JPH03291227A - ウイルスプロテアーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ウィルス感染症の治療剤、特にウィルス感染
症の治療に有用なウィルスプロテアーゼ阻害剤に関する
。

従来の技術 ウィルスプロテアーゼ、特にレトロウィルスプロテアー
ゼの特徴について、例えば、日本臨床第４７巻、第１号
（１９８９年１月号）別冊第１９７〜２０６頁、細胞工
学Ｖｏ１．７，５ｕｐｐｌ。

１，３′，９８８、Ｓ６７〜Ｓ７７、生化学第６０巻第
９号１９８８年９月第１０５３〜１０５９頁に詳しく記
載されている。これによると、ヒトＴ細胞白血病ウィル
ス（ＨＴ　Ｌ　Ｖ）や免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）を
はじめとする増殖可能な、即ち欠損株ではないレトロウ
ィルスは、ウィルス特異的プロテアーゼの遺伝子を持っ
ている。

このプロテアーゼは、ウィルス粒子形成時に、未成熟粒
子を形成している前駆体を開裂して成熟蛋白質に変換し
、成熟粒子を産出するのに必要である。したがって、レ
トロウィルスは、そのウィルスプロテアーゼ遺伝子を欠
損させるか、またはそのウィルスプロテアーゼ活性を阻
害することにより、成熟過程に欠陥を生じて、感染性を
失い、その伝播を阻止することが可能であるとされてい
る［日本臨床第４７巻、第１号（１９８９年１月号）別
冊第１９７〜２０６頁、細胞工学Ｖｏ　１゜７．５ｕｐ
ｐ１，３′，，３′，９８８、Ｓ６７〜Ｓ７７、生化学
第６０巻第９号１９８８年９月第１○５３〜１０５９頁
］。

ウィルス粒子から分離精製したプロテアーゼは、その生
化学的特徴の詳しい研究により、デスパルチックプロテ
アーゼ様の酵素ではあるが、従来から知られている真菌
や細胞由来のアスパルチックプロテアーゼとは基質特異
性、分子構築、至適ｐＨなどが異なる新規なものである
ことが判って来た［日本臨床第４７巻、第１号（１９８
９年１月号）別冊第１９７〜２０６頁、細胞工学Ｖｏ　
１゜７．５ｕｐｐ１，３′，，３′，９８８、Ｓ６７〜
Ｓ７７、生化学第６０巻第９号１９８８年９月第１０５
３〜１０５９頁］。

このようなプロテアーゼの阻害剤について、研究が行わ
れ、ペプスタチンＡをはじめとするいくつかの化合物に
ついて、レトロウィルスプロテアーゼ阻害作用が認めら
れている。しかしながら、レトロウィルスプロテアーゼ
の構造と活性の関係の詳細が必ずしも完全には解明され
ていないこと、一般的にアスパルチックプロテーゼ（ペ
プシン、レニン等）に有効な阻害剤が数少ないこと、更
にこのプロテアーゼは上記のような既知アスパルチック
プロテアーゼと性質を異にしているなどの理由から、レ
トロウィルスプロテアーゼ阻害作用が認められる化合物
の検索は容易ではなく、試行錯誤に頼らざるを得ないの
が現状である。レトロウィルスプロテアーゼは、新しく
発見されたプロテアーゼであり、その阻害作用を有する
化合物の開発は始まったばかりであり、一般的にはまだ
報告がない。

発明が解決しようとする課題 本発明は、ウィルスプロテアーゼ、特にレトロウィルス
のプロテアーゼ阻害剤を提供することを主な目的とする
ものである。

課題を解決するための手段 本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、一
定の化合物がレトロウィルスのプロテアーゼ阻害剤とし
て有効であることを見出し、本発明を完成するに至った
。

即ち、本発明は、チロスタチン、メチルオレンジ、トル
イジンブルー、ナイルブルースルフエート、ナイルブル
ークロライド、キナルジンレ・ソド、Ｎ、Ｎ−ジメチル
−インドアニリン、２．３′６−トリクロロインドフェ
ノールナトリウム塩、６−アミノ−２−ナフチルｐ−グ
アニジノベンゾエートジメタンスルホネート、ベカマイ
シンＢ−サルフェート、アミカシン−サルフェート、ゲ
ンタマイシン−サルフェート、リボマイシン−サルフェ
ート、ジベカシン−サルフェート、ストレプトマイシン
、Ｇ４１８（商品名「ゲネテシン」）、ネオマイシン−
サルフェート、カナマイシン−サルフェート、ハイグロ
マイシン及びスベクチノマイシンからなる群より選ばれ
た１種を有効成分として含有することを特徴とするウィ
ルスプロテアーゼ阻害剤を提供するものである。

本発明においてウィルスプロテアーゼ阻害作用を有する
ことが判明した上記各化合物は、いずれも公知の化合物
であり、容易に人手できるものである。

これら化合物のうちでも、特にアミノ配糖体抗生物質と
して知られるカナマイシンーサルフエート、ネオマイシ
ン等が試験管内で有効である。６−アミノ−２−ナフチ
ルｐ−グアニジンベンゾエートメタンスルホネートは水
溶性の化合物で細胞への取込みも容易であり、注目され
る。

本発明のウィルスプロテアーゼ阻害剤が有効なウィルス
としては、各種のレトロウィルスを挙げることができ、
例えば、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）、ヒト
免疫不全ウィルス（ＨＩｖ）、ウシ白血病ウィルス（Ｂ
ＬＶ）、マウス白血病ウィルス（ＭＬＶ）　、）り骨髄
芽球症ウィルス（ＡＭＶ）等レトロウィルス科に属する
ウィルスに全て有効である。

本発明のウィルスプロテアーゼ阻害剤は、通常、その使
用目的に応じた形態で使用され、その代表的なものとし
て錠剤、乳剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カ
プセル剤等が挙げられる。錠剤の形態に成形するに際し
ては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用
でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、
尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セル
ロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパツ
ール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン
溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチル
セルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等
の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カン
テン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カル
シウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル
類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセ
リド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、
カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アン
モニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤
、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、
カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤
、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレ
ングリコール等の滑沢剤等が例示できる。さらに錠剤は
必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼ
ラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠ある
いは二重錠、多層錠とすることができる。乳剤の形態に
成形するに際〔では、担体としてこの分野で従来公知の
ものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン
、カカオ油、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤
、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノー
ル等の結合剤、ラミナランカンテン等の崩壊剤等が例示
できる。

上記投与形態のうちでも、特に、液剤が好ましい。

上記投与形態にある各製剤中の有効成分である前記化合
物の濃度は特に限定はないが、通常０，３′，〜７０重
量％程度とすればよい。

本発明の阻害剤を製剤化するに際しては、慣用されてい
る各種の方法を広く採用できる。

本発明の阻害剤の投与方法は、特に制限はなく、各種の
製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度
などに応じた方法で投与されるが、通常は、血球細胞を
標的とするので注封により静脈投与される。

本発明阻害剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別その
他の条件、疾患の程度などに応じて適宜決定できるが、
通常有効成分である前記化合物の量は、１０当たり体重
１ｋｇ当たり約１００μｇ〜２０ｍｇ程度とすればよい
。該製剤は１日に２〜４回程度に分けて投与してもよい
。

発明の効果 従来公知のウィルスプロテアーゼ阻害剤に比し、本発明
の阻害剤は、レトロウィルスプロテアーゼに対して、同
等またはそれ以上の顕著な阻害作用を発揮する。

したがって、本発明の阻害剤は、ウィルス、特にレトロ
ウィルスの感染性を失わせ、その伝播を阻止する可能性
がある。

実施例 以下に、本発明阻害剤の製剤例および試験例を掲げて本
発明をより詳しく説明する。

製剤例１ チロスタン　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇデ　　
ン　　プ　　ン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１３２ｍｇマグネシウムステアレート　　　　　　１８
ｍｇ乳　　　　糖　　　　　　　　　　　　　　　　　
４５ｍｇ計　　　　　　　　　　　　　　　　　２００
ｍｇ常法により、１錠中上記組成の錠剤を製造した。

製造例２ ６−アミノ−２−ナフチルｐ グアニジノベンゾエートジメタ ンスルホネート　　　　　　　　　　　５００ｍｇポリ
エチレングリコール （分子量４０００）　　　　　　０．３ｇ塩化ナトリウ
ム　　　　　　　　　０．９ｇポリオキシエチレンソル
ビタン モノオレエート　　　　　　　　　０，４ｇメタ重亜硫
酸ナトリウム　　　　　０，１ｇメチル−パラベン　　
　　　　　　０．　１８ｇプロピル−パラベン　　　　
　　　０．０２ｇ注射用蒸留水　　　　　　　　　　　
１００−上記パラベン類、メタ重亜硫酸ナトリウム及び
塩化ナトリウムを撹拌しながら８０℃で上記の約半量の
蒸留水に溶解する。得られた溶液を４０°Ｃまで冷却し
、本発明阻害剤、次にポリエチレングリコール及びポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレエートをその溶液中
に溶解した。次にその溶液に注射用蒸留水を加えて最終
の容量に調製し、適当なフィルターペーパーを用いて滅
菌濾過することにより滅菌して１−ずつアンプルに分注
し注射剤を調製する。

試験例１ 本発明阻害剤のレトロウィルスプロテアーゼに対する作
用を、以下の方法により測定した。

■プロテアーゼの精製 ウシ白血病ウィルスＣＢＬＶ）、マウス白血病ウィルス
（ＭＬＶ）の精製法については文献に詳しい［ヨンナカ
　ワイ、　　（Ｙｏｓｈｉｎａｋａ　Ｙ、）ら、Ｐｒｏ
ｃ　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、
Ａ、　　：　８２　：　１６１８−１６２２、Ｊ、　　
Ｖｉｒａｌ、、　５５　：　８７０−８７３（１９８５
）及びヨシナカ　ワイ、（ＹｏｓｈｉｎａｋａＹ、）　
　ら、Ｊ、　　Ｖｉｒａｌ、、５７　：　８２６−８３
２　（１９８６）コ。これら文献記載の方法に従い、ウ
ィルス感染細胞培養上清からウィルスを分離し、界面活
性剤（ＮＰ４０又はトリトンＸ−１００）で溶解或いは
アセトン粉末から緩衝ｉｆｆｌ（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ、ＬＭ　　ＮａＣ１，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７
，６）で蛋白質を抽出後、ゲル濾過法と高速液体クロマ
トグラフィー法を併用し、５ＤＳ−ボリア°クリルアミ
ドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で単一バンドが
得られるまで精製した。

上記ゲル濾過法は次の条件下に行った。即ち、セファデ
ックスＧ７５　（９０Ｘ１．５ｃｍ）を用い、ＳＴＥ　
（０，１３Ｍ　　ＮａＣｌ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ／５ｐＨ７，６）で溶出し、３
鋪ずつ分画し、各分画の蛋白質組成とプロテアーゼ活性
を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析又は測定した。

また、上記高速ｉｒ１体クロりトグラフィー法は、下記
の条件下に行なった。即ち、ゲル濾過法で分画したプロ
テアーゼを含む両分をプールし、６Ｍ塩酸グアニジンで
完全に溶解し、１０ｍ１２をウォータースマイクロボン
ダカラムＣＩ８にロードし、アセトニトリル（０−６０
％）の勾配にて溶出した。５ｗ１１２ずつ分画し、凍結
乾燥後、水１−に溶解させ、その一部につき蛋白組成と
プロテアーゼ活性を調べた。

前記５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、下
記の条件下に行なった。即ち、Ｌａｅｍｍｌｉの系（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ　、　Ｕ、　Ｋ、　１９７０．　Ｎａｔｕ
ｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７　：　６８０−６８５）
に従い、ポリアクリルアミド濃度８〜１８％のグラジェ
ントゲルを用い、１５０Ｖで５時間泳動した。

市販されているトリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）　　
（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、　　Ｓｌ、　Ｐ
ｅｔｅｒｓｂｕｒｇ。

Ｆｌｏｒｉｄａ　、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）のプロテアーゼも
同様の方法で精製した。大腸菌で発現させたＨＩＶウィ
ルスプロテアーゼは、ゲル濾過した両分を用いたが、阻
害試験では同等の結果が得られた。

■プロテアーゼの基質 基質として、プロテアーゼ欠損マウス肉腫ウィルス（Ｍ
ＳＶ）を産生ずるハムスター細胞ＨＴＧ−２（Ｇａｘｄ
ａｒら、　（１９７１）　、Ｎａｔｕｒｅ、　ＮｅｗＢ
ｉｏｌ、、３２４．６９−７２に記載のものを、Ｄｒ、
　Ｇａｚｄａｒ　（ＲＩＢ、米国）から入手）より得た
ウィルス粒子を、中性界面活性剤である０、５％ノニデ
ットＮＰ−４０（以下ｒＮＰ−４０Ｊという）で可溶化
したものを用いた。

このウィルスは粒子の内部構造を構成する蛋白質（ｇｒ
ｏｕｐ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）の前駆体
である分子量６５０００の蛋白質（Ｐｒ６５）を主成分
とするものである。該Ｐｒ６５は、ＡＭＶＳＭＬＶ。

ＢＬｖＳＨＸＶＳＡＴＬＶなど同種オヨヒ異種のレトロ
ウィルスプロテアーゼの基質となり得るものである。

■プロテアーゼの活性測定 各レトロウィルス由来のプロテアーゼの活性の至適ｐＨ
は、ウィルス種によりやや異なるが一般にｐＨ６，０〜
７．０の範囲内にある。ウィルスプロテアーゼによるＰ
　ｒ６５分子内の開裂部位はウィルス種により少し異な
るが、共通のものも含め３〜４か所程度存在する。材料
の入手の容易さから主にＡＭＶプロテアーゼを用いて実
験を行なった。

種々の濃度のプロテアーゼを含む０．　０２ＭＭＥＳ（
即ち、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、シグ
マ社製）、０．５％ＮＰ−４０、濃度０．　３μｇ／ｍ
ｌのロイペプチン溶酸１００μｇに、３μｇの前記基質
（５μｇ蛋白質、０．５％ＮＰ−４０，０，１３Ｍ　　
ＮａＣ１，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．ＯＩＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４）を加え、２２℃で１６時間保
温した。　反応後、常法に従い、５ＤＳ−ＰＡＧＥによ
り、反応液中の蛋白質組成を分析し、組成変化より活性
の強さを測定した。すなわち、Ｐ　ｒ６５バンドの減少
と特異的プロダクトバンドの増加をデンシトメーターで
測定した。

■阻害剤の阻害効果と濃度の測定 上記反応においてＰｒ６５バンドが、９５％消失するプ
ロテアーゼ濃度を測定し、この濃度の活性を持つ反応液
に種々の濃度の本発明のプロテアーゼ阻害剤（１０μｍ
）を加えた。該阻害剤は、本発明によりプロテアーゼ阻
害作用を有することが見出だされた化合物を水またはジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して調製した。

対照にはそれぞれの溶媒のみを使用した。尚、ＤＭＳＯ
は２０％以下の濃度で何等プロテアーゼ活性に影響を与
えない。活性の測定は、上記「■プロテアーゼの活性測
定」の項に記載の方法で行なった。

１例として、第１図に、典型的なレトロウィルスプロテ
アーゼによるＰ　ｒ６５の開裂パターン（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによ６）を示す。ＡＭＶプロテアーゼを反応液で２
倍段階希釈し、一定量の基質を加え、反応を行なうと、
プロテアーゼ量に依存してＰｒ６５が減少する一方で反
応産物の増加が認められる。９５％のＰ　ｒ６５が減少
するプロテアーゼ濃度を求め、以下の阻害剤の阻害効果
の測定に用いた。

また、第２図は、ネオマイシン硫酸塩（ネオマイシン−
８）と６４１８によるＡＭＶプロテアーゼの活性阻害パ
ターンを示す。Ｐｒ６５の減少を５０％まで阻害するネ
オマイシン硫酸塩又はＧ４１８の濃度（５０％阻害濃度
、ＩＣ９ｏ）を求めたところ、夫々、０．００３ｍＭ及
び０．０１ｍＭであった。５０％阻害濃度の決定は、サ
ンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析後、ゲルをクマージー
ブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、アタゴ社製デ
ンシトメーター（ＫＥＭＩＣ）でＰｒ６５ノくンドの強
度を測定し、対称と比較し、Ｐｒ６５の開裂が５０％阻
害される濃度を求めた。

以下同様にして、本発明でプロテアーゼ阻害作用が見出
だされた化合物について、ＩＣ，。を求めた。

結果を第１表に示す。

第１表 チロスタチン メチルオレンジ トルイジンブルー ナイルブルーサルフェート ナイルブルークロライド キナルジンレッド Ｎ、Ｎ−ジメチル−インド アニリン ２，３′，．６−ドリクロロイ ンドフエノールナトリウム塩 ６−アミノ−２−ナフチルｐ− グアニジノベンゾエートジメタ ンスルホネート ベカマイシンＢ−サルフェート アミカシン−サルフェート １ ０３ ０．５ ０、０１ ０、０５ 第１表（続き） ゲンタマイシン−サルフェート リボマイシン−サルフェート ジベカシンーサルフェート ストレプトマイシン ４１８ ネオマイシン−サルフェート カナマイシン−サルフェート ハイグロマイシン スベクチノマイシン ５ ５ １ ０１ １ ０３ １ ５ 上記第１表から明らかなように、本発明の阻害剤はＡＭ
Ｖプロテアーゼを有効に阻害することが判る。

他のレトロウィルス、例えばヒトＴ細胞白血病ウィルス
（ＨＴＬＶ）　、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）　
、ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ、）、マウス白血病ウィ
ルス（ＭＬＶ）等に由来するプロテアーゼも、ＡＭＶプ
ロテアーゼと同様の活性を示すので、これらレトロウィ
ルスプロテアーゼも、本発明阻害剤により、同様に阻害
されることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、典型的なレトロウィルスＡＭＶのプロテアー
ゼによるＰｒ６５の開裂パターンを、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により
調べた結果を示す図面に代わる写真である。 第２図は、ネオマイシン硫酸塩（ネオマイシン−Ｓ）と
Ｇ４１８のＡＭＶプロテアーゼの活性阻害パターンを、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）により調べた結果を示す図面に代わる写真で
ある。 第２図において、矢印（＝）及びＯ〜４の数値は次の意
味を示す。 →・・・プロテアーゼがＰｒ６５を切断した時に現れる
プロダクトのバンドの位置 Ｏ〜４の数値・・・ｎの値 （以　上） ２５６− ２ 事件の表示 平成２年特許願第９２４８９号 発明の名称 ウィルスプロテアーゼ阻害剤 補正をする者

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）チロスタチン、メチルオレンジ、トルイジンブル
   ー、ナイルブルーサルフェート、ナイルブルークロライ
   ド、キナルジンレッド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−インドアニ
   リン、２，３′，６−トリクロロインドフェノールナト
   リウム塩、６−アミノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベ
   ンゾエートジメタンスルホネート、ベカマイシンＢ−サ
   ルフェート、アミカシン−サルフェート、ゲンタマイシ
   ン−サルフェート、リボマイシン−サルフェート、ジベ
   カシン−サルフェート、ストレプトマイシン、Ｇ４１８
   、ネオマイシン−サルフェート、カナマイシン−サルフ
   ェート、ハイグロマイシン及びスペクチノマイシンから
   なる群より選ばれた１種を有効成分として含有すること
   を特徴とするウィルスプロテアーゼ阻害剤。