JPH0331226B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、官能性アミノ基をもつチロニン誘導
体類。従来の免疫性担体材に結合したかかる誘導
体類からなる免疫原複合体類、及びかかる免疫原
複合体類に対して製造された対−ヨードチロニン
抗体類に関する。かかる抗体類は、生物学的流体
中のヨードチロニン類を測定するための免疫試験
において有用である。官能性を有するアミノ基を
もつ誘導体類は又、かかる免疫試験、特に、非放
射線同位元素系免疫試験に用いるための標識ヨー
ドチロニン複合体類を製造するのに有用である。 ヨードチロニン類は次の一般式を有する： ここで、β¹及びβ²は、別個に独立して、水素又
はヨウ素である。臨床的に興味のあるヨードチロ
ニン類を、次表に掲げる。

【表】 種々のヨードチロニン類、特に、血清中のホル
モンＴ−３とホルモンＴ−４の濃度の定量測定及
び担体蛋白質甲状腺結合グロブリン（thyoid
binding globulin、TBG）上のヨードチロニン
結合部位の飽和度の定量測定は、甲状腺障害の診
断において貴重な助けとなる。 免疫原複合体類の製造の目的で、ヨードチロニ
ン類は、多種の方法で免疫性担体材にそれらを結
合させて、その誘導体が生成されている。かかる
複合体類に対して製造された抗体類は、ヨードチ
ロニン類の測定用免疫試験に用いられる。又、ヨ
ードチロニン類は、かかる免疫試験に有用な標識
複合体を生み出す所望の標識部分（labeling
moiety）と結合させるために、様々な誘導体が
生成されている。 ヨードチロニン免疫原複合体類を製造するため
に、通常用いられる方法としては、カルボジイミ
ドの存在下で、ヨードチロニンを、その利用しう
るアミノ基及びカルボキシル基を介して、直接
に、担体材上に相対するカルボキシル基及びアミ
ノ基とアミド結合で結合させる方法が挙げられ
る。複合体類の混合物が得られ、従つて、対−ヨ
ードチロニン抗体類の混合物が得られる。これら
の製造方法についてはガリブ等（Gharib et al）、
J.Clin.Endocrinol33巻：509頁（1971）を参照さ
れたい。 米国特許第4171432号には、リボヌクレオチド
と、そのカルボキシ基を介するヨードチロニンと
の結合について記載されている。米国特許第
4040907号には、フエノール性水酸基で誘導体を
生成したヨードチロニン誘導体類と酸素類との結
合について記載されている。 チロキシンとアミト基を用いて、誘導体化した
アミノアシルチロキシン誘導体類の製造について
はEndocrinol89巻：606〜609頁（1971）に記載
されている。 本発明は、ヨードチロニン類のアミノ基に結合
した官能性アミノ基をもつアームを有するヨード
チロニン誘導体類に免疫性担体が結合したヨード
チロニン免疫原複合体類及びそれらのアルキルエ
ステル類を提供するものである。 提供される免疫原類は、次の一般式を有する： 式中、担体は、免疫性担体材、R′は単結合
（ａ bond）又は連結基（linking group）、ｎは
２から６までの整数、ｐは、平均して、１から約
50までの数、Ｒは水素、又は炭素原子１〜６個を
含むアルキル基及びβ¹とβ²は、個々に独立して、
水素又はヨウ素である。架橋基（bridge group）
R′が単結合（ａ bond）である場合はヨードチ
ロニン誘導体は、例えば、そのアミノ基と担体中
のカルボキシル基との間のアミド結合によつて、
直接、担体材に結合し、このような場合、担体材
は、通常、蛋白質又はポリペプチドである。架橋
基R′が、単純結合以外の場合は、例えば、ヨー
ドチロニン誘導体中のアミノ基を担体中のアミノ
基に結合させる二官能性連結試薬の残基のよう
に、種々様々な構造からなつてもよく、担体は、
この場合も通常蛋白質又はポリペプチドである。 ヨードチロニン誘導体類は、一般に第１図及び
第１ａ図の図表に示した経路によつて製造され
る。ω−アミノアルキルアルデヒドジエチルアセ
タール(1)は、適当な溶媒、例えばエタノールに加
えたエチルトリフルオロアセテート及びトリエチ
ルアミンの混合物で処理することにより、Ｎ−ト
リフルオロアセテート(2)として保護される。得ら
れたＮ−トリフルオロアセチルアルカナルジアセ
タールは加水分解されて、アルキルアルデヒドと
なり、ヨードチロニンエチルエステル(3)及び適当
な溶媒、例えばエタノールに溶解したシアノボロ
ハイドライドナトリウムと反応して、Ｎ−（ω−
Ｎ−トリフルオロアセチルアミノアルキル）ヨー
ドチロニンエチルエステル(4)を生成する。アルカ
リで加水分解すると、新規な、Ｎ−（アミノアル
キル）ヨードチロニン誘導体類(6)を生成する。あ
るいは、Ｎ−トリフルオロアセチル基は、塩酸飽
和エタノール中で還流することにより選択的に除
去され、有機溶媒に対する溶解性のよりよい(5)の
二塩酸塩を生成する。 Ｎ−アミノアルキル側腕（side arm）の線状
アルキル部分の長さは、ω−アミノアルキルアル
デヒドジエチルアセタール原料を適当に選択する
ことにより、炭素数を２から６個まで変えること
ができる。同様に、アルキルエステル基があると
するならば、これは選ばれたヨードチロニンアル
キルエステル原料によつて変わり、線状であつて
も、枝分れしていてもよく、かつ、例えば、メチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ
−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル等の炭素
原子１個ないし６個を含有してもよい。 Ｎ−（アミノアルキル）ヨードチロニンエステ
ル誘導体類(5)は、塩基で処理することによつて、
相当する酸誘導体類(6)に変換される。 エステルヨードチロニン誘導体類及び酸ヨード
チロニン誘導体類は、従来のペプチド縮合反応に
よつて、カルボキシル基含有免疫性担体材と結合
して、式： （式中、担体（CO）−は、カルボキシル基を介し
て結合した担体材を表わし、ｐは、平均して、１
から、担体上の利用できるカルボキシル基数まで
の数であり、かつ、ｎ、Ｒ、β¹及びβ²は上述の定
義のとおりである。）で示される免疫原複合体を
生成する。ヨードチロニン誘導体の、カルボキシ
ル基含有担体への直接結合を行うのに利用しうる
ペプチド縮合反応は周知であり、これには、例え
ば、カルボジイミド反応〔エールネ等（Aherne
et al）、Brit.J.Clin.Pharm.3巻：56頁（1976）及
びScience144巻：1344頁（1974）〕、混合無水物反
応〔エルランガー等（Erlanger et al）、
Methods in Immunology and
Immunochemistry、編ウイリアムズ及びチエイ
ス、アカデミツク・プレス（Williams and
Chase、Academic Press）（ニユーヨーク1967）
149頁〕及び酸アジドと活性エステル反応〔コツ
ブル（Kopple）、Peptides and Amino Acids、
ダブリユ・エー・ベンジヤミン、インコーポレー
テツド（W.A.Benjamin、Inc.）（ニユーヨーク
1966）〕を含むが、本発明はこれらに限定される
ものではない。また、この反応についてはClin.
Chem.22巻：726頁（1976）も参照されたい。 また、エステルヨードチロニン誘導体類及び酸
ヨードチロニン誘導体類は、一端で、ヨードチロ
ニン誘導体のアミノ基と結合を形成し、他端で、
担体材に存在する適当な官能基と結合を形成する
連結試薬（linking reagents）を用いて結合させ
てもよい。例えば、アミン巨大分子にアミン誘導
体類を結合させるには、ビスイミデート類、ビス
イソシアネート類及びグルタルアルデヒド
〔Immunochem.6巻：53頁（1969）〕をはじめと
する二官能性結合試薬がよく知られている。他の
有用な結合反応は、例えば、上述のコツプル
（Kopple）の論文；ロウ及びデイーン（Low
and Dean）、Affinity Chromatography、ジヨ
ン・ワイヤー及びサンズ（John Wiley＆Sons）
（ニユーヨーク1974）；ミーンズ及びフイニー
（Means and Fee−ney）、Chemical
Modification of Proteins、ホールデン−デイ
（Holden−Day）（サンフランシスコ1971）；及び
グレーザ等（Glazer et al）、Chemical
Modification of Proteins、エルセヴイア
（Elsevier）（ニユーヨーク1975）の文献に充分に
検討されている。 ビスイミデート二官能性試薬を用いて、ヨード
チロニン誘導体を蛋白質もしくはポリペプチド担
体へ結合させることは、好ましい方法である。得
られる免疫原複合体類は、式： （式中、ｍは１から10までの整数を表わす。）の
連結基R′からなり、担体材がアミノ基を介して
結合している。ビスイミデート結合試薬は、通
常、式： で示される。ｍは上に定義した通りであり、R¹
及びR²は同一であつても異なつてもよいが、通
常同一であるアルキル基であり、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、iso−プロピル等の低級アル
コール（すなわち、１〜４個の炭素原子を有す
る）であることが好ましい。特に好ましいビスイ
ミデート類としては、ジメチルアルキルイミデー
トであり、特にジメチルアジピミデートが好まし
い。ビスイミデート類は、一般に、市販源より入
手できるが公表されている方法で、当業者によつ
て製造されてもよい〔ハンター及びラドウイツグ
（Hunter and Ludwig）、J.Am.Chem.Soc.84
巻：3491頁（1962）〕。ビスイミデートは普通、適
当な塩の形で提供されるが、これは、水性反応媒
体中で溶解すると、正電荷のビスイミデート種
（species）を生じる。従つて、溶媒の蒸発又は沈
澱による等の手段で免疫原複合体を水性媒体から
単離すると、プロトンを付加したイミノ基と対を
なすべき陰イオンが該媒体中の利用可能な陰イオ
ンから供給されて、ビスイミデートの塩を生じ
る。 結合反応は、水溶液中で温和な条件、即ち、約
７ないし約10のPHで、より普通には、８ないし９
のPHで、かつ約０℃ないし約40℃の温度で、より
普通には20℃ないし30℃ですすめることができ
る。通常、官能性アミノ基を有するヨードチロニ
ン誘導体、ビスイミデート及び所望の蛋白質もし
くはポリペプチド担体材をこの順序で添加し、ヨ
ードチオニン誘導体とビスイミデートの間の反応
のために１分間ないし30分間の短い温置時間をと
る。しかる後蛋白質もしくはポリペプチドを添加
し第２の温置時間は10分間ないし４時間継続させ
る。 上記式中のｐの量は担体に結合したヨードチロ
ニン部分の数、即ち免疫原のエピトープの密度
（epitopic density）を表わし、かつ通常の状態
では、平均して、１から約50までであり、より普
通には、１から約20までである。免疫原及び抗体
応答の合成の容易さ及び再現性を考慮すると、最
適のエピトープの密度は２と約15の間となり、よ
り普通には４と10の間になる。 免疫性担体材は、ヨードチロニンアミノ誘導体
への結合のために利用しうる官能基を有する、従
来知られているもののいずれかから選択してよ
い。ほとんどの場合、担体は蛋白質もしくはポリ
ペプチドであり、端水化物類、多糖類、リポ多糖
類、核酸類等の、十分な大きさと免疫原性を有す
る他の担体材も同様に、用いられる。大低、免疫
性蛋白質類とポリペプチド類は4000ないし
10000000の分子量を有し、15000より大きいこと
が好ましく、より普通には50000より大きい。一
般に、ある１つの動物種（species）から採取し
た蛋白質は、他の種（species）の血流へ注入さ
れると免疫性をもつ。特に有用な蛋白質類は、重
要な非蛋白性成分、すなわち糖蛋白質類等を有す
るアルブミン類、グロブリン類、酵素類、ヘモシ
アニン類、グルテリン類、蛋白質類である。
30000ないし200000の分子量のアルブミン類及び
グロブリン類が特に好ましい。従来の免疫性担体
材及びそれらヘハプテンを結合させる方法に関す
るこれまでの技術については次のものを更に参照
しなければならないかもしれない：パーカー
（Parker）、Radioimmunoassay of Biologi−
cally Active Compounds、プレンテイス−ホー
ル（Prentice−Hall）〔イングルウツド・クリフ
ス、ニユージヤージイ・ユーエスエー
（Englewood Cliffs、New Jersey USA，）
1976〕；バツトラー（Butler）、J.Immunol.
Meth.7巻：１−24頁（1974）；ワインライブ及び
シユロフ（Weinryb and Shroff）、Drug
Metab.Rev.10巻；271〜283頁（1975）；ブロート
ン及びストロング（Broughton and Strong）、
Clin.Chem.22巻：726−732頁（1976）；及びプレ
イフエア等（Playfair et al）、Br.Med.Bull.30
巻：24−31頁（1974）． 本発明の免疫原複合体類を用いる特異的抗体類
の製造は、従来技術に従つてよい。それには抗体
産生を引きおこす基本的様相について述べている
数多くの教本を利用できる；例えば、パーカー
（Parker）、Padioimmunoassay of Biologically
Active Compounds、プレンテイス・ホール
（Pre−ntice−Hall）〔イングルウツド・クリフ
ス、ニユージヤージイ・ユーエスエー
（Englewood Cliffs、New Jersey USA）、
1976〕を参照してもよい。通常の場合、ウサギ、
ヤギ、ネズミ、モルモツト又はウマ等の宿主動物
の普通、アジユバントと混合して、１ケ所以上の
様々の部位に、免疫原複合体を注射する。同一部
位又は異なる部位に、一定間隔で又は不規則間隔
で、更に注射を行い、その後、最適滴定量に達し
たと判断されるまで、抗体滴定量を測定するため
に採血が行われる。宿主動物は採血されて、適切
な容量の特異的抗血清を提供する。必要に応じ
て、非特異的抗血清のような望ましくない物質を
除去するため抗血清が、実際の分析を行うのに用
いられるのに適切とみたされる以前に、精製工程
を行つてもよい。 抗体は、又、体細胞融合技術（somatic cell
hybridation technique）によつて得ることもで
き、かかる抗体は普通、単一クローン抗体
（monoclonal antibodies）と呼ばれている。か
かる単一クローン抗体についての文献は、リンホ
サイト・ハイブリドマス（Lymphocyte
Hybridomas）、編集、メルチアス等（Melchers
et al）、スプリンゲル−フエルラーク（Springer
−Verlag）（ニユーヨーク、1978）、Nature266
巻：495頁（1977）、及びScience208巻：692頁
（1980）に見出される。 本発明は次に例示されるが、次の実施例によつ
て、制限されるべく意図されたものではない。 実施例 １ Ｎ−アミノアルキルヨウ化チロニン誘導体類及
びそれらのアルキルエステルの製造 これらのヨウ化チロニン誘導体類の製造反応順
序は、第１図及び第１ａ図に図示されている。 ４−Ｎ−（トリフルオロアセチル）アミノブチル
アルデヒドジエチルアセタール(2)、ｎ−4. 100mlのエタノールに加えた90％の４―アミノ
ブチルアルデヒドジエチルアセタール(1)17.74グ
ラム（ｇ）〔0.1モル（mol）〕及びトリエチルア
ミン22.1ミリリツトル（ml）〔0.16mol〕の混合物
に、０℃、アルゴン気体下で、エチルトリフルオ
ロアセテート21.3ｇ〔0.16mol〕を15分かけて適
加した。混合物は、室温まで暖められ、１晩放置
された。反応物の体積を、真空中で濃縮し（浴槽
温度＜40℃）、エーテルに溶解し、水及び食塩水
で洗浄した。乾燥（Na₂SO₄）、ろ過及び溶媒の
真空蒸発により褐色油状物質25.3ｇを得た。104
〜105℃（0.01mm）での分別蒸溜で、無色油状物
質としてｎ＝４の生成物(2)を得た。（96％24.6ｇ） 分析結果：C₁₀H₁₈NF₃O₃（MW257.26）としての 計算値：Ｃ、46.7；Ｈ、6.8；Ｎ、55 実験値：Ｃ、46.3；Ｈ、7.0；Ｎ、53 PMR（60MHz、CDCl₃）：δppm：1.2（ｔ、Ｊ＝７
Hz、6H）；4.3（ｍ、4H）；3.2−4.0（ｍ、6H）；
4.52（ｔ、Ｊ＝５Hz、1H）；7.3（bs、1H）． IR（正味neat）：1705cm^-1 Ｎ−〔４−Ｎ−（トリフルオロアセチル）アミノブ
チル〕チロキシンエチルエステル(4)、ｎ＝４、β¹
＝β²＝Ｉ ４−Ｎ−（トリフルオロアセチル）アミノブチ
ルアルデヒドジエチルアセタール(2)、ｎ＝４、
〔3.097ｇ、12ミリモル（ｍmol）〕をテトラヒド
ロフラン／酢酸／水（１：１：１）の混合物36ml
中で、48時間、アルゴン気体下で撹拌した。この
混合物を真空蒸発し、得られた油状物質を、アル
ゴン気体下で、無水エタノール275ml中のチロキ
シンエチルエステル塩酸塩(3)、β¹＝β²＝I10.09ｇ
（12mmol）に添加した。この混合物にシアノ水
素化ホウ素ナトリウム（422ミリグラム（mg）、
6.8ｍmol〕を加え、24時間、室温で撹拌した。
この混合物をろ過し、真空濃縮し、得られた泡状
物質を、20％の酢酸エチル−ジクロルメタン40ml
に溶解、ろ過し、１晩放置した。現われた白色結
晶生成物を集め、ジクロルメタンで洗浄、乾燥
し、収量4.32ｇ（37％）、融点202−204℃の物質
を得た。 分析結果：C₂₃H₂₂N₂F₃I₄O₅・2H₂O
（MW1008.12）としての 計算値：Ｃ、27.40；Ｈ、2.70；Ｎ、2.78 実験値：Ｃ、27.36；Ｈ、2.45；Ｎ、2.77 PMR（60ｍHz、DMSO−d₆）：δppm： 1.13（ｔ、Ｊ＝３Hz、3H）；1.67（ｍ、4H）；2.7
−3.9（ｍ、6H）；4.2（多重線＋重なつた四重線、
Ｊ＝７Hz、3H）；7.12（ｓ、2H）、7.92（ｓ、
2H）；9.65（ｍ、3H）． IR（KCl）：1720、1745cm^-1 母液を真空濃縮し、酢酸エチル10mlに溶解し、
固定相として、１個のPrep−Pak−500 （プレ
ツプ−パツク−500登録商標）5.7ID×30cmシリ
カ・カートリツジ〔ウオーターズ・アソシエイ
ト、インコーポレーテツド、ミルフオード、エム
エー（Waters Associates，Inc.、Milford、
MA）〕を、移動相として、20％酢酸エチル−ジ
クロルメタンを用いて、Waters Prep500
HPLC（ウオーターズ・プレツプ・500・エツチピ
ーエルシー・登録商標）｛ウオーターズ・アソシ
エイツ、インコーポレーテツド、ミルフオード、
エムエー（Waters Associates，Inc.、Milford、
MA｝のクロマトグラフイーにかけた。 最初に、カラムから溶出されたのは、油状物質
で、ジクロルメタン−ヘキサンより白色粉末
（1.1ｇ）として沈澱した。融点64〜68℃（分解
点）。これは、次の分析データを基にして、Ｎ，
Ｎ−ビス−〔４−Ｎ−（トリフルオロアセチル）ア
ミノブチル〕チロキシンエチルエステルと同定さ
れた。（収率７％）。 分析結果：C₂₉H₃₁N₃F₆I₄O₆・H₂O（MW1157.24）
としての 計算値：Ｃ、30.10；Ｈ、2.87；Ｎ、3.63 実験値：Ｃ、30.01；Ｈ、2.45；Ｎ、4.13 PMR（60MHz、DMSO−d₆）：δppm： 1.15（ｍ＋bt、Ｊ＝７Hz、7H）；1.65（ｍ、
4H）；2.9（ｍ、3H）；3.2（ｍ、4H）；3.7（ｍ、
3H）；4.1（ｍ＋ｑ、Ｊ＝７Hz、3H）；5.73（ｍ、
2H）；7.13（ｓ、2H）；7.88（ｓ、2H）；9.4（ｍ、
1H）． IR（KCl）：1720cm^-1 次に、カラムから得られらのは、油状物質で、
ジクロルメタン−ヘキサンより白色粉末として沈
澱した（3.886ｇ）、スペクトルデータより、これ
は最初に生成した結晶と同一物質であることが判
つた。ｎ＝４、β¹＝β²＝Ｉの生成物(4)の総収量は
8.23ｇ（71％）であり、融点は105〜106℃であつ
た。 分析結果：C₂₃H₂₃N₂O₅I₄F₃（MW972.09）として
の 計算値：Ｃ、28.41；Ｈ、2.39；Ｎ、2.88 実験値；Ｃ、28.33；Ｈ、2.40；Ｎ、2.78 Ｎ−（４−アミノブチル）チロキシンエチルエス
テルビス塩酸塩(5)、ｎ＝４、β¹＝β²＝Ｉ Ｎ−〔４−Ｎ−（トリフルオロアセチル）アミノ
ブチル〕チロキシンエチルエステル(4)、ｎ＝４、
β¹＝β²＝Ｉ、（2.5ｇ、2.6mmol）を無水エタノー
ル100mlに溶解した。この溶液を塩酸ガスで処理
しながら、７時間、加熱還流した。混合物を真空
濃縮し、エタノール−エーテルから残渣を２度沈
澱させ、不完全な白さの粉末2.115ｇ（収率79％）
を得、これは、ｎ＝４、β¹＝β²＝Ｉの(5)の化合物
のビス塩酸塩ジエタノール化合物であると分析さ
れた。 分析結果：C₂₁H₂₄N₂I₄O₄・2HCl・２（C₂H₆O）
（MW1041.13）としての 計算値：Ｃ、28.84；Ｈ、3.68；Ｎ、2.69 実験値：Ｃ、29.32；Ｈ、3.28；Ｎ、2.91 PMR（60mHz、DMSO−d₆）：δppm： 1.13（ｔ、Ｊ＝７Hz）；1.77（ｍ）；3.29（ｍ）；
3.66（ｍ）；7.17（ｓ）；7.88（ｓ）；8.79（ｍ）；10
.0
（ｍ）；10.6（ｍ）． IR（KCl）：1735、2970cm^-1 Ｎ−（４−アミノブチル）チロキイン(6)、ｎ＝４、
β¹＝β²＝Ｉ Ｎ−〔４−Ｎ−（トリフルオロアセチル）アミノ
ブチル〕チロキシンエチルエーテル(4)、ｎ＝４、
β¹＝β²＝Ｉ、2.0ｇ（2.06ｍmol）をアルゴン気体
下で、テトラヒドロフラン20mlに溶解し、2Nの
水酸化ナトリウム溶液4.1mlで処理した。混合物
を、一晩中50℃で撹拌した。次に、反応混合物を
少量のシリカー（Silicar）CC−７〔ケイ酸；マリ
ンクロツドト、インコーポレーテツド、パリ ケ
イワイ（Mallinkrodt，Inc.、Paris、KY）に前
以つて吸着させ、２：１：１のクロロホルム−メ
タノール−水酸化アンモニウム混合体の下部相で
充填されたシリカ−CC−7175ｇのカラムの頂点
に施した。カラムを、２：１：１及び１：１：１
のクロロホルム−メタノール−水酸化アンモニウ
ム混合体の下部相の各々３で連続的に溶離し
た。得られた、不完全な白さの粉末を、エタノー
ル及び2Nの水酸化ナトリウム５mlに溶解し、セ
ライト（celite）でろ過されたノリツト（norit）
で処理し、酢酸で沈澱させた。β¹＝β²＝Ｉの複合
体(6)1.5ｇ（収率88％）が無定形粉末として得ら
れた。融点166℃（分解）。 分析結果：C₁₉H₂₀N₂I₄O₃・H₂O（MW850.05）と
しての 計算値：Ｃ、26.85；Ｈ、2.61；Ｎ、3.30 実験値：Ｃ、26.47；Ｈ、2.51；Ｎ、3.29 RMR（100ｍHz、CD₃OD＋Na°）：δppm： 1.48（ｍ）；2.64（ｍ）；2.82（dd、Ｊ＝６Hz、８
Hz）；3.26（ｔ、Ｊ＝６Hz）；7.04（ｓ）；7.86
（ｓ）． IR（KCl）：1640、1435、及び1505cm^-1 6Nの塩酸６ml中のこの生成物100mgを、２時
間、アルゴン気体中で還流しながら撹拌すること
により塩酸塩が生成された。ろ過後、17時間、55
℃（0.1mmHg）で乾燥して生成物82ｇ（収率79
％）を得た。 分析結果：C₁₉H₂₀N₂I₄O₃・HCl・H₂O
（MW886.50）としての 計算値：Ｃ、25.74；Ｈ、2.62；Ｎ、3.16 実験値：Ｃ、25.87；Ｈ、2.34；Ｎ、3.17 実施例 ２ ビスイミデート結合免疫原を用いて、チロキサ
ンに対する抗体類の製造 Ｎ−（４−アミノブチル）チロキシン（実施例
１）83mgを0.1M炭酸ナトリウム3.0mlに添加し、
次に0.1N水酸化ナトリウム35μを添加した。ジ
メチルアジピミデート二塩酸塩（90mg）を添加す
ると沈澱が生じた。10N水酸化ナトリウム70μ
を添加すると、この沈澱が溶解した。この反応混
合物を、３〜５分、室温に放置した後、これを、
0.2N水酸化ナトリウム50ml中に、ボウバイン
（bovine、ウシの一種）の血清アルブミン200mg
を含有する撹拌溶液に滴加した。この混合物を、
室温で、2.5時間放置し、次に、5N塩酸でPHを7.0
に調整した。生成した沈澱を、遠心除去し、かつ
その上澄みを加圧透析により、５〜７mlまで濃縮
した。 濃縮物は、0.02％のアジ化ナトリウムを含有す
るPH7.0の0.1Mリン酸ナトリウムと平衡状態にあ
る2.5×45cmのセフアデツクス（Seph−adex）
G25（粗）のカラムを用いて、クロマトグラフイ
ーにかけた。約12mlの画分を採集し、画分第９〜
12を一緒にした。この一緒にしたもの0.2mlを、
0.1N水酸化ナトリウム0.8mlに溶解稀釈し、260か
ら360ナトメートル（ｎｍ）の光吸収スペクトル
を記録した。最大吸収は328nｍでおこつた。
280nｍ及び328nｍの吸光度は、ボウバイン血清
アルブミン１モル当り6.8モルの、Ｎ−（４−アミ
ノブチル）チロキシンの包含体を測定するのに用
いられた。 Ｎ−（４−アミトブチル）チロキシンボウバイ
ン血清アルブミン複合体を一緒にしたものを稀釈
して、１ml当り0.6mgの複合体を含有するものを
得た。最初の免疫生成のため、この溶液を同量の
フロインド完全アジユバンド（Freund′s
complete adjuvant）と配合した。混合物の0.1
mlをウサギの各足に皮下注射し、0.6mlをウサギ
の背中に皮下注射した。免疫剤補助注射
（booster）による免疫生成は、３、７、11及び15
週間後に、背中に行つた。これらの免疫生成に
は、フロインド完全アジユバンドを用いた。16週
目に血液を抜取し、遠心分離により血清を採集し
た。 表Ａに示された量で、試薬を混ぜ合わせて、チ
ロキシン抗体を滴定するための抗体結合反応混合
物を調製した。 ¹²⁵Iで標識されたチロキシン
〔テトラマツト、アボツト・ラボラトリーズ、イ
ンコーポレーテツド、シカゴ、イリノイ
（TetramatAbbott Laboratories，Inc.、
Chicago、IL）〕はGammacord （ガンマコード
登録商標）結晶シンチレーシヨン計器〔マイル
ス・ラボラトリーズ・インコーポレーテツドのエ
イムス・デイビジヨン、エルクハート、インヂア
ナ（Ames Division、Miles Laboratories、
Inc.、Elkhart、IN）〕で測定すると、１ml当り
１分間に約630000カウント（cpm）を示した。す
べての試薬は、PH7.0の0.1Mリン酸ナトリウム緩
衝液に溶解して調製された。抗体は、50％ポリエ
チレングリコールが添加されるまで、２〜３時
間、室温で、 ¹²⁵I−チロキシンと温置させられ
る。ポリエチレングリコールを添加混合後、不溶
蛋白を遠心分離により沈澱させ、上澄みを傾潟し
た。粒状物中の放射能を測定した。

【表】 実施例 ３ チロキシン放射線免疫試験 表Ｂ（用いた抗血清は、実施例２のビス−イミ
デート結合免疫原に対して生成されたもの）に示
された量で、試薬を混ぜ合わせて、種々の濃度の
チロキシンを含む競争的結合反応混合物を調製し
た。 ¹²⁵I−チロキシン溶液は、１ml当り、１分
間に450000カウント（cpm）を示した。反応物
を、50％ポリエチレングリコールを添加するま
で、室温で２〜３時間温置した。不溶蛋白質を、
前に概略を述べたように採集し、放射能を測定し
た。 結果によると、チロキシンの濃度が増加するに
つれ、抗体への ¹²⁵I−チロキシン結合が減少し
た。

【表】 実施例 ４ チロキシンに対する非放射性同位元素免疫試験 NADPH、緩衝液、チロキシン抗体（実施例
２）及び表Ｃに示した量と濃度の種々の濃度のチ
ロキシンを混ぜ合わせて、反応混合物を調製し、
室温で、最低30秒間温置した。100μの0.16μM
のメトトレキセート−アミノブチルチロキシン複
合体〔1981年11月４日に出願され、現在の被譲渡
人に譲渡された米国特許出願第318028号に記載さ
れているように、上記のＮ−（４−アミノブチル）
チロキシンエチルエステルビス塩酸塩(5)、ｎ＝
４、β¹＝β²＝Ｉから製造されたもの〕を添加し、
混合物を室温で、２分間温置した。第２の温置に
続いて、ジヒドロ葉酸塩還元酵素を添加し、混合
物を更に５分、37℃で温置した。反応は、ジヒド
ロ葉酸塩を添加することにより、開始され、
340nｍでの第１の吸光度が記録された。反応は、
37℃で20分間続けられ、吸光度の最終読みが記録
された。表Ｃの結果によると、チロキシン濃度が
増加するにつれ、酵素活性（ΔA）は減少した。

【表】 実施例 ５ 直接結合免疫原を用いての、チロキシンに対す
る抗体の製造 Ｎ−（４−アミノブチル）チロキシンの第１ア
ミノグループをボウバインの血清アルブミンのカ
ルボキシル基へ結合させることにより、免疫原を
製造した。蛋白質（水３mlに151mgを溶解したも
の）をアイスバス中に冷却した。Ｎ−（４−アミ
ノブチル）チロキシンエチルエステル（39mg）を
水５mlに溶解し、蛋白質溶液に添加した。PHは
4.3であつた。１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド（水２mlに202mg
を溶解したもの）を冷却し、アルブミン、Ｎ−
（４−アミノブチル）チロキシン溶液に滴加した。
PHは5.1であり、0.1M塩酸で4.6に調整した。 ４℃で５時間、反応を続けた。次に、反応混合
物を、PH5.0の50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液と平
衡状態にあるセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−
50（微粒）の３×50cmとカラムに施した。４ミリ
リツトルの画分を採集し、280nｍで吸収を有す
る物質の第１溶出ピークを一緒にし、0.15M塩化
ナトリウムに対して透析した。 この免疫原は、１モルのボウバイン血清アルブ
ミン当り6.0モルのチロキシン残基を有した。チ
ロキシン残基のエステル官能基はアルカリで加水
分解された。25mlの透析免疫原をPH12の1M水酸
化ナトリウム0.25mlと混ぜ合わせた。この混合物
を室温で18時間放置した。次に1MHClで溶液を
PH7.5に調整した。 免疫原（１mg／ml）４mlを10mlのフロインド完
全アジユバンド及び２mlの食塩水（Saline）と混
ぜ合わせた。この混合物２mlずつをウサギに皮下
注射して免疫をつくつた。３週間後、不完全フロ
インドアジユバンドで調製した同一の混合物を用
いて、再免疫化をはかつた。免疫剤補助注射
（booster）による免疫生成は４週間毎に繰り返さ
れた。免疫剤補助注射を行つた１週間後に試験採
血が行われた。適切な滴定量を示す抗血清が、最
初の免疫生成後４ケ月までに得られた。 実施例 ６ チロイシン抗体の滴定 次に試薬を調整した。 緩衝液−0.1％（ｗ／ｖ）ボウバイン血清アルブ
ミン及び0.1％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを
含有する、PH7.0の0.1Mリン酸ナトリウム。 チロキシン−１ml中にチロキシン200ngを含有す
る、PH7.0の0.1Mリン酸ナトリウム。 チロキシンに対する抗血清−抗血清（実施例５よ
り）をPH7.0の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液に
加え、分析物にその20mlを添加すれば、下表に
示した抗血清濃度になるように稀釈した。 複合試薬−0.1％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、
0.125Mグルコース、2.5ｍM2−ヒドロオキシ
−３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸塩、
1.25％（ｗ／ｖボウバイン血清アルブミン及び
23.8μgの西洋ワサビペルオキシダーゼ／mlを含
有する、PH7.0の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液。 アポグルコースオキシダーゼ試薬−PH7.0の0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、6.0μMアポグルコー
スオキシダーゼ結合部位（米国特許第4268631
号参照）12ｍM4−アミノアンチピリン、0.1％
（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、400μグルコー
スオキシダーゼに対する抗血清／ml及び30％
（ｖ／ｖ）グリセリン。 FAD−チロキシン−40nMフラビン・アデニン・
ジヌクレオチド複合体を含有する、PH7.0の
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液。この複合体は、
米国特許第4171432号に記載されているように
製造した。 ２系列のキユベツト（各12個）をＡ及びＢと称
した。 緩衝液（0.23ml）をセツトＡ及びセツトＢに添
加した。50μのチロキシン試薬を、セツトＢの
各キユベツトに添加した。 抗血清を、下表に示した濃度になるように、各
セツトのキユベツトに添加した。キユベツトを、
室温に少なくとも５分間放置した。 1.6mlの複合試薬を各キユベツトに添加した。
次に、50μのFAD−チロキシンを添加後直ち
に、50μのアポグルコースオキシダーゼ試薬を
添加した。37℃で15分間、反応物を温置し、次に
520nMでと吸光度を記録した。 結果は次の通りである。

【表】 セツトＡの結果によると、抗体濃度が増加する
につれ、グルコースオキシダーゼ活性が減少して
おり、抗体がフラビン・アデニン・ジヌクレオチ
ド・チロキシン複合体を不活性化したことを示し
ている。チロキシンが存在するセツトＢでは、吸
光度はより高く、チロキシンと複合体が抗体結合
部位を対し、競争したことを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第１ａ図は、本発明の免疫原複合体
を生成するために、免疫性担体に結合するヨード
チロニン誘導体類を製造するための実施例に例示
された合成経路のフローダイアグラム（flow
diagram）である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式： ［式中、担体は、免疫性担体材、R′は結合
   （bond）もしくは連結基（linking group）、ｎは
   ２から６までの整数、ｐは、平均して、１から約
   50までの数、Ｒは水素、又は炭素原子１〜６個を
   含むアルキル基及びβ¹とβ²は個々に独立して、水
   素又はヨウ素をそれぞれ表わす。］で示されるヨ
   ードチロニン免疫原複合体に対して製造された抗
   体。 ２ R′が結合（bond）であり、担体材がそのカ
   ルボキシル基を介して結合されている特許請求の
   範囲第１項記載の抗体。 ３ R′が式： （式中、ｍは１から10までの整数を表わす。）で
   示される連結基（linking group）であり、担体
   材がアミノ基を介して結合されている特許請求の
   範囲第１項記載の抗体。 ４ β¹及びβ²が両者共ヨウ素である特許請求の範
   囲第１項記載の抗体。 ５ ヨードチロニン免疫原複合体が、式： ［式中、担体（−CO）−はカルボキシル基を介して
   結合されている免疫性の、蛋白質もしくはポリペ
   プチド担体材を表わし、ｎは２から６までの整
   数、ｐは、平均して、１から、該担体材上の利用
   しうるカルボキシル基までの数、Ｒは水素、又は
   炭素原子１〜６個を含むアルキル基、β¹とβ²は
   個々に独立して、水素又はヨウ素をそれぞれ表わ
   す。］で示されるものである特許請求の範囲第１
   項記載の抗体。 ６ ｎが４である特許請求の範囲第５項記載の抗
   体。 ７ Ｒが水素であり、ｎが４である特許請求の範
   囲第５項記載の抗体。 ８ Ｒが水素原子１〜６個を含むアルキル基であ
   り、ｎが４である特許請求の範囲第５項記載の抗
   体。 ９ Ｒがエチル基である特許請求の範囲第８項記
   載の抗体。 １０ β¹及びβ²が両者共ヨウ素である特許請求の
   範囲第５項記載の抗体。 １１ Ｒが水素であり、β¹及びβ²が両者共ヨウ素
   である特許請求の範囲第５項記載の抗体。 １２ Ｒが炭素原子１〜６個を含むアルキル基で
   あり、β¹及びβ²が両者共ヨウ素である特許請求の
   範囲第５項記載の抗体。 １３ Ｒがエチル基である特許請求の範囲第１２
   項記載の抗体。