JPH0330691A

JPH0330691A - 形質転換酵母細胞からｂ型肝炎表面抗原を単離する方法

Info

Publication number: JPH0330691A
Application number: JP15662489A
Authority: JP
Inventors: Han Shee G; ジー―ハン・シエー; Chin Shii Shu; シユー―チン・シー
Original assignee: Development Center for Biotechnology
Current assignee: Development Center for Biotechnology
Priority date: 1989-02-09
Filing date: 1989-06-19
Publication date: 1991-02-08
Also published as: EP0384058A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】免呼匹１１本発明は形質転換酵母細胞からＢ型肝炎表面抗原（ＨＢ
ｓＡｆＩ）を単離する方法に係る。

Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質は感染ヒト
血漿から精製できＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ＞感染の予
防ワクチンとして使用し得ることが知られている。　Ｈ
ＢｓＡｙ遺伝子は血漿依存性を軽減するために大腸菌、
酵母細胞及び哺乳類細胞中でクローニングされ発現され
てきた。酵母細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから２２ｎｍの粒子として回収
されたＨＢｓＡｇの合成はＶａｌｅｎｚｕｅｌａ等、Ｎ
ａｔｕｒｅ、２９８：３４７〜３５０（１９８２）　；
Ｈｉｔｚｅｍａｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ
ｅａｒｃｈ、１１：２７４５〜２フロ３（１９８３）及
びＭｉ　ｙａｎｏｈａｒａ等、ＰＮＡＳ、８０：１〜５
（１９８３）に報告されている。

形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｎ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅパン酵母）によって産生された組換えＨＢ
ｓＡｇタンパク質粒子は米国特許第４，７０７，５４２
号に記載のように単離されている０通常は、発現された
ＨＢｓＡｇを細胞ホモジネートから分離し精製するため
に、プロテアーゼインヒビターであるフェニルメチルス
ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び非イオン性界面活
性剤であるポリオキシエチレン（９，５）−ｐ−ｔ−オ
クチル−フェノール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１
００）を細胞ホモジネートに添加する０次に、チオシア
ン酸カリウムもしくはナトリウム（ＫＳＣＮもしくはＮ
ａ５ＣＮ）または尿素のごときカオトロピック剤を使用
して種々の形態の表面抗原タンパク質集塊を形成させ、
次いで溶融シリカに吸着、ボレートＮ−モルホリノプロ
パンスルホン酸（ＭＯＰＳ）バッファによる溶出、ブチ
ルアガロースを用いる疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ（八ｍｂ
ｅｒｌｉｔｅ　ＸＡ［ｌ−２樹脂）による処理、限外−
過、セファロース６Ｂクロマトグラフイー、並びに、イ
ムノアフィニティー及びＥＣＴＩ（ＡＭセルロースクロ
マトグラフィー等で精製処理する。

種々の疎水性基を固定用担体として使用する改良された
疎水性相互作用クロマトグラフィーは欧州特許第０１７
９４８５＾２号に報告されている。また、亭米国特許第４，６２４，９１８％号は、濃縮、沈降、イ
ムノアフィニティーカラム、アニオン交換及びゲル透過
クロマトグラフィーによって組換え細胞培養物からＨＢ
ｓＡｇを精製する方法が記載されている。

本発明の目的は、ポリエチレングリコールによる選択的
沈降（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）及び後均質化（ｐ
ｏｓｔｈｏｍｏｇｅｎ　１ｚａｔ　１ｏｎ）を用いるこ
とによってＨＢｓＡｙの単離方法を改良することである
。

１１へ１１本発明の目的は、形質転換酵母細胞から）ｌ　Ｂ　ｓ　
Ａｇタンパク質精粒子分離及び回収する改良方法を提供
することである。

本発明の別の目的は、インヒビターまたは界面活性剤を
添加することなく細胞ホモジネートからＨＢｓＡｙを抽
出する方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、より迅速でより経済的な高純
度ＨＢｓＡｇの効率的な回収方法を提供することである
。

本発明は、形質転換酵母細胞により産生されたＨＢｓＡ
９タンパク質粒子が質重子エチレングリコール（ＰＥＧ
）による選択的沈降及び後均質化によって細胞ホモジネ
ートから高収率で選択的に回収されるという知見に基づ
く、使用したＰＥＧは透析濾過（ｄｉａｒｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎ）及びゾーン超遠心によって容易に除去できる。

　ｆ＆均質化によって混合が容易になりまた以降の処理
手順が簡単になる。このため、前処理操作工程を減らし
てｔｌＢｓＡｇタンパク質の回収効率を向上させること
が可能である。更に精製することによって高純度のｆｌ
ＢｓＡｇｌＢｓＡｇタンバクられる。

１乱ｒ支１本発明は形質転換酵母細胞からＢ型肝炎表面抗原（ＩＢ
ｓＡｇ）を単離する方法であって、（ａ）前記細胞を破
壊し均質化して細胞ホモジネートを調製する段階と、（ｂ）（細胞抽出物重量に対して）１〜１０重量％のポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することによる
順次沈降と後均質化とを含む抽出によって前記細胞ホモ
ジネートから前記タンパク質を分離する段階と、（ｃ）前記ＨＢｓ八ｇへンパク質をより高度に精製する
段階とを含むことを特徴とする方法を提供する。

組換えＢ型肝炎表面抗原タンパク粒子は、形質転換酵母
細胞、特にＳａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｅｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅによって合成される。　ＩＢｓＡｙタンパク質
をコードするＤＮＡ分子を含む組換え遺伝子プラスミド
によって酵母細胞を形質転換し、適当な条件下の発酵培
地で培養する。ＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ　！！伝転子酵ｆ
ｆ１−細胞中で構成的に発現され得る。

発現酵母細胞を繰り返し洗浄し、遠心して随伴した発酵
培地成分を除去する。ポリオキシエチレン（９，５）ｐ
−ｔ−オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
）のごとき界面活性剤の存在下または非存在下に細胞を
トリスバッファ溶液に懸濁させる。通常は、細胞を懸濁
させるバッファが、タンパク質の分離を促進する界面活
性剤を含有することが必要であるが、本発明の方法によ
れば、バッファが必ずしも界面活性剤を含む必要がない
。

細胞懸濁液を好ましくは６００ｎｍの光学密度的２５０
〜３５０に調整し、次にＤｙｎｏ−Ｍｉｌｌのごときガ
ラスピーズホモジナイザーに細胞の破壊が最も多く生じ
るような最″ａ流量及びガラスピーズ濃度において導入
する１以上の処理によって細胞ホモジネートが得られる
。

得られた細胞ホモジネートを遠心分離する。細胞の上清
に対して、選択的沈降と後均質化とを含む抽出処理を行
なう。選択的沈降は、分子量的＃り、０００〜ｔｏ、０
００好ましくは、６，０００のポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）約１〜１０重量％（細胞抽出物の重量に対す
るＰＥＧの重量として）を順次添加することにより行な
う。後均質化ではＰｏ１ｙｔｒｏｎ細胞ホモジナイザー
（Ｋｉｎｅ＋５ａｔｉｃｓ）を使用する。好ましい手順
によれは、細胞抽出物に３重量％のＰＥＧを添加して細
胞タンパク質を沈降させ、遠心し、第１沈降物の上清に
８重量％のＰＥＣを添加する。得られた沈降物を後均質
化する。く活性によって示される）ＨＢｓＡｉＦのレベ
ルは、第２のＰＥＧ沈降後の沈降物中において９０％以
上回収される。別の好ましい手順によれば、細胞抽出物
に８重量％のＰＥＣを添加し、後均貫化し、次いで後均
質化したベレット懸濁液に３重量％のＰＥＧを添加し、
次に第２のＰＥＧ処理上清に８重量％のＰＥＧを添加す
る。

ＰＥＧの順次添加によって細胞タンパク質の除去が容易
になり、ＨＢｓＡｇの回収率が向上する。順次沈降によ
って通常の方法の約１５０〜２００倍の精製が得られる
。ＨＢｓＡｙの回収に対する順次沈降の効果を表１−１
及び１−２に示す。表１−１によれば、８重量％のＰＥ
Ｇの添加によってＨＢｓＡｇの最適回収率が得られるが
、所望でないタンパク質のレベルも極めて高い。２段階
沈降によってＨＢｓｈを回収すると、所望でないタンパ
ク質が減少する（表１−２）。従って、ｔｌＢｓＡｇの
最適回収率は３％のＰＥＧの添加に続いて８％のＰＥＧ
を添加する順次沈降平原によって得られる。

入ユ」２ポリエチレングリ１−　ルー６０００（ＰＥＧ−６００
０）　ヲ用イる１段階沈降によるＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ
の回収率ＰＥＧ％　　　　　　１％　２％　３％　４％
　８％ｌｌＢｓΔｇ回収率（５％）　　　３，９　　１
０．３　１７．１　２１．２　８６．５不要タンパク質
（％）　７．５　１６．９　３４．０　３５．０　４６
．７ポリエチレングリ：７−　ルー６０００（ＰＥＧ−
８０００）を用イる２段階沈降によるＨＢｓＡｇの回収
率ＰＥＧ％　　　　　　１％＋８％　２％＋８％　３％
＋８％１１ＢｓＡＦ１回収賦％）　　　８６．３　　　
８５．１　　　８３．２不要タンパク質砒）　３８．６
　　　２７．１　　　１５．３また後均質化処理もＨＢ
ｓＡｇ回収率を向上させる。

後均質化によって得られる回収率（表２）は、酵母細胞
中のＩｔ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇタンパク質合成及びタンパク
質粒子形成が小胞体めごときオルガホラ中で行なわれる
ことを示唆する。後均質化によって、沈降した小胞体ま
たはミクロソームからＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　２粒子が遊離
し易くなる。

人」し後均質化によるＨＢｓＡｙ回収率の改良試験Ｎｏ、処理
前　ベレット／バッファ処理後１　　　８２．８１　　
　　　１１５　　　　１０２．３１２　　　８９．６＄
　　　　　　１／４　　　　１１７．８＄３　　　８８
．５１　　　　　１／３　　　　１３０．５１上記手順
によってＨＢｓＡｙタンパク粒子が部分精製される。よ
り高度に精製する段階では、ショ糖及び塩化セシウム（
Ｃｓ（Ｊ）密度勾配超遠心法、プロセススケール連続的
ゾーン超遠心法、サイズ排除クロマトグラフィー、段階
的塩化セシウム密度勾配超遠心法、等を用いる。精製さ
れたＨＢｓＡｇ粒子はヒト血漿に由来するＩＩ　Ｂ　ｓ
　Ａ　２粒子と同じ物理的及び化学的特性を有する。

以下の実施例によって本発明がより十分に理解されよう
、但し、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるも
のではない。特に注釈がなければすべての部及びパーセ
ンテージは重量部及び重量％である。

Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１遠心機でＪ＾−１０ロータ
を使用し、形質転換酵母細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅの発酵ブイヨン６０１を遠心
力９０００ｇ（８０００ｒｐｍ）で５分間バッチ遠心し
くバッチ当たりの容Ｍ３１）、湿潤重量６２５０ｇ（ま
たは乾燥重量的１５６０１？）の細胞を収集した。遠心
管の細胞ペレットをＴＢＳＩバッファ溶液（１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｌ、Ｔｒｉｓ＜ヒドロキシメチル〉ア
ミノメタンｐＨ７，５，０，１４８のＮａＣ１）に懸濁
させ、再度ペレッＩ・化し、随伴した発酵培地成分を除
去した。ペレット化した酵母細胞をＴＢＳ２バッファ　
（１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＮ　ｐＨ７，５，０，５Ｍの
ＮａＣ１，０，１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）に再
懸濁させ６６０ｎｍ＜０Ｄｓ６゜）での最終光学密度３
００にし、細胞懸濁液を螺動ポンプでホモジナイザー（
Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ、Ｈｉｌｌｙ、Ｍｏｄｅｌ　ＫＤＬ
）に流量７（ｈ１７分で導入した。１９　、１００ｙの
細胞ホモジネートを回収し、Ｊ２−２１遠心機で遠心力
１２，０００ｙ（９０００ｒｐｍ）で１５分間遠心し、
合計１５，４００ｇの上清を得た。＾ｕｓｒｉａ（登録
商標）法（＾ｂｂｏＬｔ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　Ａ
ｓ５ａｙ）で測定した上清中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢ
ｓＡｇ）の濃度は１ｏｚｇ／ｌであり、Ｌｏｗｒｙ法に
よって分析した総タンパク質濃度は２８ｇ／ｌであった
。

分子量６，０００（ＰＥＧ−６０００）のポリエチレン
グリコール溶液（５０％）を１５０ｙ／分の速度で最終
濃度８重量％まで上清に添加し、４℃で１６時間攪拌し
てＨＢｓＡｙを沈降させた。　１２，０００ｇで１５分
間遠心後、１３６５ｇの沈降物をＴＢＳＩに溶解しｔ初
期重量の３倍にし、次に懸濁液をＰｏ１ｙｔｒｏｎホモ
ジナイザーで４℃にて４．５００ｒｐｍで３０秒間ずつ
３回均質化した。ホモジネートを最終濃度３重量％まで
のＰＥＧ−６０００で処理し酵母細胞タンパク質を４°
Ｃで６時間沈降させた。沈降したタンパク質を１２，０
００！？（９０００ｒｐｍ）で１５分間遠心して除去し
た。得られた上清を最終濃度８重量％までのＰＥＧ−６
０００で再度処理し４℃で１６時間攪拌しながらＩｔ　
［１ｓ　Ａ　ｇを沈降させた。第２沈降物を１２，００
０９で１５分間遠心処理した。上清を除去しペレット（
約４５５１？）をＴＢＳＩに溶解して重量を３倍にし次
にＰｏ１ｙＬｒｏｎで均質化した。次にタンパク質懸濁
液を０．２２μの多孔膜で濾過した。膜をＴＢＳＩで連
続的に洗浄してＰ液を収集した。分画分子量（ＭＷＣＯ
）ｔｏｏ、０００の膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌ
ｉｃｏｎ　Ｕｎｉｔ）を用いて限外濾過してＰ液を濃縮
した。非沢過物を収集したく約２．０００１？＞。

非濾過物を更に処理して酵母細胞タンパク質からＨＢｓ
Ａｇを精製した。分画遠心によって沈降させ分離を行な
った。煽動ポンプを使用し、１，８００ｍｔ’の４０％
ショ糖溶液と１，４００ｚｌのＴＢＳＩ溶液とをＥＮＩ
（Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃ　Ｉｎｃ、、Ｋ
−３コア）超遠心機に充填した。２１の試料を１０１７
時間の一定流量でロータの底部から導入した。４℃、３
５．ＯＯＯｒｐｍ（９０，ＯＯＯｇ）にて遠心機のグイ
ナミックリオリエンテーション（ｄｙｎａｍｉｃ　ｒｅ
−ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）によって２〜４０％のショ
糖密度勾配を形成した。３時間処理した後に各２００ｍ
１の複数の分画を収集した。

１１＾Ｕ（血球凝集単位）、０Ｄ２６゜及び屈折率の検
出によって分画を選択し、合わせてプールした。分画分
子量１００，０００の限外濾過膜で濃縮及び透析濾過し
てショ糖を除去した。得られた溶液を容量８００ｘｉに
調整した。

密度１．１（１−１，２５ｇ／ｃ＋ｍ’の塩化セシウム
（ＣｓＣｉ’）密度勾配限外濾過によってＩｔ　Ｂ　ｓ
　Ａ　ｇ粒子を分離した。

分画を選択し、透析濾過及び限外濾過によって（約１０
０ｚ１に）濃縮した。酵母タンパク質から得られたＨＢ
ｓＡｙタンパク質粒子を更に精製するために、サイズ排
除クロマトグラフィー（ＴＳＫ　ＩＩＬ６５）を行なっ
た。選択された分画を合わせてプールし、Ｂｅｃｋｍａ
ｎゾーンロータ（Ｔｉ−１５型）で段階的塩化セシウム
密度勾配超遠心を行なった。密度１．３０．１．２５．
１．２ｏ、１．１０のＣｓ５ｌの階段希釈溶液を使用し
１．１５を出発点とした。３１．０００ｒｐｍ（１００
，０ＯＯＦＩ）、４℃にて４４時間超遠心後、選択され
たｌｌＢｓＡｇ分画を透析してＣ５Ｃｔ’を除去し、限
外濾過によって濃縮して精製ＨＢｓＡｙタンパク粒子を
得た。

火韮１ｊ工発酵酵母細胞を収集し実施例１に記載の手順で破壊した
。遠心（１２，０００ｇ、１５分）して酵母細胞破片を
除去し、ＰＥＧ−６０００を最終濃度３重量％まで上清
に添加し、得られた溶液を４℃で６時間攪拌し、次に４
℃で遠心（１２，０００ｇ、１５分間）して沈降物を除
去した。ＰＥＧ−６０００溶液（５０％）を最終濃度８
重量％まで上清に添加し、４℃で１６時間攪拌した。遠
心後、Ｐｏ１ｙｔｏｎを用い沈降物を４℃で後均質化（
４，５００ｒｐｍ、３０秒間）した。ホモジネートを実
施例１の手順で精製して精製ＨＢｓＡＩ？タンパク質粒
子を得た。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）形質転換酵母細胞からＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ
Ａｇ）タンパク質を単離する方法であって、（ａ）前記
細胞を破壊し均質化して細胞ホモジネートを調製する段
階と、（ｂ）（細胞抽出物重量に対して）１〜１０重量％のポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することによる
順次沈降と後均質化とを含む抽出によって前記細胞ホモ
ジネートから前記タンパク質を分離する段階と、（ｃ）前記ＨＢｓＡｇタンパク質をより高度に精製する
段階とを含むことを特徴とする方法。
（２）前記抽出が、前記細胞ホモジネートに３重量％の
ＰＥＧを添加して酵母細胞タンパク質を沈降させ、遠心
し、上清に８重量％のＰＥＧを添加し、後均質化する手
順を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（３）前記抽出が、前記細胞ホモジネートに８重量％の
ＰＥＧを添加し、後均質化し、次にこの後均質化した懸
濁液に３重量％のＰＥＧを添加し、この第２のＰＥＧ処
理上清に８重量％のＰＥＧを添加する手順を含むことを
特徴とする請求項１に記載の方法。
（４）沈降のために使用される前記ポリエチレングリコ
ールが分子量２，０００〜１０，０００であることを特
徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
（５）前記ポリエチレングリコールが好ましくは分子量
６，０００であることを特徴とする請求項４に記載の方
法。
（６）前記の後均質化がＰｏｌｙｔｒｏｎ細胞ホモジナ
イザーで行なわれることを特徴とする請求項１に記載の
方法。
（７）前記のより高度な精製が、ショ糖及び塩化セシウ
ム密度勾配超遠心法、プロセススケール連続的ゾーン超
遠心法、サイズ排除クロマトグラフィー及び段階的塩化
セシウム密度勾配超遠心法によって行なわれることを特
徴とする請求項１に記載の方法。
（８）前記ＨＢｓＡｇタンパク質が形質転換Ｓａｃｃｈ
ａｒｏ−￥ｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥中で
合成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。