ｔ ＡＴＣＡＣＴ ＴＴＡ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＧＴＨ
８ＱＴＬＲＮ 工 ＴＬＩＱＧ１９ ７３ ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＣＣＣＣＧ ＧＧＴ ＧＡ
Ａ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＣＣＣ
ＰＰＧＰＰＧＥＫＧＤＲＧＰ ５８ ８６ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＧＧＴ ＣＣ
Ａ ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＴＴ ＣＣＡ ＧＧＴ Ｃ
ＣＡ ＡＴＡＴＧＥＳＧＰＲＧＦＰＧＰ エ ９７ ９９ ＧＧＴ ＣＣＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＣＴＴ ＡＡ
Ａ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＣＡ
ＡＴＴ ＧＧＣＧＰＰＧＬ’ＫＧＤＲＧＡ 工
Ｇ３６ １２ ＴＴＴ ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＧＴ ＣＧＡ ＧＧＡ
Ｃ’Ｉ’ＣＣＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＧＣＣＧＧＡ
ＡＧＧＦＰＧＳＲＧＬＰＧＹＡＧＲ ７５ ２５ ＣＣＡ ＧＧＡ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＣＣＡ
ＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧ ＡＡＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＡＡ
ＧＰＧＮＳＧＰＫＧＱＫＧＥＫ ０１４ ３８ ＧＧＧ ＡＧＴ ＧＧＡ ＭＣＡＣＡ ＴＴＡ ＡＧＡ
ＣＣＡ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＴＣＡＣＴ ＧＡＴＧＳ
ＧＮＴＬＲＰＶＱＬＴＤ ０５３ ５７ ＣＡＴ ＡＴＴ ＡＧＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＣＣＣＴＣ
Ｔ ＴＭ ＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧ ＧＴＴＧＧＧＣＧＧ
Ｇ０９７
る領域を含むｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸
配列を示す。 第２図はヒトスカベンジャーレセプター■型をコードす
る領域を含むｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸
配列を示す。 （２１） ８８ 目 旨 藁 ８ 号 目 む ＜Ｅ−Ｉ Ｃ！Ｉｃ！ｌ ｓ＋ Ｌｌ＞
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〇−＜ｌ−Ｉ ＣＪｌ）臼−０田Ｅ−１ｔ！ｌ
日 ＯＣ！＋ υ Ｅ−１ｃＪ ＣＪｌ） ０べ １−ＩＥ−ＩＥ−Ｉ Ｅ−４日 は 日−＜ｌ−Ｉ ＣＥｌ口 素＞目、」。 に。旨７札邑、鴎。糺 召 閤 吾 已 召 ご Ｅ−１−υｏ ＜ｌ−Ｉ Ｃ！ＩＬ） ベー
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ＣＴ Ａ’Ｉ’Ｇ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＧＴＧＶＳＡＥＩＭＡＭＫＥＥＱＶ ０２ ３４ ＣＡＴ ＴＴＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＭ ＡＴＡ ＡＡ
Ａ ＧＧＡ ＧＭ ＧＴＧ ＡＡＡ ＧＴＡ ＣＴＧＨ
ＬＥＱＥＩＫＧＥＶＫＶＬ ４１ ４７ ＡＡＴ ＡＡＣＡＴＣＡＣＴ ＡＡＴ ＧＡＴ ＣＴＣ
ＡＧＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＧＧ ＧＡＡＮＮ
工 ＴＮＤＬＲＬＫＤＷＥＥＩＯ ６０ ＣＡＴ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＣＣＴＴＧ ＡＧＡ Ｍ
Ｔ ＡＴＣＡＣＴ ＴＴＡ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＧＴＨ
８ＱＴＬＲＮ 工 ＴＬＩＱＧ１９ ７３ ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＣＣＣＣＧ ＧＧＴ ＧＡ
Ａ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＣＣＣ
ＰＰＧＰＰＧＥＫＧＤＲＧＰ ５８ ８６ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＧＧＴ ＣＣ
Ａ ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＴＴ ＣＣＡ ＧＧＴ Ｃ
ＣＡ ＡＴＡＴＧＥＳＧＰＲＧＦＰＧＰ エ ９７ ９９ ＧＧＴ ＣＣＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＣＴＴ ＡＡ
Ａ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＣＡ
ＡＴＴ ＧＧＣＧＰＰＧＬ’ＫＧＤＲＧＡ 工
Ｇ３６ １２ ＴＴＴ ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＧＴ ＣＧＡ ＧＧＡ
Ｃ’Ｉ’ＣＣＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＧＣＣＧＧＡ
ＡＧＧＦＰＧＳＲＧＬＰＧＹＡＧＲ ７５ ２５ ＣＣＡ ＧＧＡ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＣＣＡ
ＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧ ＡＡＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＡＡ
ＧＰＧＮＳＧＰＫＧＱＫＧＥＫ ０１４ ３８ ＧＧＧ ＡＧＴ ＧＧＡ ＭＣＡＣＡ ＴＴＡ ＡＧＡ
ＣＣＡ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＴＣＡＣＴ ＧＡＴＧＳ
ＧＮＴＬＲＰＶＱＬＴＤ ０５３ ５７ ＣＡＴ ＡＴＴ ＡＧＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＣＣＣＴＣ
Ｔ ＴＭ ＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧ ＧＴＴＧＧＧＣＧＧ
Ｇ０９７
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、動物細胞中で機能し得るプロモーターの制御下にヒ
トスカベンジャーレセプターＩ型又はII型をコードする
遺伝子を含んで成るベクターにより形質転換された、ヒ
トスカベンジヤーレセプターＩ型又はII型を発現するこ
とができる動物細胞。 ２、前記ヒトスカベンジャーレセプター I 型又はII型
をコードする遺伝子が第１図又は第２図に示す塩基配列
中のコード領域の塩基配列を有する請求項１に記載の動
物細胞。 ３、前記プロモーターがサイトメガロウイルスのプロモ
ーターである請求項１に記載の動物細胞。 ４、前記動物細胞がチャイニーズハムスターオバリー細
胞である請求項１に記載の動物細胞。 ５、サイトメガロウイルスのプロモーターの下流に第１
図又は第２図に示す塩基配列中のコード領域を含むｃＤ
ＮＡ断片が挿入されたベクターにより形質転換されたチ
ャイニーズハムスターオバリー細胞である請求項１に記
載の動物細胞。 ６、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞を培養す
ることを特徴とするヒトスカベンジャーレセプターの製
造方法。 ７、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞を用いる
血中変性リポ蛋白質又は変性物の検出方法。 ８、ヒトスカベンジャーレセプターII型をコードする遺
伝子。 ９、第２図に示すコード領域の塩基配列を有する請求項
８に記載の遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2090274A JPH03290184A (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | スカベンジャーレセプター産生動物細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2090274A JPH03290184A (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | スカベンジャーレセプター産生動物細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03290184A true JPH03290184A (ja) | 1991-12-19 |
Family
ID=13993938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2090274A Pending JPH03290184A (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | スカベンジャーレセプター産生動物細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03290184A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996000288A3 (en) * | 1994-06-23 | 1996-04-04 | Massachusetts Inst Technology | Class bi and ci scavenger receptors |
| WO1996011268A1 (en) * | 1994-10-06 | 1996-04-18 | Warner-Lambert Company | Method of using a scavenger receptor in the treatment of atherosclerosis |
| US5925333A (en) * | 1995-11-15 | 1999-07-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for modulation of lipid uptake |
| US5962322A (en) * | 1996-11-15 | 1999-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for modulation of cholesterol transport |
| EP0871885A4 (en) * | 1995-05-30 | 2000-11-22 | Smithkline Beecham Corp | 293 CELLS WITH INCREASED ADHESION. |
| US6350859B1 (en) | 1994-06-23 | 2002-02-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Class BI and CI scavenger receptors |
| US7045350B2 (en) | 2001-08-30 | 2006-05-16 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Alternatively spliced circulating tissue factor |
| JP2008263992A (ja) * | 1994-11-30 | 2008-11-06 | Nippon Chemiphar Co Ltd | 変性低密度リポ蛋白質受容体 |
-
1990
- 1990-04-06 JP JP2090274A patent/JPH03290184A/ja active Pending
Cited By (9)
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