JPH03290199A - 酸性ホスファターゼ活性測定法 - Google Patents
酸性ホスファターゼ活性測定法Info
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- JPH03290199A JPH03290199A JP9189690A JP9189690A JPH03290199A JP H03290199 A JPH03290199 A JP H03290199A JP 9189690 A JP9189690 A JP 9189690A JP 9189690 A JP9189690 A JP 9189690A JP H03290199 A JPH03290199 A JP H03290199A
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- acid phosphatase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、酸性ホスファターゼ活性測定法に関する。本
発明によれば酸性ホスファターゼ活性の高感度測定が可
能であり、臨床検査用測定法として医学的治療や臨床検
査の分野において極めて有用である。
発明によれば酸性ホスファターゼ活性の高感度測定が可
能であり、臨床検査用測定法として医学的治療や臨床検
査の分野において極めて有用である。
［従来の技術］
酸性ホスファターゼ（以下Ａｃｐと記す）は、酸性条件
下（ｐＨ４〜６）において、リン酸モノエステルを加水
分解する酵素で、前立腺癌、骨転移をもつ乳癌や骨疾患
、肝及び腎疾患患者で血清、血漿または尿中のＡｃｐ活
性の上昇が見られ、特に前立腺癌において著しく上昇す
ることから、Ａｃｐ活性は腫瘍マーカーとして極めて重
要とされている。
下（ｐＨ４〜６）において、リン酸モノエステルを加水
分解する酵素で、前立腺癌、骨転移をもつ乳癌や骨疾患
、肝及び腎疾患患者で血清、血漿または尿中のＡｃｐ活
性の上昇が見られ、特に前立腺癌において著しく上昇す
ることから、Ａｃｐ活性は腫瘍マーカーとして極めて重
要とされている。
これまでにＡｃｐ活性を、基質としてフェニルリン酸、
ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリセロリン酸、プロ
パンジオールリン酸、チモールフタレインリン酸、フェ
ノールフタレインリン酸、アデノシンモノリン酸、ナフ
チルリン酸、２−クロロ４−ニトロフェニルリン酸、２
，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸を用いて測
定する方法が報告されている。しかし、これらの基質に
は以下に示すように種々の問題点があり、測定上の不便
さ、あるいは測定値の不正確さを有するため、日常の臨
床検査に実用化されたものでも信頼度は低い。
ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリセロリン酸、プロ
パンジオールリン酸、チモールフタレインリン酸、フェ
ノールフタレインリン酸、アデノシンモノリン酸、ナフ
チルリン酸、２−クロロ４−ニトロフェニルリン酸、２
，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸を用いて測
定する方法が報告されている。しかし、これらの基質に
は以下に示すように種々の問題点があり、測定上の不便
さ、あるいは測定値の不正確さを有するため、日常の臨
床検査に実用化されたものでも信頼度は低い。
基質としてフェニルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸
、β−グリセロリン酸、プロパンジオールリン酸、チモ
ールフタレインリン酸、フェノールフタレインリン酸、
アデノシンモノリン酸を用いた場合は、反応に長時間を
要する、あるいは停止呈色反応を必要とするため初速度
分析ができず、自動分析装置への適応も不可能である。
、β−グリセロリン酸、プロパンジオールリン酸、チモ
ールフタレインリン酸、フェノールフタレインリン酸、
アデノシンモノリン酸を用いた場合は、反応に長時間を
要する、あるいは停止呈色反応を必要とするため初速度
分析ができず、自動分析装置への適応も不可能である。
また基質として、ナフチルリン酸、２−クロロ−４−ニ
トロフェニルリン酸、２，６−ジクロロ−４−二トロフ
ェニルリン酸を用いた場合は、反応までに大きなラグタ
イムがあり、測定値に大きな誤差が発生することが避け
られない、あるいは分光分析の測定波長が４００ｎｍ近
傍であるため、やはりその波長域に高い吸光を示す血清
中のヘモグロビンやビリルビンの影響を受けやすい。
トロフェニルリン酸、２，６−ジクロロ−４−二トロフ
ェニルリン酸を用いた場合は、反応までに大きなラグタ
イムがあり、測定値に大きな誤差が発生することが避け
られない、あるいは分光分析の測定波長が４００ｎｍ近
傍であるため、やはりその波長域に高い吸光を示す血清
中のヘモグロビンやビリルビンの影響を受けやすい。
一方、生体試料中の酸性ホスファターゼ活性を測定する
際、本発明者らの先願発明に係る一般式（） ［式中、Ｒは−（ＣＨ２） 、 ＣＨ３（ｎ＝ｏ 〜３
）、Ｘはハロゲン原子を表す。］で表されるホスホモノ
エステルまたはその塩を基質として用いた場合、初速度
分析が可能であり、かつヘモグロビンやビリルビンの影
響を受けにくい紫外領域に測定波長を有するため、自動
分析装置を用いて極めて正確で再現性の良いＡｃｐ活性
の測定が可能である（特願平１−１２８４３１）。
際、本発明者らの先願発明に係る一般式（） ［式中、Ｒは−（ＣＨ２） 、 ＣＨ３（ｎ＝ｏ 〜３
）、Ｘはハロゲン原子を表す。］で表されるホスホモノ
エステルまたはその塩を基質として用いた場合、初速度
分析が可能であり、かつヘモグロビンやビリルビンの影
響を受けにくい紫外領域に測定波長を有するため、自動
分析装置を用いて極めて正確で再現性の良いＡｃｐ活性
の測定が可能である（特願平１−１２８４３１）。
しかし、一般に血清、血漿、または尿など生体試料中の
Ａｃｐ活性は、それ自体が比較的低いため一般式（Ｉ）
で表されるホスホモノエステルまたはその塩を基質に用
いて測定しても、それだけで高い測定感度を得ることは
困難である。
Ａｃｐ活性は、それ自体が比較的低いため一般式（Ｉ）
で表されるホスホモノエステルまたはその塩を基質に用
いて測定しても、それだけで高い測定感度を得ることは
困難である。
［発明が解決しようとする課題］
本発明の目的は、一般式（Ｉ）で表されるホスホモノエ
ステルまたはその塩を基質を用いて感度の高いＡｃｐ活
性の測定を可能とすることである。
ステルまたはその塩を基質を用いて感度の高いＡｃｐ活
性の測定を可能とすることである。
［問題点を解決するための手段］
本発明者らは、Ａｃｐ活性測定の際に一般式（１）で表
される基質と種々のアルコールの添加を組み合わせるこ
とを検討した結果、より高感度の測定が可能なことを見
出だした。本発明は、この知見に基づいてなされたもの
である。
される基質と種々のアルコールの添加を組み合わせるこ
とを検討した結果、より高感度の測定が可能なことを見
出だした。本発明は、この知見に基づいてなされたもの
である。
すなわち本発明は、一般式（１）
［式中、Ｒは−（ＣＨ２） 、、ＣＨ３（ｎ＝ｏ〜３）
、Ｘはハロゲン原子を表す。］で表されるホスホモノエ
ステルまたはその塩を基質として用い、かつ３〜６個の
炭素原子を含有する少なくとも１種の直鎖状アルコール
を、酸性ホスファターゼ活性化剤として反応液中に基質
と共存させることを特徴とする酸性ホスファターゼ活性
の高感度測定法である。
、Ｘはハロゲン原子を表す。］で表されるホスホモノエ
ステルまたはその塩を基質として用い、かつ３〜６個の
炭素原子を含有する少なくとも１種の直鎖状アルコール
を、酸性ホスファターゼ活性化剤として反応液中に基質
と共存させることを特徴とする酸性ホスファターゼ活性
の高感度測定法である。
上記式（Ｉ）のＲは、メチル、エチル、プロピルまたは
ブチルである。Ｘは、例えば塩素、臭素、フッ素などの
ハロゲン原子である。上記式（Ｉ）のホスホモノエステ
ルの塩を基質として用いる場合、その塩としては、例え
ばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、シクロヘキ
シルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩などのアミン
塩等が挙げられる。
ブチルである。Ｘは、例えば塩素、臭素、フッ素などの
ハロゲン原子である。上記式（Ｉ）のホスホモノエステ
ルの塩を基質として用いる場合、その塩としては、例え
ばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、シクロヘキ
シルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩などのアミン
塩等が挙げられる。
Ａｃｐ測定の際に基質として用いるときの濃度は５０μ
Ｍ〜５ｍＭの範囲であり、前立腺由来酸性ホスファター
ゼに対するＫｍ値が０．１４ｍＭであることから好まし
くは１ｍＭ〜２ｍＭである。
Ｍ〜５ｍＭの範囲であり、前立腺由来酸性ホスファター
ゼに対するＫｍ値が０．１４ｍＭであることから好まし
くは１ｍＭ〜２ｍＭである。
基質に共存させるＡｃｐ活性化剤のアルコールは、３〜
６個の炭素原子を有する直鎖状アルコールであり、好ま
しくはｎ−プロパツール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタ
ノール、ｎ−ヘキサノール、１，４−ブタンジオール、
ｌ、２−ベンタンジオール、１，５−ベンタンジオール
、１，２−ヘキサンジオール、特に好ましくは、１．４
−ブタンジオールまたは１，５−ベンタンジオールであ
る。これらのアルコールは、測定の際単独で用いても数
種類組み合わせて用いても構わない。
６個の炭素原子を有する直鎖状アルコールであり、好ま
しくはｎ−プロパツール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタ
ノール、ｎ−ヘキサノール、１，４−ブタンジオール、
ｌ、２−ベンタンジオール、１，５−ベンタンジオール
、１，２−ヘキサンジオール、特に好ましくは、１．４
−ブタンジオールまたは１，５−ベンタンジオールであ
る。これらのアルコールは、測定の際単独で用いても数
種類組み合わせて用いても構わない。
本発明で用いるアルコールの反応液中での濃度は、一般
に１０ ｍＭ〜２０００ ｍＭであり、好ましくは１０
０ｍＭ 〜１０００ ｍＭである。
に１０ ｍＭ〜２０００ ｍＭであり、好ましくは１０
０ｍＭ 〜１０００ ｍＭである。
反応時のｐＨは４．０〜６，５、好ましくは５．０〜６
．０に設定する。ｐＨをその範囲で一定に保つための緩
衝剤として、クエン酸、酢酸、コハク酸、フタル酸およ
びその塩などが使用できる。それら以外の緩衝剤でもｐ
Ｈ４，０〜６．５の範囲で緩衝能を維持できるものであ
れば用いることが可能である。緩衝剤の濃度は一般的に
５０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍ
Ｍに設定する。
．０に設定する。ｐＨをその範囲で一定に保つための緩
衝剤として、クエン酸、酢酸、コハク酸、フタル酸およ
びその塩などが使用できる。それら以外の緩衝剤でもｐ
Ｈ４，０〜６．５の範囲で緩衝能を維持できるものであ
れば用いることが可能である。緩衝剤の濃度は一般的に
５０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍ
Ｍに設定する。
また、反応液には診断目的に好適な添加剤、例えばＢｒ
１ｊ−３５、トリトンＸ−１００のような界面活性剤、
あるいはマグネシウムイオンのような安定化剤を加える
ことも可能である。
１ｊ−３５、トリトンＸ−１００のような界面活性剤、
あるいはマグネシウムイオンのような安定化剤を加える
ことも可能である。
本発明の方法によるＡｃｐ活性の測定は、通常衣のよう
に実施する。まず、適当な活性化剤であるアルコールを
含む緩衝液に測定すべき生体試料を混合し、その溶液を
２０°Ｃ〜４０℃で２分間〜１０分間、好ましくは３０
°Ｃ〜３７℃で３分間〜５分間インキュベートする。次
に、その混合液に一般式（Ｉ）で表されるホスホモノエ
ステル又はその塩を基質として含む液を加えて急速に攪
拌し、そこで起こるＡｃｐによる基質分解反応を分光光
度計にて３００ｎｍ〜３７０ｎｍ 、好ましくは３３０
ｎｍ〜３４０ｎｍの波長における吸光度変化として測定
し、それをもとに１分間当りの吸光度の増加を求めるこ
とにより活性を測定する。
に実施する。まず、適当な活性化剤であるアルコールを
含む緩衝液に測定すべき生体試料を混合し、その溶液を
２０°Ｃ〜４０℃で２分間〜１０分間、好ましくは３０
°Ｃ〜３７℃で３分間〜５分間インキュベートする。次
に、その混合液に一般式（Ｉ）で表されるホスホモノエ
ステル又はその塩を基質として含む液を加えて急速に攪
拌し、そこで起こるＡｃｐによる基質分解反応を分光光
度計にて３００ｎｍ〜３７０ｎｍ 、好ましくは３３０
ｎｍ〜３４０ｎｍの波長における吸光度変化として測定
し、それをもとに１分間当りの吸光度の増加を求めるこ
とにより活性を測定する。
［実施例コ
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれによって限定されるものではない。
本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例１
基質として２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリ
ン酸、活性化剤として１，５−ベンタンジオールを用い
てヒト前立腺由来の酸性ホスファターゼの活性を測定し
た。基質の合成は特願平１−１２８４３１記載の方法に
よった。以下に測定の概要を示す。
ン酸、活性化剤として１，５−ベンタンジオールを用い
てヒト前立腺由来の酸性ホスファターゼの活性を測定し
た。基質の合成は特願平１−１２８４３１記載の方法に
よった。以下に測定の概要を示す。
０．１％トリトンＸ−１００および種々の濃度の１，５
−ベンタンジオールを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，４） ２ ｍｌに試料のヒト前立腺由来酸性ホス
ファターゼ（シグマ社製）０．１ｍｌを加え、３７℃で
３分間インキュベートする。これに、Ｏ，０１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ３，０）に２，６−ジクロロ−４−アセ
チルフェニルリン酸を６ｍＭとなるように溶解して得た
基質液をＱ、５ｍｌ加えて反応を開始させ、分光光度計
（日立２２０Ａ型）にて３４０ｎｍでの吸光度変化を測
定し、１分間当りの吸光度変化を求めた。
−ベンタンジオールを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，４） ２ ｍｌに試料のヒト前立腺由来酸性ホス
ファターゼ（シグマ社製）０．１ｍｌを加え、３７℃で
３分間インキュベートする。これに、Ｏ，０１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ３，０）に２，６−ジクロロ−４−アセ
チルフェニルリン酸を６ｍＭとなるように溶解して得た
基質液をＱ、５ｍｌ加えて反応を開始させ、分光光度計
（日立２２０Ａ型）にて３４０ｎｍでの吸光度変化を測
定し、１分間当りの吸光度変化を求めた。
０
その測定結果を、１，５−ベンタンジオールが無添加の
場合の活性値と共に第１表に示す。
場合の活性値と共に第１表に示す。
第１表
行った。
測定結果を第２表に示す。
第２表
実施例２
１．５−ベンタンジオールを１−プロパツール、１−７
’タノール、１，４−ブタンジオール、１，２−ベンタ
ンジオール、１，２−ヘキサンジオール、プロピレング
リコールに代えて、実施例１と同様の操作で測定を［発
明の効果」 本発明の方法によりＡｃｐ活性を測定すると、実施例に
示す通り対照値と比較して相対活性は著しく向上する。
’タノール、１，４−ブタンジオール、１，２−ベンタ
ンジオール、１，２−ヘキサンジオール、プロピレング
リコールに代えて、実施例１と同様の操作で測定を［発
明の効果」 本発明の方法によりＡｃｐ活性を測定すると、実施例に
示す通り対照値と比較して相対活性は著しく向上する。
したがって本発明は、種々の長所を有する基質である一
般式（Ｉ）で表されるホスホモノエステルまたはその塩
について極めて高感度のＡｃｐ活性測定を提供し、これ
をもって日常の臨床検査の実施に貢献するものである。
般式（Ｉ）で表されるホスホモノエステルまたはその塩
について極めて高感度のＡｃｐ活性測定を提供し、これ
をもって日常の臨床検査の実施に貢献するものである。
Claims (1)
- （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ｒは−（ＣＨ＿２）＿ｎＣＨ＿３（ｎ＝０〜３
）、Ｘはハロゲン原子を表す。］で表されるホスホモノ
エステルまたはその塩を基質として用い、かつ３〜６個
の炭素原子を含有する少なくとも１種の直鎖状アルコー
ルを、酸性ホスファターゼ活性化剤として反応液中に基
質と共存させることを特徴とする酸性ホスファターゼ活
性測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9189690A JP2503716B2 (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | 酸性ホスファタ―ゼ活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9189690A JP2503716B2 (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | 酸性ホスファタ―ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03290199A true JPH03290199A (ja) | 1991-12-19 |
| JP2503716B2 JP2503716B2 (ja) | 1996-06-05 |
Family
ID=14039332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9189690A Expired - Fee Related JP2503716B2 (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | 酸性ホスファタ―ゼ活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2503716B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997041441A1 (en) * | 1996-04-26 | 1997-11-06 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive enzyme screen for tissue remodelling-associated conditions |
| US6811995B1 (en) | 1996-04-26 | 2004-11-02 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive enzyme screen for cancer |
-
1990
- 1990-04-06 JP JP9189690A patent/JP2503716B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997041441A1 (en) * | 1996-04-26 | 1997-11-06 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive enzyme screen for tissue remodelling-associated conditions |
| US6811995B1 (en) | 1996-04-26 | 2004-11-02 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive enzyme screen for cancer |
| EP1418434A3 (en) * | 1996-04-26 | 2006-03-29 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive enzyme screen for tissue remodelling-associated conditions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2503716B2 (ja) | 1996-06-05 |
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