JPH0330698A - イソ酵素の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物学的流体中に存在する生物学的に活性な
酵素の量を決定する方法およびシステ１２に関する。さ
らに詳しくは、本発明は、生物学的流体中に存在する乳
酸脱水素酵素のイソ酵素を定量的に決定するための多重
アッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅａｓｓａｙ）試薬システム
およびアッセイ方法に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）イソ
酵素は、同一種の異なる生活段階、異なる器官および異
なる組織において多形で存在し得る触媒的に活性なタン
パク質である。ある種の生物学的に活性な酵素は２つ以
上のポリペプチドサブユニットからなり、体内において
種々のイソ酵素の特徴的で不均衡な混合物として見られ
る。この不均衡が、特定の生理的条件に関連する特徴的
なイソ酵素プロフィルを生じさせる。

ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＩ−［Ｘｔばしば乳
酸脱水素酵素またはし一うクテート：ＮＡＤ酸化還元酵
素とも呼ばれる）は、そのような生物学的に活性な酵素
である。Ｌ　Ｄ　Ｈは４つの３５キロダルトンの大きさ
のサブユニットからなる４量体タン九くり質であり、人
体内では５種のイソ酵素形として現れる。Ｌ　Ｄ　Ｈサ
ブユニットは、一般にｒＭＪおよびｒＨＪと称される２
種の異なるタイプのポリペプチド鎖からなり、これらが
組み合わされてホモテトラマーおよびヘテロテトラマー
、すなわちＨ，，８３Ｍ、ＨｔＭ−１１（Ｍ、お上びＭ
４を形成する。この命名法は、Ｍ−サブユニットが骨格
筋中に広く存在し、■−サブユニットが心臓中に広く存
在することからきている。

Ｍ−サブユニットおよび■１−サブユニット含（ｊイソ
酵素は、ムとらと電気泳動分離により同定されたもので
あり、陰極への相対的な移動速度に基づいて通常ＬＤ−
１、ＬＤ−２、ＬＤ−３、ＬＤ＝４およびＬＤ−５と呼
ばれた（ＬＤ−１が最も速い）。それらの対応するサブ
ユニット組成は、それぞれ、Ｈ，，０３Ｍ　、　Ｈｔ　
Ｍ　ｔ、ＨＭ３およびＭ４である。

本明細書においてｒＬＤＨＪとは、全測定し得る酵素（
全ＬＤＨ）活性に寄与し特徴的なイソ酵素プロフィルを
構成する複数のすべてのイソ酵素からなる酵素種として
の乳酸脱水素酵素を意味する。

本明細書においてｒＬＤＪとは、末尾の数字で特別に同
定される乳酸脱水素酵素の個々のイソ酵素をいう。たと
えば、Ｈ−サブユニットからなる乳酸脱水素酵素のホモ
テトラマーはＬＤ−１と呼ばれ、３個の１１−サブユニ
ットと１１１１ｉｌｃ）Ｍ−サブユニットからなるヘテ
ロテトラマーはＬＤ−２と呼ばれる。

Ｌ　Ｄ　Ｈの各イソ酵素の比例型は器官および組織によ
って著しく変化するが、一定の器官または組織内では比
較的一定である。この分布により、各器官および組織に
特徴的なイソ酵素プロフィルまたはパターンが得られる
。たとえば、心臓および赤血球はＬＤ−１およびＬＤ−
２の比率が高く、肝臓および骨格筋はＬＤ−５を主とし
て含み、肺、腎臓および脳はＬＤ−２、ＬＤ−３および
ＬＤ４を種々の程度に主として含む混合物を含む。血液
中の疾患状態または傷害のある器官または組織からのこ
れらのイソ酵素の存在は、血清Ｌ　Ｄ　Ｈの全正常レベ
ルの上昇により検出することができる。

血清イソ酵素組成をさらに特徴付けることにより、その
血中イソ酵素を採取した生理学的採取源を同定するのに
役立てることができる。従って、血清ＬＤＨおよびその
イソ酵素組成を決定することは、種々の病理学的疾患状
態の診断において一層臨床的価値を増してきている。

心筋梗塞の疑いを診断することは、Ｌ　Ｄ　Ｈの決定を
臨床的に応用する例のうちで最もしばしば行なわれるも
のである。これらの症例において、その他のイソ酵素に
対してしＤ−１イソ酵素が上昇することが心筋傷害に特
異的なものであり、心筋傷害を確認するものとなる。と
いうのは、心臓はＬＤ−１酵素を最も大きな比率で含ん
でいるからである二色性心筋梗塞の診断におけるスピー
ドが望まれ、それは患者の命を救うためにしばしば必要
である。

電気泳動はＬ　Ｄ　Ｈイソ酵素を分離するのに用いられ
る第一の方法であったが、完全なイソ酵素プロフィルを
得るために今でも広く用いられている。

しかしながら、この方法は、複数の長い工程を要するこ
と、および高価な装置が必要であるという点で幾つかの
欠点を有する。この方法の手順は、一般に完了するのに
少なくとも約１時間を要し、その時間の大部分は熟練者
による試料の操作に割かれる。イオン交換カラムを用い
た分離法も開発されているが、同様の欠点を有する。

ＬＤＨイソ酵素を分析するための他の方法は、イソ酵素
の幾つかを選択的に抑制または変性させ、そのような処
理に抵抗性のイソ酵素の相対比を定量するものである。

たとえば、尿素、熱および高いｐＨは最大のＭ−サブユ
ニットを含有するイソ酵素を段々に不活化するのに用い
られ、高基質レベルのピルビン酸または乳酸はｌ−１−
サブユニットを選択的に抑制するのに用いられ、α−ケ
ト酪酸はＨ−サブユニットに対する特異性を有する基質
として用いられてきた。

米国特許第４，２５０−．２５５号明細書には、全Ｌ　
Ｄ　Ｉ（活性をまず測定し、ついで試料をイオン性両親
媒性化合物で処理することによりイソ酵素を選択的に抑
制することからなる方法が記載されている。ついで、こ
の処理した試料の酵素活性を測定し、この測定値を最初
の測定値から差し引く。

この差異が抑制したイソ酵素の活性である。

しかしながら、これら方法のいずれも、試料を種々の単
調で時間のかかる操作（希釈、前処理など）にかけたり
、さらに多工程アッセイにかけたりすることなく、生物
学的流体の単一の試料から乳酸脱水素酵素の完全なイソ
酵素プロフィルを迅速に定量することはできない。急患
室または分娩室などのように、病理学的試料を処置する
ために数分以内に比較的迅速な診断が必要とされる臨床
条件下では、スピードおよび試料の調製を最小にするこ
とが重要である。

これまで、ＬＤＨなどの生物学的に活性な酵素を含んで
いると思われる生物学的流体の完全なイソ酵素プロフィ
ルを数分以内に決定することのできるアッセイ法および
アッセイ試薬が、長い間臨床的に望まれてきた。本発明
はそのようなアッセイ法およびアッセイ試薬システムを
提供するものであり、アッセイする前に試料を操作する
ことが実質的に必要なく、通常の電気泳動法に比べて１
０倍以上も迅速なアッセイが可能である。

（課題を解決するための手段） 本発明は、選択した生物学的流体中に存在する生物学的
に活性な酵素であって、酵素的に活性な少なくとも２つ
のサブユニットからなり生物学的流体中でイソ酵素の混
合物として存在し得る酵素のイソ酵素プロフィルを定量
的に決定する方法であって、 （ａ）生物学的流体を少なくとも３つの部分に分けて （ｉ）選択した第一のサブユニットおよび選択した第二
のサブユニットの酵素活性を測定する１組みの活性効率
（ｏｎｅ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）
を有する第一アッセイ試薬を用い、該生物学的流体の第
一の部分について第一のアッセイを行って第一の測定値
を得、 （ｉ　ｉ）該選択した第一のサブユニットおよび該選択
した第二のサブユニットの酵素活性を測定する、該第一
アッセイ試薬の活性効率とは異なる１組みの活性効率を
有する第三アッセイ試薬を用い、該生物学的流体の第二
の部分について第二のアッセイを行って第二の測定値を
得、 （ｉｉｉ）単一の選択した酵素的に活性なイソ酵素の定
量が可能な第三アッセイ試薬を用い、該生物学的流体の
第三の部分について第三のアッセイを行って第三の測定
値を得、 （ｂ）上記工程（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉＤで得た
該測定したサブユニットのそれぞれについての定量値お
よび該サブユニットの値の合計を決定して生物学的流体
中の全酵素活性を得、 （ｃ）該第一の選択したサブユニットの合計値および上
記工程（ｂ）で得た全酵素活性から該第一の選択したサ
ブユニットの全定量部分濃度を決定して第一の測定パラ
メーターを得、 （ｄ）上記工程（ａ）（ｉｉｉ）で得た測定値および上
記工程（ｂ）で得た全酵素活性から該第一の選択したイ
ソ酵素の全定量濃度を決定して第二の測定パラメーター
を得、ついで （ｅ）上記工程（ｃ）および（ｄ）で得た測定パラメー
ターを該選択した酵素についての標準と比較して生物学
的流体中に存在する該酵素のイソ酵素プロフィルを決定
する ことを特徴とする方法を提供する。

本発明は、生物学的に活性な酵素であって、少なくとも
２つの酵素的に活性なサブユニットからなり、イソ酵素
の混合物として存在する酵素を含むと思われる生物学的
流体の試料の完全なイソ酵素プロフィルを決定するため
の方法を含む。そのような試料の完全なイソ酵素プロフ
ィルは、本明細書に開示する比較的迅速なアッセイ法お
よび多アッセイ試薬システムにより定量的に決定するこ
とができる。

本発明の方法は、少なくとも２つの分画（ｆｒａｃｔｉ
ｏｎａｌ）サブユニットの酵素活性および１つのイソ酵
素活性を測定することを含む。この決定は、２つのサブ
ユニット特異的アッセイ試薬および１つのイソ酵素特異
的アッセイ試薬からなるアッセイ試薬システムを用いて
調製した３つの単工程アッセイ混合物から得ることがで
きる。完全なイソ酵素プロフィルは、上記情報から代数
的に定量することができる。

適当な自動装置およびプログラムを用い、これらアッセ
イを同時に行って全ＬＤＨイソ酵素の評価を約５分で完
了することができる。

本発明のアッセイ法は、多重アッセイ試薬システムを用
いてアッセイするために生物学的流体の試料を少なくと
も３つの部分に分け、凸部分について別々にアッセイ行
うことを含む。

第一のアッセイは、選択した第一のサブユニットおよび
選択した第二のサブユニットの酵素活性を測定するＩ組
みの活性効率を有する第一アッセイ試薬を用いて該生物
学的流体の第一の部分について行う。第一のサブユニッ
トおよび第二のサブユニットの酵素活性の第一の測定値
か得られる。

第二のアッセイも、第一のアッセイと同じ選択した第一
のサブユニットおよび選択した第二のサブユニットの酵
素活性を測定する、上記第一アッセイ試薬の活性効率と
は異なる１組みの活性効率を有する第二アッセイ試薬を
用い、生物学的流体の第二の部分について同様に行う。

従って、第一の相対測定値とは異なる第二の測定値が得
られる。

たとえば、第一アッセイ試薬は第一のサブユニットに対
して一層高い活性効率を有していてよく、第二アッセイ
試薬は第二のサブユニットに対して一層高い活性効率を
有していてよい。

第三のアッセイは、単一の選択したイソ酵素の活性を直
接定量することのできるイソ酵素特異的第三アッセイ試
薬を用い、生物学的流体の第三の部分について行う。

ついで、生物学的流体中の完全なイソ酵素プロフィルを
決定することができる。得られた各サブユニットについ
ての活性効率を示す代数式から、測定したサブユニット
のそれぞれについての定量値を決定する。上記で得られ
た第一のサブユニットおよび第二のサブユニットについ
て得られた値の合計から、生物学的流体中の全酵素活性
が得られる。

第一の選択したサブユニットの活性の合計値および全酵
素活性から第一の選択したサブユニットの全定量部分濃
度を決定し、第一の測定パラメーターを得る。１つの選
択したイソ酵素の全定量濃度は、第三のアッセイで得ら
れた直接測定値と全酵素活性から決定し、第二の測定パ
ラメーターを得る。第一および第二の測定パラメーター
は、全酵素活性に基づいて％濃度で表すのが好ましい。

ついで、この第一および第二の測定パラメーターを該選
択した酵素についての標準と比較し、適合する定量イソ
酵素プロフィルを決定する。

標準は、イソ酵素プロフィル中の各サブユニットについ
ての既知の確率値（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕ
ｅ）から作成し、第一および第二の各イソ酵素プロフィ
ルに適合させたｌまたは２以上の曲線からなる。

別の態様において、標準は、同じ第一および第二の各測
定パラメーターによりイソ酵素プロフィルを定量的に示
す！または２以上の代数式から経験的に得られたもので
あってもよい。適合目的のために、この経験的に得られ
た標準は、既知の特徴的なイソ酵素プロフィルからなる
データの集合（ｂｏｄｙ）に線形回帰分析を適用するこ
とによって定められたｌまたは２以上の曲線を含んでい
てよい。

本発明のアッセイ法およびアッセイ試薬システムの主要
な幾つかの利点は、そのスピード、簡弔さ、および正確
さである。

適当な市販の自動化またはプログラム化臨床アナライザ
ー装置を用いることにより、ヒト生物学的流体試料中の
完全なＬＤＨイソ酵素プロフィルを、従来の全ＬＤＨア
ッセイに通常必要とされるのと同じ時間のみで完了し評
価することができる。

さらに詳しく説明すると、自動化分光光度計診断システ
ムである市販の装置を用いることにより、完全なＬ　Ｄ
　Ｈイソ酵素プロフィルを約５分以内で定量的に決定す
ることができる。従って、本発明のアッセイ法のスピー
ドは、よく知られた電気泳動法に比べて１０倍以上速い
ことになる。本発明の主な利点は、本発明のアッセイ法
およびアッセイ試薬システムを行うことによって迅速に
得られた全Ｌ　Ｄ　）−１活性および直接ＬＤ−１活性
により、潜在的な急性心筋梗塞として現れる臨床例を迅
速に評価することができろことである。

本発明のアッセイ法によりヒト血清をアッセイする利点
は、血清を分離したり血清の部分を臨床アナライザー装
置の試料カップ中にアリコートしたりするのは別として
、アッセイ前に試料を操作する必要が実質的にないこと
である。さらに、得られた結果は全Ｌ　Ｄ　Ｉ−［と同
じ単位で送られ、非Ｗ釈血清とされる。装置がそれ自体
で（ｏｎ　−ｂｏａｒｄ）計算能を有している場合には
、全Ｌ　Ｄ　Ｈｌおよび５種の個々のすべてのイソ酵素
を、全量に対する％かまたは国際単位／ＱＣＩ　ＬＪ　
／＆）で報告することかできる。この場合には、それ以
上計算する必゛冴がない。

さらに、本発明の方法では、クロマトグラフィー法およ
び電気泳動法を行っている間に通常生しる、よく知られ
た誤差源による正確さの変動（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ
）が回避される。これらの誤差は、多数の試料の操作、
試料の希釈、アッセイの遅延した作動およびそれに付随
する試料の劣化などにより生じる。たとえば、経済的な
理由から、臨床技術者は電気泳動ゲルプレートを満たす
のに充分な生物学的試料が得られるまで試料を保持した
ままにしておくことがしばしば必要になる。これには通
常、１０個またはそれ以上の試料が必要である。

一方、本発明のアッセイ法は、単一試料の多均−速度ア
ツセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　
ｒａｔｅａｓｓａｙ）に基づいており、本明細書にも開
示しているように精密で信頼性の高いことがわかってい
る。

さらに、最少量の試料、本発明の多重アッセイ試薬シス
テムおよび単一の臨床装置を用い、各アッセイを同時に
行うことができる。さらに、装置がデータストックを有
しておりデータ操作能を有する場合には、！またはそれ
以上の標準を代数式および曲線の形でそれに保持するこ
とができる。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、生物学的流体の酵素活性の迅速な測定法、お
よびイソ酵素プロフィルにおける比例分布の定量決定法
を提供するものである。

当業者であれば、本発明のアッセイ法およびアッセイ試
薬システムを、生物学的に活性な酵素であって少なくと
も２つのサブユニット（ポリペプチド）からなり、人体
および生物学的流体中でイソ酵素の混合物として存在し
得る酵素のイソ酵素プロフィルを決定するために適切に
適合させ得ることがイつかるであろう。

本明細書において「生物学的流体」とは、全血、血漿、
血清、脊髄液および尿を含む。

本明細書において「イソ酵素」とは、分子的に識別され
る酵素種のサブタイプであって、その酵素を構成してい
るサブユニットの１または２以上が酵素的に活性であり
得るものをいう。

本明細書において「イソ酵素プロフィル」とは、アッセ
イを行おうとする生物学的流体中のイソ酵素にあり得る
種々のイソ形の相対的な比例分布パターンをいう。

本明細書において「単工程アッセイ混合」とは、アッセ
イするために生物学的流体の試料をアッセイ試薬と混合
する前に、試料を予備操作することが実質的に必要ない
ことをいう。

本明細書において「サブユニット特異的アッセイ試薬」
とは、少なくとも２つのサブユニットの部分酵素活性を
測定するある種の活性効率を有するアッセイ試薬をいう
。

本明細書において「イソ酵素特異的アッセイ試薬」とは
、イソ酵素の酵素活性を実質的に完全な活性効率で測定
するアッセイ試薬をいう。

本明細書において「１組みの活性効率」または「活性効
率」とは、アッセイ混合物中に存在するイソ酵素を構成
する少な（とも２つのサブユニット構造の酵素活性を測
定する基質の能力をいう。

多形で存在する酵素の例としては、乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ）、クレアチンキナーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノトラン
スフェラーゼなどを挙げることができる。

ＬＤＨの場合には、生物学的流体（とりわけ血清）中に
存在するＬＤＨの生物学的な器官または生理学的採取源
は、そのイソ酵素プロフィルを評価することにより同定
することができる。特徴的なイソ酵素プロフィルは、心
臓、骨格筋、赤血球、副腎、肝臓、肺臓、脳などの器官
および組織に付随する。Ｌ　Ｄ　Ｈのイソ酵素プロフィ
ルおよび、特にＬＤ−２に対するＬＤ−１の比を決定す
ることは、心筋梗塞の価値ある指標となる。

本明細書において「Ｍ−サブユニット」およびｒｌ（−
サブユニット」とは、従来より理解されているように、
それぞれヒト骨格筋および心臓中に主として見られるＬ
ＤＨの分画サブユニットをいう。

本発明のアッセイ法は、２つのパラメーター１．ｉ゛な
わし分画Ｍ−サブユニットの全酵素活性およびり、　Ｉ
）−１イソ酵素の酵素活性に基づき、Ｌ　ｌ）　１１υ
）イソ酵素プロフィルを迅速に決定するのに特に通して
いる。

本発明のアッセイ法およびアッセイ試薬システムを説明
するために、一定のＬ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬を用いた血
清中のＬ　Ｄ　Ｈイソ酵素の決定法を記載するが、本発
明はこれに限られるものではない。

本発明のアッセイ法は、血清の分離および臨床アナライ
ザー装置の試料カップ中へのアリコートのほかは、アッ
セイ前に試料を操作する必要か′」コ質的にない。アッ
セイは、アッセイ混合物を調製する数分の間、またはそ
れ以内に行うことができる。その結果は、ＬＤＨ全量と
同じ単位で得られ、非希釈血清とされる。それ以上計算
する必要はない。アッセイ前の希釈などの試料操作が必
要ないので、本発明のアッセイ法はまた比較的高レベル
の精密さおよび正確さを保持している。

たとえば、免疫学的方法およびクロマトグラフィー法で
は、それぞれ約２００μＱおよび１０００μＱの血清試
料か必要であり、そのすべてがアッセイで用い尽くされ
る。本発明のアッセイ法では、３ｍＱの大きさのキュベ
ツトを用いたと仮定して、手動アッセイで最大約１００
μＱの試料が必要である。自動化アッセイでは、一般に
約０２５〜約０．５ｘσのアッセイ試薬しか必要とされ
ない。

自動化アッセイでは約５０〜約１００μａの試料を試料
カップ中に入れておく必要があるからしれないが、未使
用試料は他のアッセイに利用することができる。さらに
、アッセイ混合物を調製４′るに際して生物学的流体を
アッセイ試薬と混合する場合に、アッセイ試薬の希釈を
最小限に押さえることができる。たとえば、アッセイ混
合物は、生物学的流体；アッセイ試薬（約１ｇ１００部
）からなっている。

たとえば、臨床アナライザーを用いてアッセイするのに
１＋（ｌのアッセイ試薬当たり１０〜２０μＱの血清を
３７℃で混合し、１０〜１２００ＩＵ／＆の範囲の血清
Ｌ　Ｄ　Ｈ活性およびＬＤ−１活性について一層優れた
直線性が正確に決定できるように、約２．５〜約５．０
μＱの血清および約０．２５１１ａのアッセイ試薬を用
いる。

全アッセイ手順には、典型的なＬ　Ｄ　Ｈ全アッセイを
行うのに必要な時間しか必要とされない。ノーとえば、
二色フィルター（３４０／−３８０ｎｍ）または約３３
０〜約３８０ｎｍでの吸光度を測定する検出器を用いる
運動モード（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍｏｄｅ）にある自動化
分光測光臨床アナライザーを用いた場合、約４〜５分で
ある。適当なアナライザーとしては、アボット■Ｐ二色
バッチアナライザーおよびアボットスペクトラム診断シ
ステム（アボット・ラボラトリーズ、ノースンカゴ、イ
リノイ）などが挙げられる。

一般に、ＬＤＨアッセイは、下記に示す一般的反応に基
づいている。

一ヒ記反応式において、Ｌ　Ｄ　ｌ−１酵素により乳酸
はピルビン酸に変換され、それと同時にＮＡＤにコヂン
アミドーアデニンノヌクレオチド）かＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ（
還元型ＮＡＤ）に還元される。従って、ＮＡＤＩＩの生
成速度、または逆の反応におけろＮＡＤへの酸化速度は
、約３４０ｎｍでの吸光度の変化の割合によって測定さ
れるように、試料中のＬ　ｌｉ　ＩＩ活ヤ１（−１１１
，（藺１４７、本発明のアッセイ法の一つの側面は、少
なくとし３つのアッセイ試薬からなる多重アッセイＬ　
Ｄ　Ｈ試薬システム、弔−の試料および単一装置の臨床
アナライザーを用いて２つのパラメーターを測定するこ
とにより、Ｌ　Ｄ　［−１を含んでいると思われる生物
学的流体試料中のＬ　Ｄ　１１の完全なイソ酵素プロフ
ィルを約５分以内で走用４−ることかできろことである
。トＩ−サブユニットまたはＭ−サブユニットの％を第
一のベラメーターとして走用し、■、ＤＨ酵素の％を第
二のパラメーターとじて定量する。アッセイ試薬のうち
２つの試薬はザブユニット特異的であるか、各サブユニ
ットに対して異なる１組みの活性効率を有する。各サブ
ユニットの定量値は、各サブユニ・ノドについて各試薬
の活性効率を示す代数式から決定することができる。

得られた複数の等式を同時に解くことにより、各サブユ
ニットの酵素活性を加えて全Ｌ　Ｄ　Ｈ活性が得られ、
これから％が決定される。

残りのＬ　Ｄ　Ｈイソ酵素は、この情報から、そのイソ
酵素プロフィルを示４°ように適合させた多積式を用い
て正確かつ定量的に決定することができる。このイソ酵
素プロフィルは、データの集合に線形回帰分析を適用す
ることによって定められ２つの測定パラメーターのそれ
ぞれでプロットした曲線に適合される。

本発明のアッセイ法の精密さおよび正確さは、下記でさ
らに詳細に記載するように、ヒト血清のアッセイで得ら
れた情報を数学的積分に基づいて許容し得る直線性を有
することがわかった。

Ｌ　Ｄ　Ｈアッセイについては、各アッセイ試薬の基質
は、脂肪族鎖中に約３〜４個の炭素原子を有するα−ヒ
ドロキシ脂肪族酸およびその酸化類似体、還元型（ＮＡ
ＤＨ）または酸化型（ＮＡＤ）のニコチンアミド−アデ
ニンジヌクレオチド、およびそれら基質の類似体よりな
る群から選ぶことができる。好ましい基質は、酪酸塩、
乳酸塩およびピルビン酸塩である。

各アッセイにはまた、約７〜約ｌＯのｐ）（を付与する
のに充分なバッファーが含まれる。好ましいＬ　Ｄ　Ｈ
アッセイ試薬システムにおいては、各アッセイ試薬はＮ
ＡＤのＮ　Ａ　Ｄ　Ｈへの還元をモニターし、この還元
は脂肪族鎖中に３〜４個の炭素原子を有するＬ−２−ヒ
ドロキシ脂肪族酸の酸化と共役している。

血清中の定量的ＬＤＩ〜Ｉイソ酵素の決定のため、酪酸
塩基質が第一のサブユニット特異的アッセイ試薬に好ま
しく、乳酸塩基質が他方のサブユニット特異的アッセイ
試薬として好ましい。この目的のため、下記でさらに詳
細に記載するように、基質の濃度は第一のアッセイ試薬
においてはＨ−サブユニットに対して最適化し、第二の
アッセイ試薬においてはＭ−サブユニットに対して最適
化４−るのが好ましい。ＬＤ−１イソ酵素は、第三のＬ
ＤＨアッセイ試薬により直接測定するのが好ましい。

本発明の特に好ましいＬ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬システム
においては、各試薬はＮＡＤの還元をモニターする。そ
れゆえ、各アッセイ試薬は、基質、ＮＡＤ、および約７
〜約ｌＯ１好ましくは約８〜９．５、さらに好ましくは
約８．５〜約９のｐＨを付与するのに充分なバッファー
を含んでいる。

本発明のアッセイ法は、第三のｔ、ｔｊ−１イソ酵素特
異的アツセイ工程中に、１個またはそれ以１−のＭ−サ
ブユニットを含有するイソ酵素（ＬＤ２〜ＬＤ−５）を
選択的に不活化してこれらイソ酵素の測定可能な酵素活
性を除くことのできるカオトロープ剤を含むＬ　Ｄ　Ｈ
アッセイ試薬を組み込むのが好ましい。本明細書におい
て「カオトロープ剤」とは、大きな直径、−価の負の電
荷、およびタンパク質の二次構造および三次構造を変え
得る低い電荷密度を有する無機アニオンをいう。

その上うなカオトロープアニオンは、ホフマイスターま
たは離液順列の構成アニオンである。そのようなアニオ
ンには、大きな部分モルイオン容積（ｐａｒｔｉａｌ　
ｍｏｌａｌ　１ｏｎｉｃ　ｖｏｌｕｍｕｅｓＸｒｐｈｉ
Ｊの記号で表示され、ｙｒＱ１モルの単位で表される）
を有するアニオンが含まれる。とくに好ましいアニオン
は、該容積が３０ｘＱ１モル以上のアニオンである。

そのようなカオトロープアニオンの例としては、Ｔ　ｃ
　Ｏ４−１ＣＩＯ４−１ＲｅＯ，−１ＢＦ４＼５ｅＣＮ
−１ＳＯ８Ｆ−１ＳＣＮ−１およびＩ−が挙げられる。

これらアニオンは、ウォルフ（Ｗｏｌｆｆ、　Ｊ　、）
およびモーレイ（Ｍａｕｒｅｙ、　Ｊ　、　Ｒ、）のＢ
　ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓＡｃｔａ、６９．
５８〜６７（１９６３］、ニー記載されている。

上記カオトロープ剤含有アッセイ試薬はまた、１１−サ
ブユニット単独からなる残りのイソ酵素（ＬＤ−１）を
同時に決定するのに必要な充分な量の基質をも含んでい
る。全ＬＤＨとともにＬＤｌを定量することは、心筋梗
塞を診断する上で、またこの疾患を他の器官からのＬ　
Ｄ　Ｈ漏出を含む疾患から識別する上で特に望ましく価
値あるものである。基質としてのし一乳酸塩、およびカ
オトロープ剤としての過塩素酸ナトリウムからなる特に
好ましいアッセイ試薬か、ヨーロッパ特許出願第２９２
．８３８号明細書に下記のように記載されている。

上記好ましい第三のアッセイ試薬の基本原理は、カオト
ロープ剤が、ある種のタンパク質が水溶液中にあるとき
の正常な構造的関連を選択的に崩壊さ仕ることができる
ことにある。

一般に、カオトロープ剤の有用ｍは、約１００〜約５０
００　ミ！Ｊ　モル／ｆ２（ｍＭ／（２）、好ましくけ
約６００〜約１５００ｍＭ／１２、さらに好ましくは約
５００〜約１０００ｉＭ／（２の濃度である。アッセイ
混合物中にカオトロープ剤が存在していると、生物学的
流体中の１またはそれ以上のＭ−サブユニットを含有す
るすべてのＬＤＨイソ酵素（すなわちＬＤ−２からＬＤ
−５まで）を直ちに不活化する。ＬＤ−１のみが安定で
あり、その酵素活性はＬ　Ｄ　■１アッセイ試薬により
直接測定することができる。

Ｌ、　Ｄ　−２からＬＤ−５までのイソ酵素を不活化す
ることに加えて、カオトロープ剤はＬＤ−１の基質（乳
酸塩、ピルビン酸塩およびそれらの類似体など）に対す
る親和性を減少させろ。その結果、同じ量のＬＤ−１を
用いて（ほかはすべて同等、反応の方向は乳酸塩−ピル
ビン酸塩）同等の反応速度を得るには、カオトロープ剤
か存在する場合には存在しない場合に比べて高濃度の乳
酸塩が必要である。同じ理由によって、ピルビン酸塩、
シュウ酸塩および高レベルの乳酸塩により生じる抑制も
また減少する。従って、ＬＤ−１に特児的なイソ酵素で
あるアッセイ試薬であって高レベルの基質（すなわち、
乳酸塩またはピルビン酸塩）を含むものからは、反応時
間の枠を通じて高濃度の基質が利用できること、および
同じ反応時間の枠の間に生じる生成物抑制のレベルが低
いことのために、−層優れた直線性か得られるであろう
。この現象の他の利点は、シュウ酸塩を含む抗凝血管中
に回収した試料での妨害がなくなることである。

たとえば、過・塩素酸ナトリウムは、基質（乳酸塩また
はピルビン酸塩）とＬＤ−１との間の親和性を減少さＵ
・る。生じた反応速度の減少は、基質をさらに加えるこ
とにより元に戻すことができる。

たとえば、特に好ましいＬ　Ｄ　Ｉ−１アツセイ試薬は
、過塩素酸イオン濃度に基づいて約６００　ｍＭ／Ｃ〜
約１０００　ｍＭ／ｆ２の過塩素酸ナトリウム、および
Ｌ−乳酸濃度に基づいて約５０ｍＭ／Ｑ〜約５００鯖Ｍ
／１２のＩ、−乳酸塩基質からなり、ＮＡＤの存（［−
下でＬＤ−１の迅速かつ正確な直接測定が可能である。

一般に、Ｌ、　Ｄ　Ｈアッセイ試薬は、少なくとも１つ
の基質（一般に酪酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、ＮＡＤ
、ＮＡＤＨまたはそれらの基質類似体）、バッファーお
よび場合により色原体または指示色素を含む。幾つかの
アッセイにおいては、Ｎ　Ａ　Ｉ）は色原体であり得る
。加えて、アッセイ試薬には必要に応じてインヒビター
、安・定化剤および保存剤が含まれていてよい。Ｉ、Ｄ
Ｈアッセイ試薬の」、５本的な調合は当該技術分野でよ
く知られているので、本明ｗ書では詳しく述べない。

基質およびバッファーを含み本発明のアッセイ法に用い
ることのできる市販の［、ＤＨアッセイ試薬としテハ、
Ａ−ＧＥＮＴ　　ＬＤＨｌ、（アボット・ラボラトリー
ズ）、Ｌ　ＩＱＵ　ＩＤ−５ＴＡＴＬＤ−Ｌ−ＶＶ（ベ
ックマン）、Ｆ　Ａ　Ｓ　ＴＣＩ−ＩＥＭ　　　ＬＤＨ
−Ｌ（ＢＭＣ）、　　Ｌ　　Ｄ　　Ｈ−Ｌ、　　−ＳＶ
、ＩＬ［カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ月、Ｃ
ＺＹＭＥ　　ＬＤＨＣクルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）１、
Ｃ０ＬＯＲＩＭＥＴＲＩ　Ｘ（ダウ・ケミカルズ）、Ｌ
ＤＨ−Ｌ（７４ッシ−ｒ　　）、ＵＬ’ｒＲＡＺＹＭＥ
［ハルレコ（Ｈａｒｌｅｃｏ）］、Ｉ−（ＭＡ　　Ｌ　
Ｄ　Ｈ−Ｖ　Ｖ　［／％イセル（Ｉ（ｙｃｅｌ）］、Ｓ
Ｐ　［Ｎ　　ＣＨＥＭ　Ｌｌ）ＨＬ（ＳＫＩ）、および
ＬＤＨ（Ｌ−Ｐ）［ワーシングトン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ
ｔｏｎ）］なとが挙げられろ。

好ましいＬ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬システムは少なくとも
３種のアッセイ試薬からなり、これらアッセイ試薬のう
ち第一アッセイ試薬における基質の活性効率は第二アッ
セイ試薬における基質の活性効率とは異なり、Ｉ］−サ
ブユニットおよびＭ−サブユニットについて２組みの異
なる測定値を得るごとができる。

たとえば、第一Ｌ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬の好ましい基質
は酪酸塩であり、第二Ｌ　Ｉ）　Ｈアッセイ試薬の好ま
しい基質は乳酸塩である。特に好ましい基質としては、
Ｌ−２−ヒドロキシ酪酸、２−オキソ酪酸、およびし＝
乳酸が挙げられる。有用な第一Ｌ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬
は、Ｌ−２−ヒドロキシ酪酸含量に基づいて酪酸塩基質
を約２０〜約５００ｍＭ／Ｌ好ましくは約５０〜約３０
Ｏｎ＋Ｍ／ｆ２、さらに好ましくは約１００　ｍＭ／１
２の濃度で含む。

有用な第二Ｌ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬は、Ｌ−乳酸含量に
基づいて乳酸塩基質を約１００〜約１０００ｍＭ／１２
．好ましくは約２００〜約６００ｍＭ、Ｑ、さらに好ま
しくは約４０Ｏｎ＋Ｍ／１２の濃度で含む。

上記各ＬＤＨアッセイ試薬はまた、約２〜約２０ｍＭ／
１２．好ましくは約３〜約１２ｍＭ／＆、さらに好まし
くは約７ｓＭ／１２の濃度のＮＡＤ、および約７〜約Ｉ
Ｏ１好ましくは約８〜約９．５、さらに好ましくは約８
５〜約９のＩ）　Ｉ−１を付与するに充分なバッファー
をも含む。適当なバッファーは当該技術分野でよく知ら
れており、その例としては、たとえば、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（トリス）、Ｌ−グルタミン
酸（グルタミン酸塩）、２−アミノ−２−メチル−１，
３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）などが挙げられる。

トリスバッファーとグルタミン酸塩バッファーの組合わ
せが特に好ましい。

それゆえ、有用なアッセイ試薬システムは、それぞれ別
々の容器に入れた少なくとも３種のＬ　Ｄ　Ｈアッセイ
試薬のキットからなる。各アッセイ試薬は液体の形態で
あってよい。基質とバッファーに加えて安定化剤および
保存剤を含んでいるのが好ましい。適当な安定化剤とし
ては、エチレンジアミン四酢酸、およびその塩などの金
属イオンキレート化剤が挙げられる。適当な保存剤とし
ては、硫酸ゲンタマイシンなどの抗生物質、アジ化ナト
リウム、ホウ酸などが挙１ｆられる。

別の態様として、少なくとも１つのアッセイ試薬は、粉
末状または凍結乾燥した形態で供給して希釈液で再構成
して使用することもできる。そのような態様においては
、希釈液はアッセイ試薬の構成分の一部を含有する水の
みからなっていてよい。

一つの好ましい態様において、Ｌ　Ｄ　ＩＩに対して標
準を経験的に導き出すことができる。完全なＬＤＨイソ
酵素プロフィルは、２つの測定パラメーターを用いたｌ
または２以上の代数式により数学的に決定することがで
きる。代数式は、実施例１０に記載するように、イソ酵
素プロフィルを記述するために用いるのが好ましい。血
清の電気泳動図から得られた既知の特徴的なＬＤＩＩイ
ソ酵素プロフィルからなるデータの集合に線形回帰分析
を適用し、そうして定められた曲線にこのイソ酵素プロ
フィルを適合させる。このイソ酵素プロフィルに付随す
る疾患状態は、Ｌ　Ｄ　Ｈの生理学的採取源を診断する
のに用いることができる。適合さＵ゛るために、これら
の曲線を２つの測定パラメーターでプロットする。デー
タを適合させるために、コンピューター処理した線形多
項回帰分析モデルを用いるのが好ましい。当業者であれ
ば、他のデータ適合プログラムおよび数学モデルを用い
ることができることがわかるであろう。

本発明のアッセイ法により得られたアッセイ結果を比較
するために作成した漂檗は、記憶能を有するアナライザ
ー装置にそのまま記憶させるのが好ましい。たとえば、
標準は、自動臨床アナライザー中に記憶させた各測定パ
ラメーターに適合させた代数式かまたは曲線、またはそ
の両方であってよい。別の態様として、そのような標準
は、容易に比較することができるようないかなる記憶手
段中に保持することらできる。記憶手段の例としては、
コンピューターのディスクメモリー、充分なプログラミ
ングおよび記憶能を有する手持式（ｈａｎｄ　−ｈｅｌ
ｄ）カルキュレータ−またはアナログ読み取り手段、た
とえば期待値を適当な読み取り窓またはスロットから読
み取ることのできろダイアル化セレクターホイールまた
はスライド化セレクターヂャートが挙げられる。

好ましい態様において、データの集合は、選択された酵
素を含んでいることが知られている生物学的流体のよう
な一群の試料の、測定した特徴的で完全なイソ酵素プロ
フィルからなる。試料群の、酵素を含有する生物学的流
体の各試料に付随する生理学的疾患状態もまた知られて
いる。従、・て、ある種の疾廖状態に付随する特徴的な
酵素プロフィルまたは該酵素の採取源を決定することか
できる。

本発明の方法の一つの態様において、乳酸脱水素酵素（
ＬＤＩ（）の完全なイソ酵素プロフィルを、好ましくは
血清を用いて定量的に決定することかできる。全面から
血清を分離すること以外は、アッセイ前に試料をそれ以
上操作する必要かない。

Ｌ　Ｄ　Ｈアッセイにおいては、選択した第一のサブユ
ニットはＬＤＨのｌｌ−サブユニットであり、選択した
第二のサブユニットはしＤＨのＭ−サブユニットであり
、同定した選択イソ酵素は■１−サブユニットのホモテ
トラマー（ＬＤ−１）である。

ＬＤ−１アツセイ試薬は、他の非選択イソ酵素の測定し
得る酵素活性を不活化し得るカオトロープ剤を含んでい
るのが好ましい。

２つのＬ　Ｄ　ＨサブユニットおよびＬＤ−１の酵素活
性は、分光測光手段（自動臨床多重試験アナライザーな
ど）により得るのが好ましい。経験的に導かれたけ学を
用いるのが好ましい。有用な経験的標卆は、Ｌｌ）−１
およびＭ−サブユニットに基づいてイソ酵素プロフィル
を定１的に記述するように適合させたｌまたは２以上の
代数式からなる。適合させるために、既知の疾患状態に
付随する血清のＬ　Ｄ　Ｈ電気泳動図からなるデータの
集合に線形回帰分析を適用することにより曲線を作成す
る。従って、病理学的状態の原因となっている器官採取
源または生理学的採取源を迅速に決定して適当な治療を
行うことかできる。

本発明による好ましい多重アッセイ試薬システムは、ヒ
ト血清中の完全なＬＤ）Ｉイソ酵素プロフィルを定量的
に決定する目的で本発明のアッセイ法に使用するのに適
した３種のＬＤＨアッセイ試薬からなる。第一Ｌ　Ｄ　
Ｈアッセイ試薬は、Ｈ−サブユニットとＭ−サブユニッ
トとの酵素活性の相対的な差異を定量することのできる
少なくとも１つの基質を含み、このアッセイ試薬を生物
学的流体の第一部分と混合したときに第一の相対測定値
を得ろことができる。

第二Ｌ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬も同様に、この試薬を生物
学的流体の第二部分と混合したときに、■」サブユニッ
トとＭ−サブユニットとの酵素活性の相対的な差異を定
量することのできる少なくと乙１つの基質を含む。しか
しながら、第三アッセイ試薬の基質特異性は第一アッセ
イ試薬の括質特シーＮ性とは充分に異なるように選択さ
れており、第の相対測定値とは異なる第二の相対測定値
を得ろ。

第一ＬＤＨアッセイ試薬と第二Ｌ　Ｄ　Ｉ−１アツセ（
試薬の基質濃度は、各サブユニットの活性効率の差異が
最大となるように最適化するのが好ましい。

この目的のために、最適化はホモテトラマーであるＬＤ
−１とり、Ｄ−５の酵素活性の差異に基づかせることが
できる。たとえば、第一ＬＤＨアッセイ試薬はＨ，サブ
ユニット−Ｍ４サブユニットの酵素活性に最適化し、第
二ＬＤＨアッセイ試薬はＭ、−Ｉｌ、酵素活性に最適化
する。ついで、■４−サブユニットおよびＭ−サブユニ
ットについての組合わせ測定値の合計から同時解法によ
り全Ｌ　Ｄ　Ｈ酵素活性を決定することができろ。

血ｒ青中のＬ　Ｄ　Ｉ（を定量的に決定するための好ま
しい態様において、本発明の試薬システムの第三アッセ
イ試薬は、米国特許出願第５５，１０７号および対応ヨ
ーロッパ特許出願第２９２，８３８号谷明細書に記載さ
れているＬｌ）−１特異的アツセイ試薬である。ＬＤ−
１特異的アツセイ試薬は、他の非選択イソ酵素の酵素活
性を同時に不活化するがＬＤ−１の活性は安定のまま保
持するカオトロープ剤を含んでいる。基質濃度は、この
試薬により直接測定したしＤ−１活性が、全Ｌ　Ｄ　ｔ
ｌを測定することので、きるアッセイ試薬および同量の
［純粋なＪＬＤ−１を用いて得られるＬＤ−１活性と同
等になるように最適化する。

本発明のアッセイ法によりヒト血清をアッセイするため
の特に好ましいＬ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬システムにおい
て、第一アッセイ試薬は酪酸塩基質を含み、第三アッセ
イ試薬は乳酸塩基質を含み、第三アッセイ試薬は乳酸塩
基質およびカオトロープ剤を含み、各アッセイ試薬はさ
らにＮＡＤおよび約８〜約９．５のｐａｌを付与するの
に充分なバッファーを含んでいる。第三アッセイ試薬中
のカオトロープ剤は、過塩素酸ナトリウムであるのが好
ましい。

使用した物質の用語説明 特にことわらない限り、下記に掲げる物質を実施例１−
１０および図面に用いた。

前置： ！、Ｌ−乳酸塩の濃度は、Ｌ−乳酸のナトリウム塩のス
トック溶液中の活性なし一乳酸含量に基づいていた。

２、Ｌ−２−ヒドロキシ酪酸塩の濃度は、Ｌ２−ヒドロ
キシ酪酸のナトリウム塩のストック溶液中の活性なＬ−
２−ヒドロキシ酪酸含量に基づいていた。

３、ＮＡＤとは酸化型のニコチンアミドーアデニンノヌ
クレオチド（ＮＡＤ“）をいう。

バッファー ４、トリスとは、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル
）−１，３−プロパンジオールとしても知られているト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの市販のバッフ
ァー溶液（ｐＨ約７〜８）をいう。

５、グルタミン酸塩とは、Ｌ−グルタミン酸バッファー
溶液（ｐＨ約８〜９）をいう。

カオトロープ剤： ６、過塩素酸ナトリウムから活性な過塩素酸塩カオトロ
ープアニオン含量を得る。

安定化剤ニ ア、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩などの、フ
リーラジカルの生成を抑制することのできる金属イオン
キレート化剤を調製する。

保在剋： ８、硫酸ゲンタマイシンなどの構成物質型の保存剤を調
製する。

酵素： ９、最適化のために用いたヒトＬＤ−１（血球）および
ヒトＬＤ−５（胎盤）はシグマ・ケミカル・カンパニー
（セントルイス、ミズーリ）から得た。

つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１〜５ これらの実施例は、本発明のアッセイ法に使用するのに
適したＬ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬の組成物を記載したもの
である。これら組成物は、ＮＡＤの還元をモニターする
ことができるように、所望のｐＨが約８〜約９．５、好
ましくは約８．５〜約９であるときに特に有用である。

吸塵　　　　　　　　　実施例Ｎｏ（ｍＭ／Ｑ＊）（１
）（２）（３）（４）（５） １００　　２００ （ａ）Ｌ−２−七ドロキシ酪酸 （ｂ）Ｌ−乳酸 （ｃ）ＮＡＤ （ｄ）トリス （ｅ）グルタミン酸塩 （ｆ）カオトロープ剤 ４００　　　８７ ７　　７　　７　　７ １２０　　１２０　　１２０　　１２０１３　　　１３
　　　１３　　　１３ （ｇ）安定化剤　　　　Ｑ、Ｓ、＊＊Ｑ、Ｓ、　　Ｑ、
Ｓ、　　Ｑ、Ｓ、　　Ｑ、Ｓ。

（ｈ）保存剤　　　　　Ｑ、Ｓ、　　Ｑ、Ｓ、　　Ｑ、
Ｓ、　　Ｑ、Ｓ、　　Ｑ、Ｓ。

（注）＊：基質またはカオトロープ剤の活性に基づく。

＊＊：Ｑ、Ｓ、は充分量を意味する。

実施例１〜５の組成物は、液体の形態で新たに調製する
ことができる。別の態様では、組成物の一部を粉末の形
態で調製し、使用に際して希釈溶液中に分散させること
ができる。粉末の態様においては、液体試薬を調製した
ときのＮＡＤの有用な耐用期間を延ばすための充分な安
定化剤とともに、都合よく有用な重量の粉末を得るため
に充分な量の実質的に不活性な充填剤を粉末中に含ませ
ることができる。

他の態様においては、基質の一部分を粉末部分に含ませ
、基質の残りの部分を液体部分に含ませた２層アッセイ
試薬キットとすることもでき、緒に混合してＬ　Ｄ　［
（アッセイ試薬を調製する。

本発明の多重アッセイ試薬システムに上記ＬＤＨアッセ
イ試薬を使用することに関しては、実施例１の組成物が
第一ＬＤＨアッセイ試薬として特に好ましく、Ｌ　Ｄ　
Ｉ−１のＭ−サブユニットに比較してＨ−サブユニット
に対して最適化した酪酸塩基質特異性を有する。実施例
３の組成物は第二−Ｌ　Ｄ　［（アッセイ試薬として特
に好ましく、Ｌ　Ｄ　Ｉｔの１１−サブユニットに比較
してＭ−サブユニットに対して最適化した乳酸塩基質特
異性を有する。

実施例５の組成物は、第三のＬＤ−１特異的アツセイ試
薬として使用するのに特に適している。

実施例６ 本実施例では、本発明のアッセイ法にＬＤ−１特異的ア
ツセイ試薬として使用するのに適した、粉末部分と希釈
液部分とからなる２層ＬＤ−１特異的アッセイ試薬を記
載する。粉末１ｇ当たり希釈液３０ｘＱで再構成して各
活性成分の濃度が下記のようになるように、下記粉末部
分を特別に調製した。

灰分　　　　　　　　　再構成試薬のｔａ　Ｍ　／（１
粉末部分 り一乳酸塩　　　　　　　　　　４７ ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　７トリス　　　　
　　　　　　　　１２０グルタミン酸　　　　　　　　
　　１３安定化剤　　　　　　　　　　　Ｑ、Ｓ。

充填剤　　　　　　　　　　　　Ｑ、Ｓ。

希釈液部分 り一乳酸塩　　　　　　　　　１６５ 過塩素酸塩　　　　　　　　　８２５ ｐＨ約９にするための 水酸化ナトリウム　　　　　　　Ｑ、Ｓ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｑ、Ｓ。

別のやり方として、非酵素特異的全Ｌ　Ｄ　Ｈアッセイ
試薬として使用するために、上記粉末部分を上記希釈液
部分ではなく水３０Ｊ１１２当たり上記粉末１．０９を
溶解することによって再構成することができる。

再構成したＬＤ−１特異的アツセイ試薬を、全Ｌ　Ｄ　
Ｈアッセイ試薬に対して使用するのと同じアッセイ態様
、試料および装置を用いて使用するときは、その結果測
定して得られる酵・素活性はＬＤ−１イソ酵素のみに基
づくものである。さらに、得られたＬＤ−１活性率位は
、同量の純粋なＬＤｌを全Ｌ　Ｄ　Ｈ試薬により、たと
えば上記粉末部分を希釈液の代わりに水で再構成してア
ッセイしたときに測定されるであろうＬＤ−１活性に正
比例した。

他のＬＤ−１特異的アツセイ試薬は、市販の粉末状また
は液体状の全ＬＤＨアッセイ試薬からｊ１ｑ製すること
ができる。希釈液部分の正確な調合は、最適化の研究に
より下記のようにして行うことかできる。−群のヒト血
清試料（ＬＤＨおよびＬＤルベルが上昇したものを含む
）を入手し、ＬＤ−１決定のための確立された免疫学的
方法、電気泳動法またはクロマトグラフィー法（すなわ
ち、参照方法）によりＬＤ−ルベルを決定する。

このデータを、異なる濃度のＬ−乳酸塩および／または
過塩素酸ナトリウムを含む種々の希釈溶液で市販のＬＤ
Ｈ試薬粉末を再構成して得られた乙の（すなわち、実験
条件）と相関させる。

過塩素酸ナトリウムは、過塩素酸アニオン濃度が約１０
０〜約５０００　ｍＭ／Ｑ、好ましくは５００〜約１５
００　ｍＭ／Ｉ２、−層好ましくは６００〜約１０００
　ｍＭ／１２の範囲であってよく、Ｌ−乳酸塩は、約Ｏ
〜約５００ｍＭ／１２の範囲であってよい。ついで、線
形回帰分析を用い、ＬＤ−１参照法で得られた結果を各
実験条件のものと比較して各比較について傾き、切片お
よび相関係数の値を得る。最適化ＬＤ−１試薬は、傾き
および相関係数がそれぞれほぼ単一（ｕｎｉｔｙ）にな
り、切片値がＯに近接する希釈液調合を選択することに
より、上記分析から導き出すことができる。

上記手順は、全ＬＤＨのための既存の粉末状または凍結
乾燥状態の試薬調合物を、ＬＤ−１イソ酵素の選択アッ
セイのために容易に適合させることを可能にするもので
ある。一つのヒト試料を用いて全ＬＤＨアッセイおよび
ＬＤ−１アツセイから得られた結果は、容易に組み合わ
せてＬＤ−１：ＬＤｌ比を得ることかでき、これは診断
的価値を有することがわかっている。

実施例７ 本実施例は、単工程アッセイ混合から実施例６のＬＤ−
１特異的アツセイ試薬を用いて得られた結果と、血清Ｌ
Ｄ−１の単離のための多工程標へ（・法の結果との間に
優れた相関関係があることを示す。

単工程アッセイ混合は、ヨーロッパ特許出願下２９２．
８３８号明細書に記載されている一工程法に従い、血清
試料を面調製することなく、試料を実施例６のＬＤＩ特
異的アッセイ試薬と混合することからなる。２つずつの
アリコート試料を、アボット■Ｐ二色バッチアナライザ
ー上およびアボットスペクトラム診断システム臨床アナ
ライザー上（それぞれ運動モードにある）で、アボット
Ａ−ＧＥＮＴ、ＬＤＨ試薬（基質、ＮＡＤおよびバッフ
ァーを含有するがカオトロープ剤は含有しない）を用い
て直接アッセイした。アボットＶＰ装置しユで２．５μ
ｅの試料を、アボットスペクトラム装置上で５μａの試
料をそれぞれアッセイするのに約２５０μ個のアッセイ
試薬を用いた。

比較のため、ロツシュ・ダイアグノスティック拳システ
ムズ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ）（ナシトリー、ＮＪ）の市販のＩＳＯＭＵＮＥ−
ＬＤ法に従い、血清試料を面処理した。ＩＳＯＭＵＮＥ
−ＬＤ法およびＬＤ−１を単離するためのアッセイは以
下のようにして行った。試料のアリコートに抗ＬＤ−５
（Ｍ４）血清（ヤギ）を加え、混合し、周囲温度（室温
）にて５分間インキュベートした。

ついで、このアリコートに第二の抗体懸蜀液（ロバ）を
加え、混合し、周囲温度にてさらに５分間インキユベー
トシ、ついで遠心分離した。ついで、この上清の２つず
つの５μｇおよびｌＯμＱの試料を上記のようにしてア
ッセイし、通常の試薬、この場合はアボット／ＩＧＥＮ
Ｔ　　ＬＤＩ−１試薬を用いてＬＤ−１イソ酵素活性を
決定した。

線形回帰分析のためにコンピューター処理したプログラ
ムを用い、谷臨床装置上での２つの方法の間の相関関係
を決定し、その結果をグラフに示した。そのグラフは、
アポブトＶＰアナライザー上で行ったアッセイについて
は第１図に、アボットスペクトラムアナライザー上で行
ったアッセイについては第２図に示しである。実施例６
のＬＤ−１特異的アツセイ試薬を用いて得られたＬＤ−
１アツセイ結果はＹ軸上に、多工程標準アッセイの結果
はＸ＃Ｊ上にプロットした。完全な相関関係では、切片
が０、傾きが１．０でグラフが２分される。相関関係の
結果を下記に示す。

１ボフトｖＰ標準＊　　　　Ｉポ゛アトスペクトラム標
賭＊ｖｓ　ＬＤ−１試薬Ｕ　　ＶＳ　ＬＤ−１試薬＊＊
切片　　　　−０，０４１０，４４５ 傾き　　　　　　１．０１　　　　　０，９４７相関係
数　　　０．９９７　　　　０．９９４試料数　　　　
　１０２　　　　　９２（注）＊：多工程法ＬＤ−ｌア
ッセイ（Ｉ　ＳＯＭＵＮＥ−ＬＤ試薬を用いて行い、つ
いでＡ　−Ｇ　Ｅ　Ｎ　ＴＬ　Ｄ　Ｈ試薬で決定） ＊＊：実施例６のＬＤ−１特異的アツセイ試薬を用い行
った一工程法 上記結果は、まず血清試料からＬＤ−１を単離し、つい
でＬＤ−１活性を測定する多工程法と、ＬＤ−１活性の
単離と測定を同時に行う一工程法におけるＬＤ−１特異
的試薬との間に実質的に優れた相関関係が存在すること
を示していた。従って、アッセイ混合物を調製する一工
程法、およびＬＤ−１特異的アツセイ試薬が本発明のア
ッセイ法に特に好ましいことがわかった。

実施例８ 本実施例では、Ｍ−サブユニット（Ｍ４）の酵！活性の
活性効率とｌ−１−サブユニット（Ｉ（、）の酵素活性
の活性効率との差異を最大にするための、Ｌ　Ｄ　Ｈア
ッセイ試薬の最適化を記載する。ついで、最適化した第
一Ｌ　Ｄ　ＩＩアッセイ試薬の正確な調合を選択するこ
とができる。

Ｌ−２−ヒドロキシ酪酸塩基質の濃度を２０〜約１００
ｍＭ／１２に変化させた他は、実施例１のＬ　Ｄ　Ｈア
ッセイ試薬に対応するＬＤＨアッセイ試薬の組成物を調
製した。分画ｌ］−サブユニットおよびＭ−サブユニッ
トの活性の活性効率の差異をＬＤ−１およびＬＤ−５を
用いて決定した。他の点については、アッセイ混合物の
調製法、試料容積の大きさおよびＶＰ二色バッチアナラ
イザーは実施例７に記載したものを使用した。

比較のため、このデータの活性効率を、Ｌ−乳酸濃度が
７０ｍＭ／１２のし一乳酸塩基質を含むアッセイ試薬を
用いて決定した酵素活性の活性効率％と相対してグラフ
にした。１（４（四角形で示す）およびＭ、（十字形で
示す）について第３図に示したグラフ化データから、（
ｌ−１−サブユニット）−（Ｍ−サブユニット）０−ｔ
、−Ｍ、）としての試薬の活性効率の最大差異が決定さ
れ、第３図中に破線で示すように約１００　ｍＭ／ｅの
酪酸塩濃度にて最適化された。この最適化基質濃度にお
いて、Ｌ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬の活性効率は、Ｈ−サブ
ユニットに対して約６９．６％、Ｍ−サブユニットに対
して約２０．７％と評価された。この最適化アッセイ試
薬は、本発明のＨ−サブユニット特異的「第一」Ｌ　Ｄ
　Ｈアッセイ試薬に適していると評価された。

実施例９ 実施例３のＬＤＨアッセイ試薬に対応するＬＤＨアッセ
イ試薬の組成物を調製し、乳酸塩基質を約１００ｍＭ／
Ｃ〜約５００ｍＭ／１２ニ変化させた他は実施例８の手
順を繰り返した。

第４図に示したグラフ化データから、（Ｍ−サブユニッ
ト）−（夏４−サブユニットＸＭ、−Ｈ，）としての試
薬の酵素的活性効率の最大差異は、約４００ｍＭ／１２
のし一乳酸塩濃度において最適化された。この最適化Ｌ
ＤＨアッセイ試薬の活性効率は、■−サブユニットに対
しては約４５．４％、Ｍ−サブユニットに対しては約９
５．２％と評価された。

この最適化アッセイ試薬は、多重アッセイ試薬システム
（第一Ｌ　Ｄ　Ｉ−１アツセイ試薬が実施例８において
最適化されたもの）のためのＭ−サブユニット特異的［
第二ＪＬＤＨアッセイ試薬として適していると評価され
た。

Ｘ嵐性上ｙ 本実施例では、既知のイソ酵素プロフィルからなるデー
タの集合およびＬＤＨアッセイ試薬システムから導き出
された、ＬＤＨのための経験的標準の作成について記載
する。本実施例ではまた、残りのＬＤＨイソ酵素の活性
を数学的に決定することのできる２つの測定パラメータ
ーとして、Ｍ−サブユニットおよびＬＩ）−１イソ酵素
の部分酵素活性を選択することの適切さについても記載
する。

血清試料は、オッタムワ・リージョナル・ヘルス・ファ
ウンデーション（Ｏｔｔｕｍｗａ　ＲｅｇｉｏｎａｌＨ
ｅａｌｔｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（オッタムワ、ア
イオワ）から入手した。この試料は、少なくとも８５人
の患者からなる比較的大きな患者集団を示していた。

この試料は、−人の患者から１または２以上の連続サン
プリングも示し、最大１０のサンプリングを一人の患者
から行っていた。電気泳動図を作成し、広範囲の病理学
的状態を伴う血清からの広範囲の既知のＬＤＨイソ酵素
プロフィル値を有するデータの集合を得た。市販のバン
ド型電気泳動キット（ベックマンＰＡＲＡＧＯＮ−ＬＤ
）を製造業者の説明書に従って用いた。

Ｌ　Ｄ　Ｈイソ酵素の変異性は１つの機能性サブユニッ
ト組成物および１つのイソ酵素を定量することにより予
測することができるとの仮定に基づき、８５の電気泳動
図を示す１組みのデータを２変数の線形多項回帰分析に
供した。下記式（１）に示すよく知られた最小二乗法（
二重平均（ＲＭＳ）誤差としても知られる）を用い、１
組みのデータ得点を得た。

（１）　　Ｄ＝Ａ＋＋ＡｔＸ＋Ａ３Ｘ”＋Ａ４Ｙ＋Ａｓ
Ｙ”＋Ａ　ｓ　Ｘ　Ｙ　±Ａ　７　Ｘ　”　Ｙ　＋　Ａ
　ａ　Ｘ　Ｙ　”　＋　Ａ　ｅ　Ｘ　’　Ｙ　２（式中
、Ｄ＝従属変数、ｘ、ｙ−独立変数：および゛Ａ１〜Ａ
、＝独立変数の係数） Ｍ−サブユニットの％を独立変数ｒＸＪとして用い、各
イソ酵素の％を独立変数ｒＹＪとしてかまたは従属変数
「Ｄ」として評価した。

各イソ酵素についての係数（Ａ、〜Ａ、）は、パーソナ
ルコンピューター（アップル■モデル）で使用するため
にポリノミアル・リグレッション・イン・トウー・バリ
アブルズ（Ｐｏｌｙｎｏａ＋ｉａｌＲｅｇｒｅｓｓｉｏ
ｎ　ｉｎ　Ｔｗｏ　Ｖａｒｉａｂｌｅｓ）のために書か
れた市販のコンピュータープログラムを用いて得た。こ
のプログラムのアウトプットは、９つの式係数、ついで
推定値のＲＭＳ誤差をプリントした。

このアウトプットから、ＸおよびＹのいかなる値に対し
ても従属変数りの値を予測することができた。

８５の電気泳動図についての回帰分析のＲＭＳ誤差を下
記表にまとめて示す。

従属変数 Ｙ変数　ＬＤ−Ｉ　　ＬＤ−２１、Ｄ−３ＬＤ−４ＬＤ
−５合計１、Ｄ−１−２，２１２，６９１，７６１，８
１８，４７ＬＤ−２２，３３−３，６９２，３４３，２
６１１，６２ＬＤ−３８，３６４，２９−１，５５１，
３４１５，５４ＬＤ−４４，５９４，９７３２１−２，
４０１５１７ＬＤ−５３，２７３，８２１，５３１，１
８−８，９０上記データは、ＲＭＳ誤差の合計値が最小
（すなわち８．４７）であることに基づき、ＬＤ−１イ
ソ酵素が他のイソ酵素に対して最も適合したことを示し
ている。

４７４の電気泳動図を示す第２の組みのデータについて
のイソ酵素プロフィルを、以下のようにして代数的に決
定した。各試料における全％Ｍサブユニット［Ｘ＝０．
２５（％ＬＤ−２）＋０．５（％ＬＤ−３）＋０．７５
（％ＬＤ−４）十ＬＤ−５１および％ＬＤ−１（Ｙ）を
独立変数として用い、式％式％ びＬＤ−５の％（それぞれ従属変数Ｄ）を予測した。

最小二乗法により各イソ酵素の係数（Ａ、〜Ａ、）を再
び得た。得られた式は、イソ酵素プロフィルを正確に示
すと評価された。

係数についての適合のＲＭＳ誤差（計算したＤ値）およ
び４７４の電気泳動図に対して得られた全Ｌ　Ｄ　Ｈに
基づく％Ｌ　Ｉ）　−２、ＬＤ−３、ＬＤ４およびＬＤ
−５イソ酵素のデータ範囲は下記のとおりであった。

イソ酵素　ＬＤ−２ＬＤ−３ＬＤ−４ＬＤ−５合計２．
０３　２．７２　１，４１　１．４９　７．６５％範囲
　　１１〜５３６〜３３１〜２３０〜６８上記データに
示すように、電気泳動データの集積が８５から４７４に
増加するとＲＭＳ誤差の合計値は最小の７．６５に減少
した。

実際のデータ値に対する上記プール予測値の回帰分析を
、イソ酵素当たり４７４の患者の観察データ得点の適合
および１８９６の組合わせデータ得点の適合について下
記に示す。

各イソ酵素適合および組合わせ適合の回帰分析ＬＤ−２
ＬＤ−３ＬＤ−４ＬＤ−５組合わせ切片　　　３．８ｇ
　　５．１４　１．７ｇ　　０．２２　　０．３４Ｙ切
片の 標準誤差　１．９３　２．３１　１．２０　１．４７　
　１．９７傾き　　　　０．９０　０．７２　０．７２
　０．９８　　０．９８傾きの 標準誤差　０．０１　０．０２　０．０２　０．０１　
　０．００相関係数　０．９５　０．８５　０．８５　
０，９９　　０．９９観察数（ロ）　　４７４　　４７
４　　４７４　　４７４　　１８９６従って、予測値−
０，９８（実際の測定（ａ）＋０．３４　％（ｎ＝　１
８９６として実際のデータの相関係数＝０．９９）であ
ることが回帰分析により、ノ；された。相関は許容し得
るものと評価された。

上記結果は、２つの測定パラメーター、すなわち分画Ｍ
−サブユニットおよびＬＤ−１（全Ｌ　Ｄ　Ｈの％とし
て）を比較することにより、完全ＬＤＨイソ酵素プロフ
ィルを定量的に決定し得ろことを示していた。

第５図は、実際の４７４の電気泳動図からの情報に基づ
いて得られたＬＤＨイソ酵素データベースを、％Ｍ−サ
ブユニットおよび％ＬＤ−１イソ酵素によりプロットし
たグラフを示す。このデータは、上記８５の電気泳動図
とさらに３８９の電気泳動図からの累積情報を含む。

比較のため、第６図は、％Ｍ−サブユニットと％ＬＤ−
１イソ酵素により定められた■、ＤＨイソ酵素ユニバー
ス（ｕｎ　１ｖｅｒｓｅ）を示すグラフである。

このユニバースは、全ＬＤ−１変量から全ＬＤ５変量へ
の直線勾配により完全に定められた境界、全ＬＤ−１変
量から全ＬＤ−２変量への直線勾配により完全に定めら
れた境界、および％Ｍ−サブユニットの最大変化度（ｖ
ａｒｉａｂｉｌｉＬｙ）により定められた境界からなる
。第６図からさらにわかることは、％イソ酵素かサブユ
ニットの単なる２項分布により得られる場合には、すべ
ての試料は破線上に分布することである。ＬＤＨイソ酵
素プロフィルの標準値は箱で囲まれた領域で示され、こ
の標準からの酵素プロフィルの特定の変異により、急性
心筋梗塞（ＡＭＦ）、うつ血性心不全（ＣＨＦ　）、肝
臓または筋肉疾患などの種々の病理学的状態を決定する
ことができる。

加えて、第７図は、血清の４７４の電気泳動図の累積％
値からの、予測された電気泳動データについてのＬＤ−
１：ＬＤ−２の等級比（波線で示す）および実際の電気
泳動データについてのＬＤ：ＬＤ−２の等級比（実線で
示す）を示すグラフである。

上記数学モデルで得られる良好な相関に基づき、２つの
パラメーター、すなわち％Ｍ−サブユニ・ソトと％ＬＤ
−１イソ酵素を本発明のＬＤＨアッセイ法に採用した。

これらの所見はまた、イソ酵素プロフィルを予測するた
めに上記２つのパラメーターを用いることの適切さを示
しており、一般に他の研究者の所見と一致するものであ
る。

たとえば、フェルトマン（Ｆ　ｅｌｄｍａｎ）は最近、
血清ＬＤＨイソ酵素パターンはＭ−サブユニットの分画
（Ｐ（至））および５つのイソ酵素の中での該サブユニ
ットの分布に帰せられるという結論を出した［フェルト
マン、［ザ・Ｐｍ・ディストリビューションニア・モデ
ル・フォア・インターブリーティング・ＬＤ・アイソザ
イム・パターンズ（Ｔｈｅ　ＰｍＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉ
ｏｎ：　Ａ　Ｍｏｄｅｌ　Ｆｏｒ　Ｉ　ｎｔｅｒｐｒｅ
ｔｉｎｇＬＤ　　Ｉｓｏｚｙｍｅ　Ｐａｔｔｅｒｎｓ）
Ｊ、Ｃｔｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ａ　ｅｔａ。

１３５．１０９〜１３４（１９８３）参照］。しかしな
がら、フェルトマンの提唱したモデルと違って、本発明
のアッセイ法は、２つのパラメーターすなわちＭ−サブ
ユニットの分画および全ＬＤ１（ともに直接均一反応に
より決定される）から完全ＬＤＨイソ酵素プロフィルを
直接的に示すことができる。

実施例８および実施例９で説明した第３図および第４図
は、それぞれ、各サブユニットの活性効率の差異が最大
となるように各アッセイ試薬の基質特異性を最適化する
ことによる、第一アッセイ試薬および第二アッセイ試薬
を選択するための一つの好ましい方法を示す。この目的
のために、Ｈ−サブユニットのホモテトラマー（Ｈ４）
、すなわちＬＤ−１イソ酵素、およびＭ−サブユニット
のホモテトラマー（Ｍ４）、すなわちＬＤ−５イソ酵素
を用いた。これらホモテトラマーを用いて残りの３つの
へテロテトラマー、すなわちＬＤ−２、ＬＤ−３および
ＬＤ−４イソ酵素の相対的親和性を補間することの適切
さは、他の研究者により確認されているしグビエルナ（
Ｇ　ｕｂｉｅｒｎａ）ら、［エスティメーション・オン
・コリレーション・オン・ラクテート・デヒドロゲナー
ゼ・サブユニット・モール・クォータ・ベイスト・オン
・ディファレンシズ・イン・サブストレイト・インヒビ
ジョン（ＥｓｔｉＩＩｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｒｒｅ
ｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＬａｃｔａｔｅＤｅｈｙｄｒｏｇ
ｅｎａｓｅ　５ｕｂｕｎｉｔｓ　Ｍｏ１ｅ　Ｑｏｕｔａ
　Ｂａ５ｅｄｏｎ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　５
ｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｉ　ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）Ｊ、Ｍｏ
１ｅｃ、Ｃｅ１ｌｕ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　ｌ　９．
１６５〜ｌ　７　（１（１９７Ｂ）参照］。

血清中のＬＤＨをアッセイするための好ましい方法にお
いて、多重アッセイ試薬システムは、それぞれサブユニ
ット特異的な第一アッセイ試薬および第二アッセイ試薬
からなる。このアッセイは、各アッセイ試薬が異なる１
組みの活性効率を有することにより異なる測定値が得ら
れ、これから全Ｌ　Ｄ　Ｈ活性を決定することができる
限り、同一または異なる基質に基づくことができる。こ
の目的のため、各サブユニット特異的アッセイ試薬は実
施例８および実施例９に記載したようにして最適化する
ことができる。ＬＤ−１イソ酵素は、実施例７に記載し
たＬＤ−１特異的試薬により直接決定するのが好ましい
。従って、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元（好ましくは約
８〜約９．５のｐ　ｔ−ｔに″おける）は、システムと
しての３つのすへてのアッセイ試薬によりモニターする
ことができる。

ＮＡＤＨの生成速度は、好ましくはランダムアクセスマ
ルチテストアナライザーであるアボット・スペクトラム
診断システムを用い、３４０　ｒｕｎでの吸光度の増加
の割合により分光測光的に測定することができる。その
ような装置を用い、各アッセイを本発明のアッセイ法に
より同時に行うことができる。

ついで、上記最適化第一アッセイ試薬および最適化第ニ
アッセイ試薬で得られた測定値を合わせることにより、
血清中の全酵素活性、Ｌ　Ｄ　Ｈを得ることができる。

たとえば、１００ｍＭ／ｆ２の基質としての１７−２−
ヒドロキシ酪酸塩、７ｍＭ／ｌ！ｔ／）ＮＡＤ＋および
充分なグルタミン酸塩バッファー（１）ｌ−１約８８）
を含有する実施例８の最適化ＬＤＩ！アッセイ試薬（以
下、「アッセイ試薬Ａ」としい・））、並びに４００ｍ
Ｍ／Ｃのし一乳酸塩、７ｍＭ／ｆ２のＮ　Ａ　ｌ）＋お
よび充分なグルタミン酸塩バッファー（ｐ　Ｉ−１約８
，８）を含有する実施例９の最適化Ｌ　Ｄ　＋１アツセ
イ試薬（以下、「アッセイ試薬Ｂ」ともいう）から得ら
れた活性効率に関する情報から下記代数式（２）および
（３）を記載することができる。

（２）Ａ＝０．６９６（Ｈ）＋０．２０７（Ｍ）（３）
　　　Ｂ＝０．４５４（Ｈ）＋０．９５２（Ｍ）全Ｌ　
Ｄ　Ｈ酵素活性はＨ−サブユニットの値とＩ！サブユニ
ットの値の合計であるが、下記式（４）に記載するよう
にして等式（２）および（３）を同時に解くことにより
得ることができる。

（４）Ｍ＋Ｈ＝０．８７５１（Ａ）＋０．８６　ｏ　９
（Ｂ）＝全ＬＤＨ活性 分画Ｍ−サブユニット活性および％Ｍ−サブユニット活
性は、それぞれ下記式（５）および（６）に従って決定
することができる。

（５）Ｍ−サブユニット活性−−０，７９７（Ａ）＋１
．２２４（Ｂ） （６）％Ｍ−サブユニットーＭ−ザブユニット／全ＬＩ
］−１Ｘ　Ｉ　ＯＯ この％値は、全Ｌ　Ｄ　ｌ−１活性の値を等式（４）か
ら得た場合の多項回帰等式（１）におけるｒＸＪパラメ
ーターである。

本発明のＬ　Ｄ　Ｈアッセイ法において、等式（１）に
おけるｒＹＪパラメーターの％値は、第三のＬＤＩ特異
的アッセイ試薬を用いてＬＤ−１活性を直接測定するこ
とにより得ることができる。この情報から、下記等式（
７）による相対的関係を記載することができる。

（７）％ＬＤ−１＝ＬＤ−１活性／全ＬＤＨ活性（式中
、全Ｌ　Ｄ　Ｈ活性は等式（４）から得ることができる
）それゆえ、所定の生物学的流体試料中のＬ　Ｄ　Ｉ（
の完全なイソ酵素プロフィルは、等式（６）および（７
）から得られた値を等式（１）中に代入することにより
定量的に記載することができる。ついで、等式（６）で
得られたＭ−サブユニットの定量部分％および等式（７
）で得られた％ＬＤ−１を、上記２つの測定パラメータ
ーでプロットしたＬ　Ｄ　Ｈの特徴的イソ酵素プロフィ
ルからなるデータの集合に回帰分析を適用することによ
り定められた標桑曲線と比較することにより、上記イソ
酵素プロフィルを適合させることができる。

そのようなデータの集合は、実施例に説明するようにヒ
ト血清からの電気泳動データから得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアッセイ法に使用するのに適したＬ
Ｄ−１特異的アツセイ試薬を用いた単工程アッセイ混合
により得られたＬＤ−１アツセイ結果を、アボットｖＰ
二色バッチアナライザーを用いた多工程標準法により得
られた結果と相関させて示すグラフ； 第２図は、本発明のアッセイ法に使用するのに適したＬ
Ｄ−１特異的アツセイ試薬を用いた単工程アッセイ混合
により得られたＬＤ−１アツセイ結果を、アボットスペ
クトラム診断ンステムアナライザーを用いた多工程標準
法により得られた結果と相関させて示すグラフ； 第３図は、種々の濃度のし−２−ヒドロキン酪酸塩基質
を含むＬ　Ｄ　Ｈアッセイ試薬の最適化を、単一濃度の
し一乳酸塩基質を有するアッセイ試薬の活性効率との関
係により示すグラフ 第４図は、種々の濃度の■７−乳酸塩基質を含むＬＤＨ
アッセイ試薬の最適化を、単一濃度のＬ−乳酸塩基質を
有するアッセイ試薬の活性効率との関係により示すグラ
フ； 第５図は、種々の病理学的状態のヒトから採取した血清
の４７４からなる一群の電気泳動図から得たＬ　Ｄ　Ｉ
−１イソ酵素プロフイルのデータの集合を、％Ｍ−サブ
ユニットおよび％ＬＤ−１酵素活性によりプロットして
示すグラフ； 第６図は、既知のイソ酵素プロフィルを何する疾患状態
が起こる、第５図と同じ２つのパラメーターにより定め
られたＬ　Ｄ　Ｈイソ酵素ユニバースを示すグラフ；お
よび 第７図は、第５図の試料の群からの累積％情報から等吸
付けした、ＬＤ−，１：ＬＤ−２イソ酵素の予測比と同
実測比を示すグラフである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）選択した生物学的流体中に存在する生物学的に活
   性な酵素であって、酵素的に活性な少なくとも２つのサ
   ブユニットからなり生物学的流体中でイソ酵素の混合物
   として存在し得る酵素のイソ酵素プロフィルを定量的に
   決定する方法であって、 （ａ）生物学的流体を少なくとも３つの部分に分けて （ｉ）選択した第一のサブユニットおよび選択した第二
   のサブユニットの酵素活性を測定する１組みの活性効率
   を有する第一アッセイ試薬を用い、該生物学的流体の第
   一の部分について第一のアッセイを行って第一の測定値
   を得、 （ｉｉ）該選択した第一のサブユニットおよび該選択し
   た第二のサブユニットの酵素活性を測定する、該第一ア
   ッセイ試薬の活性効率とは異なる１組みの活性効率を有
   する第二アッセイ試薬を用い、該生物学的流体の第二の
   部分について第二のアッセイを行って第二の測定値を得
   、 （ｉｉｉ）単一の選択した酵素的に活性なイソ酵素の定
   量が可能な第三アッセイ試薬を用い、該生物学的流体の
   第三の部分について第三のアッセイを行って第三の測定
   値を得、 （ｂ）上記工程（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）で得
   た該測定したサブユニットのそれぞれについての定量値
   および該サブユニットの値の合計を決定して生物学的流
   体中の全酵素活性を得、 （ｃ）該第一の選択したサブユニットの合計値および上
   記工程（ｂ）で得た全酵素活性から該第一の選択したサ
   ブユニットの全定量部分濃度を決定して第一の測定パラ
   メーターを得、 （ｄ）上記工程（ａ）（ｉｉｉ）で得た測定値および上
   記工程（ｂ）で得た全酵素活性から該単一の選択したイ
   ソ酵素の全定量濃度を決定して第二の測定パラメーター
   を得、ついで （ｅ）上記工程（ｃ）および（ｄ）で得た測定パラメー
   ターを該選択した酵素についての標準と比較して生物学
   的流体中に存在する該酵素のイソ酵素プロフィルを決定
   する ことを特徴とする方法。
2. （２）標準が、イソ酵素プロフィル中の各サブユニット
   についての既知の確率値から作成し、第一および第二の
   各測定パラメーターに適合させた１または２以上の曲線
   からなる、請求項（１）に記載の方法。
3. （３）標準が経験的に得られたものであり、該経験的標
   準が、第一および第二の各測定パラメーターによりイソ
   酵素プロフィルを定量的に示す１または２以上の代数式
   からなり、該選択した酵素についての既知の特徴的なイ
   ソ酵素プロフィルからなるデータの集合から作成した１
   または２以上の曲線を含む、請求項（１）に記載の方法
   。
4. （４）酵素が、乳酸脱水素酵素、クレアチンキナーゼ、
   アルカリ性ホスファターゼ、リンゴ酸脱水素酵素および
   アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼよりなる群か
   ら選ばれたものであり、生物学的流体が全血、血清、血
   漿、脊髄液および尿よりなる群から選ばれたものである
   、請求項（１）に記載の方法。
5. （５）各アッセイ試薬が、脂肪族鎖中に約３〜４個の炭
   素原子を有するα−ヒドロキシ脂肪族酸およびその酸化
   類似体、還元型または酸化型のニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチド、およびこれらの類似体よりなる群から
   選ばれた基質を少なくとも１種含む、請求項（１）に記
   載の方法。
6. （６）各アッセイ試薬が、約７〜約１０のｐＨを付与す
   るためのバッファーをさらに含む、請求項（１）に記載
   の方法。
7. （７）第三アッセイ試薬が、少なくとも１種のイソ酵素
   特異的基質および該選択したイソ酵素以外のすべてのイ
   ソ酵素の測定し得る酵素活性を不活化するカオトロープ
   剤を含む、請求項（１）に記載の方法。
8. （８）カオトロープ剤が、ＴｃＯ＿４＾−、ＣｌＯ＿４
   ＾−、ＲｅＯ＿４＾−、ＢＦ＿４＾−、ＳＣＮ＾−およ
   びＩ＾−よりなる群から選ばれた離液順列の一つである
   アニオンを有する無機塩である、請求項（７）に記載の
   方法。
9. （９）各アッセイ試薬がニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチドを含む、請求項（１）に記載の方法。
10. （１０）選択した酵素が乳酸脱水素酵素であり、同定さ
    れた第一の選択されたサブユニットがＨ＾−サブユニッ
    トであり、同定された第二の選択されたサブユニットが
    Ｍ−サブユニットであり、同定された単一の選択された
    イソ酵素がホモテトラマーであり、第一アッセイ試薬が
    酪酸塩基質を含み、第二アッセイ試薬が乳酸塩基質を含
    み、第三アッセイ試薬が乳酸塩基質およびカオトロープ
    剤を含み、各アッセイ試薬がニコチンアミドアデニンジ
    ヌクレオチドおよび約７〜約１０のｐＨを付与するのに
    充分なバッファーをさらに含む、請求項（１）に記載の
    方法。