JPH0330679A - ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ - Google Patents
ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡInfo
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- JPH0330679A JPH0330679A JP1163662A JP16366289A JPH0330679A JP H0330679 A JPH0330679 A JP H0330679A JP 1163662 A JP1163662 A JP 1163662A JP 16366289 A JP16366289 A JP 16366289A JP H0330679 A JPH0330679 A JP H0330679A
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- lys
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードす
るＤＮＡ、並びにＢａｎ ｌメチラーゼ及び、Ｂａｎ
ｌメチラーゼをコードするＤＮＡに関する。
るＤＮＡ、並びにＢａｎ ｌメチラーゼ及び、Ｂａｎ
ｌメチラーゼをコードするＤＮＡに関する。
■型制限酵素はいままでのところ細菌等から約１２０種
類の■型制限酵素が発見され商品化されている。■型制
限酵素はデオキシリボ核酸（Ｄ Ｎ Ａ）鎖中のある特
定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性の
高い酵素であり、遺伝子工学の分野で幅広く利用されて
いる。また遺伝子診断による臨床検査にもその利用が期
待されている。
類の■型制限酵素が発見され商品化されている。■型制
限酵素はデオキシリボ核酸（Ｄ Ｎ Ａ）鎖中のある特
定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性の
高い酵素であり、遺伝子工学の分野で幅広く利用されて
いる。また遺伝子診断による臨床検査にもその利用が期
待されている。
Ｂａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼは■型制限酵素のひ
とつである。本酵素はＤＮＡの塩基配列中のＧＧＰｙＰ
ｕＣＣを認識しこれを切断する酵素であり、バチルス
アノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒ
ｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７において生産
される酵素であるが、このバチルス アノイリノリティ
カス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉ
ｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７は、 Ｂａｎ １以外
に他の制限酵素Ｂａｎ Ｕ 、 Ｂａｎ ＩＩＩを菌
体内に同時に生産するためこれらを除くことが非常に困
難であり製造上の問題を抱えていた。
とつである。本酵素はＤＮＡの塩基配列中のＧＧＰｙＰ
ｕＣＣを認識しこれを切断する酵素であり、バチルス
アノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒ
ｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７において生産
される酵素であるが、このバチルス アノイリノリティ
カス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉ
ｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７は、 Ｂａｎ １以外
に他の制限酵素Ｂａｎ Ｕ 、 Ｂａｎ ＩＩＩを菌
体内に同時に生産するためこれらを除くことが非常に困
難であり製造上の問題を抱えていた。
一方、制限サイトメチラーゼは制限酵素の認識塩基配列
をメチル化するものであって、遺伝子操作では制限酵素
の認識配列をメチル化することによりそれに対応する制
限酵素による切断を防ぐことに使われているものである
が、Ｂａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼの認識塩基配列
をメチル化するＢａｎ ｌメチラーゼ、及びそのＤＮＡ
を取得した例は現在まで見当らない。
をメチル化するものであって、遺伝子操作では制限酵素
の認識配列をメチル化することによりそれに対応する制
限酵素による切断を防ぐことに使われているものである
が、Ｂａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼの認識塩基配列
をメチル化するＢａｎ ｌメチラーゼ、及びそのＤＮＡ
を取得した例は現在まで見当らない。
〔発明が解決しようとする課題］
遺伝子操作技術を使用してバチルス アノイリノリティ
カス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃ
ｕｓ）以外の宿主にＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ
を生産させることができれば、該バチルス アノイリノ
リティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙ
ｔｉｃｕｓ）に由来する夾雑酵素の問題は解決し、純粋
なりａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを得ることが可能
となる。本発明の課題は、この遺伝子操作技術によりＢ
ａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを生産する際に、まず
必要となる該酵素をコードするＤＮＡを提供することに
あり、また、このＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡを宿主に保持させる場合、宿主本来の
ＤＮＡが産生ずるＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼに
より切断され宿主増殖が阻害されるのを防止するために
は、Ｂａｎ ｌメチラーゼの産生能を宿主に付与せしめ
る必要があり、このために必須となるＢａｎ Ｉメチラ
ーゼをコードするＤＮＡを提供することにある。
カス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃ
ｕｓ）以外の宿主にＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ
を生産させることができれば、該バチルス アノイリノ
リティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙ
ｔｉｃｕｓ）に由来する夾雑酵素の問題は解決し、純粋
なりａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを得ることが可能
となる。本発明の課題は、この遺伝子操作技術によりＢ
ａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを生産する際に、まず
必要となる該酵素をコードするＤＮＡを提供することに
あり、また、このＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡを宿主に保持させる場合、宿主本来の
ＤＮＡが産生ずるＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼに
より切断され宿主増殖が阻害されるのを防止するために
は、Ｂａｎ ｌメチラーゼの産生能を宿主に付与せしめ
る必要があり、このために必須となるＢａｎ Ｉメチラ
ーゼをコードするＤＮＡを提供することにある。
また、本発明の課題には、この他、種々の遺伝子操作技
術において有用なりａｎ Ｉメチラーゼ自体を提供する
ことも含む。
術において有用なりａｎ Ｉメチラーゼ自体を提供する
ことも含む。
本発明者らはＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ生産菌
から染色体ＤＮＡを採取し得られた染色体ＤＮＡを適当
な制限酵素で消化してｐＢＲ３２２などのプラスミドに
組み込み、このプラスミドにより大腸菌等に形質転換し
、形質転換菌を増殖させてＢａｎ■制限エンドヌクレア
ーゼ、またはＢａｎ ！メチラーゼ生産菌をそれぞれ単
離し、これら生産菌を培養することにより、Ｂａｎ Ｉ
制限エンドヌクレアーゼ及びＢａｎ Ｉメチラーゼを採
取するとともに、これら酵素をコードするＤＮＡを単離
、同定することにも成功し、本発明を完成するに至った
ものである。
から染色体ＤＮＡを採取し得られた染色体ＤＮＡを適当
な制限酵素で消化してｐＢＲ３２２などのプラスミドに
組み込み、このプラスミドにより大腸菌等に形質転換し
、形質転換菌を増殖させてＢａｎ■制限エンドヌクレア
ーゼ、またはＢａｎ ！メチラーゼ生産菌をそれぞれ単
離し、これら生産菌を培養することにより、Ｂａｎ Ｉ
制限エンドヌクレアーゼ及びＢａｎ Ｉメチラーゼを採
取するとともに、これら酵素をコードするＤＮＡを単離
、同定することにも成功し、本発明を完成するに至った
ものである。
すなわち本発明は、
（１）バチルス アノイリノリティカス（Ｂａｃｉ ｆ
ｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＢａｎ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ断片。
ｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＢａｎ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ断片。
（２）次の式Ｉで表わされるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有する（１）記載のＤＮＡ断片。
塩基配列を有する（１）記載のＤＮＡ断片。
式１
％式％
（３）次の式■で表わされる塩基配列を有する（２）記
載のＤＮＡ断片。
載のＤＮＡ断片。
式■
ＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣ
ＡＡＴＣＴＧＴＴＴＣ
ＴＡＡＡＧＣＡＴＣＴ
ＴＧＴＴＧＴＡＴＴＡ
ＴＴＡＣＡＴＡＡＣＡ
ＡＡＡＧＴＧＴＴＡＧ
ＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡ
ＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ｌｉｅ ＬｅｕＡＡＧＧＡＧＣ
ＧＴＴ ＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴ ΔへＧＣＡＧＡＡ
ＴＡ ＡＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡ
ＴＡＣＧＴＴＡＧＧＴ ＣへへＧＴＣＧＣＴＣＡＡ
ＡＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＡＴＡＡ八＾Ａ ＧＴＡＡＴＧＧＡＣ八 ＣＡＴへＧＡＡＧＧＴ ＧＴＧＡＣＣＣＡＴＡ へへＡＡＧＧＣＡＧＣ ＧＴＡＡＣＴＡＣＡＡ ＾へへＡＧＣＧＴＴＧ ＣＧＡＴＴＧＡＧＡＴ Ｔ
ＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＡＧＴＡＣＣＡＴ ＣＧＡＧ
ＣＧＴ八八八 ＧＣへへへＡＣＡＡＧＴＡＴＡＧＣＴＴ
ＡＴ へＡＡＡＡＴＧＣＡへ ＾ＴＴＡＴＣＧＡＴＧ ＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴ ＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡ ＣＴＴＣＣＡＡＣＧＴＴＴＧ
ＴＡＡＴＡＡＴ ＡＧＣＣＡＴＴＧＣ八ｔｙ 八ｒｇ Ｇへｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ １ｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ １１ｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ 八ｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ５ｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ 八ｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ １１ｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ＴｈｒＧｌｕ ｌｉ
ｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ ＰｈｅＡｓｐ Ｉｌｅ
Ｈ４ｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ ５ｅｒＧｌｙ Ｐｈｅ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ （４）バチルス アノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓａｎｅ’ｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＢａｎ
ｌメチラーゼをコードするＤＮＡ断片。
ｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ｌｉｅ ＬｅｕＡＡＧＧＡＧＣ
ＧＴＴ ＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴ ΔへＧＣＡＧＡＡ
ＴＡ ＡＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡ
ＴＡＣＧＴＴＡＧＧＴ ＣへへＧＴＣＧＣＴＣＡＡ
ＡＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＡＴＡＡ八＾Ａ ＧＴＡＡＴＧＧＡＣ八 ＣＡＴへＧＡＡＧＧＴ ＧＴＧＡＣＣＣＡＴＡ へへＡＡＧＧＣＡＧＣ ＧＴＡＡＣＴＡＣＡＡ ＾へへＡＧＣＧＴＴＧ ＣＧＡＴＴＧＡＧＡＴ Ｔ
ＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＡＧＴＡＣＣＡＴ ＣＧＡＧ
ＣＧＴ八八八 ＧＣへへへＡＣＡＡＧＴＡＴＡＧＣＴＴ
ＡＴ へＡＡＡＡＴＧＣＡへ ＾ＴＴＡＴＣＧＡＴＧ ＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴ ＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡ ＣＴＴＣＣＡＡＣＧＴＴＴＧ
ＴＡＡＴＡＡＴ ＡＧＣＣＡＴＴＧＣ八ｔｙ 八ｒｇ Ｇへｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ １ｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ １１ｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ 八ｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ５ｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ 八ｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ １１ｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ＴｈｒＧｌｕ ｌｉ
ｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ ＰｈｅＡｓｐ Ｉｌｅ
Ｈ４ｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ ５ｅｒＧｌｙ Ｐｈｅ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ （４）バチルス アノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓａｎｅ’ｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＢａｎ
ｌメチラーゼをコードするＤＮＡ断片。
（５）次の式ＩＩＩで表わされるアミノ酸配列をコード
する塩基配列を有する（４）記載のＤＮＡ断片。
する塩基配列を有する（４）記載のＤＮＡ断片。
弐■
Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｖ
ａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ１ｅ Ｔｙｒ １ｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ｌｉｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ ＰｈｅＰｈｅ Ｇｉｎ Ａｓｎ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
ＧｌｙＡｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈ４
ｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕｌｌｅ Ａｓｐ
Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ 旧５Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ ｒｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｃｙｓ（６）次の弐■で表わされる塩基配列ををする（
５）記載のＤＮＡ断片。
ａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ１ｅ Ｔｙｒ １ｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ｌｉｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ ＰｈｅＰｈｅ Ｇｉｎ Ａｓｎ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
ＧｌｙＡｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈ４
ｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕｌｌｅ Ａｓｐ
Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ 旧５Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ ｒｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｃｙｓ（６）次の弐■で表わされる塩基配列ををする（
５）記載のＤＮＡ断片。
弐■
ＡＴＧＡＡＧＡＴＴＡ ＡＡＴＴＴＧＴＴＧＡ Ｃ
ＴＴＧＴＴＴＧＣＴ ＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＴ
ＴＣＧＡＡＴ ＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡ ＡＧＡＧＣ
ＧＧＣＣＡ ＡＡＣＧＧＴＴＴＧＡ八ＡＧＧＣＴＴＧ
Ｃへ ＾へＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＡＡＴＴＴＴ
ＡへへＧＡＧＧＡＡＣしｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ ｉｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ ｌｉｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ １；’ＩしＴＡＡＩ；に’ｌ’に ’ｒＡＡｉ’ＧＴ
ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴ ＣＴＣＡＣＡＡＧＴＡ ＴＡＡＧＡＡＴＧＡＡ ＴＧＴＡＴＧＡ ＣＡＡＡＴＡＴＣＴＴ ＴＡＴＴＴＧＡＴＧＡ ＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴ （力 （４）〜（６）いずれか記載のＤＮＡ断片を含む
発現ベクター （８） （７）記載の発現ベクターにより形質転換さ
れた形質転換体。
ＴＴＧＴＴＴＧＣＴ ＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＴ
ＴＣＧＡＡＴ ＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡ ＡＧＡＧＣ
ＧＧＣＣＡ ＡＡＣＧＧＴＴＴＧＡ八ＡＧＧＣＴＴＧ
Ｃへ ＾へＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＡＡＴＴＴＴ
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発現ベクター （８） （７）記載の発現ベクターにより形質転換さ
れた形質転換体。
（９）エシャリヒア（ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属す
る微生物を形質転換したものである（８）記載の形質転
換体。
る微生物を形質転換したものである（８）記載の形質転
換体。
ＧＯ） （４）〜（６）いずれか記載のＤＮＡ断片を
組み込んだ発現ベクターにより、生物細胞あるいは微生
物を形質転換し、得られた形質転換体を培養して培養物
からＢａｎ Ｉメチラーゼを採取することを特徴とする
Ｂａｎ Ｉメチラーゼの製造方法。
組み込んだ発現ベクターにより、生物細胞あるいは微生
物を形質転換し、得られた形質転換体を培養して培養物
からＢａｎ Ｉメチラーゼを採取することを特徴とする
Ｂａｎ Ｉメチラーゼの製造方法。
（１１）バチルス アノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来の約４．
４０００の分子量（Ｓ［ｌＳ−ＰＡＧＥ法による）を有
するＢａｎ Ｉメチラーゼ。
ｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来の約４．
４０００の分子量（Ｓ［ｌＳ−ＰＡＧＥ法による）を有
するＢａｎ Ｉメチラーゼ。
面 次の式ＩＩＩで表わされるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドである（１１）記載のＢａｎ Ｉメチラーゼ
。
リペプチドである（１１）記載のＢａｎ Ｉメチラーゼ
。
式■
Ｍｅｔ Ｌｙｓ ｌｉｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ＡｌａＧｌ
ｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＧｌｕＡｒｇ Ａｌａ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ １１ｅ Ｔｈｒ ５ｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ １ｕ Ｐｒ。
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ＡｌａＧｌ
ｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＧｌｕＡｒｇ Ａｌａ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ １１ｅ Ｔｈｒ ５ｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ １ｕ Ｐｒ。
Ｐｈｅ
Ｐｈｅ
Ｌｙｓ
Ａｒｇ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ ５ｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｙｒ
Ｇｉｎ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｃｙｓ
Ｇｉｎ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ
Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ
Ｌｙｓ
Ｐｈｅ
Ｇｌｕ
０
Ｌｅｕ
Ｓｅｒ
＾５ｐ
１１ｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖ
ａｌ Ｖａｔ Ｇｌｙ Ａｓｎｒｎｅ Ｌｌｉｎ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｖａｔ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ ＧｌｙＧｉｎ Ｍｅｔ Ｌ
ｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｔ Ｖ
ａｌに関する。
ａｌ Ｖａｔ Ｇｌｙ Ａｓｎｒｎｅ Ｌｌｉｎ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｖａｔ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ ＧｌｙＧｉｎ Ｍｅｔ Ｌ
ｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｔ Ｖ
ａｌに関する。
以下に本発明を詳述する。
本発明のＢａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
むプラスミドは例えばエシャリヒア（ｅｓｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド
）として知られるコリシンＥｌ因子等の培養された細胞
内で増殖しうる形式をとるプラスミドにバチルス アノ
イリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏ
ｌｙｔｉｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７由来のＢａｎ ｌ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子、Ｂａｎ Ｉメチラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片、およびＢａｎ Ｉメチラーゼの
みを含むＤＮＡ断片を組み込んでなるプラスミドであり
、前記ベクターＤＮＡとしては天然に存在するものを抽
出したものの他、増殖に必須な部分以外のＤＮＡの部分
が一部欠失しているものでもよ（Ｃｏ１Ｅ １の系統、
ｐＢＲ３２２の系統、ｐｓｃｌｏｌの系統、９Ｍ８９の
系統、ラムダファージの系統が挙げられる。
むプラスミドは例えばエシャリヒア（ｅｓｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド
）として知られるコリシンＥｌ因子等の培養された細胞
内で増殖しうる形式をとるプラスミドにバチルス アノ
イリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏ
ｌｙｔｉｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７由来のＢａｎ ｌ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子、Ｂａｎ Ｉメチラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片、およびＢａｎ Ｉメチラーゼの
みを含むＤＮＡ断片を組み込んでなるプラスミドであり
、前記ベクターＤＮＡとしては天然に存在するものを抽
出したものの他、増殖に必須な部分以外のＤＮＡの部分
が一部欠失しているものでもよ（Ｃｏ１Ｅ １の系統、
ｐＢＲ３２２の系統、ｐｓｃｌｏｌの系統、９Ｍ８９の
系統、ラムダファージの系統が挙げられる。
また前記ベクターＤＮＡに前記染色体ＤＮＡ断片を組み
込む方法は既知のいずれの方法も適用しうる。例えば適
当な制限酵素で処理して染色体ＤＮＡを特定部位で切断
し、ついで同様に処理したベクターＤＮＡと混合しりガ
ーゼによって再結合する方法が用いられる。
込む方法は既知のいずれの方法も適用しうる。例えば適
当な制限酵素で処理して染色体ＤＮＡを特定部位で切断
し、ついで同様に処理したベクターＤＮＡと混合しりガ
ーゼによって再結合する方法が用いられる。
ベクターＤＮＡとしてｐＢＲ３２２プラスミドを用いこ
れにバチルスアノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７か
ら調製された染色体ＤＮＡ断片を組み込むことにより、
新規プラスミドｐＢＡＮＩＲＭ ８が得られる。ｐＢＡ
ＮＩＲＭ ８プラスミドの制限酵素地図を第１図に示す
。第１図に示す様にこのプラスミドはｐＢＲ３２２プラ
スミドの制限サイトにバチルス アノイリノリティカス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）
ＩＡＭ１０７７のＢａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子、およびＢａｎ Ｉメチラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が組み込まれた８ｋｂの塩基対を有するプラスミ
ドである。
れにバチルスアノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７か
ら調製された染色体ＤＮＡ断片を組み込むことにより、
新規プラスミドｐＢＡＮＩＲＭ ８が得られる。ｐＢＡ
ＮＩＲＭ ８プラスミドの制限酵素地図を第１図に示す
。第１図に示す様にこのプラスミドはｐＢＲ３２２プラ
スミドの制限サイトにバチルス アノイリノリティカス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）
ＩＡＭ１０７７のＢａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子、およびＢａｎ Ｉメチラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が組み込まれた８ｋｂの塩基対を有するプラスミ
ドである。
本発明のＢａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼをコード遺
伝子、およびＢａｎ Ｉメチラーゼ遺伝子は次の様にし
て同定できる。
伝子、およびＢａｎ Ｉメチラーゼ遺伝子は次の様にし
て同定できる。
まず本発明者らは、Ｂａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を同定するため本プラスミド菌株エッジエリヒア
コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ） ＨＢ
ＩＯＩ（ｐＢａｎｌＲＭ８） （ＦＥＲＭ Ｐ−９４２
４） （エシェリヒア コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｈｉａ
ｃｏｌｔ）蚤ＩＢＩＯＩ （ｐＢＡＮｌｌ） と同じ
である。〕を培養し、菌体を取得した。
遺伝子を同定するため本プラスミド菌株エッジエリヒア
コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ） ＨＢ
ＩＯＩ（ｐＢａｎｌＲＭ８） （ＦＥＲＭ Ｐ−９４２
４） （エシェリヒア コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｈｉａ
ｃｏｌｔ）蚤ＩＢＩＯＩ （ｐＢＡＮｌｌ） と同じ
である。〕を培養し、菌体を取得した。
本菌体より Ｂａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼ、Ｂａ
ｎ Ｉメチラーゼをそれぞれ電気泳動（ＳＯ５ＰＡＧＥ
）でシングルバンドになるまで精製純化し本標品にてア
ミノ酸シーケンサ−によりＮ末端アミノ酸配列を決定し
た。
ｎ Ｉメチラーゼをそれぞれ電気泳動（ＳＯ５ＰＡＧＥ
）でシングルバンドになるまで精製純化し本標品にてア
ミノ酸シーケンサ−によりＮ末端アミノ酸配列を決定し
た。
更にＢａｎ ［制限エンドヌクレアーゼを生産する上記
菌株を培養しその培養菌体よりプラスミドを調製した。
菌株を培養しその培養菌体よりプラスミドを調製した。
本プラスミドは当然ながらＢａｎ ｌ制限エンドヌクレ
アーゼを暗号化しているＤＮＡとＢａｎＩメチ・ラーゼ
を暗号化しているＤＮＡを保有しており、これを用いて
塩基配列を決定できる。ＤＮＡ塩基配列を決めるため本
プラスミドより上記２つの酵素を暗号化していると思わ
れる領域のＤＮＡ断片を塩基配列決定に適したベクター
、例えばｐＵｃ１８． Ｍ１３ｍｐｌＢに移し、Ｍ１３
−ジオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｐｒｏ、Ｎａ ｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ 、 ７４．５４６３−５４
６７ （１９７７）より決定した。即ちｐＵｃ１８．
Ｍ１３ｍｐｌＢに組み換えプラスミドに変えた後、種々
制限酵素による制限酵素サイトの決定、及びサブクロー
ニング、マングビーンヌクレアーゼ、エキソヌクレアー
ゼ■を用いるデレージョン法により、種々デレーション
ミュータントを作成しＢａｎ ｒ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子、Ｂａｎ Ｉメチラーゼ遺伝子の領域を決定し
た。さらに、デレージョン ミュータントの挿入ＤＮＡ
断片の塩基配列を決定した。また、制限酵素活性、メチ
ラーゼ活性のうち前者の活性のみが発現するデレージョ
ン ミュータントでは菌が死滅するため、塩基配列を決
めるべき領域のＤＮＡが取れないため塩基配列が決めら
れないことがある。そのような場合、カスタムプライマ
ー法等を活用して決定した。その結果、前記式■で表わ
されるＢａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼをコードする
ＤＮＡ配列及び弐■で表わされるＢａｎ Ｉメチラーゼ
をコードするＤＮＡ配列を決定した。
アーゼを暗号化しているＤＮＡとＢａｎＩメチ・ラーゼ
を暗号化しているＤＮＡを保有しており、これを用いて
塩基配列を決定できる。ＤＮＡ塩基配列を決めるため本
プラスミドより上記２つの酵素を暗号化していると思わ
れる領域のＤＮＡ断片を塩基配列決定に適したベクター
、例えばｐＵｃ１８． Ｍ１３ｍｐｌＢに移し、Ｍ１３
−ジオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｐｒｏ、Ｎａ ｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ 、 ７４．５４６３−５４
６７ （１９７７）より決定した。即ちｐＵｃ１８．
Ｍ１３ｍｐｌＢに組み換えプラスミドに変えた後、種々
制限酵素による制限酵素サイトの決定、及びサブクロー
ニング、マングビーンヌクレアーゼ、エキソヌクレアー
ゼ■を用いるデレージョン法により、種々デレーション
ミュータントを作成しＢａｎ ｒ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子、Ｂａｎ Ｉメチラーゼ遺伝子の領域を決定し
た。さらに、デレージョン ミュータントの挿入ＤＮＡ
断片の塩基配列を決定した。また、制限酵素活性、メチ
ラーゼ活性のうち前者の活性のみが発現するデレージョ
ン ミュータントでは菌が死滅するため、塩基配列を決
めるべき領域のＤＮＡが取れないため塩基配列が決めら
れないことがある。そのような場合、カスタムプライマ
ー法等を活用して決定した。その結果、前記式■で表わ
されるＢａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼをコードする
ＤＮＡ配列及び弐■で表わされるＢａｎ Ｉメチラーゼ
をコードするＤＮＡ配列を決定した。
塩基配列から決定したＮ末端のアミノ酸配列は精製Ｂａ
ｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ、Ｂａｎ ［メチラーゼ
標品から得たＮ末端のアミノ酸配列と一致した。ここで
塩基配列を決定したＤＮＡ配列を利用して各々の遺伝子
を採取することが可能となると同時に遺伝子操作の手法
を利用してＢａｎ １制限エンドヌクレアーゼ、Ｂａｎ
Ｉメチラーゼの生産系を構築することができる。遺伝
子操作の手法を用いて物質生産を行うには大腸菌、酵母
または動物細胞を用いた系のいずれを使用してもよい。
ｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ、Ｂａｎ ［メチラーゼ
標品から得たＮ末端のアミノ酸配列と一致した。ここで
塩基配列を決定したＤＮＡ配列を利用して各々の遺伝子
を採取することが可能となると同時に遺伝子操作の手法
を利用してＢａｎ １制限エンドヌクレアーゼ、Ｂａｎ
Ｉメチラーゼの生産系を構築することができる。遺伝
子操作の手法を用いて物質生産を行うには大腸菌、酵母
または動物細胞を用いた系のいずれを使用してもよい。
（日本生化学会場“遺伝子研究法Ｉｆ ”ｐｐ１２６−
１５０．ａｐ１７０−２０４（１９８６）） 、例えば
大腸菌を宿主としてＢａｎ １制限エンドヌクレアーゼ
を生産するには前記のＤＮＡ配列に発現のため制御部位
、例えばトリプトファンオペロンのプロモーターとＳＤ
配列を付加したＤＮＡ配列をＢａｎ Ｉメチラーゼ遺伝
子を付加したｐＢＲ３２２などのベクターＤＮＡに連結
し、大腸菌に導入すればよい。
１５０．ａｐ１７０−２０４（１９８６）） 、例えば
大腸菌を宿主としてＢａｎ １制限エンドヌクレアーゼ
を生産するには前記のＤＮＡ配列に発現のため制御部位
、例えばトリプトファンオペロンのプロモーターとＳＤ
配列を付加したＤＮＡ配列をＢａｎ Ｉメチラーゼ遺伝
子を付加したｐＢＲ３２２などのベクターＤＮＡに連結
し、大腸菌に導入すればよい。
酵母を宿主とする場合、発現の制御部位としては、抑制
性酸性フォスファターゼ遺伝子やグリセロアルデヒド３
−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどが
知られており、酵母内での複製オリジンとしては２μｍ
プラスミド由来、酵母染色体由来のものを用いるとよい
。動物細胞を宿主とする場合、発現制御部位としたＳＶ
４０プロモーターやＩＩＢウィルス遺伝子のプロモータ
ーなどがしられており、複製開始としてはＳＶ４０やポ
リオーマウィルスのものを用いるとよい。また、Ｒａｎ
１制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡのみを
使用する場合には宿主が増殖できない場合があるから本
発明のＲａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードする
ＤＮＡと、Ｂａｎ ＩメチラーゼをコードするＤＮＡと
併用して上記のような発現系を構築すれば、Ｂａｎ Ｉ
制限エンドヌクレアーゼを大量に生産することができる
。Ｂａｎ Ｉメチラーゼのみを生産したい時は上記発現
系にＢａｎ ■メチラーゼ遺伝子のみ利用すれば本酵素
のみを大量に生産できる。
性酸性フォスファターゼ遺伝子やグリセロアルデヒド３
−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどが
知られており、酵母内での複製オリジンとしては２μｍ
プラスミド由来、酵母染色体由来のものを用いるとよい
。動物細胞を宿主とする場合、発現制御部位としたＳＶ
４０プロモーターやＩＩＢウィルス遺伝子のプロモータ
ーなどがしられており、複製開始としてはＳＶ４０やポ
リオーマウィルスのものを用いるとよい。また、Ｒａｎ
１制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡのみを
使用する場合には宿主が増殖できない場合があるから本
発明のＲａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードする
ＤＮＡと、Ｂａｎ ＩメチラーゼをコードするＤＮＡと
併用して上記のような発現系を構築すれば、Ｂａｎ Ｉ
制限エンドヌクレアーゼを大量に生産することができる
。Ｂａｎ Ｉメチラーゼのみを生産したい時は上記発現
系にＢａｎ ■メチラーゼ遺伝子のみ利用すれば本酵素
のみを大量に生産できる。
以下実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例１
（１） ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を
もつ染色体ＤＮＡの調製 バチルス アノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａ
ｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７をＬ
−ｂｒｏｔｈ培地（純水１２当りトリプトン（Ｄｉｒｃ
ｏ）１０ｇ、酵母エキス５ｇ、 ＮａＣｌ Ｌｏｇをｐ
Ｈ７，０に調製したもの） ５０ｍ１に接種し、３０°
Ｃで振とう培養をおこない、１４時間後菌体を集めた。
もつ染色体ＤＮＡの調製 バチルス アノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａ
ｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ） ＩＡＭ１０７７をＬ
−ｂｒｏｔｈ培地（純水１２当りトリプトン（Ｄｉｒｃ
ｏ）１０ｇ、酵母エキス５ｇ、 ＮａＣｌ Ｌｏｇをｐ
Ｈ７，０に調製したもの） ５０ｍ１に接種し、３０°
Ｃで振とう培養をおこない、１４時間後菌体を集めた。
次に集めた菌体をｌＯ■／−のリゾチーム（太陽化学■
製）、２０％ショ糖、ｌ ｍＭ ＥＤＴ＾を含む５０ｍ
Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐ）（７，６）２０ｍＱに懸濁
し、３７°Ｃで１０分間静置した。次に１％ラウロイル
サルコシン酸を含む０．１ Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ９
，６）４４ｄ及び５．４４■／ｄのプロナーゼ溶液２．
Ｏｄを加え、５００°Ｃで３０分間静置した。次に塩
化セシウム６６ｇ。
製）、２０％ショ糖、ｌ ｍＭ ＥＤＴ＾を含む５０ｍ
Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐ）（７，６）２０ｍＱに懸濁
し、３７°Ｃで１０分間静置した。次に１％ラウロイル
サルコシン酸を含む０．１ Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ９
，６）４４ｄ及び５．４４■／ｄのプロナーゼ溶液２．
Ｏｄを加え、５００°Ｃで３０分間静置した。次に塩
化セシウム６６ｇ。
ｌＯ■／成のエチジウムブロマイド溶液３．３ ｄを加
え、混合した後に３８．ＯＯＯｒｐｍ 、４０時間の遠
心分離をおこなった。ＤＮＡを注射器で抜取り、ｎ−ブ
タノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、
１ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＩＯＩＩＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，Ｏ）に透析することにより約５００μｇの
染色体ＤＮＡを取得した。
え、混合した後に３８．ＯＯＯｒｐｍ 、４０時間の遠
心分離をおこなった。ＤＮＡを注射器で抜取り、ｎ−ブ
タノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、
１ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＩＯＩＩＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，Ｏ）に透析することにより約５００μｇの
染色体ＤＮＡを取得した。
（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
られた染色体ＤＮＡ３μｇについて０．０２ユニツトの
５Ａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼを加え、３７°Ｃ
１１時間の反応を行うことにより、これを部分分解した
。次にベクタープラスミドｐＢＲ３２２（東洋紡績型）
１μｇについて４ユニツトのＢａｍＨＩ 制限酵素を加
え、３７°Ｃ１１時間の反応を行うことによりこれを完
全分解し、更にｌユニットのアルカリフォスファターゼ
を加え、３７°Ｃ１１時間の反応を行うことにより、５
′末端のリン酸を除去した。
られた染色体ＤＮＡ３μｇについて０．０２ユニツトの
５Ａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼを加え、３７°Ｃ
１１時間の反応を行うことにより、これを部分分解した
。次にベクタープラスミドｐＢＲ３２２（東洋紡績型）
１μｇについて４ユニツトのＢａｍＨＩ 制限酵素を加
え、３７°Ｃ１１時間の反応を行うことによりこれを完
全分解し、更にｌユニットのアルカリフォスファターゼ
を加え、３７°Ｃ１１時間の反応を行うことにより、５
′末端のリン酸を除去した。
以上の方法により得られた３μｇの染色体ＤＮＡ断片と
１μｇのｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片を混合し、更に１ｍ
ＭＡＴＰ及び５ＩＩＩＭジチオスライトールの存在下に
５ユニツトのＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを用い
て１５°Ｃ１１６時間の連結反応を行うことにより染色
体ＤＮＡを組込んだプラスミドＤＮＡを取得した。
１μｇのｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片を混合し、更に１ｍ
ＭＡＴＰ及び５ＩＩＩＭジチオスライトールの存在下に
５ユニツトのＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを用い
て１５°Ｃ１１６時間の連結反応を行うことにより染色
体ＤＮＡを組込んだプラスミドＤＮＡを取得した。
（３） ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
む組換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリに一１２株とエシリヒア・３９８株
のハイブリッド株であるエシェリヒア・３９８８１０１
株をＬＢ培地（純水１１当りトリプトン（Ｄｉｒｃｏ）
１０ｇ、酵母エキス５ｇ、 ＮａＣ１１０ｇ＠ｐＨ７
，０に調製したもの）ｌＯＩｄに接種し、３７°Ｃで振
とう培養を行い、対数増殖期まで生育させた後に集菌し
た。これを水冷下、最終濃度で０．０３Ｍ ＣａＣ１ｚ
の溶液に懸濁させてコンピテントな細胞とした。この細
胞懸濁液に（２）で得たプラスミドＤＮＡの溶解液を加
えて、水冷下で６０分反応させ、４２°Ｃ，１−２分間
ヒートショックをあたえて、前記プラスミドＤＮＡを細
胞内にとり込ませた０次いでこの細胞懸濁液を別途前記
ＬＢ培地に接種し、３７’Ｃ，３５時間振とう培養して
且つＢａｎ ［制限エンドヌクレアーゼを生産する株を
分離し、ニジエリチア・コリ）ＩＢＩＯＩ （ｐＢａｎ
ｌＲＭ８） （ＦＥＲＭ Ｐ−９４２４）を得た。この
形質転換微生物に含まれるプラスミドｐＢａｎｌＲＭ８
の制限酵素地図を第１図に示す。またｐＢａｎＩＲＭ８
をサブクローニングしてＢａｎ Ｉメチラーゼを生産す
る株を分離しエシェリヒア・コリ （ｐＢａｎＩＭ ４
）（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７４１）を得た。
む組換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリに一１２株とエシリヒア・３９８株
のハイブリッド株であるエシェリヒア・３９８８１０１
株をＬＢ培地（純水１１当りトリプトン（Ｄｉｒｃｏ）
１０ｇ、酵母エキス５ｇ、 ＮａＣ１１０ｇ＠ｐＨ７
，０に調製したもの）ｌＯＩｄに接種し、３７°Ｃで振
とう培養を行い、対数増殖期まで生育させた後に集菌し
た。これを水冷下、最終濃度で０．０３Ｍ ＣａＣ１ｚ
の溶液に懸濁させてコンピテントな細胞とした。この細
胞懸濁液に（２）で得たプラスミドＤＮＡの溶解液を加
えて、水冷下で６０分反応させ、４２°Ｃ，１−２分間
ヒートショックをあたえて、前記プラスミドＤＮＡを細
胞内にとり込ませた０次いでこの細胞懸濁液を別途前記
ＬＢ培地に接種し、３７’Ｃ，３５時間振とう培養して
且つＢａｎ ［制限エンドヌクレアーゼを生産する株を
分離し、ニジエリチア・コリ）ＩＢＩＯＩ （ｐＢａｎ
ｌＲＭ８） （ＦＥＲＭ Ｐ−９４２４）を得た。この
形質転換微生物に含まれるプラスミドｐＢａｎｌＲＭ８
の制限酵素地図を第１図に示す。またｐＢａｎＩＲＭ８
をサブクローニングしてＢａｎ Ｉメチラーゼを生産す
る株を分離しエシェリヒア・コリ （ｐＢａｎＩＭ ４
）（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７４１）を得た。
（４） ：Ｌ’ｙエリヒア・コリＨＢＩＯＩ （ｐＢ
ａｎｌｌｌＭ ８ ）によるＢａｎ ｌ制限エンドヌク
レアーゼの生産（３）で得られた形質転換株エシェリヒ
ア・１１月ｌＢ１０１ （ｐＢａｎｌＲＭ８） （ＦＥ
ＲＭ Ｐ−９４２４）を前記ＬＢ培地２００Ｌ発酵タン
クで３７°Ｃ，１６時間通気攪拌培養を行った。これを
遠心分離して集菌、培養菌体３８５ｇをえた。得られた
菌体１００ｇよりＢａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼを
精製した。菌体１００ｇをＢｕｆｆｅｒＡ（１０ｍＭ
Ｍｇｃｈ、 ７ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含ん
だ２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７，５）５００成に
懸濁した。この懸濁液を超音波破砕器ソニファイアにて
１０分間破砕後、上澄液を調製した。上澄液を０゜２Ｍ
ＮａＣ１存在下でポリエチレンイミンを０．２％になる
ように添加し、８０００ｒｐｍ 、２０分間遠心分離を
行い上澄液を得た。この上澄液に硫安を７０％飽和加え
、硫安沈澱後洗澱物を集め、１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、７
ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭのトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し透析を行った。透析
後、フォスフォセルロース力ラム（体積２００ｄ）クロ
マトグラフィを行った。Ｒａｎ ｌ制限エンドヌクレア
ーゼはＫＣＩ濃度０．５Ｍ付近で溶出された。溶出され
た酵素液を透析チューブに入れ透析した。透析液を更に
ヒドロキシアパタイトカラム（８０Ｉｎ１）クロマトグ
ラフィを行った。リン酸濃度０．３ＭにてＢａｎ Ｉ画
分が溶出された。更にこの画分を透析後ＤＥＡＥ−セフ
ァロース（４０ｄ）クロマトグラフィを行うとＲａｎ
Ｉは洗浄画分に溶出することが認められた。この両分を
濃縮後セファクリルＳ−２００ゲル濾過を実施した。ゲ
ル濾過Ｂａｎ Ｉ画分を透析チューブに入れ、２ａ＋Ｍ
メルカプトエタノール、５０％グリセロールを含ん
だリン酸緩衝液に透析することにより２．８ Ｉｎ１の
酵素液が得られた。
ａｎｌｌｌＭ ８ ）によるＢａｎ ｌ制限エンドヌク
レアーゼの生産（３）で得られた形質転換株エシェリヒ
ア・１１月ｌＢ１０１ （ｐＢａｎｌＲＭ８） （ＦＥ
ＲＭ Ｐ−９４２４）を前記ＬＢ培地２００Ｌ発酵タン
クで３７°Ｃ，１６時間通気攪拌培養を行った。これを
遠心分離して集菌、培養菌体３８５ｇをえた。得られた
菌体１００ｇよりＢａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼを
精製した。菌体１００ｇをＢｕｆｆｅｒＡ（１０ｍＭ
Ｍｇｃｈ、 ７ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含ん
だ２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７，５）５００成に
懸濁した。この懸濁液を超音波破砕器ソニファイアにて
１０分間破砕後、上澄液を調製した。上澄液を０゜２Ｍ
ＮａＣ１存在下でポリエチレンイミンを０．２％になる
ように添加し、８０００ｒｐｍ 、２０分間遠心分離を
行い上澄液を得た。この上澄液に硫安を７０％飽和加え
、硫安沈澱後洗澱物を集め、１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、７
ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭのトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し透析を行った。透析
後、フォスフォセルロース力ラム（体積２００ｄ）クロ
マトグラフィを行った。Ｒａｎ ｌ制限エンドヌクレア
ーゼはＫＣＩ濃度０．５Ｍ付近で溶出された。溶出され
た酵素液を透析チューブに入れ透析した。透析液を更に
ヒドロキシアパタイトカラム（８０Ｉｎ１）クロマトグ
ラフィを行った。リン酸濃度０．３ＭにてＢａｎ Ｉ画
分が溶出された。更にこの画分を透析後ＤＥＡＥ−セフ
ァロース（４０ｄ）クロマトグラフィを行うとＲａｎ
Ｉは洗浄画分に溶出することが認められた。この両分を
濃縮後セファクリルＳ−２００ゲル濾過を実施した。ゲ
ル濾過Ｂａｎ Ｉ画分を透析チューブに入れ、２ａ＋Ｍ
メルカプトエタノール、５０％グリセロールを含ん
だリン酸緩衝液に透析することにより２．８ Ｉｎ１の
酵素液が得られた。
この精製Ｂａｎ Ｉ酵素を５ＤＳ−ＰＡＧＥ法にて蛋白
純度を調べると単一の１３ａｎ Ｉ蛋白であることがわ
かった。またセファクリル５−２００の溶出位置により
Ｂａｎ Ｉの分子量は約７２．０００（ＳＯ５−ＰＡＧ
Ｅよりサブユニット分子１３６，０００のダイマー）と
推定された（第２図）。本酵素標品についてアミノ酸シ
ーケンサ−にてＮ末端アミノ酸配列を決めるとＡｌａＧ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ｉ １ｅ−Ａｓｐ−Ｇ ｌｕ−ＬｅｕＧｌｕであ
ることが判明した。
純度を調べると単一の１３ａｎ Ｉ蛋白であることがわ
かった。またセファクリル５−２００の溶出位置により
Ｂａｎ Ｉの分子量は約７２．０００（ＳＯ５−ＰＡＧ
Ｅよりサブユニット分子１３６，０００のダイマー）と
推定された（第２図）。本酵素標品についてアミノ酸シ
ーケンサ−にてＮ末端アミノ酸配列を決めるとＡｌａＧ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ｉ １ｅ−Ａｓｐ−Ｇ ｌｕ−ＬｅｕＧｌｕであ
ることが判明した。
（５） ＢａｎＩメチラーゼ遺伝子を含む組換えプラ
スミドによる形質転換 Ｂａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡを含む組換
えプラスミドｐＢａｎｌＲＭ ８よりメチラーゼ遺伝子
のみを含むＢａｎ ＩＩＩ −５ｐｈ Ｉ断片をｐＵｃ
１８のＡｃｃｆ−ｓｐｈ Ｉサイトに挿入しｐＢａｎｌ
Ｍ ４を調製した（第３図）。次いでｐＢａｎｌＭ ４
を用いて常法によりＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩを形質転換
した。
スミドによる形質転換 Ｂａｎ ｌ制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡを含む組換
えプラスミドｐＢａｎｌＲＭ ８よりメチラーゼ遺伝子
のみを含むＢａｎ ＩＩＩ −５ｐｈ Ｉ断片をｐＵｃ
１８のＡｃｃｆ−ｓｐｈ Ｉサイトに挿入しｐＢａｎｌ
Ｍ ４を調製した（第３図）。次いでｐＢａｎｌＭ ４
を用いて常法によりＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩを形質転換
した。
（６）エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ （ｐＢａｎ Ｉ
Ｍ ４ ）によるＲａｎ Ｉメチラーゼの生産 Ｂａｎ ＩメチラーゼをコードするＤＮＡをもつｐＢａ
ｎｌＭ４を保有するＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ （ｐＢ
ａｎｌＭ４）（ＦＩＥＲＭ Ｐ−１０７４１）をＬ−ｂ
ｒｏｔｈ培地で０．５２フラスコを用いて培養し、菌体
を集めた。菌体をＢｕｆｆｅｒＡ ５０ｍ１に懸濁後超
音波破砕（３Ａ、１０分）した。３５，０００ｒｐｍ
、３０分遠心して上澄液を得た。この上澄液をフォスフ
ォセルロース力ラム（４０ｄ） クロマトグラフィを実
施した。Ｂａｎ Ｉメチラーゼはカラムを通過するので
これを集め、ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィを行った
。Ｂａｎ ＩメチラーゼはＫＣＩ ０．３Ｍで溶°出さ
れる。この両分を再びフォスフォセルロース力ラム（２
０ｄ）クロマトを実施した。Ｂａｎ １メチラーゼは０
．４５Ｍ ＫＣＩで溶出された。この両分を濃縮し、セ
ファクリルＳ−２００ゲル濾過（２ｃｍｘ３７ｃｍ）を
おこなった。Ｂａｎ Ｉメチラーゼ画分を透析し更にヘ
パリン（１０ｄ）カラムクロマトグラフィを行った。溶
出画分をポリエチレングリコール濃縮後、５０％グリセ
ロール溶液で透析した。全活性４キロユニツトのＢａｎ
Ｉメチラーゼを得た。
Ｍ ４ ）によるＲａｎ Ｉメチラーゼの生産 Ｂａｎ ＩメチラーゼをコードするＤＮＡをもつｐＢａ
ｎｌＭ４を保有するＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ （ｐＢ
ａｎｌＭ４）（ＦＩＥＲＭ Ｐ−１０７４１）をＬ−ｂ
ｒｏｔｈ培地で０．５２フラスコを用いて培養し、菌体
を集めた。菌体をＢｕｆｆｅｒＡ ５０ｍ１に懸濁後超
音波破砕（３Ａ、１０分）した。３５，０００ｒｐｍ
、３０分遠心して上澄液を得た。この上澄液をフォスフ
ォセルロース力ラム（４０ｄ） クロマトグラフィを実
施した。Ｂａｎ Ｉメチラーゼはカラムを通過するので
これを集め、ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィを行った
。Ｂａｎ ＩメチラーゼはＫＣＩ ０．３Ｍで溶°出さ
れる。この両分を再びフォスフォセルロース力ラム（２
０ｄ）クロマトを実施した。Ｂａｎ １メチラーゼは０
．４５Ｍ ＫＣＩで溶出された。この両分を濃縮し、セ
ファクリルＳ−２００ゲル濾過（２ｃｍｘ３７ｃｍ）を
おこなった。Ｂａｎ Ｉメチラーゼ画分を透析し更にヘ
パリン（１０ｄ）カラムクロマトグラフィを行った。溶
出画分をポリエチレングリコール濃縮後、５０％グリセ
ロール溶液で透析した。全活性４キロユニツトのＢａｎ
Ｉメチラーゼを得た。
本標品を５Ｏ３−ＰＡＧＥ後銀染後注染色法白純度を調
べると単一のバンド（第８図）を示した。またこの場合
、分子量は約４４，０００であった。ゲル濾過法では約
４５，０００であった（第４図）。本酵素はモノマー酵
素であると推定された。
べると単一のバンド（第８図）を示した。またこの場合
、分子量は約４４，０００であった。ゲル濾過法では約
４５，０００であった（第４図）。本酵素はモノマー酵
素であると推定された。
（７） Ｂａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ、Ｂａｎ
ＩメチラーゼをコードするＤＮＡの単離及び塩基配列
の決定 （３）で得られたＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを
生産する株エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ （ｐＢａｎ
ｌＲＭ ８ ）（ＦＥＲＭ Ｐ−９４２４）を培養し常
法により組み換えプラスミド（ｐＢａｎｌＲＭ ８ ）
を調製した。調製したｐＢａｎｌｌｌＭＢを制限酵素旧
ｎｄｌＩ［、５ｐｈＩで切断し、Ｂａｎ １制限エンド
ヌクレアーゼ、Ｂａｎ ＩメチラーゼをコートするＤＮ
Ａ断片（６，２ｋｂ）を切り出しクレノーフラグメン［
・に平滑末端化した後、これをｐＵｃｌＢの旧ｎｃｌＩ
サイトに挿入しρＢａｎｌＲＭ６．２を作成した（第５
図）。このｐｔｌｃ １８に挿入されたｐＢａｎｌＲＭ
８由来のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す（第６図）
。
ＩメチラーゼをコードするＤＮＡの単離及び塩基配列
の決定 （３）で得られたＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを
生産する株エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ （ｐＢａｎ
ｌＲＭ ８ ）（ＦＥＲＭ Ｐ−９４２４）を培養し常
法により組み換えプラスミド（ｐＢａｎｌＲＭ ８ ）
を調製した。調製したｐＢａｎｌｌｌＭＢを制限酵素旧
ｎｄｌＩ［、５ｐｈＩで切断し、Ｂａｎ １制限エンド
ヌクレアーゼ、Ｂａｎ ＩメチラーゼをコートするＤＮ
Ａ断片（６，２ｋｂ）を切り出しクレノーフラグメン［
・に平滑末端化した後、これをｐＵｃｌＢの旧ｎｃｌＩ
サイトに挿入しρＢａｎｌＲＭ６．２を作成した（第５
図）。このｐｔｌｃ １８に挿入されたｐＢａｎｌＲＭ
８由来のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す（第６図）
。
また、この挿入断片におけるＢａｎ Ｉ制限エンドヌク
レアーゼ及びＢａｎ Ｉメチラーゼのコーディング領域
を第７図に示す。図中、ＢａｎＩＲはＢａｎ Ｉ制限エ
ンドヌクレアーゼのコーディング領域を表わし、Ｂａｎ
ＩＭはＢａｎ Ｉメチラーゼのコーディング領域を表わ
す。なお、Ｃｍｐ １〜４は塩基配列を決定するのに使
用したカスタムメイトプライマーを示す。
レアーゼ及びＢａｎ Ｉメチラーゼのコーディング領域
を第７図に示す。図中、ＢａｎＩＲはＢａｎ Ｉ制限エ
ンドヌクレアーゼのコーディング領域を表わし、Ｂａｎ
ＩＭはＢａｎ Ｉメチラーゼのコーディング領域を表わ
す。なお、Ｃｍｐ １〜４は塩基配列を決定するのに使
用したカスタムメイトプライマーを示す。
次にｐＢａｎｌＲＭ６．２を制限酵素； ＢａｍＨＩ、
Ｋｐｎｌで切断しＢａｍＨＩ−にｐｎｌ Ｄ Ｎ Ａ
断片を調製した。このＤＮＡ断片をエキソヌクレアーゼ
■、マングビーンヌクレアーゼでＢａｎ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子側より漸次的欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏ
ｎ）を行い、得られた漸次的デレーシコン ミュタント
を作成し、ジオキシ法にてシーケンス決定を行った。こ
れによりＤＮＡの１．方の鎖の塩基配列が決定された。
Ｋｐｎｌで切断しＢａｍＨＩ−にｐｎｌ Ｄ Ｎ Ａ
断片を調製した。このＤＮＡ断片をエキソヌクレアーゼ
■、マングビーンヌクレアーゼでＢａｎ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子側より漸次的欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏ
ｎ）を行い、得られた漸次的デレーシコン ミュタント
を作成し、ジオキシ法にてシーケンス決定を行った。こ
れによりＤＮＡの１．方の鎖の塩基配列が決定された。
他方の鎖については、上述のとおり決定した塩基配列に
相補的なヌクレオチド（１７ｍａｒ）を合成しこれらを
プライマーとしジオキシ方にて塩基配列の決定を行った
。その結果、前記式■及び■に示されるＢａｎ Ｉ制限
エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ及びＢａｎ Ｉ
メチラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定した。
相補的なヌクレオチド（１７ｍａｒ）を合成しこれらを
プライマーとしジオキシ方にて塩基配列の決定を行った
。その結果、前記式■及び■に示されるＢａｎ Ｉ制限
エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ及びＢａｎ Ｉ
メチラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定した。
また、この■及び■の塩基配列に対応する式Ｉ及び式■
のアミノ酸配列は、Ｎ末端において前記（４）及び（６
）の項に示したＢａｎ １制限エンドヌクレアーゼ及び
Ｂａｎ ＩメチラーゼのＮ末端のアミノ酸配列とそれぞ
れ一致した。
のアミノ酸配列は、Ｎ末端において前記（４）及び（６
）の項に示したＢａｎ １制限エンドヌクレアーゼ及び
Ｂａｎ ＩメチラーゼのＮ末端のアミノ酸配列とそれぞ
れ一致した。
〔発明の効果）
本発明により、Ｒａｎ １制限エンドヌクレアーゼをコ
ードするＤＮＡ及びＢａｎ Ｉメチラーゼをコードする
ＤＮＡを提供することができた。これにより夾雑酵素を
含有しない純粋なりａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ標
品を遺伝子操作技術を用いることにより効率的かつ大量
に生産することが可能となる。また、本発明により提供
されるＢａｎ ［メチラーゼ自体も遺伝子操作技術にお
いて試薬等として極めて重要なものであり、遺伝子操作
技術の発展に大いに寄与するものである。
ードするＤＮＡ及びＢａｎ Ｉメチラーゼをコードする
ＤＮＡを提供することができた。これにより夾雑酵素を
含有しない純粋なりａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ標
品を遺伝子操作技術を用いることにより効率的かつ大量
に生産することが可能となる。また、本発明により提供
されるＢａｎ ［メチラーゼ自体も遺伝子操作技術にお
いて試薬等として極めて重要なものであり、遺伝子操作
技術の発展に大いに寄与するものである。
第１図はｐＢａｎｌＲＭ ８のプラスミドの制限酵素地
図、第２図はｐＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼの分
子量の測定結果を示す図、第３図はｐｌａｎ ＩＲＭ
８よりｐＢａｎｌＭ ４への構築図、第４図はＲａｎ
Ｉノチラーゼ分子量、の測定結果を示す図、第５図はｐ
ＢａｎｌＲＭ６．２の構築図、第６図はｐＢａｎｌＲＭ
６．２の作成に際し、ｐＵｃｌＢに挿入されたｐＢａｎ
ｌＲＭ ８由来のＤＮＡ断片の制限酵素地図を、第７図
はｐＵｃｌＢに挿入されたｐＢａｎｌＲＭ ８由来のＤ
ＮＡ断片におけるＢａｎ １制限エンドヌクレアーゼ及
びＢａｎ Ｉメチラーゼのコーディング領域、並びにこ
れら酵素のＤＮＡ塩基配列決定のストラキジーを示す図
である。 第８図は本発明により得られたＢａｎ Ｉメチラーゼの
電気泳動パターンを表わす写真である。
図、第２図はｐＢａｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼの分
子量の測定結果を示す図、第３図はｐｌａｎ ＩＲＭ
８よりｐＢａｎｌＭ ４への構築図、第４図はＲａｎ
Ｉノチラーゼ分子量、の測定結果を示す図、第５図はｐ
ＢａｎｌＲＭ６．２の構築図、第６図はｐＢａｎｌＲＭ
６．２の作成に際し、ｐＵｃｌＢに挿入されたｐＢａｎ
ｌＲＭ ８由来のＤＮＡ断片の制限酵素地図を、第７図
はｐＵｃｌＢに挿入されたｐＢａｎｌＲＭ ８由来のＤ
ＮＡ断片におけるＢａｎ １制限エンドヌクレアーゼ及
びＢａｎ Ｉメチラーゼのコーディング領域、並びにこ
れら酵素のＤＮＡ塩基配列決定のストラキジーを示す図
である。 第８図は本発明により得られたＢａｎ Ｉメチラーゼの
電気泳動パターンを表わす写真である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、バチルスアノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＢａｎＩ制限
エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ断片。 ２、次の式 I で表わされるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有する請求項１記載のＤＮＡ断片。 式 I
１０ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａ
ｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ
２０ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｒｐ
３０ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
４０ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｌ
ｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
５０ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ
６０ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐ
ｈｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
７０ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌ
ｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
８０ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ
９０ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐ
ｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ
１００ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
１１０ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
１２０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ
１３０ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
１４０ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
１５０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
１６０ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
１７０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｍ
ｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ
１８０ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
１９０ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇ
ｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
２００ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ｌｌｅ
２１０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ ｌｌｅ Ｐｈｅ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ
２２０ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａ
ｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
２３０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖ
ａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ
２４０ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
２５０ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｈ
ｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
２６０ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
２７０ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
２８０ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｉ
ｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
２９０ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ
３００ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａ
ｒｇ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ
３１０ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔ
ｙｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｙｒ
３２０ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ
３３０ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉ
ｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ
３４０ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
３５０ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ ３、次の式IIで表わされる塩基配列を有する請求項２記
載のＤＮＡ断片。 式II １０ ２０
３０ ＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣ
ＴＴＡＡＡＴＡＣＡＡ ＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴ ＧＡ
ＴＧＡＡＴ ４０ ＴＧＧ ５０ ６０
７０ ＡＡＡＧＡＡＡＣＧＣ
ＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧ ＴＧＧＣＣＧＧＡＴＴ ＴＴ
ＣＴＡＧＣ ８０ ＴＡＡ ９０ １００
１１０ ＡＡＡＧＧＡＧＴＣＧ
ＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡ ＴＴＡＴＴＣＣＴＡＡ ＡＣ
ＴＧＧＴＣ１２０ ＧＡＡ １３０ １４０
１５０ ＴＣＧＣＡＡＧＡＴＧ
ＣＴＴＴＴＡＴＡＴＣ ＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴ ＣＴ
ＣＡＣＴＡ１６０ ＡＧＡ １７０ １８０
１９０ ＡＣＡＡＣＣＣＴＴＴ
ＣＧＡＣＡＴＴＴＴＣ ＣＡＡＣＴＡＡＴＡＧ ＡＣ
ＧＣＡＴＣ２００ ＴＡＡ ２１０ ２２０
２３０ ＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣ
ＡＡＴＣＴＧＴＴＴＣ ＴＡＡＡＧＣＡＴＣＴ ＴＧ
ＴＴＧＴＡ２４０ ＴＴＡ ２５０ ２６０
２７０ ＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧ
ＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣ ＡＣＴＡＡＡＴＣＧＣ ＴＴ
ＧＡＡＴＣ２８０ ＡＡＡ ２９０ ３００
３１０ ＡＣＴＴＴＧＡＴＴＣ
ＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣ ＡＴＧＡＴＴＣＣＣＴ ＡＴ
ＧＧＡＡＴ３２０ ＣＣＡ ３３０ ３４０
３５０ ＴＴＡＣＡＴＡＡＣＡ
ＡＡＡＧＴＧＴＴＡＧ ＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡ ＡＴ
ＴＴＴＴＴ３６０ ＴＧＧ ３７０ ３８０
３９０ ＡＡＴＧＡＧＡＡＡＡ
ＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡ ＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡ ＧＡ
ＡＣＴＴＣ４００ ＣＧＧ ４１０ ４２０
４３０ ＴＴＡＣＡＴＣＡＴＴ
ＡＡＣＴＡＡＴＴＣＡ ＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡ ＴＴ
ＧＡＣＧＧ４４０ ＡＣＣ ４５０ ４６０
４７０ ＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴ
ＡＡＧＡＣＡＧＴＣＣ ＣＡＣＴＴＴＣＴＧＡ ＴＴ
ＴＡＴＡＴ４８０ ＡＡＡ ４９０ ５００
５１０ ＧＡＴＧＴＡＡＴＴＧ
ＴＡＴＴＡＣＴＣＡＴ ＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴ ＡＡ
ＴＧＣＴＧ５２０ ＴＴＡ ５３０ ５４０
５５０ ＡＴＴＣＧＧＡＡＧＴ
ＡＴＣＣＧＡＡＧＴＴ ＴＴＧＡＴＧＡＡＡＴ ＧＴ
ＧＡＡＧＴ５６０ ＴＧＧ ５７０ ５８０
５９０ ＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴ
ＧＧＴＡＡＧＡＣＴＧ ＡＣＧＡＧＴＴＧＡＡ ＧＡ
ＡＧＴＴＴ６００ ＡＴＴ ６１０ ６２０
６３０ ＡＡＧＧＡＧＣＧＴＴ
ＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴ ＡＡＧＣＡＧＡＡＴＡ ＡＣ
ＡＧＧＡＧ６４０ ＧＧＧ ６５０ ６６０
６７０ ＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡ
ＴＡＣＧＴＴＡＧＧＴ ＣＡＡＧＴＣＧＣＴＣ ＡＡ
ＡＣＣＣＡ６８０ ＴＧＴ ６９０ ７００
７１０ ＡＡＴＡＧＡＴＴＴＴ
ＣＴＡＡＧＡＡＣＴＣ ＧＡＴＴＣＧＧＧＴＣ ＴＡ
ＡＧＧＧＴ７２０ ＣＡＣ ７３０ ７４０
７５０ ＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡ
ＧＴＡＡＴＧＧＡＣＡ ＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴ ＧＴ
ＧＡＣＣＣ７６０ ＡＴＡ ７７０ ７８０
７９０ ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＡ
ＡＡＣＡＣＴＡＡＣＣ ＡＣＴＴＴＴＧＡＴＧ ＴＡ
ＧＴＣＡＴ８００ ＡＡＡ ８１０ ８２０
８３０ ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣ
ＡＡＡＡＧＣＧＴＴＧ ＣＧＡＴＴＧＡＧＡＴ ＴＡ
ＧＣＴＴＣ８４０ ＣＡＧ ８５０ ８６０
８７０ ＧＴＡＡＣＴＡＣＡＡ
ＡＴＡＧＴＡＣＣＡＴ ＣＧＡＧＣＧＴＡＡＡ ＧＣ
ＴＧＧＡＣ８８０ ＡＡＧ ８９０ ９００
９１０ ＣＴＡＡＡＧＣＡＣＧ
ＡＴＡＣＧＡＴＡＴＧ ＧＴＴＡＧＴＧＡＴＡ ＣＴ
ＧＧＣＡＡ９２０ ＴＴＡ ９３０ ９４０
９５０ ＴＡＴＡＧＣＴＴＡＴ
ＡＴＴＡＴＣＧＡＴＧ ＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡ ＣＴ
ＴＣＣＡＡ９６０ ＣＧＴ ９７０ ９８０
９９０ １ＡＡＡＡＡＴＧＣＡＡ
ＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴ ＴＴＧＴＡＡＴＡＡＴ ＡＧ
ＣＣＡＴＴ０００ ＧＣＡ １０１０ １０２０
１０３０ １ＣＡＧＴＡＧＣＴＴＡ
ＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡ ＧＡＡＣＴＡＡＡＴＧ ＴＣ
ＴＴＧＣＴ０４０ ＡＡＡ １０５０ １０６０ ＡＴＴＣＡＴＣＴＴＡ ＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧ ＡＡ ４、バチルスアノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＢａｎＩメチ
ラーゼをコードするＤＮＡ断片。 ５、次の式IIIで表わされるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有する請求項４記載のＤＮＡ断片。 式III
１０ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａ
ｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ
２０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
３０ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
４０ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ
５０ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａ
ｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ
６０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ
７０ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐ
ｈｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
８０ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
９０ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ
１００ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
１１０ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａ
ｒｇ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ
１２０ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａ
ｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ
１３０ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
１４０ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
１５０ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
１６０ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａ
ｓｎ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ
１７０ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
１８０ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｙ
１９０ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｔ
ｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ
２００ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇ
ｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｌａ
２１０ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
２２０ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
２３０ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖ
ａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｎ
２４０ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ
２５０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
２６０ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｃｙｓ
２７０ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐ
ｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ
２８０ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｙｒ
２９０ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌ
ｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
３００ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐ
ｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｈｉｓ
３１０ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉ
ｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
３２０ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａ
ｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
３３０ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｔ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｍｅｔ
３４０ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐ
ｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ
３５０ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
３６０ Ａｓｐ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｓｎ
３７０ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ
３８０ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐ
ｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ
３９０ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａ
ｓｐ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｌａ
４００ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ
４１０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ
４２０ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｖａ ｌ６、次の式IVで表わされる塩基配列を有する請求項５
記載のＤＮＡ断片。 式IV
ＡＴＧＡＡＧＡＴＴＡ
ＡＡＴＴＴＧＴＴＧＡ ＣＴＴＧＴＴＴＧＣＴ ＧＧ
ＡＡＴＴＧ ４０ ＧＡＧ ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴ ＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡ ＡＧＡ
ＧＣＧＧＣＣＡ ＡＡＣＧＧＴＴ ８０ ＴＧＡ ＡＴＴＧＧＡＧＡＣＴ ＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣ ＴＴＴ
ＣＴＡＧＴＧＡ ＧＡＴＣＧＡＣ１２０ ＡＡＡ
ＡＡＧＧＣＴＴＧＣＧ
ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣ ＣＣＴＴＡＡＴＴＴＴ ＡＡ
ＡＧＡＧＧ１６０ ＡＡＣ ＣＴＣＡＡＧＧＴＧＡ ＴＡＴＡＣＡＣＧＡＡ ＡＴＴ
ＡＣＣＡＧＣＴ ＴＴＣＣＡＧＡ２００ ＡＴＴ ＣＧＡＴＴＴＴＣＴＴ ＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴ ＴＴＣ
ＣＴＴＧＴＣＡ ＡＣＣＣＴＴＴ２４０ ＴＣＡ ＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡ ＡＡＣＡＡＣＡＡＧＧ ＡＴＴ
ＴＧＧＧＧＡＴ ＡＣＡＡＧＡＧ２８０ ＧＡＡ ＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴ ＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧ ＡＧＧ
ＧＴＴＣＴＴＡ ＧＧＧＡＴＡＡ３２０ ＣＣＧ ＣＣＣＡＡＡＧＧＣＴ ＴＴＣＴＴＡＴＴＡＧ ＡＡＡ
ＡＴＧＴＴＣＧ ＧＧＧＡＣＴＧ３６０ ＧＴＡ ＡＣＡＣＡＣＧＡＣＡ ＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣ ＴＴＴ
ＡＡＡＧＡＣＧ ＡＴＣＡＴＴＴ４００ ＣＡＡ ＡＡＴＴＡＧＡＧＧＡ ＡＴＴＧＧＧＴＴＡＣ ＧＧＧ
ＧＴＴＡＧＣＴ ＡＣＣＴＡＴＴ４４０ ＡＣＴ ＴＡＡＣＡＧＴＡＧＴ ＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ ＴＣＣ
ＣＣＣＡＡＡＡ ＣＣＧＡＧＴＡ４８０ ＡＧＧ ＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴ ＴＡＧＧＣＡＴＡＣＴ ＣＧＧ
ＡＡＧＴＡＡＡ ＣＣＡＡＡＧＴ５２０ ＴＡＡ ＣＴＣＴＡＡＣＣＴＣ ＴＡＡＴＧＴＴＧＧＡ ＧＣＡ
ＧＣＣＧＡＴＴ ＣＴＣＡＣＡＡ５６０ ＧＴＡ ＴＡＡＧＡＡＴＧＡＡ ＣＡＡＡＴＡＴＣＴＴ ＴＡＴ
ＴＴＧＡＴＧＡ ＡＡＧＣＴＡＴ６００ ＧＣＴ ＡＣＴＧＴＴＡＡＡＧ ＡＣＡＴＴＴＴＡＧＡ ＡＧＡ
ＴＴＣＴＣＣＡ ＡＧＴＧＡＡＡ６４０ ＡＡＴ ＡＴＣＧＣＴＧＴＴＣ ＴＧＡＣＧＡＡＴＴＴ ＡＴＣ
ＧＧＴＣＡＡＣ ＴＴＴＣＡＡＡ６８０ ＧＧＴ
ＴＧＴＴＧＧＴＡＡＴ
ＡＡＣＴＴＴＧＡＡＴ ＴＧＣＴＡＣＡＴＧＧ ＣＴ
ＡＴＣＧＣ７２０ ＴＴＡ ＡＴＴＧＡＴＴＡＴＣ ＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡ ＴＴＣ
ＧＡＴＴＣＡＴ ＴＣＴＴＧＧＧ７６０ ＡＡＣ ＴＴＧＧＣＡＴＣＡＡ ＧＧＧＴＧＡＴＴＧＴ ＡＣＡ
ＡＡＡＧＡＧＧ ＡＡＡＴＴＧＡ８００ ＡＴＴ ＴＣＴＡＡＡＴＣＡＧ ＴＴＧＡＴＴＧＣＡＡ ＡＴＡ
ＧＡＡＧＡＡＡ ＧＡＡＡＡＴＴ８４０ ＴＡＴ ＧＧＴＡＣＧＣＡＣＣ ＡＡＧＡＣＧＧＡＡＡ ＡＧＣ
ＣＴＴＡＡＣＴ ＴＴＡＧＡＧＣ８８０ ＡＡＡ ＴＴＣＧＧＡＣＧＴＴ ＴＴＡＴＡＡＣＣＡＣ ＧＡＴ
ＣＡＧＣＴＴＧ ＡＧＧＴＡＡＴ９２０ ＡＡＴ ＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡ ＣＴＣＣＡＡＡＡＡＧ ＧＡＴ
ＡＴＴＴＡＡＧ ＡＧＡＡＧＡＡ９６０ ＧＡＡ
１ＡＡＴＡＡＡＴＴＴ
Ａ ＡＴＣＣＣＧＴＴＴＧ ＴＧＧＧＡＡＴＡＴＧ Ｔ
ＣＴＴＴＴＧ０００ ＡＧＧ
１ＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴ
ＣＣＴＴＧＡＣＣＣＡ ＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴ ＣＡ
ＡＴＣＣＡ０４０ ＣＣＴ
１ＣＡＣＡＴＣＴＡＧＣ ＧＡＴＧＣＴＣＡＴ
Ａ ＡＧＴＴＧＧＧＡＧＴ ＡＧＴＴＣＡＧ０８０ ＡＡＴ
１ＡＡＴＧＴＴＣＣＴＡ
ＧＡＡＧＧＡＴＡＡＣ ＡＣＣＴＣＧＧＧＡＡ ＴＧ
ＴＧＣＴＡ１２０ ＧＡＣ
１ＴＧＣＡＡＧＧＴＴＴ
ＣＣＣＡＧＡＴＧＡＴ ＴＴＣＡＴＡＣＴＡＣ ＡＴ
ＴＣＣＡＡ１６０ ＴＧＡ
１ＣＡＡＴＴＴＴＧＣＡ
ＴＡＣＡＡＧＣＡＧＴ ＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣ ＡＧ
ＴＣＡＣＴ２００ ＧＴＣ
１ＡＡＡＧＴＡＧＴＧＧ
ＡＡＡＡＡＧＴＧＡＴ ＣＧＡＣＧＡＴＴＴＡ ＴＴ
ＴＣＡＡＡ２４０ ＡＣＡ
１ＡＴＧＴＡＡＡＴＧＡ
ＡＴＴＧＴＴＴＧＧＡ ＣＡＧＡＴＧＡＡＡＣ ＴＴ
ＧＣＡＡＡ２８０ ＴＧＴ ＴＧＴＡＴＧＡ ７、請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡ断片を含む発
現ベクター。 ８、請求項７記載の発現ベクターにより形質転換された
形質転換体。 ９、エシャリヒア（ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する
微生物を形質転換したものである請求項８記載の形質転
換体。 １０、請求項４〜６いずれか記載のＤＮＡ断片を組み込
んだ発現ベクターにより、生物細胞あるいは微生物を形
質転換し、得られた形質転換体を培養して培養物からＢ
ａｎ I メチラーゼを採取することを特徴とするＢａｎ
I メチラーゼの製造方法。 １１、バチルスアノイリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来の約４，４０
００の分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による）を有するＢ
ａｎ I メチラーゼ。 １２、次の式IIIで表わされるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドである請求項１１記載のＢａｎ I メチラー
ゼ。 式III
１０ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａ
ｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ
２０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
３０ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
４０ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ
５０ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａ
ｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ
６０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ
７０ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐ
ｈｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
８０ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
９０ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ
１００ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
１１０Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａ
ｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ
１２０ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａ
ｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ
１３０ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
１４０ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
１５０ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
１６０ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａ
ｓｎ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ
１７０ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
１８０ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｙ
１９０ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｔ
ｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ
２００ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇ
ｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｌａ
２１０ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
２２０ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
２３０ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖ
ａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｎ
２４０ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ
２５０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
２６０ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ｌｌｅ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｃｙｓ
２７０ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐ
ｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ
２８０ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｙｒ
２９０ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌ
ｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
３００ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐ
ｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｈｉｓ
３１０ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉ
ｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
３２０ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａ
ｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
３３０ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｍｅｔ
３４０ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐ
ｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ
３５０ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
３６０ Ａｓｐ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｓｎ
３７０ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ
３８０ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐ
ｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ
３９０ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａ
ｓｐ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｌａ
４００Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ
４１０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ
４２０ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｖａｌ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1163662A JPH084510B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1163662A JPH084510B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0330679A true JPH0330679A (ja) | 1991-02-08 |
| JPH084510B2 JPH084510B2 (ja) | 1996-01-24 |
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ID=15778204
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1163662A Expired - Lifetime JPH084510B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH084510B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0321268A2 (en) * | 1987-12-17 | 1989-06-21 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the BanI restriction endonuclease and methylase |
-
1989
- 1989-06-28 JP JP1163662A patent/JPH084510B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0321268A2 (en) * | 1987-12-17 | 1989-06-21 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the BanI restriction endonuclease and methylase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH084510B2 (ja) | 1996-01-24 |
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