JPH03290186A - リパーゼの製造方法 - Google Patents
リパーゼの製造方法Info
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- JPH03290186A JPH03290186A JP2090888A JP9088890A JPH03290186A JP H03290186 A JPH03290186 A JP H03290186A JP 2090888 A JP2090888 A JP 2090888A JP 9088890 A JP9088890 A JP 9088890A JP H03290186 A JPH03290186 A JP H03290186A
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- JP
- Japan
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- lipase
- dna
- mold
- cultured
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はカビリパーゼをコードするＤＮＡを組み込んだ
組換体ＤＮＡを含む酵母を用いるカビリパーゼの製造方
法に関する。
組換体ＤＮＡを含む酵母を用いるカビリパーゼの製造方
法に関する。
従来の技術および課題
リパーゼはその多岐の触媒作用から、工業的に重要な酵
素である。特に、カビのリパーゼはトリグリセリドの１
，３位を特異的に分解または合成できるという特徴を有
しており、油脂の改質やエステル合成等への利用価値が
高い。
素である。特に、カビのリパーゼはトリグリセリドの１
，３位を特異的に分解または合成できるという特徴を有
しており、油脂の改質やエステル合成等への利用価値が
高い。
本発明者らは、先に、カビの一種であるリゾプス・ニベ
ウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎ１ｖｅｕｓ）のリパーゼを
コードするＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを組み込んた組
換体ＤＮＡを含む大腸菌を培養したところ、大腸菌内に
カビリパーゼが蓄積されることを見い出し、該ＤＮＡの
配列、該ＤＮＡ配列を連結したベクターおよび該ベクタ
ーを大腸菌に導入して発現させることよりなるカビリパ
ーゼの生産方法の発明を完成し、既に特許出願した（特
開昭６４８０２９０号）。
ウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎ１ｖｅｕｓ）のリパーゼを
コードするＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを組み込んた組
換体ＤＮＡを含む大腸菌を培養したところ、大腸菌内に
カビリパーゼが蓄積されることを見い出し、該ＤＮＡの
配列、該ＤＮＡ配列を連結したベクターおよび該ベクタ
ーを大腸菌に導入して発現させることよりなるカビリパ
ーゼの生産方法の発明を完成し、既に特許出願した（特
開昭６４８０２９０号）。
この方法は、カビリパーゼの生産方法として非常に有用
なものであるが、リパーゼか大腸菌の菌内に蓄積される
ため、精製工程か複雑となり、工業的に大量生産するに
は、さらに改良が望まれる。
なものであるが、リパーゼか大腸菌の菌内に蓄積される
ため、精製工程か複雑となり、工業的に大量生産するに
は、さらに改良が望まれる。
そこで、本発明者らは、リパーゼが宿主菌体内に蓄積さ
れずに効率良く菌体外に分泌される生産系を目的とし、
宿主として酵母に着目して研究、開発に取り組んた。そ
の結果、リパーゼをコードするＤＮＡ配列および発現に
適したプロモーターを連結した酵母形質転換用ベクター
を構築することに成功し、本発明を実践するに至った。
れずに効率良く菌体外に分泌される生産系を目的とし、
宿主として酵母に着目して研究、開発に取り組んた。そ
の結果、リパーゼをコードするＤＮＡ配列および発現に
適したプロモーターを連結した酵母形質転換用ベクター
を構築することに成功し、本発明を実践するに至った。
課題を解決するための手段
本発明は、カビリパーゼをコードするＤＮＡを絹み込ん
た組換体ＤＮＡを含む酵母を培地に培養し、該培養物中
にカビリパーゼを蓄積させ、培養物から、該リパーゼを
採取することを特徴とするリパーゼの製造方法を提供す
るものである。
た組換体ＤＮＡを含む酵母を培地に培養し、該培養物中
にカビリパーゼを蓄積させ、培養物から、該リパーゼを
採取することを特徴とするリパーゼの製造方法を提供す
るものである。
本発明の製造方法を実施するには、まず、リパーゼをコ
ードするＤＮＡ配列を連結したベクターを酵母宿主に導
入して発現させる。
ードするＤＮＡ配列を連結したベクターを酵母宿主に導
入して発現させる。
かかるベクターの構築には、まず、常法に従い、固体培
養法または肢体培養性によりカビを培養する。本発明で
用いることかできるカビとしては、リゾプス（Ｒｈ １
ｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アスペル
ギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属等のリパーゼ生産菌が挙げ
られる。
養法または肢体培養性によりカビを培養する。本発明で
用いることかできるカビとしては、リゾプス（Ｒｈ １
ｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アスペル
ギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属等のリパーゼ生産菌が挙げ
られる。
このうち、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎ
１ｖｅｕｓ）は代表的な１，３位特異的リパーゼ生産菌
として公知であり、好適である。
１ｖｅｕｓ）は代表的な１，３位特異的リパーゼ生産菌
として公知であり、好適である。
つぎに、培養したカビから、染色体ＤＮＡを調製する。
かかる調製は常法により、例えば、ハイネスらの方法［
ハイネス１ エム・ジェイら、ネイチャ（Ｈｙｎｅｓ、
Ｍ、 Ｊ、ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ） 、 ３０
５゜６００（１９８３）］によって行うことができる。
ハイネス１ エム・ジェイら、ネイチャ（Ｈｙｎｅｓ、
Ｍ、 Ｊ、ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ） 、 ３０
５゜６００（１９８３）］によって行うことができる。
このように調製した染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリ
ーを作製し、これから目的遺伝子を含むＤＮＡ断片をク
ローニングする。これは、ＤＮＡ断片を大腸菌に形質転
換し、例えば、コロニーハイブリダイセーションによっ
て目的遺伝子を保持する形質転換菌を選択し、かかる形
質転換菌を増殖させることによって行うことができる。
ーを作製し、これから目的遺伝子を含むＤＮＡ断片をク
ローニングする。これは、ＤＮＡ断片を大腸菌に形質転
換し、例えば、コロニーハイブリダイセーションによっ
て目的遺伝子を保持する形質転換菌を選択し、かかる形
質転換菌を増殖させることによって行うことができる。
得られたクローン化ＤＮＡ断片を用いて発現ベフタ−を
構築する。構築はクローン化ＤＮＡ断片を適当なベクタ
ーに連結することにより行う。同時に連結する適当なプ
ロモーターとしては、ホスホグリセリン酸キナーセ（Ｐ
ＧＫ）、グリセルアル７ヒト−３−リン酸脱水素酵素（
ＧＡＰＤＨ）、酸性ホスファターセ（ＰＨ０５）、トリ
プトファン合成酵素（ＴＲＰＩ）、アルコール脱水素酵
素（ＡＤＨ）等のプロモーターが挙げられる。構築は制
限エンドヌクレアーゼ法などの常法に従って行うことが
できる。得られた発現ベクターは常法により精製、増殖
させることができる。
構築する。構築はクローン化ＤＮＡ断片を適当なベクタ
ーに連結することにより行う。同時に連結する適当なプ
ロモーターとしては、ホスホグリセリン酸キナーセ（Ｐ
ＧＫ）、グリセルアル７ヒト−３−リン酸脱水素酵素（
ＧＡＰＤＨ）、酸性ホスファターセ（ＰＨ０５）、トリ
プトファン合成酵素（ＴＲＰＩ）、アルコール脱水素酵
素（ＡＤＨ）等のプロモーターが挙げられる。構築は制
限エンドヌクレアーゼ法などの常法に従って行うことが
できる。得られた発現ベクターは常法により精製、増殖
させることができる。
ついで、このように構築したー・フタ−を宿主に導入し
、増殖させ発現させる。本発明では宿主として酵母を用
いる。例えば、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚ ｙｇｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などを用いることができ、入手
容易性等の観点より、ことにサツカロミセス０セレビシ
ユア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ５ｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）が好ましい。
、増殖させ発現させる。本発明では宿主として酵母を用
いる。例えば、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚ ｙｇｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などを用いることができ、入手
容易性等の観点より、ことにサツカロミセス０セレビシ
ユア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ５ｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）が好ましい。
導入方法は、チ七すアーセなどて処理してプロトプラス
トを作製する方法、あるいはアルカリ金属塩などで処理
する方法のような常法によって行うことができる。好ま
しい導入方法は塩化リチウムで処理するリチウム法であ
る。
トを作製する方法、あるいはアルカリ金属塩などで処理
する方法のような常法によって行うことができる。好ま
しい導入方法は塩化リチウムで処理するリチウム法であ
る。
ベクターを導入した形質転換酵母の培養は、常法により
、例えば、振とう培養法、流加培養法などにより行うこ
とができる。用いる培地は通常の酵母培養培地でよく、
グルコース、シュクロース、フラクトース、ガラクトー
スのような炭素源、硫酸アンモニウム、ペプトン、大豆
蛋白加水分解物のような窒素源、その他、ビタミン、ア
ミノ酸、無機塩、微量元素のような栄養成分を適宜配合
したｐＨ３〜８のものが用いられる。通常、２０〜３５
°Ｃで２０〜１００時間培養することにより、所望のカ
ビリパーゼが収率よ（菌体外に分泌、蓄積される。
、例えば、振とう培養法、流加培養法などにより行うこ
とができる。用いる培地は通常の酵母培養培地でよく、
グルコース、シュクロース、フラクトース、ガラクトー
スのような炭素源、硫酸アンモニウム、ペプトン、大豆
蛋白加水分解物のような窒素源、その他、ビタミン、ア
ミノ酸、無機塩、微量元素のような栄養成分を適宜配合
したｐＨ３〜８のものが用いられる。通常、２０〜３５
°Ｃで２０〜１００時間培養することにより、所望のカ
ビリパーゼが収率よ（菌体外に分泌、蓄積される。
培養の後、遠心等の常法により培養物から菌体を分離除
去し、上清からＵＦｉｌ縮や硫安沈澱等の常法によりリ
パーゼを回収、精製する。
去し、上清からＵＦｉｌ縮や硫安沈澱等の常法によりリ
パーゼを回収、精製する。
かくして、本発明の製造方法は、加水分解、工ステル交
換反応等に利用できるカビリ／ Ｎ＋−七の生産に好適
に適用できる。特に、１．３位特異性（１゜３位特異的
氷解性や１．３位特異的エステル交換性）を有するリパ
ーゼの生産に好適に適用できる。
換反応等に利用できるカビリ／ Ｎ＋−七の生産に好適
に適用できる。特に、１．３位特異性（１゜３位特異的
氷解性や１．３位特異的エステル交換性）を有するリパ
ーゼの生産に好適に適用できる。
寡狙珂
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳Ｌ（説明する。
実施例１
リゾプス由来リパーゼ遺伝子の取得
（１）染色体遺伝子ライブラリーの作製ハイネスらの方
法（前出）に従い、リノ（−セ生産菌リゾプス・ニベウ
ス Ｉ Ｆ Ｏ４，７５９株から染色体ＤＮＡを調製し
た。
法（前出）に従い、リノ（−セ生産菌リゾプス・ニベウ
ス Ｉ Ｆ Ｏ４，７５９株から染色体ＤＮＡを調製し
た。
続いて、この染色体ＤＮＡ中のいずれの制限酵素の分解
によるＤＮＡ断片上にリパーゼ遺伝子が存在しているか
を調べるために、特開昭６４−８０２９０号に記載のご
とくに単離ｌまたリゾプス・ニベウスのリパーゼｃＤＮ
Ａをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行
った。
によるＤＮＡ断片上にリパーゼ遺伝子が存在しているか
を調べるために、特開昭６４−８０２９０号に記載のご
とくに単離ｌまたリゾプス・ニベウスのリパーゼｃＤＮ
Ａをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行
った。
その結果、制限酵素Ｐｓｔｌて分解を受けた約４、．５
ｋｂのＤＮＡ断片上にリノク−ゼ遺伝子が存在すること
が判明した。そこで、染色体ＤＮＡをＰｓｔｌで切断し
、アガロースゲル電気泳動を行った後、４．０ｋｂ〜５
．Ｏｋｂの分解物ＤＮＡ断片をゲルから切り出し抽出・
回収した。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、該回収
したＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵｃ１８のＰｓ
ｔ１部位に連結し、大腸菌ＪＭＩ ０９株に形質転換し
、染色体遺伝子ライブラリーを得た。
ｋｂのＤＮＡ断片上にリノク−ゼ遺伝子が存在すること
が判明した。そこで、染色体ＤＮＡをＰｓｔｌで切断し
、アガロースゲル電気泳動を行った後、４．０ｋｂ〜５
．Ｏｋｂの分解物ＤＮＡ断片をゲルから切り出し抽出・
回収した。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、該回収
したＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵｃ１８のＰｓ
ｔ１部位に連結し、大腸菌ＪＭＩ ０９株に形質転換し
、染色体遺伝子ライブラリーを得た。
（２）遺伝子ライブラリーのスクリーニング先に作製し
た約３００個の遺伝子ライブラリーについて、（１）と
同様に、リパーゼｃＤＮＡをプローブとしてコロニーハ
イブリタイゼーションを行い、プラスミドｐＧＰＩを持
つ形質転換菌をポジティブクローンとして選択した。該
ｐＧＰＩはリゾプスに由来する４、、３ｋｂのＰｓｔｌ
切断のＤＮＡ片を有するものであり、その制限酵素切断
地図を第１図に示す。
た約３００個の遺伝子ライブラリーについて、（１）と
同様に、リパーゼｃＤＮＡをプローブとしてコロニーハ
イブリタイゼーションを行い、プラスミドｐＧＰＩを持
つ形質転換菌をポジティブクローンとして選択した。該
ｐＧＰＩはリゾプスに由来する４、、３ｋｂのＰｓｔｌ
切断のＤＮＡ片を有するものであり、その制限酵素切断
地図を第１図に示す。
このプラスミドは平底２年３月２２日に工業技術院微生
物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１１３６７の
下で寄託した。
物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１１３６７の
下で寄託した。
（３）染色体リパーゼ遺伝子の構造
リパーゼｃＤＮＡをプローブとして行ったササンハイブ
リタイセーションの結果、ｐＧＰＩのＥｃｏＲＩ ３．
Ｏｋｂ ＤＮＡ断片上にリパーゼ遺伝子が存在して
いることが判明した。そこで、このＤＮＡ断片について
サンカーらの方法［サンガーエフ、サイエンス（Ｓａｎ
ｇｅｒ、Ｆ、 ５ｃｉｅｎｃｅ） 、 ２旦、１２
０５（１９８１）］に従って、その全塩基配列を決定し
た。その結果、決定した塩基配列中に、既に明らかにし
たリパーゼ ｃＤＮＡの塩基配列（特開昭６４−８０２
９０号参照）と全く同一の配列か存在し染色体リパーゼ
遺伝子の構造か明らかになった。
リタイセーションの結果、ｐＧＰＩのＥｃｏＲＩ ３．
Ｏｋｂ ＤＮＡ断片上にリパーゼ遺伝子が存在して
いることが判明した。そこで、このＤＮＡ断片について
サンカーらの方法［サンガーエフ、サイエンス（Ｓａｎ
ｇｅｒ、Ｆ、 ５ｃｉｅｎｃｅ） 、 ２旦、１２
０５（１９８１）］に従って、その全塩基配列を決定し
た。その結果、決定した塩基配列中に、既に明らかにし
たリパーゼ ｃＤＮＡの塩基配列（特開昭６４−８０２
９０号参照）と全く同一の配列か存在し染色体リパーゼ
遺伝子の構造か明らかになった。
第２図に染色体リパーゼ遺伝子の構造遺伝子とその５′
側、３′側の塩基配列および塩基配列より推定されるア
ミノ酸配列を示す。第２図から判るように、染色体リパ
ーゼ遺伝子はＡ Ｔ Ｇ （Ｍｅｔ）開始コドンから始
まりＴＡＡの終止コドンで終わる、３９２個のアミノ酸
をフードする１１７６塩基対のフレームから構成される
。
側、３′側の塩基配列および塩基配列より推定されるア
ミノ酸配列を示す。第２図から判るように、染色体リパ
ーゼ遺伝子はＡ Ｔ Ｇ （Ｍｅｔ）開始コドンから始
まりＴＡＡの終止コドンで終わる、３９２個のアミノ酸
をフードする１１７６塩基対のフレームから構成される
。
実施例２
リパーゼ遺伝子の発現
（１）発現プラスミドの構築
リパーゼ遺伝子を酵母内で発現させるために、第３図に
示す工程により、発現プラスミド゛ｐＭΔ９１２４を構
築した。
示す工程により、発現プラスミド゛ｐＭΔ９１２４を構
築した。
まず、ｐＧＰＩのＥｃｏＲＩ’−ＢａｍＨＩ ３．０
ｋｂＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により抽出
して単離し、ＤＮＡポリメラーゼ１およびフレノウ断片
を用い、該単離したＤＮＡの両端末を平滑化した。
ｋｂＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により抽出
して単離し、ＤＮＡポリメラーゼ１およびフレノウ断片
を用い、該単離したＤＮＡの両端末を平滑化した。
平滑末端化した３、０ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片をベクターｐＵｃ１８のＨｉｎｃＨ部位にサ
ブクローニングしてプラスミドｐＧ Ｐ Ｅ ３を得た
。
ＤＮＡ断片をベクターｐＵｃ１８のＨｉｎｃＨ部位にサ
ブクローニングしてプラスミドｐＧ Ｐ Ｅ ３を得た
。
ｐＧ Ｐ Ｅ ３をＢａｍＨＩおよびＳ ａｃ Ｔの両
制限酵素て切断し、エキソヌクレアーセ′■及びマング
・ビーン・ヌクレアーゼを用いて、ＢａｍＨ１部位側か
らリパーゼ遺伝子の５′側プロモーター領域の欠失を行
ってプラスミド ｐｃ Ｐ Ｄ ２４を得た。
制限酵素て切断し、エキソヌクレアーセ′■及びマング
・ビーン・ヌクレアーゼを用いて、ＢａｍＨ１部位側か
らリパーゼ遺伝子の５′側プロモーター領域の欠失を行
ってプラスミド ｐｃ Ｐ Ｄ ２４を得た。
該ｐｃ Ｐ Ｄ ２４をＥｃｏＲＴおよび５ａｉｌの両
制限酵素で切断した後、ＤＮＡポリメラーゼ■およびフ
レノウ断片によりＤＮＡ末端を平滑化した。
制限酵素で切断した後、ＤＮＡポリメラーゼ■およびフ
レノウ断片によりＤＮＡ末端を平滑化した。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりＢａｍＨＩリンカ−（５
’ ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣ３’ ）を付加した後、発現
ベクターｐＭＡ９］のＢｇｌＩＩ部位にクローニングし
て発現プラスミドｐＭＡ９１２４を得た。
’ ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣ３’ ）を付加した後、発現
ベクターｐＭＡ９］のＢｇｌＩＩ部位にクローニングし
て発現プラスミドｐＭＡ９１２４を得た。
このプラスミドは、平成２年３月２２日に工業技術院微
生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−］］３６８
の下で寄託した。
生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−］］３６８
の下で寄託した。
なお、前記ｐＭＡ９１はＪ、 Ｍｅｌｌｏｒ ｅｔ ａ
ｌ、 Ｇｅｎｅ。
ｌ、 Ｇｅｎｅ。
２４、１ （１９８３）に報告されている酵母用発現ベ
クターであり、Ｂｇｌ Ｈ部位の両側にはＰＧＫプロモ
ーターとＰＧＫターミネークーか保持されている。
クターであり、Ｂｇｌ Ｈ部位の両側にはＰＧＫプロモ
ーターとＰＧＫターミネークーか保持されている。
このｐＭＡ９］の制限酵素切断地図を第３図に示す。
前記のごとく構築した発現プラスミドｐＭＡ９１２４を
、リチウム法［エイチ・イト−ら、ジャーナル・オブ・
バイオテクノロジー（Ｈ，Ｉｔｏｅｔａｌ、 Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、上５３．１６３（１９８３）
’］に従ってサツカロミセス・セレビジュアＡ Ｈ２２
株に形質転換した。
、リチウム法［エイチ・イト−ら、ジャーナル・オブ・
バイオテクノロジー（Ｈ，Ｉｔｏｅｔａｌ、 Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、上５３．１６３（１９８３）
’］に従ってサツカロミセス・セレビジュアＡ Ｈ２２
株に形質転換した。
（２）リパーゼ遺伝子の発現
ｐＭＡ９１．２４形質転換酵母の単一コロニーを終濃度
５０μｇ／ｍｌになるようにヒスチジンを添加したＹＮ
Ｂ培地（０，７％デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社イースト・
ナイトロジェン・ベース（Ｙ ｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅ
ｎ Ｂａ５ｅ） 、２％グルコース、ｐＩ−Ｔ５．６
）に植菌し、３０’Ｃで一晩振盪培養した。
５０μｇ／ｍｌになるようにヒスチジンを添加したＹＮ
Ｂ培地（０，７％デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社イースト・
ナイトロジェン・ベース（Ｙ ｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅ
ｎ Ｂａ５ｅ） 、２％グルコース、ｐＩ−Ｔ５．６
）に植菌し、３０’Ｃで一晩振盪培養した。
０．２５ｍ１の培養液を５０ｍ１のＹＰＤ培地（１％酵
母エキス、２％ペフトン、２％グルコース）に加え、３
０°Ｃにて４８時間振盪培養した。
母エキス、２％ペフトン、２％グルコース）に加え、３
０°Ｃにて４８時間振盪培養した。
培養終了後、遠心分離により菌体を除去し、培養土清中
のリパーゼ活性をオリーブ油乳化液を基質とした方法（
仲恭寛、薬剤学、４５，３４１（１９８５）に従って測
定した。
のリパーゼ活性をオリーブ油乳化液を基質とした方法（
仲恭寛、薬剤学、４５，３４１（１９８５）に従って測
定した。
対照として、リパーゼ遺伝子が存在しないサツカロミセ
ス・セレビシェＡＩ−ｒ２２株に発現ベクターｐＭＡ９
１を導入した形質転換酵母を同様に培１ 養し、培養土清中のリパーゼ活性を調べた。
ス・セレビシェＡＩ−ｒ２２株に発現ベクターｐＭＡ９
１を導入した形質転換酵母を同様に培１ 養し、培養土清中のリパーゼ活性を調べた。
結果を第１表に示す。
第１表
２
使用する組み換え体プラスミドを構築する手順を示した
フロー図である。
フロー図である。
Claims (4)
- （１）カビリパーゼをコードするＤＮＡを組み込んた組
換体ＤＮＡを含む酵母を培地に培養し、培養物中にカビ
リパーゼを蓄積させ、該培養物から、該リパーゼを採取
することを特徴とするリパーゼの製造方法。 - （２）該カビがリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属である
ことを特徴とする請求項第１項記載の方法。 - （３）該酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属であることを特徴とする請求項第１項記載の
方法。 - （４）カビリパーゼが第２図に示したアミノ酸配列を有
することを特徴とする請求項第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2090888A JP2513896B2 (ja) | 1990-04-04 | 1990-04-04 | リパ―ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2090888A JP2513896B2 (ja) | 1990-04-04 | 1990-04-04 | リパ―ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03290186A true JPH03290186A (ja) | 1991-12-19 |
| JP2513896B2 JP2513896B2 (ja) | 1996-07-03 |
Family
ID=14010965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2090888A Expired - Lifetime JP2513896B2 (ja) | 1990-04-04 | 1990-04-04 | リパ―ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2513896B2 (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6041487A (ja) * | 1983-04-25 | 1985-03-05 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用 |
| JPS6332489A (ja) * | 1986-04-25 | 1988-02-12 | ラボフイナ・ソシエテ・アノニム | 特異的リパ−ゼをコ−ドするｄｎａセグメント、それを発現するためのベクタ−、これらのベクタ−により形質転換された微生物及びその使用 |
| JPS6443193A (en) * | 1987-08-11 | 1989-02-15 | Tanpaku Kogaku Kenkyusho Kk | Production of phospholipase a2 |
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-
1990
- 1990-04-04 JP JP2090888A patent/JP2513896B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2513896B2 (ja) | 1996-07-03 |
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