JPH03292896A - ヒト型２抗原特異性抗体および分泌細胞の作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｉ来肢歪 二特異性抗体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ抗体、以下ｂ
ｆ抗体）は同一分子中にふたつの異なる抗原に対する結
合部位を持つ抗体である。このような抗体は、種々の抗
原特異性を組み合わせることによって、これまで知られ
ていなかった、高い機能を持つ人工抗体として働くこと
が可能である．たとえば、マーカー物質として、螢光色
素、酵素、放射性化合物等と結合する抗体は、生体内、
生体外での目的物質の検出に用いることができる．さら
に最も期待されるｂｆ抗体の応用方法は、癌の診断およ
び治療である。特に治療においては、一方の抗原結合部
位は癌と、他方は抗癌作用のある薬剤や毒素と結合する
ようなりｆ抗体が、癌のミサイル療法に応用できるもの
として期待されている。

ｂｆ抗体の作製方法には、大別して、化学結合法とハイ
ブリッドハイブリドーマ法とがある（新本ら、蛋白質、
核酸、酵素、■、２１７　（１９８８）、化学結合法は
、抗体分子同志を様々な架橋試薬で結合させることによ
って、ｂｆ抗体を得る方法であるが、反応中に抗体の失
活が起こったり、あるいは用いる架橋試薬、保護剤等の
安全性に問題があったりする。そしてこれらの問題はい
まだ完全に解決されていない。さらに、化学結合法によ
って得られたｂｆ抗体は、投与された生体中では不安定
であり、投与後急速に血中濃度が減少する。このことか
らも天然型抗体に近いハイブリッドハイブリドーマ法に
よるｂｆ抗体の調整方法が好んで用いられるようになっ
ている（Ｓｔａｅｒｚら、Ｐｒｏｃ、　ＮａＥｌ、＾ｃ
ａｄ、ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　　８３．　１４５３　（１
９８６））。

ハイブリッドハイブリドーマ法によるｂｆ抗体作製方法
はＲｅａｄｉｎｇ　（特開昭５８−５９９９４号公報）
によって提供されている。抗体を分泌するハイブリドー
マと、他の抗体を分泌するハイブリドーマあるいはリン
パ球とを融合させ、ｂｆ抗体を分泌するハイブリッドハ
イブリドーマ（クオドローマあるいはトリオーマ）を作
製する方法である。

Ｒｅａｄ　ｉｎｇは２種類の色素に対するｂｆ抗体を分
泌するマウスクオドローマを例示している。

しかし、ヒトへのｂｆ抗体の投与を考えた場合、マウス
の抗体はヒトにとっては異種タンパク質であるため、頻
回投与すると抗抗体の出現が考えられる。抗抗体は投与
されたｂｒ抗体を不活性化してしまうばかりか、アナフ
ィラキシ−ショックを引き起こすことも考えられる。し
たがって、ヒト型のｂｆ抗体作製方法が望まれていた。

ヒト型ｂｆ抗体を最初に報告したのはＴｉｅｂｏｕｔら
（Ｊ、　Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．　、１３９工３４０２　（
１９８７）　）である。Ｔｉｅｂｏｕｔらはエプスタイ
ンバーウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ　−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒ
ｕｓ）　　（ＥＢ■）で形質転換して得た抗破傷風毒素
抗体分泌細胞と、抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体分泌
細胞をモデル系に、ｂｆ抗体を分泌するハイブリドーマ
を作製した。新本も同様な方法で、ＩｇＡあるいは１ｇ
Ｍクラスのｂｆ抗体の作製方法を提案している（特開昭
６２−２４４３９２号公報）。しかしこれらの方法は、
ＥＢＶ形質転換細胞（Ｂリンパ芽球様細胞、以下ＢＬＣ
）の抗体分泌能が低いこと、ＢＬＣのクローニングが困
難であること等のために、実用的なりｆ抗体分泌細胞を
得る方法としては適当ではなかった。シータス社は、Ｕ
２６６細胞を親株として作製したヒト−ヒトハイブリド
ーマとヒトリンパ球を融合することによってｂｆ抗体を
分泌するトリオーマを作製する方法を提案している（特
開昭６４−６０３７３号公報）。

しかし、この方法も、ヒト−ヒトハイブリドーマの作製
が一般に困難であることから、実用性が低いと考えられ
る。最近岩佐らも（層化、ｌ−１４１０（１９８９））
同様な方法で癌細胞および、フィコエリスリン色素に対
するｂｆ抗体を得たと報告した。しかし、融合効率は極
めて低く、実用的ではない。

又抗腫瘍剤に特異的な結合性をもつ二特異性ヒト型抗体
で実用的なものは得られていない。このような二特異性
ヒト型抗体が得られれば、治療用、生化学研究用などに
有用である。

゛しよ゛と　る 本発明は、上記の点に鑑み、二特異性ヒト型抗体で、抗
腫瘍剤を認識する抗体およびこの抗体を分泌する細胞を
取得する方法を提供することを課題とする。

ｉ　　　ｎ　　るための すなわち、本発明は、 （１）二つの異なる抗原を認識し、これに結合性を有す
るヒト型抗体であって、その一方の抗原認識性が抗腫瘍
性薬剤に対する認識性である二特異性ヒト型抗体、及び （２）　　ヒトリンパ球ヲエブスタインバーウィルスで
形質転換して抗腫瘍性薬剤とこれと異なる抗原との二つ
の異なる抗原を特異的に認識する抗体を分泌する細胞を
得、この細胞をそれぞれマウスミエローマ細胞と細胞融
合して前記二つの異なる抗原を認識するマウス−ヒトハ
イプリドーマをそれぞれ得、得られたマウス−ヒトハイ
プリドーマに薬剤耐性を付与することよりなる二特異性
ヒト型抗体分泌細胞の取得方法に関する。

本発明における最も重要な、抗体分泌細胞の取得方法は
、ＥＢＶで形質転換したＢＬＣと、マウスミエローマと
の融合法を用いる方法である。この方法は、これまで報
告されたいずれのｂｆ抗体作製方法にも記載されていな
い。ＥＢＶ形質転換を行なっていないヒトリンパ球とマ
ウスミエローマとの融合も考えられるが、ヒトリンパ球
は大量に取得することが困難であることから、形質転換
させて、増殖させてからマウスミエローマと融合させる
ほうが効果的である。

また、ｂｆ抗体の一方の抗原結合部位が認識する抗原と
なる抗癌薬剤の選択も重要である。

本発明者らは、薬剤として、ヒマ種子由来の毒素リシン
、ジフテリア毒素およびペプチド性抗癌荊ネオカルチノ
スクチンを選択し、これらの薬剤と結合するヒトモノク
ローナル抗体分泌細胞を作製し、ｂｆ抗体分泌細胞を得
るための、一方の抗体分泌細胞とした。

ヒトをこれらの抗原で免疫することは実際上不可能であ
る。したがって、リンパ球提供者が持っている自然抗体
を選択しなくてはならない。このためにもＥＢＶ形質転
換によってＢＬＣを増やした後マウスミエローマ細胞と
融合する方法は効果的である。

以下上記ハイブリドーマ及びｂｆ抗体分泌融合細胞の作
成について説明する。

（１）　　ヒトリンパ球の形質転換 ヒトリンパ球は、血液又は手術で摘出した組織所属リン
パ節、牌臓などから調整が可能である。

一般的には、末消血液から得る方法が容易である。

リンパ球の分離は、フィコールパック（ファルマシア社
製）を使用した遠心分離法などが例示できる。このよう
にして分離したリンパ球をＥＢＶにより形質転換させる
。

ＥＢＶは、これを生産する細胞株から調整するが、一般
的には、マーモセットＢ９５−８株（ＡＴＣＣＣＲＬ　
　１６１２）が使用される。８９５８株を１〜２０％の
ウシ胎児血清（以下ＦＣ３と称する）を含むＲＰＭＩ　
　１６４０培地等の適当な培地中で培養し、この上清を
そのまま、或いは、滅菌フィルターを通した後ウィルス
液として使用する。

リンパ球は、そのまま、或いは、ヒツジ赤血球ロゼツト
形成法や抗血清と補体で処理する方法などによってＴ細
胞を除いた後、ＥＢＶを感染させて形質転換する。形質
転換後のリンパ球の培養に用いる培地は、動物細胞の培
養に用いられているものであればどのようなものでも良
い。形質転換には、培地１ｄ当り１０４〜１０′Ｔ個、
好ましくは、ｌＸｌ０’〜２Ｘ１０’個の密度にリンパ
球を浮遊させ、培地容量の５〜５０％容量のＥＢＶ含有
培養液を添加してＥＢＶを感染させる。これを試験管、
シャーレ、Ｔフラスコ、９６穴又は２４穴プレートなど
に入れて培養する。培養温度は２５〜４０°Ｃ１好まし
くは３５〜３８°Ｃで、１〜１５％の炭酸ガス、好まし
くは４〜７％の炭酸ガス存在下、湿度９０％以上の雰囲
気下で培養する。培養開始後、７〜１０日後には形質転
換したＢＬＣが増殖してくる。

（２）抗抗癌薬剤抗体分泌細胞の取得 抗癌薬剤は強い細胞毒性を有するため、正常人に対し抗
原感作を行うことができない。このため、ドナーのリン
パ球中に自然感作されたリンパ球を得るため、多数のＢ
ＬＣをスクリーニングすることが必要である。

抗抗癌薬剤抗体分泌細胞の検出には、抗癌薬剤を抗原と
して用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が使用可能で
ある。９６穴ＥＬＩＳＡプレートに０．１〜ｌＯＯμｇ
　１ｄｆＡ度の抗原、好ましくは１〜１０μｇ／ｙｍ抗
原溶液を５０〜１００μ！添加し、抗原をプレートに吸
着させた後、抗原溶液をプレートから捨てブロッキング
操作を行う。ブロッキングには、牛血清アルブミン、ス
キムミルク、市販のブロッキング試薬を用いることがで
きる。

ブロッキング試薬をウェル−杯に満たし、室温で１時間
以上静置してプロンキングを行い、その後ブロッキング
試薬又はＰＢＳ等でプレートを洗浄し、ついてプレート
にＢＬＣの培養上清を２０〜１００μ！加える。室温で
１時間以上静置し、その後プレートを洗浄し、酵素標識
した抗ヒト免疫グロブリン抗体を５０〜１００μ！加え
る。標識抗体を加えて１時間以上静置後、プレートを洗
浄し、基質溶液を加えて、ウェルに結合した酵素活性を
検出する。この方法の他に市販のビオチン−アビジンシ
ステムを用いた高感度検出法を使用して抗抗癌薬剤抗体
を検出することもできる。

抗抗癌薬荊抗体陽性細胞は、継代し、細胞融合を行う、
この後抗体陽性細胞をクローニングした後細胞融合を行
うこともできる。

（３）細胞融合に用いる親株の取得 −船釣なハイブリドーマ作製用親株のほとんどは、８−
アザグアニン、或いは６−チオグアニン耐性でアミノプ
テリン存在下死滅するＨＡＴ　（ヒボキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）感受性株であるが、本発明で使
用するＢＬＣは、ＨＡＴ培地中でも生育するため、細胞
融合親株には他の選択マーカーを付与することが必要と
なる。

細胞融合親株としては、ＨＡＴ感受性でかつウアバイン
耐性を持つ細胞が適する。この親株をＢＬＣと融合し、
ＨＡＴ、ウアバインを含む培地で培養すると、細胞融合
株のみが生育し、親株およびＢＬＣとも死滅するため容
易に融合細胞のみを選択できる。

このような、細胞融合親株は、マウスミエローマ細胞Ｓ
Ｐ２を用いて作製する。すなわち、ＩｕＭのウアバイン
存在下でＳＦ３を培養し、生存細胞を、さらに階段的に
、１００μＭのウアバインを含む培地に移して培養し、
ウアバイン耐性株を得る。この株をハイブリドーマ親株
として使用し得る。

（４）親株とＢＬＣの細胞融合 細胞融合を行うに当り、親株とＢＬＣの比率を１：１０
〜１０：１、好ましくは１１〜１：２の割合で混合する
。細胞融合にあたっては、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）又はセンダイウィルスを用いる方法のいずれでも
使用し得る。或いは、電気融合法等の物理的な方法も採
用可能である。

融合操作終了後、細胞を９６穴或いは２４穴プレートに
２Ｘ１０’／ｄ以下でまき込んで培養を行う、このよう
にしてまいた細胞培養ウェルに５〜１０μＭウアバイン
、１００μＭヒボキサンチン、０．４μＭアミノプテリ
ン及び１６μＭチミジンを含む培地を加え、２〜３日毎
に半量交換し、細胞を選択培養する。

細胞生育ウェル上清中の抗抗癌薬剤抗体をＥＬＩＳＡで
測定し、所望する細胞の生育ウェルを選択する。

（５）　　ハイブリドーマのクローニング上記（４）に
記載した手順で選択して得られた抗抗癌剤抗体を分泌す
るハイブリドーマのうちから、生育の速いハイブリドー
マを選ぶためにクローニングを行う、クローニングにあ
たっては、限界希釈法、ソフトアガー平板法、フィブリ
ンゲル平板法、セルソーターによる細胞分画法が例示で
きる。

このようにして得たヒト抗抗癌薬剤抗体産生マウスーヒ
トハイブリドーマは、次の細胞生物学上の特性を存する
。

細胞由来：マウス−ヒトパイブリドーマ形　状　：球形 表面付着性：培養器に弱く付着する性質を有する。

このようにして得られたマウス−ヒトハイプリドーマは
表１のとおり微工研に寄託されている。

表１ （６）　　マウス−ヒトハイプリドーマからの薬剤耐性
株の取得 ｂｆ抗体を分泌する融合細胞株（ハイブリッドハイブリ
ドーマ）を得るためには、細胞融合後、／”ｔイブリッ
ドハイブリドーマのみを選択的に増殖させ、融合に用い
たそれぞれのハイブリドーマは死滅するような選択マー
カーをあらかじめハイブリドーマに付与してお（必要が
ある。

（５）で得られるハイブリドーマはウアバイン耐性であ
るため、これもマーカーに用いることができる。また、
８−アザグアニン、あるいは６−チオグアニン耐性とし
て、ＨＡＴ培地中で死滅させるようにすることも可能で
ある。さらに、細菌由来のｎｅｏ遺伝子や、ｇｐｔ遺伝
子をハイブリドーマに導入して０４１８あるいはミコフ
ェノール酸耐性とすることもできる。

（７）ハイブリッドハイブリドーマの作製２種類の抗体
を分泌する細胞同志を融合する。

片方の細胞は、抗抗癌剤抗体を分泌するマウス−ハイブ
リドーマである。もう一方の細胞は、抗癌抗原抗体と結
合するヒト抗体を分泌する細胞ならどのようなものでも
よい。

肺癌、乳癌、皮フ癌、子宮癌、胃癌、大腸癌、すいぞう
癌、肝癌等に対する抗体を分泌する細胞である。

細胞は、ヒトリンパ球、ＥＢＶ形質転換細胞、ヒト−ヒ
トハイブリドーマ、マウス−ヒトハイプリドーマ等どの
ようなものでも良い。ただし、（６）で述べたように適
当な選択方法を利用できる細胞が適している。

抗体を分泌する２種類の細胞の融合方法は、本質的には
（４）（５）と同じである。

異なるのは、融合操作終了後のハイブリッドハイブリド
ーマの選択方法である。ウアバイン耐性株とＧ４１８耐
性株の融合の場合には、ウアバインとＣ４１８存在下で
ハイブリッドハイブリドーマを選択することができる。

ウアバイン耐性６−チオグアニン耐性株とウアバイン感
受性株の融合の場合には（４）と同様に０−ＨＡＴ培地
で選択培養を行うことができる。

この他に、融合前に、アクチノマイシンＤやエメチンの
ような細胞増殖阻害剤であらかじめハイブリドーマを処
理して、増殖能を消失させておく方法もある。この場合
相手の細胞が感受性である薬剤による選択が可能である
。

以上の如くして得られた細胞は、ヒト型の二特異性を持
つ抗体を分泌する。これらの抗体は、特異性の一方には
必ず、上述した抗腫瘍性物質に対する特異性をもち、一
方に他の親株由来の特異性を有しかつヒト型であるとい
う特徴を有する。

又、親株の組みあわせにより、抗すシンー抗ジフテリア
トキシン、抗すシンー抗ネオカルチノスクチン、抗ジフ
テリアトキシンー抗ネオカルチノスクチン等の二特異性
がいずれも抗腫瘍物質に対する特異性を有するヒト型抗
体を得ることもできる。

以下に実施例を示し本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ 親株細胞の作製 ８−アザグアニン耐性、ＨＡＴ感受性のマウスミエロー
マ細胞ＳＰ２株を、１μＭのウアバインを含むｌＯ％Ｆ
Ｃ３添加ダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸
濁し、９６穴プレ一ト１枚にウェル当り１×１０ｓ個の
細胞をまき込んだ。

これを２週間培養して、ウアバイン耐性株４０個を得た
。

このうち増殖の速い１０ウエルを２４穴プレート（コー
ニング２５Ｂ２０）に移して培地２ｄを添加し、１週間
培養した。さらに１０ウエルのうち増殖の速い５ウエル
を５Ｃ１１のシャーレ（ファルコン３００２）に移し、
ウアバイン濃度を段階的に、１μＭ、１０μＭ、５０μ
Ｍ、最終的に１００μＭまで増加させた。

５株とも１００μＭウアバイン存在下で生き残り耐性株
を取得できた。

このうち最も増殖の速い１株を選び５Ｐ２１０２と名づ
けで以下の細胞融合に用いた。

実施例２ 抗リシン抗体分泌マウスーヒトハイプリドーマの作製 健常人６名の上腕静脈より末梢血を採取した。

それぞれの血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２
倍希釈し、遠心管（フアシヨン２０９５）に予め分注し
ておいたフィコールパック（ファルマシア）上に重層し
た。

これを１，８００回転で４０分間遠心し、フィコールバ
ックと血漿の界面に沈降したリンパ球（未消血リンパ球
、ＰＢＬ）を採取した。

ＰＢＬ−１−ＰＢＳで２回洗浄した後形質転換に用いた
。ＥＢＶはマーモセットＢ９５−８株の培養上清に含ま
れるものを用いた。

Ｂ９５−８株をｌＯ％牛脂児血清（Ｆｅ２．大日本製薬
）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。

培養上清を０．４５μｍのフィルター（マイレクスＨＡ
、ミリポア）で濾過し、使用まで一８０℃に保存した。

上記ＰＢＬ　　ｌＸｌ０’個を遠心し、その上清を除い
たペレットにＥＢＶを含む培養上清１ｉを加えてＰＢＬ
にＥＢＶを感染させた。

ＰＢＬとＥＢＶの混合液に１０％ＦＣ３添加ＲＰＭ１１
６４０培地１４ＩＩｉを加え、よく懸濁して１５０μｌ
づつ９６穴マイクロタイタープレート（フアシヨン３０
７２）にまき込んだ。

細胞は３７°Ｃ１５％炭酸ガス９５％空気、湿度９５％
以上で培養した。

培養１週間後に培地を１００μ！添加し、その後３〜７
日毎に培地を半量づつ交換した。４〜８週間後、はとん
どのウェルに形質転換したＢＬＣが増殖してきた。

６名のＰＢＬから１．４００のＢＬＣ増殖ウェルを得た
。ＢＬＣの培養上清中に含まれる抗リシン抗体を酵素免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で下記手順により定量した。

定量法： リシン（ＲＣＡ、。、生化学工業社製）を、０．０５Ｍ
　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓに５μｇ／−となるように溶解し、
その５０μｌを９６穴ＥＬ　ｒ　ＳＡプレート（住人ベ
ークライト社製）に分注し４〜７°Ｃで一夜静置してリ
シンをプレートに吸着させた。翌日リシン溶液を捨て、
脱イオン水で４倍希釈したブロンフェース（大日本製薬
社製）４００＃ｊ！を加え、室温で１時間プレートをブ
ロッキングした。　プレートを０．０５％ツイン２０を
含むＰＢＳで２回洗浄後、ＢＬＣの培養上清５０μｌを
加えて室温で１時間静置した。

プレートを３回洗浄後、４倍希釈ブロックエースで１０
．０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗ヒト１ｇＭ
（タボ社）５０μ！を加えて、室温でさらに１時間静置
した。

プレートを６回洗浄後、基質として０．００６％のＨｘ
　Ｏｚを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）に
ｔｌｊＭした２、２°−アジノビス（３−エチルベンズ
−チアゾリンスルホン酸）２アンモニウム塩（ＡＢＴＳ
、和光社製）を基質として１００μｌ加えた。

６名のドナーのうち、ＭＨ，ＹＫ、からのＢＬＣより、
それぞれ各１個づつのＩｇＭ型リシリシン抗体むウェル
を検出した。

ＢＬＣの番号はＭＨ１０８、ＹＫ４５であった。

これらの細胞は段階的に１０ｄ培養まで増殖させ、８０
°Ｃまたは液体窒素中に保存した。

上記■で得た抗すシン抗体分泌ＢＬＣ１，５Ｘ１０″個
と同数の５Ｐ２１０２を、Ｆｅ２を含まないＲＰＭ１１
６４０培地で２回洗浄した。

これを５０ｄ遠心管（フアシヨン２０７０）中で混合後
、１５００回転で１０分間遠心してベレットにした。上
清を完全に除去した後、５０％ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ、シグマ）１〆を５０〜６０秒かけてゆっくり
滴下して細胞融合を行った。

３分間静置後、Ｆｅ２を含まないＲＰＭ１１６４０培地
１５ｄを徐々に加えてＰＥＧを希釈した。細胞を遠心分
離した後、これを１０％ＦＣ３を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１
６４０培地６０ｄに懸濁し、この１５０μ！づつを９６
穴マイクロタイタ一プレート４枚に分注した。

Ｍ　Ｈ１０８は２回、ＹＫ４５は１回、細胞融合を行っ
た。融合の翌日、５μＭウアバイン、１００μＭヒボキ
サンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジ
ン（０−ＨＡＴ）を含む１０％ＦＣ３添加ＲＰＭ１１６
４０培地を加え、その後２〜３日毎に０−ＨＡＴ培地を
用いてプレートの培地を半量づつ交換して、ハイブリド
ーマを増殖させた。

培養２〜３週間後、プレートを観察したところ、すべて
のウェルにハイブリドーマが増殖していた。

ハイブリドーマの培養上清中の抗リシン抗体の検出は上
記■と同様に行った。

ＭＨ１０Ｂからのハイブリドーマでは７６８ウ工ル中７
６８ウエル全部、ＹＫ４５からは３８４ウ工ル全部が陽
性であった。

増殖の速いハイブリドーマ、ＭＨ１０８Ｈ１６、ＹＫ４
５Ｈ７のクローニングを行った。

９６大丸底プレート（コーニング２５８５０）にハイブ
リドーマを１ウェル当り平均０．５個人るようにまき込
み、３〜４週間培養後上清中の抗体をＥＬＩＳＡにより
測定した。

ＭＨ１０８Ｈ１６はプレート４枚にまき込んで１７４ウ
エルにハイブリドーマが増殖し、このうち１３２ウエル
が抗リシン抗体陽性であった。

ＹＫ４５Ｈ７はプレート２枚にまき込んで６４ウエルに
ハイブリドーマが増殖し、このうち１５ウエルが抗体陽
性であった。

最終的に抗体産生の良い増殖の速いハイブリドーマＭＨ
１０８Ｈ１６−１とＹＫ４５Ｈ７−３を得た。

実施例３ 抗ジフテリア毒素抗体分泌マウスーヒトハイブリドーマ
の作製 健常人２名の上腕静脈より抹消血を採取した。

それぞれの血液から、実施例２の方法にしたがってリン
パ球を調製し、ＥＢＶを感染させた。

２名のＰＢＬから４９７のＢＬＣ増殖ウェルを得た。Ｂ
ＬＣの培養上清中に含まれる抗ジフテリア毒素抗体をＥ
Ｌ　Ｔ　ＳＡで下記手順により定量した。

定量法ニ ジフチリア毒素（和光純薬社製）を０．０５ＭＮ　ａ　
ＨＣＯｘに５μｇ／ｍｌとなるように溶解し、その５０
μｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し４〜７°Ｃで
一夜静置して毒素をプレートに吸着させた。翌日毒素溶
液を捨て、脱イオン水で４倍希釈したブロックエース４
００μｌを加え、室温で１時間プレートをブロッキング
した。

プレートを０．０５％ツイン２０を含むＰＢＳで２回洗
浄後、ＢＬＣの培養上清５０μｌを加えて室温で１時間
静置した。

プレートを３回洗浄後、４倍希釈ブロックエースでｔｏ
、ｏｏｏ倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗ヒト１　ｇ
Ｍ５０μＰを加えて、室温でさらに１時間静置した。

プレートを６回洗浄後、基質として、０．００６％のＨ
ｚ　Ｏ□を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）
に溶解したＡＢＴＳを基質として１００μ！加えた。

２名のドナーからのＢＬＣより、それぞれ各１個づつの
ＩｇＭ型抗ジフテリア毒素抗体を含むウェルを検出した
。

ＢＬＣの番号はＭＨ１６１、ＹＫ１４９であった。これ
らの細胞は段階的にｌｏ＋ｄ培養まで増殖させ、−８０
°Ｃまたは液体窒素中に保存した。

上記■で得た抗ジフテリア毒素抗体分泌ＢＬＣ１，５Ｘ
１０’個と同数の５Ｐ２１０２を、ＦＣＳを含まないＲ
ＰＭ１１６４０培地で２回洗浄した。

これを５０Ｈ１遠心管中で混合後、１５００回転で１０
分間遠心してペレットにした。上清を完全に除去した後
、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、シグマ社製
）ＩＭｌを５０〜６０秒かけてゆっくり滴下して細胞融
合を行った。

３分間静置後、Ｆｅ２を含まないＥＲＤＦ培地（極東製
薬社製）１５ｄを徐々に加えてＰＥＧを希釈した。細胞
を遠心分離させた後、これを１０％ＦＣ３を含むＥＲＤ
Ｆ培地６０ｉｄに懸濁し、この１５０ｐｌづつを９６穴
マイクロタイタ一プレート４枚に分注した。

融合の翌日、Ｏ−ＨＡ、　Ｔを含む１０％ＦＣＳ添加Ｅ
ＲＤＦ培地を加え、その後２〜３日毎に０ＨＡＴ培地を
用いてプレートの培地を半量づつ交換して、ハイブリド
ーマを増殖させた。

培養２〜３週間後、プレートを観察したところ、すべて
のウェルにハイブリドーマが増殖していた。

ハイブリドーマの培養上清中の抗ジフテリア毒素抗°体
の検出は上記■と同様に行った。

ＭＨ１６１からのハイブリドーマでは３８４ウエル中３
６０ウエル、ＹＫ１４９からは３８４ウエル中３８４ウ
エルすべてが陽性であった。

増殖の速いハイブリドーマ、ＭＨ１６１Ｈ１９、ＹＫ１
４９Ｈ８のクローニングを行った。

９６大丸底プレートにハイブリドーマを１ウェル当り平
均０．５個人るようにまき込み、３〜４週間培養後↓清
中の抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。

ＭＨ１６１Ｈ１９はプレート３枚にまき込んで１９ウエ
ルにハイブリドーマが増殖し、このうち１３ウエルが抗
ジフテリアトキシン抗体陽性であった。

ＹＫ１４９Ｈ８はプレート３枚にまき込んで１１８ウエ
ルにバイプリドーマが増殖し、このうち２ウエルが抗体
陽性であった。

最終的に抗体産生の良い増殖の速いハイブリドーマＨ１
６１Ｈ１９−５とＹＫＩ　４９Ｈ８−６８を得た。

実施例４ 抗ネオカルチノスタチン抗体分泌マウス−ヒトハイプリ
ドーマの作製 健常人１名の上腕静脈より末梢血を採取した。

血清から実施例２の方法によりリンパ球を調製し、ＥＢ
Ｖを感染させた。

４〜８週間後、はとんどのウェルに形質転換したＢＬＣ
が増殖してきた。

１名のＰＢＬから２０７のＢＬＣ増殖ウェルを得た。Ｂ
ＬＣの培養上清中に含まれる抗ネオカルチノスクチン抗
体をＥＬＴＳＡで下記手順により定量した。

定量法： ネオカルチノスタチン（山之内製薬）を０．０５ＭＮａ
ＨＣＯ＊に５ｕｇ／Ｉ１１となるように溶解し、その５
０μｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し４〜７°Ｃ
で一夜静置してネオカルチノスタチンをプレートに吸着
させた。翌日ネオカルチノスタチン溶液を捨て、脱イオ
ン水で４倍希釈したブロックエース４００μ！を加え、
室温で１時間プレートをブロッキングした。

プレートを０．０５％ツイン２０を含むＰＢＳで２回洗
浄後、ＢＬＣの培養上清５０ｔｔｌを加えて室温で１時
間静置した。

プレートを３回洗浄後、４倍希釈プロンクエースで１０
，０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗ヒト１　ｇ
Ｍ５０μｌを加えて、室温でさらに１時間静置した。

プレートを６回洗浄後、基質として、０．００６％０：
）　Ｈ２０ｚを含む０．１Ｍりｘ７酸緩衝？Ｆ！ｌ（ｐ
　Ｈ４，Ｑ）に溶解したＡＢＴＳを基質として１００μ
！加えた。

１名のドナーからのＢＬＣより、１個のＩｇＭ型抗ネオ
カルチノスクチン抗体を含むウェルを検出した。

ＢＬＣの番号はＹＫ１３６であった。この細胞は段階的
に１０維培養まで増殖させ、−８０’Ｃまたは液体チッ
ソ中に保存した。

■　　　人による　　オカルチノス　チン上記■で得た
抗ネオカルチノスクチン抗体分泌ＢＬＣ，ＹＫ１３６．
１×１０？個および同数の５Ｐ２１０２を、Ｆｅ２を含
まないＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地で２回洗浄した。

これを５０ｄ遠心管（ファルコン２０７０）中で混合後
、１５００回転で１０分間遠心してペレットにした。上
清を完全に除去した後、５０％ＰＥＧｌｔを５０〜６０
秒かけてゆっくり滴下して細胞融合を行った。

３分間静置、Ｆｅ２を含まないＥＲＤＦ培地１５ｄを徐
々に加えて、ＰＥＧを希釈した。細胞を遠心分離させた
後、これを１０％ＦＣ３を含むＥＲＤＦ培地４５ｍに懸
濁し、この１５０μｆづつを９６穴マイクロ力ルチヤー
プレート３枚に分注した。

融合の翌日、０−ＨＡＴを含む１０％ＦＣ３添加ＥＲＤ
Ｆ培地を加え、その後２〜３日毎に０−ＨＡＴ培地を用
いてプレートの培地を半量づつ交換して、ハイブリドー
マを増殖させた。

培養２〜３週間後、プレートを観察したところ、すべて
のウェルにハイブリドーマが増殖していた。

ハイブリドーマの培養土清中の抗ネオカルチノスクチン
抗体の検出は上記■と同様に行った。

ＹＫ１３６からのハイブリドーマは２８８ウエル中全ウ
エルが陽性であった。

増殖の速いハイブリドーマ、ＹＫ１３６Ｈ１５ノクロー
ニングを行った。

９６穴丸底マイクロカルチヤープレートにハイブリドー
マを１ウェル当り平均０．５個人るようにまき込み、３
〜４週間培養後上清中の抗体をＥＬＩＳＡにより測定し
た。

ＹＫ１３６Ｈ１５はプレート３枚にまき込んで６３ウエ
ルにハイブリドーマが増殖し、このうち１ウエルＹＫ１
３６　Ｈ２Ｓ−５６が抗ネオカルチノスクチン抗体陽性
であった。このクローンのクローニングをさらにくり返
し、最終的に抗体産生の良い増殖の速いハイブリドーマ
ＹＫ１３６Ｈ１５５６，１６を得た。

実施例５ 薬剤耐性ハイプリドーマ株の作製 ＭＨ１０８Ｈ１６−１（以下、ＭＨ１０８Ｈ）。

ＹＫ４５Ｈ７−３（以下、ＹＫ４５Ｈ）、ＭＨＩ６１Ｈ
１９−５（以下、ＭＨ１６１Ｈ）およびＹＫ１４９Ｈ８
−６８（以下、ＹＫ１４９Ｈ）を、村上らの方法（Ｍｕ
ｒａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　
２１　＋５９３　（１９８５））３０ｄｇ／ｄの６−チ
オグアニンを加えた、１０％ＦＣ３含有ＥＲＤＦ培地中
で培養し、それぞれの６−チオグアニン耐性株ＭＨ１０
８ＨＲ，ＹＫ４５ＨＲ，ＭＨ１６１ＨＲ。

ＹＫ１４９ＨＲを得た。これらの細胞は、ＨＡＴ培地中
で死滅するＨＡＴ感受性細胞であった。

実施例６ ＭＨ１０８ＨとＭＨ１６１ＨＲの細胞融合によるｂｆ抗
体分泌ハイブリッドハイブリドーマの作製■アクチノマ
イシンＤ几 ＥＲＤＦで３回遠心洗浄したＭＨ１０８Ｈ１ｘｌＯ７を
１０ｄのＥＲＤＦに懸濁し、これにアクチンマイシンＤ
（シグマ）を４００ｎｇ／ｄとなるように添加して、３
７°Ｃで２時間インキュベーションした。細胞を集め、
１０％ＦＣ３−ＥＲＤＦで３回洗浄後、１０ｍの１０％
ＦＣ３−ＥＲＤＦに懸濁し、３７°Ｃで１時間インキュ
ベーションした。細胞をＥＲＤＦでさらに２回洗浄した
ものをアクチノマイシンＤ処理細胞とした。この処理に
よってＭＨ１０８Ｈは完全に増殖能を失った。

■廠ｍ墓金 ｌＸｌ０’のアクチノマイシンＤ処理ＭＨ１０８Ｈおよ
びＭＨ１６１ＨＲを５０ｄ遠心管中で混合し、実施例２
のごと＜ＰＥＧで融合した。融合細胞を３０ｄの１０％
ＦＣＳ−ＥＲＤＦに浮遊させ、９６穴マイクロ力ルチヤ
ープレート２枚に１５０μｌづつまき込んだ。培養２日
目よりＨＡＴ培地による選択培養を開始した。培養３週
間後１９２ウェルすべてのウェルに融合細胞の増殖がみ
られた。

■■披生叫１１立不 ＭＨ１０８ＨはＩｇＭ（に）の抗リシン抗体、ＭＨ１６
１ＨＲはＩｇＭ（λ）の抗ジフテリア毒素抗体を分泌す
る。したがって、これらのハイブリドーマの融合によっ
て得られたハイブリッドハイブリドーマが分泌するｂｆ
抗体は、にとλを同−分子上に持ち、にとλの双方を持
った抗リシンおよび抗ジフテリア毒素抗体でなくてはな
らない。

まず、にとλを同一分子中に含む抗体を検出するために
、抗ヒトに（１／１０００希釈タゴ社希釈タートしたＥ
ＬＩＳＡプレートにλ鎖を含む抗体分子が結合するか否
かをパーオキシダーゼ標識抗ヒトλ（１／１０００希釈
、タボ社）を用いて検討した。■で得られた１９２ウエ
ル中、６ウエル（＃１．２．４．５．６．７）が陽性で
あった。

さらに抗リシンおよび抗ジフテリア毒素抗体中にいずれ
もにとλが含まれているウェルをＥＬＩＳＡで検出した
ところ２ウエル（＃５、＃７）が陽性であった。

以上の結果を表２に示す。＃５および＃７はｂｆ抗体を
分泌するハイブリッドハイブリドーマを含んでいること
が明らかになった。

表２ ４、発明の効果 本発明によれば、一方の特異性が抗腫瘍性物質、すなわ
ち、抗リシン、抗ジフテリア毒素、抗ネオカルチンスク
チンのいずれかである、二特異性ヒト型抗体およびこれ
を分泌する細胞を得ることができる。このような抗体は
医療用や生化学研究用として有用に利用される。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）二つの異なる抗原に結合性を有するヒト型抗体で
   あって、一方の抗原認識性が抗腫瘍性薬剤に対する認識
   性である二特異性ヒト型抗体。
2. （２）抗腫瘍性薬剤がヒマ種子リシン、ジフテリア毒素
   、ネオカルチノスタチンのいずれかである請求項（１）
   記載の二特異性ヒト型抗体。
3. （３）二種類のハイブリドーマを細胞融合して二特異性
   ヒト型抗体分泌細胞を取得するに際して ［１］一方の抗体分泌細胞がヒトリンパ球をエプスタイ
   ンバーウィルスで形質転換した、抗腫瘍性薬剤に特異的
   な抗体を分泌する細胞を ［２］マウスミエローマ細胞と細胞融合して抗腫瘍性薬
   剤に特異的な抗体を分泌するマウス−ヒトハイプリドー
   マを得、 ［３］得られたマウス−ヒトハイプリドーマに薬剤耐性
   を付与したことを特徴とする、二特異性ヒト型抗体分泌
   細胞の取得方法。
4. （４）抗腫瘍性薬剤がヒマ種子リシン、ジフテリア毒素
   、ネオカルチノスタチンのいずれかである請求項（３）
   記載の二特異性ヒト型抗体分泌細胞の取得方法。
5. （５）薬剤耐性が８−アザグアニン、６−チオグアニン
   、ウアバイン、Ｇ４１８、ミコフェノール酸耐性のいず
   れかである請求項（３）又は請求項（４）記載の二特異
   性ヒト型抗体分泌細胞の取得方法。