JPH0334971A - 固相ペプチド合成用活性エステル - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
【粟上曵創旦透１
本発明は固相ペプチド合成において有用な１フェニル−
ピラゾリン−５−オンのエノールエステル誘導体をベー
スにした化合物、それらの固相ペプチド合成におりるア
ミノ酸用活性化基としての用途、それらの固相ペプヂト
合戊におけるカップリング試薬としての用途及びそれら
のカップリング反応をモニターする際の使用効果に関す
る。 発明は、更に、本化合物を有する活性化アミノ酸エステ
ル、固相ペブヂト合成におＧづる化合物及び活性化アミ
ノ酸の製造及び使用方法に関する。 従来の共蘭 ペプチドば固相合成とアミノ末端ブロック［・アミノ酸
なペブヂト鎖に段階的に加え、それらのカルボニル末端
を固体支持体に結合させることを伴う複２１１なプロセ
スである。 固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、第１アルフアーアミ
ン保護アミノ酸を有機リンカ−ニＪ：っで不溶性樹脂合
成ヘットに共有結合させることから始めるのが代表的で
ある。次に、一般的な合成サイクルは最後のアミノ酸の
アルファーアくン基を脱保護し、洗浄し、必要ならば中
和した後に、加える次のアルファーアミン保護アミノ酸
のカルホキシル活性化形と反応させることから／ｌる。 各々の連続したアミノ酸をカルボン酸基のカルボニル炭
素によって末端窒素に結合させる。 最も最近のベブヂト合成装置はカルボシ−イミ１〜試薬
との（例えばジシクロへキシルカルホシイミ１ｊ（ＤＣ
ＣＩ）との）、或はシイソブロビルカルホシイミド（Ｄ
ＴＰＣＤＩ）とのカップリングを行う。合成は、合成８
Ｊ脂を中に入れた反応容器で行う。 カップリング反応か完了した後に、カルホン酸火によっ
て合成樹脂に結合させた保護アミノ酸を脱ブロッキング
剤１例えＣＪトリフルオロ酢醍（ＴＦＡ）或はピペリジ
ンで脱ブロックし、（ＴＦＡを使用する場合）塩基で洗
浄し、次の活性アミノ酸残基を反応容器に加える。所望
のペプチド残基を得たら、ペプチドを、通常無水フッ化
水素（ＨＦ ）か或はＴＥＡのいずれかで合成支持体か
ら切断させる。 カップリングを自動５ｐｐｓで行う方法は基本的に２つ
あり、活性アミノ酸誘導体を用いるか或はカップリング
の前に活性化させた遊離アミノ酸誘導体を用いる。活性
誘導体、活性なエステルを用いることの１つの利点は、
それらが結晶性ならば、高純度になり、清浄なカップリ
ングをもたらし得ることである。活性なエステルの不利
な点は、それらが反応性の高い場合、溶解した際に及び
固体状態で長期貯蔵した際に不安定になることである。 よって、活性なエステルは粉末として貯蔵し、カップリ
ングの前に溶解しなければならない。 ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）活性なエステルが現
在固相ペプチド合成及び溶液合成において用いられてい
る。これらの誘４体は下記の点て不利な悩みがある。す
なわち毒性の高い、値段の高い吸湿性物質であるペンタ
フルオロフェノールから作られる。廃棄物の処理が問題
である。ＰＰＰは危険なジオキシン様物質を含有し或は
貯蔵時にこのような物質を生じ得、この反応において遊
離するペンタフルオロフェノールは極めて酸性であり、
樹脂に（−１いたアミノ基をプロトン付化して最終のカ
ップリング段階の速度を減しさせると考えられる。これ
は平衡プロセスであるので、この温和な酸にあるプロト
ン付化はカップリングか完結に至るのを妨げないが、プ
ロセスの速度を減じさせ得る；２つのＰＰＰエステル、
セリン（Ｓ ｅ ｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）は非結
晶性であり、そのためこれらに代えて代りの結晶性エス
テルを用いる。ＰＰＰエステルの溶液安定性は不十分で
あると考えられる。すなわち、ＰＰＰ活性エステルを用
いる代りの有用な代替法が必要とされる。 同相ペプチド合成について利用可能な系は、例えは米国
特許Ｌ３６２，６９９号、同４，５３１．２５８号、同
３．６４７．３９０号及び３．５５７．０７７号に記載
されている。理想的には、系は次のアミノ酸をペプチド
鎖に加える前に、各々のアミノ酸付加が完全であること
をモニターする方法を含む。このような系はペプチドの
できるだけ最良の収率な確実にする。 アミノ酸合成反応をモニターするいくつかの利用可能な
方法は、Ｇ、 Ｂａｒａｎｙ及びＢ、Ｍａｎｉｆｉｅｌ
ｄがＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ、 ２巻、１５０〜１５４
頁（１９７９年） 、 ”５ｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａＳｏｌｉ
ｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
”に載せている。 同相ペプチド合成をモニターする種々の方法の内、今日
利用可能な最も効率的かつ感度のよい方法はアミノ基を
検出することによって未反応の或は遊離のアミノ酸の存
在を求めるものである。これらの方法は、通常、反応を
停止させ、樹脂結合したアミノ基なアミノ基と反応性の
試薬で滴定することを伴い、検出し得る応答（例えば比
色測定或は電位差測定）を示す。これらの滴定方法は、
過塩素酸或はピクリン酸のような或ばハライド＋；、Ｘ
ｙ例えはビリジンーヒトロクロリ１−を形成するハロゲ
ン化合物を用いるのが普通である。これらの方法はカッ
プリング反応を停止させることを必要とし、アミノ基の
内のいくつかを破壊し、ペプチド釦自体と反応性である
ことを含むいくつかの欠点を有する。 発明の構成 本発明の化合物は下記の一般式を有する１−フェニル−
ピラゾリン−５−オンのエノールエステルである ここでＲ１は下記からなる群より選ぶ Ｈ、メチル（Ｃ
Ｈ３）、エチル（ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ＣＨ
（ＣＨ３） ２ ） 、フェニル、ニトロフェニル、ク
ロロフェニル及びヘンシル、或はこれらの簡単な変形。 簡単な変形は、例えば芳香族環に付いた１或はそれ以上
の置換基を含む。 Ｒ２は下記からなる群より選ふ：Ｈ、メチル（ＣＨ３）
、エチル（ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ＣＨ（ＣＨ
３） ２ ） 、フェニル、ニトロフェニル、クロロフ
ェニル、ベンジル、ハロゲン（例えば、Ｃ，Ｃ，Ｂｒ）
、 ニトロ（ＮＯ２）及びアゾ誘導体（例えば、Ｐｈ−
Ｎ＝Ｎ−）或はこれらの簡単な変形。加えて、Ｒ１及び
Ｒ２はピラゾール環の３及び４環位置の間のブリッジを
表わすことができ、該ブリッジはメチレン基約３〜約８
を有する。置換基ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは下記からなる
群より選ぶ・Ｈ，ＮＯ２、ハロゲン及び５０３Ｈ；Ｘは
下記からなる群より選ぶ ホルミル、アセチル、ベンゾ
イル、フェノキシアセチル及びトルエンスルホニル、２
，４．６−ドリメチルベンセンスルホニル。Ｘは、また
、下記にすることができる：ホスホニウム塩、例えばト
リス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホ
スフェート或はテトラフルオロポレート、ウラン塩、例
えばテトラメヂルウランヘキサフルオロホスフェート或
はテトラフルオロボレート及びこれらの化合物の誘導体
。加えて、Ｘはアミノ酸及びアミン保護アミノ酸誘導体
を表わし、それで活性アミノ酸誘導体を形成する。しか
し、Ｒ２ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅが全てＨによって表わさ
れるならば、Ｒ＋はメチルになることができない、とい
うのは、この構造を有する化合物Ｍｐｐは低い活性を有
し、通常低い収率で生成され、自己指示しないからであ
る。 本１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合物をアミノ
酸のカルボキシル基によってエステル化して活性アミノ
酸誘導体を生成する。アミノ酸は通常下記の一般式を有
するアミン保護アミノ酸誘導体である Ｒ’ ０ １］Ｉ Ｙ −Ｎ Ｈ−ＣＨ−Ｃ−ＯＨ ここで、Ｒｏはアミノ酸側鎖を表わし、Ｙは保護基、例
えばα−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍ
ｏｃ） 、ｔ−ブチルオキシ−カルボニル（ｔＢｏｃ）
、２− （４−ビフェニリル）＝２−プロビルオキシ
カルホニル（Ｂｐｏｃ）及び２−ニトロピリジルスルフ
ェニル（Ｎｐｙｓ）である。 本化合物は固相ペプチド合成用の優れた性質を有する。 化合物は５ｐｐｓ系に加えた場合、比色指示薬として働
く。本化合物から作る活性アミノ酸エステルは純粋、結
晶性、安定であり、自己指示性である。例えば、３−メ
チル−１＝（４′ニトロフエニル）２ピラゾリン−５−
オン（Ｎｐｐ）のアミノ酸エステルは高度の結晶性であ
り、５ｐｐｓ用に通常用いられる溶媒（例えば、ＤＭＦ
）の溶液において安定であり、ヒドロキシル基に対して
非反応性である。カップリングの間に遊離するＮｐｐを
未反応アミノ基でイオン化して強いべんがら着色を支持
体にもたらし、これは、カップリングが完了した際に、
色があせて非イオン化Ｎｐｐの金色になる。この色の変
化を用いて反応の完結をモニターすることができる。 本ｌ−フェニル−ピラゾリン−５−オン誘導体は既知の
カップリング試薬への添加剤として用いることができ、
新規なカップリング試薬を構成することができ或はアミ
ノ酸の活性なエステルとして用いることができる。例え
ば、固相ペプチド合成において、新規カップリング試薬
として、Ｘがホスホニウム塩である、例えばトリス（ジ
メチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェー
ト組成物を、非予備活性化α−アミン保護アミノ酸誘導
体（また、「遊離」保護アミノ酸とも呼ぶ）に対しｌ当
量の第三塩基と共に、５ｐｐｓ系に加える。生成した活
性種を次いで支持体に結合したペプチドに加えてカップ
リング及び連鎖伸長を行なわせ、同時に１−フェニル−
ピラゾリン−５−オン成分を遊離し、これが比色指示薬
として作用する。また、本１−フェニル−ピラゾリン−
５−オン化合物のホスホニウム誘導体をＤＣＣＩ手順の
別法として用いることができる。 それらの製法については本明細書中下記に記載する。 本１−フェニル−ピラゾリン−５−オン誘導体を用いて
下記を含むいくつかの所望の性質を有する活性アミノ酸
エステルを生成する・安価な非毒性物質から作ることが
できる；カップリングの間に遊離する副生物は低い活性
及び未反応活性エステルとの区別を可能にし、それでカ
ップリングの定量を可能にするスペクトル特性を有する
；高度の結晶性であり、ＤＭＦに可溶性であり、ジシク
ロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＴ）縮合法を含む種
々の方法によって高い収率及び純度で製造することがで
きる。 本化合物から生成する活性アミノ酸誘導体の性質は下記
を含む：高い結晶性及び反応性、安定性及び加水分解よ
りもむしろアミノリシスへの選択性。これらの化合物の
アミノ酸エステルはヒドロキシル基の存在に対して比較
的不活性であるので、水素結合した分断（ｄｉｓｒｕｐ
ｔｉｎｇ）アルコール、例えば２，２．２− トリフル
オロエタノールの存在において有利に用い、それでペプ
チド第二構造及び凝集によって妨げられる困難な反応を
完了に至らせることができる。これらのアルコールを用
いることは、ヒドロキシルによる作用に対し不活性でな
いＰＰＰ或はその他のエステルを用いる場合、５ｐｐｓ
において適していない。本活性アミノ酸エステルは自己
指示性てあり、固相ペプチド・合成の分光測光モニター
リング及び自動化を容易にする。 憩１Ｂ榎圧募４０４里 本発明は１−フェニル−ピラゾリン−５−オンに基づく
化学誘導体及び固相ペプチド合成（ｓｐｐｓ）における
それらの使用方法に関する。組成物は１−フェニル−ピ
ラゾリン−５−オンのエノールエステル誘導体及びこれ
らの化合物を含有するアミノ酸活性なエステルである。 ５ｐｐｓ用の他のエステル及びヘースの１フェニル−ピ
ラゾリン−５−オン構造に置換することによって生成す
る誘導体に比へて１−フェニル−ピラゾリン−５−オン
エステルの活性か高いことは本発明の主題である。 本発明の化合物は下記の一般式を有する１ ０ フェニル−ピラゾリン オンのエノールニス チルである・ ここでＲ１は下記からなる群より選ぶ・Ｈ、メチル（Ｃ
Ｈ３）、エチル（ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ＣＨ
（ＣＨ３） ｚ ） 、フェニル、ニトロフェニル、ク
ロロフェニル及びベンジル、或はこれらの簡単な変形。 簡単な変形は、例えば芳香族環に付いた１或はそれ以上
の置換基を含む。 Ｒ２は下記からなる群より選ぶ Ｈ、メチル（ＣＨ３）
、エチル（ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ＣＨ（ＣＨ
３） ２ ） 、フェニル、ニトロフェニル、クロロフ
ェニル、ヘンシル、ハロゲン（例えば、Ｃ３，Ｂｒ）、
ニトロ（ＮＯ□）及びアゾ誘導体（例えば、Ｐｈ−Ｎ＝
Ｎ−）或はこれらの簡単な変形。加えて、Ｒ８及びＲ２
はピラゾル環の３及び４環位置の間のブリッジを表わす
ことができ、該ブリッジはメヂレン基約３〜約８を有す
る。置換基ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは下記からなる群より
選ぶ・Ｈ，ＮＯ３、ハロゲン及び５Ｏ３Ｈ，Ｘは下記か
らなる群より選ぶ、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、
フェノキシアセチル及びトルエンスルホニル、２，４．
６−１−リメチルベンゼンスルホニル。Ｘは、また、下
記にすることができる：ホスホニウム塩、例えばトリス
（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフ
ェート或はテトラフルオロボレート、ウロニウム塩、例
えばテトラメチルウロニウムヘキサフルオロボスフェ−
１・或はテトラフルオロボレー１〜及びこれらの化合物
の誘導体。加えて、Ｘはアミノ酸及びアミン保護アミノ
酸誘導体を表わす。しかし、Ｒ２及びａ、ｂ、ｃ、ｄ及
びｅが全て１１によって表わされるならば、Ｒ１はメチ
ルに１（ることができない、というのは、この構造を有
する化合物Ｍｐｐは低い活性を有し、通常低い収率て生
成され、自己指示しないからである。 Ｍｐｐは木１−フェニルー３−メチルー２ピラゾリン−
５−オン物質のメチル誘導体である。Ｍｐｌ）及びそれ
から作るアミノ酸エステルについては、Ｇ、ｌ＋ｏｓｓ
ｅ等がＰｅｐｔｉｄｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｍ１ｔＣａｒ
ｂｏｘｙｌａｋｔｉｖｉｅｒｔｅｎ Ｃｂｏ−Ａｍｉｎ
ｏｓａｕｒｅｎ、 ２３６〜２４２頁（１９６４年）に
、溶液合成法によってジペプチドを製造するために記載
した。Ｍｐｐは低い活性を有し、５ｐｐｓにおいて用い
る場合に、自己指示、比色性を持たない。 本明細書中に記載する化合物は同じ物質のエノール及び
ケト形を含む。エノール形を構造式で表わし、名前はケ
ト形に基づいて挙げる。 本化合物の好ましい組合せは下記を含むｃ ＝ Ｎ Ｏ
２、ａ ＝ ｂ ＝ ｄ ＝ ｅ ＝ Ｈ、Ｒ２＝ Ｈ
及びＲ，＝メチル或はフェニル Ｃ−ハロゲン、ａ＝ｂ＝ｄ＝ｅ＝ＨＲ２＝Ｈ及びＲ１−
メチル或はフェニル Ｃ＝ａ−ハロゲン ｂ ＝ ｄ ＝ ｅ ＝ ＨＲ２Ｈ
、及びＲ１−メチル或はフェニル ｃ＝ａ＝ＮＯ２、ｂ＝ｄ＝ｅ＝ＨＲ２＝Ｈ及びＲ，−メ
チル或はフェニル ａ ＝ ｂ ＝ ｃ ＝ ｄ ＝ ｅ ＝ Ｈ、Ｒ２＝
Ｈ、及びＲ１＝フェニル或は４−ニトロフェニル、及
びａ＝ｂ＝ｄ＝ｅ＝Ｈ，ｃ−ニトロ、Ｒ１及びＲ２は３
及び４位を結合する４つのメチレン基を表わし：Ｘは上
に挙げた基の内のいずれかである。 これらの化合物は下記を含む・ 菟−１名−−１ Ｉ）ｐｐ １．３−ジフェニル−２−ピラゾリン
５−オン Ｐｐｍ １−フェニル−３−（４′−二トロフェ
ニル）−２−ピラゾリン−５− オン Ｎｐｐ Ｐｎｐ （、ｊ２ｍｐ ３−メチルー］−（４′−二トロフェニル）−２−ピラ
ゾリン−５−オン ３−フェニル−］−（４＝−二トロフェニル）−２−ピ
ラゾリン−５−才ン ３−メチル−１−（４′−クロロフェニ ４ ル）−２−ピラゾリン−５−オン ＰＣＪ２ｐ ３−フェニル−１−（４′−クロロフ
ェニル）−２−ピラゾリン−５−オン ＤＣｕｍｐ ３−メチル−１−（２’、４’−ジクロ
ロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン ＤＣｊ２ｐｐ ３−フェニル−１−（２°、４°−ジ
クロロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オ ン ＤＮｍｐ ３−メチル−１−（２’、４’−ジニト
ロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン ＤＮｐｐ ３−フェニル−１−（２’、４°−ジニ
トロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オ ン 本１−フェニル−ピラゾリン−５−オン誘導体はフェニ
ルヒドラジンとアシルアセテートエステルとを反応させ
て作る。この方法によって、１−フェニル環及びＲ，へ
の改良を行う。フェニル環に付いた置換基（ａ−ｅ）は
例えばＨ、ニトロ、ハロゲン或は５Ｏ３Ｈにすることが
できる。 Ｎｐｐを作るのに、例えは、４−ニトロフェニルヒドラ
ジンとエチルアセトアセテートとを反応させ、ＰＣｆｔ
ｐを作るのに、４−クロロフェニルヒドラジンとエチル
ベンゾイルアセテートとを反応させる。この方法ては、
フェニルヒドラジン誘導体を適した極性溶媒（例えば、
ジメチルホルムア主ド、ジメチルスルホキシド、メタノ
ール、エタノール或は任意の簡単なアルコール或は氷酢
酸）中で、必要に応じて酸（例えばＨＣｌ２）或は塩基
（例えばピリジン或はトリエチルアよン）の存在におい
て攪拌する。完全な溶解を行うのに暖めることが必要な
場合がしばしばあり、そうする場合、混合物を室温に冷
却した後に、アシルアセトアセテートのアリール或はア
ルキルエステル（例えばエチルアセトアセテート或はエ
チルベンゾイルアセテート）１当量を加える。アシル基
の性質が置換基Ｒ１を指図し、例えば、Ｎｐｐを必要と
するならば、エチルアセトアセテートを用い、Ｐｎｐを
必要とするならば、エチルベンゾイルアセテートを用い
る。エステル基の性質は作られる生成物に影響を与えず
、エステル婁はメチル、エチル、任意の簡単なアルキル
エステル、フェニル、ベンジル或はアリール含有基にす
ることができる。混合物をゆっくり加熱して約８５〜９
０℃にする。反応を一晩放置し、その場合、温度を（約
６０℃に）下げるのが普通である。生成物は高い温度の
反応から晶出し、室温に冷却した際に完全に溶液から出
て来る。生成物の結晶を反応混合から分離しく例えば濾
過によって）、結晶を溶媒（例えばアルコール、酢酸或
は水）で濾液が無色になるまで洗浄する。次いて、結晶
を乾燥する。 活性アミノ酸エステルは、本１−フェニル−ピラゾリン
−５−オン化合物をアミノ酸のカルボキシル基によって
エステル化して作る。アミノ酸は通常下記の一般式を有
するアミン保護アミノ酸である。 Ｒ゛ ○ ｌ ＩＩ Ｙ−Ｎ Ｈ−ＣＨ−Ｃ−ＯＨ ここで、Ｒ゛はアミノ酸側鎖を表わし、Ｙは保護基であ
る。本発明の好ましい実施態様では、Ｙは下記からなる
群より選ふ保護基であるａ−フルオレニルメチルーオギ
シカルポニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−プチルオキシ力ルホニ
ル（ｔＢｏｃ） 、２−（４−ビフェニリル）−２−プ
ロビルオキシカルホニル（Ｂｐｏｃ）及び二１〜口ビリ
ジルスルフェニル（Ｎｐｙｓ）。下記の一般式を有する
活性アミノ酸エステルが形成されるに こで、Ｒ，、Ｒ２、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｒ及びＹは前
に規定した通りの基である。上記一般式を有する活性エ
ステルは既知のＬ−或はＤ−アミノ酸或はそれらの誘導
体の内のいずれかから作ることができる。例えば、アミ
ド側鎖を有するアミノ酸（例えば、グルタミン、アスパ
ラギン）はａ−アミン基についての保護基に加えてアミ
ド側鎖についての保護基を有し得る。１９８９年 ８ ２月２７日に出願した同時係属米国特許出願０７／３１
６．５７０号に記載する通りのＴａｏｂ （ｌ−リアル
コキシヘンジル）をベースにした保護基は固相ペプチド
合成における本目的に有用である。本活性エステルは、
Ｆｍｏｃがα−アミノ保護基であるＦｍｏｃ固相ベプヂ
ド合成において特に有用である。 活性アミノ酸エステルは、種々の方法により、例えば、
直接フェニルピラゾリジノンホスホニウム塩を経て或は
中間の非対称無水物を通して、或はカップリング試薬、
例えばジイソブロビル力ルポジイミト（Ｄ Ｉ ＰＣＤ
Ｉ）、ＤＣＣＩ或はジフェニルホスホロアジドを用い
て作る。カップリング試薬方法では、選んだ１−フェニ
ル−ピラゾリン−５−オン誘導体（例えば、Ｎｐｐ或は
Ｐｎｐ）を有機溶媒、例えばジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）に加え、必要ならば、化合物を完全に溶解させる
まで暖める。溶液を冷却して室温にし、アミン保護アミ
ノ酸にすることができる選択のアミノ酸を混合物に加え
、溶解するまで攪拌する。１−フェニル−ピラゾリン−
５−オン化合物をわずかに過剰に用いるのが普通である
。次いて、混合物を冷却して約−１０°〜約２０°Ｃと
し、カップリング剤、例えばジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣＤＩ）を加える。カップリング試薬の添
加量はアミノ酸の量に等しいか、或はそれよりわずかに
過剰にする。次いて、反応混合物を攪拌する。攪拌は、
カップリング剤及びエステル化の副生物から沈殿が形成
されるまで続８−Ｊる。例えば、ＤＣＣＤ Ｉを用いる
場合、沈殿はジシクロヘキシルウレアになる。沈殿を取
り去り（例えば、濾過により）、濾液を蒸発させる。蒸
発した際に、活性アミノ酸エステルが残分から晶出され
る。結晶を次いで必要に応して、例えばアセトニトリル
から再晶出させて更に精製することができる。 上述した手順と同様の方法を用いて、Ｆｍｏｃバリンの
２７の異なる活性エステルを作った。 これらの活性エステルを、それらの特性及び比活性と共
に表１に掲げる（活性の順に掲記する）。 活性を比較するのに用いる方法は、本質的にり、１４ｕ
ｄｓｏｎがＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒＬ５３巻、６１７頁（１９８８年）に記
載している方法に従って異なるカップリング試薬の効率
を比較する。この手順にいくつかの改良を行って、Ｆｍ
ｏ ｃ−アミノ酸活性エステルを比較するためのその適
性を改良する。この方法では、試験エステルと等モル量
のＦｍｏｃ−Ｉ ｊ２ｅ−ＯＰＦＰエステルとを混合し
、ＤＭＦ （ジメチルホルムアミド）にＤＭＦ ： ト
リフルオロエタノール３：１で溶解し、注射器カラム反
応装置系に収容する膨潤Ｇ １ ｎ （Ｔｍｏｂ）−Ａ
１ ａ−ＰＡＣ−樹脂のサンプルに加えた。２時間し
た後に、カップリングを停止させ、末端Ｆｍｏｃ基を取
り去り、ＶａＩ２及び■βｅの相対加入を樹脂加水分解
の後にアミノ酸分析によって求めた。結果を活性なエス
テルのいくつかの物理的特性と共に表１に挙げる。 Ｆｍｏｃ−Ｖａ １−ＯＦＦＰは５６．８％で加入され
たので、バリンをこれより多く加入した活性エステル↓
ゴＰＦＰエステルより一層活′性になる。 このことは、また、Ｄｈｏｂｔ （シヒ１〜ロヒトロキ
シオキソベンゾトリアジン）及びＤＮＴ （ジニトロフ
ェニル）エステルにもあてはまる。高効率とみなされる
多くを含む他の全ての候補は著しく活性が低く、この内
の一層低いデイビジョンはＭｐｌ）エステルであり、こ
れは３２２％の加入において、ＰＰＰの活性の半分より
わずかに高い活性を有する。が、本化学的誘導体は驚く
べきかつ有用な性質を有する。 表２で種々の本改良１−フェニル−ピラゾリン５−オン
エノールエステルの効率データを揚泥する。前に試験し
たエステルを中央として載せ、別の実験における値の間
の厳密な対応を得た。 −、Ｃ 匡 山 、ｆ：、ｅ Ｑ、ＣＬ ｍ： 、Ｃ（１） Ｚ （：ｌＩ＋ Σ ０ 咄 山 山 Σ ＊ Ｆｍｏｃ−Ｖａ １−Ｏｐｎｐに代えてｔＢの
ｃ−Ｖａｌ−ＯＰｎｐ（融点］、 ２０】２２）を用い
た場合に、同じ値か得られた。 ＊＊＊＊ 室温のＤＭＦに超音波処理（ｓｏｎｉｃａ
ｔｉｏｎ） ’ｖないで０２Ｍ可溶性。 ＊＊＊ 室温のＤＭＦに２分超音波処理して０．２Ｍ
可溶性。 ＊＊ 室温のＤＭＦに５分超音波処理して０２Ｍ可溶
性。 表２に示す通りに、１つの変形の他の全てはＰＦＰに比
べて活性が高い。２−カルボエトキシシクロヘキサノン
と４−二トロフェニルヒドラジンとを反応させて形成し
たＮｐｃ誘導体ては、Ｒ１及びＲ２を４−メチレン基で
ブリッジすることによって引き起こされるピラゾール環
の変形は系の芳香族性を減少させ、その活性を著しく低
下させた。対応して、最少の変化、フェニルによるメチ
ルの置換は結合及び著しい活性の増大をもたらし、良好
な溶解度及び高い結晶度を保留する。 ６ 塩素化シリーズにおいて、Ｄ（１２ｐｐとＰＣβｐとを
比較すれば、４−モノクロロ誘導体は２．４ジクロロ誘
導体に比べてはるかに活性が高い。これは、おそらく、
２−ＣＩ２基のバルク及び電子富化性が入ってくるアミ
ン基とピラゾール環の窒素との水素結合を抑制するから
であろう。 Ｎ１）ｐ及びＰｎｐは、共に、超活性であるが比較的不
安定なりｎｐ誘導体に比べて、実際極めて活性の高い誘
導体である。ＰｎｐはＮｐｐと比べてわずかに活性が高
く、かつ溶解度が大きい。また、ｔＢｏｃ−Ｃａ ｌ
０Ｏｐｎｐエステルは良好な結晶度を示し、活性が同じ
である。 本エステルはＰＰＰに比べて１０〜２０倍活性が高く、
結晶性が高く、貯蔵安定性であり、ヒドロキシル基に対
して比較的不活性であり、自己指示性を有する。ＤＭＦ
溶液中のＮｐｐアニオンは４８８ｎｍにおける吸光係数
５．３ＸＩＯ３（これが不完全なカップリングにおいて
へんがる色が観察される理由である）、任意の可能な干
渉源（例えば未反応エステルによって）から十分に離れ
た波長を有する。 表２は、また、競合方法において変法を導入する 通常
の手順（加入するＶａ１％、最後から２番目の欄）にお
いて、混合成分を完全に溶解した後に、競合実験をＤＭ
Ｐにおいて行う。改良法（最終欄）では、溶解をＤ Ｍ
Ｆ ／ ｌ−リフルオロエタノール（ＴＦＥ）の３・
１混合物で変化させ、競合を２分の後に行った。ＰＰＰ
対照における相対加入を変化させなかった。カップリン
グは依然完結に至る。が、１−フェニル−ピラゾリン−
５−オン誘導体の相対加入は、Ｐｎｐ及びＮｐｐの場合
の他は、増大する。増大はこの混合物におけるＰＰＰエ
ステルの部分分解に基因させることかでき、１−フェニ
ル−ピラゾリン−５−オン誘導体は一層安定である。こ
の溶媒の組合せを用いれば、ロジン結合ペプチドの水素
結合した第二構造を破壊し、はとんどのカップリングが
均一な速度になるのを確実にし、活性誘導と８■合せた
際に、この速度は非常に大きくなる。 本コーフェニルービラゾリンー５−オン誘導体ば既知の
カップリング試薬への添加剤として用いることかでき、
新規なカップリング試薬を構成することができ或はアミ
ノ酸の活性エステルとして用いることができる。例えば
、固相ペプチド合成において、新規カップリング試薬と
して、Ｘがホスホニウム塩である、例えばトリス（ジメ
チルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
紹成物を、非予備活性化α−アミン保護アミノ酸誘導体
（また、「遊離」保護アミノ酸とも呼ぶ）に対し１当量
の第三塩基と共に、５ｐｐｓ系に加える。生成した活性
種を次いて支持体に結合したペプチドに加えてカップリ
ング及び連鎖伸長を行なわせ、同時に１−フェニル−ピ
ラゾリン−５オン成分を遊離し、これが比色指示薬とし
て作用する。また、本１−フェニル−ピラゾリン−５オ
ン化合物のホスホニウム誘導体をＤＣＣＩ手順の別法と
して用いることができる。それらの製法については本明
細書中下記に記載する。 上述したプロセスによって作った活性アミノ酸な固相ペ
プチド合成において用いる。この方法 ９ ては、第１アミノ酸（通常、ａ−アミン保護アミノ酸）
をそのカルホキシル基によって合成（６（脂或はヘッド
に共有結合させる。合成樹脂の例は下記を含む Ｆｍｏ
ｃ相溶性ポリスチレンＰＡＣ及びＰＡＬ樹脂（カリフォ
ルニア、ノハト、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃ
ｈｍ）、 ｔ Ｂ ｏ ｃ相溶性ポリスチレン樹脂、Ｍ
ＢＨＡ及びＰＡＭ樹脂、並びに封入形（Ｐｅｐｓｙｎｋ
）或はフリー形のポリジメヂルアクリルアミン、機能化
セラミック粒子、ＨＰ ＣＣ及び他のシリカ、調節され
た細孔のガラス、ポリエチレングリコールーボリスヂレ
ンコボリマー −数的な合成ザイクルはアミノ酸のα−
アミン基を脱保護し、洗浄し、適している場合には中和
し、次いて加える次のカルボキシル活性化アミノ酸と反
応させることからなる。各々の連続したアミノ酸を樹脂
結合したアミノ酸或はペプチド鎖の末端窒素にそのカル
ボン酸基のカルホニル炭素によって結合させる。活性化
基がカップリング反応の間に遊離され、反応媒体に開放
され、系内に存在する未反応アミノ基によってイオン化
されることから、 ０ 反応の完了をモニターする指示薬として作用する。例え
ば、Ｎｐｐ保訊アミノ酸を用いる場合、カップリング反
応の間に遊離されるＮｐｐは未反応アミン基によってイ
オン化され、イオン化した状態で強い赤色になる。反応
を完了した際に、遊離アミノ基が全て消費されるにつれ
て、ｒ”Ｊｐｐは非イオン化されるようになり、色があ
ぜで金色になる。このように、反応は自己指示的であり
、遊離アミン基の試験をするために反応を停止する必要
を排除する。 上記の方法の別の実施態様では、エノール形（すなわち
、Ｘ＝Ｈ）の１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合
物をアミノ酸活性化基として用いずに、比色指示薬とし
て５ＰＰＳ系に別途加えて反応の完了をモニターする。 ５ＰＰＳ法の別の実施態様では、Ｘが陽に荷電した種で
ある１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合物をカッ
プリング試薬として作る。有用な試薬１．Ｊ下記を含む
ホスホニウム及びウラン塩、例えばｌ・リス（シアル
ギルアミノ）ホスホニウム塩及びテＩ〜ラアルキルウラ
ン塩にテトラフルオロボレート或はヘキサフルオロホス
フェート対イオンを配合したもの。アルキル基はメチル
或はエチル基が普通であるが、また小さい環系、例えば
ピロリジン、ピペリジンにすることもてきる。１フェニ
ル−ピラゾリン−５−オンアニオンと活性誘導体（例え
ばヘキサメチルホスホニウムクロリド或はテトラメチル
ウランクロリド）とを反応させて付加体を形成して所望
のカップリング試薬とする。このハイブリットを次いで
遊離のアミノ酸に加えてカップリング用に活性化しかつ
１−フェニル−ピラゾリン−５−オン成分を遊離させ、
これは、次いで樹脂に結合したペプチドのアミン基との
反応の程度の比色モニターリングになる。 カップリングが完了した際に、アニオンの赤色はあぜで
金色になる。これらのハイゾリン１〜カップリング試薬
ば５ＰＰＳにおＧづる効率的かつ自己指示性カップリン
グ試薬であり、実際の活性なカスデルそれら臼体を直接
合成する僅れた方ｉ’７３な提（ｐ（する。上述したＤ
ＣＣ１法は実施しかつスケールアップするのが比較的困
難である。ハイブリット試薬を用い、次いでアミノ酸誘
導体をアミン基の不存在において活性化すると活性なエ
ステルを生じ、該エステルを次いで水から沈殿させ、濾
過して分離する。 本方法の別の実施態様では、溶液相か或は固相のいずれ
かの合成におけるカップリングの程度をモニターし、完
了を指示した後に、ペプチドのアセンブリープロセスに
おける次の工程を開始することができる。これにより、
高品質のペプチドを必要とする最少の時間で合成するこ
とになる。エノールアニオンが吸収する波長が高いこと
、例えばＮｐｐの場合の４８８ｎｍは、他の吸収種が測
定を妨げないことを意味する。例として、○ １ｍモル
のスケールで、カップリングが９９％完了した場合、４
８８ｎｍにおける吸収は２０．Ｄ。 ユニットになるべきである。よって、この完了度にモニ
ターして、なお−層高い完了のレベルに近づき得る。こ
れはいくつかの方法によって達成することができ、例え
ば、光源、フィルター及び光 ３ 電池を線状様式で配置し、反応室を直接路に置くことが
できる。別法として、反応装置のガラス表面から反射す
る先の吸収の変化を用いることができ、或は光源を透明
な反応装置内に埋封し、ディレクターを反応装置のまわ
りにシリンダーとして配置することができ、これは最も
感度がよい。 本ｌ−フェニル−ピラゾリン−５−オン誘導体の用途の
内のいくつかは下記を含む・溶液及び固相の両方の合成
における全てのＮ−保護アミノ酸の活性エステルとして
；カルボジイミド、（ベンゾトリアゾリルオキシ）トリ
ス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート（ＢＯＰ）及び活性なエステルカップリングへ
の添加剤として、ハイブリット試薬の成分として任意の
タイプのペプチドカップリング用のカップリング完了指
示薬として。本化合物のアシル誘導体も、また、ペプチ
ド及びＤＮＡの両方の合成において、連鎖停止及びキャ
ッピング試薬として用いることができる。このような誘
導体は、加え ４ て、ヌクレオシドモノマーを直接製造する際に重要にな
り得る。アルキル置換されたホスホルアミダイト及びウ
レアに関する誘導体は、自己指示性であり、向上した反
応性及び安定性を有するＢＯＰ及びＨＢＴＵ （２−（
Ｉ Ｈ−ベンゾトリアゾル１−イル）−１，１，３，３
−テトラメチル−ウランへキサフルオロ−ホスフェート
）カップリング剤の類似物を生じる。例えば、本１−フ
ェニル−ピラゾリン−５−オンのスルホニル誘導体はホ
スフェート−トリエステル媒介ＤＮＡ合成における良好
なカップリング剤になる。例えば、メシチレンスルホニ
ル３−メチル−１−（４′−二トロフェニル）−２−ピ
ラゾリン−５−オン（Ｍ Ｓ−Ｎ ｐｐ）を使用した場
合、優れた結果を生じる。適したｐＫを有するそれらの
誘導体、例えばＮｐｐは有用なアミダイト活性剤として
働くことができる。 発明を更に下記の例によって示す。 例」２ 】−フェニル−ピラゾリン−５−オンの調製置換された
フェニルヒドラジンとアシルアセトアセテートアリール
或はアルキルエステルとを加熱によって縮合させて所望
の誘導体をもたらす。 これを下記に挙げるＮｐｐの調製によって説明する。 ４−ニトロフェニルヒドラジン（水１０％を含有する。 １．７ｇ、１０ｍモル）を氷酢酸（２０ｍ℃）中で攪拌
し、完全な溶液が生じるまで３５℃に暖めた。攪拌した
混合物を室温に冷却し、エチルアセトアセテ−ｈ（１，
３０ｇ１．２７ｒｎＪ２．１０ｍモル）を迅速に加えた
。室温で１０分した後に、フラスコを油浴に入れ、加熱
を始めて３０分かけて８５℃にした。この温度において
更に３０分した後に、稠密な黄色沈殿が生成した。反応
を８０℃において２時間放置し、次いで６０℃において
一晩攪拌し、室温に冷却した。結晶を濾過によって捕集
し、酢酸のいくつかの小部分て濾液が無色になるまで洗
浄し、次いでエーテルで洗浄し、風乾して融点２１９°
〜２２０℃ノＮ ｐ ｐ２．ｏＯｇを収率９１％で得た
。 鯉塁 フェニルピラゾリノンアミノ酸エステルの調製この方法
は任意のＮ−及び側−鎖保護アミノ酸及び全てのエステ
ル成分に応用可能である。方法はジシクロへキシル力ル
ホジイミト及びジメチルホルムアミド溶媒中の２成分を
用いる。下記の例で、Ｆｍ０ｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＮｐｐ
を下記の通りにして調製する ３−メチル−１−（４′−ニトロフェニル）２−ピラゾ
リン−５−オン（１，１２ｇ、５．１ｍモル）をＤＭＦ
（２５ｒｎＪ２）に、約４５℃に暖めて溶解した。透明
な暗オレンジ色溶液が生威し、これを攪拌し、室温に冷
却し、Ｆｍ０ｃ−Ｌバリン（１，７ｇ、５ｍモル）を加
えた。これが全て溶解した際に、混合物を１５℃の浴に
入れ、激しく混合する反応にジシクロへキシルー力ルホ
ジイミト（１０７ｇ、５．０５ｍモル）を加えた。攪拌
を１５°Ｃにおいて２日間続けた。沈殿したジシクロへ
キシルウレアを濾過によって取り去り、濾液な蒸発させ
た。Ｎｐｐエステルが直 ７ ちに晶出した。それを高い真空において短Ｉ時間乾燥し
、次いて熱アセトニトリル１００ｍＩｌから再晶出させ
て、融点１９５’ 〜１９７℃のＦｍｏｃＶａｌ ０
Ｎｐｐ２．２Ｈを収率８０％で得た。 下記の表３は上記の方法によって調製したＦｍｏｃ−ア
ミノ酸ＮｐＩＩ）エステル（−ＯＮｐｐと表示する）を
更にいくつか示す 表３：活性Ｆｍｏｃ−アミノ酸Ｎｐｐエステルアミノ酸
分工屡−収崖 融点（℃）Ｆｍｏｃ″′Ｇ
ｌｙ−ＯＮｐｐ ４９１１ ８６％
１６４〜１６７Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＮｐｐ
５１２ ７８％ １８５〜１８
７Ｆｍｏｃ−Ｌ−１１ｅ−ＯＮｐｐ
５５４ ８３％ １７２〜１７３Ｆｍｏｃ−Ｌ
−八５ｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＮｐｐ ６１２ ５３
％ １３２〜１３３Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｂｕ
ｔ）−ＯＮｐｐ ６６０ ７３％ １３９〜１４１Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｍｏｂ）−ＯＮｐｐ ７５０
７５％ １６６〜１６７Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＮ
ｐｐ Ｆ＋４０ ８０％ １９５
〜＋９７促旦 合成を、Ｅｘｃｅｌｌベブヂド合成装置で、注記した他
は標準の試薬及び操作プロトコルを用いて行った。全て
のＮ−メチルモルホリン及びＨＯＢｔ溶液（活性剤及び
プリウォッシュ）をＨＰＬＣグレードＤＭＦに替えた。 この方法では活性化或はプリウォッシュを必要としない
。各々のカートリッジにＮｐｐエステル単独を０．５ｍ
モル（ＢＯＰ或はＨＯＢｔを必要としない）充填した。 カップリングの間目視検査して、カップリングが５分以
内で完了したことを示した。金色の活性なエステル溶液
が反応カラムに入った際に樹脂を強い赤色に変えさせ、
強い赤色はカップリングが進行するにつれてあぜで金色
になった。合成を完了した後に、樹脂を、金色の存在に
よって示される通りに、Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ （ＴＦＡ
／ＤＭＳ／ＤＣＭ、１４：Ｉ・５）によって２時間の間
切断させた。樹脂を濾過し、濾液を蒸発させ、生成物の
ペプチドを氷酢酸から凍結乾燥した。これは、高純度に
一致するＨＰＬＣ及びＡＡＡ挙動を存するペプチド１２
０ｍｇ （１００％）をもたらした。 例」− 固相ペプチド合成における指示薬としてのＮｐＰの使用 例３に記載する方法を改良してＤＭＦ２００ｍ、Ｑ中Ｎ
ｐｌ）Ｉｇの溶ン夜でプリウォッシュをもたらした。カ
ートリッジにＩ’Ｊｐｐエステル単独を０．２５ｍモル
（２，５倍過剰）充填した。カップリングを３０分間行
わせた。カラムはブリウォッシュの間に強い赤色になり
、カップリングの間に色があせて金色になった。これは
ｔ’ｌｐｐを指示薬として用いる例である。この特定の
例はＮｐｐエステルをカップリング用に使用したが、Ｎ
ｐｐを使用する他の方法は全て同し変化を示したてあろ
う。カップリングは５〜１０分以内て完了した。切断及
び分析して、例３て得られたのに匹敵する収率及び分析
データを得た。 剋Ｅ 例２の方法に正確に従い、Ｎｐｐ （１，１２ｇ、５．
０５ｍモル）をＤＭＦ （２５ｍｎ）に溶解し、フェノ
キシ酢酸（０，７６ｇ、５ｍモル）を攪拌する溶液に加
えて１５°Ｃで置いた。 Ｄ ＣＣＩ （１，、０７ｇ ）を加え、混合物を一晩
攪拌した。懸濁液を４℃において２時間放置し、次いで
濾過し、濾液を蒸発させた。残分を無水エーテル２０ｍ
℃に溶解して４℃において一晩放置した。ＰＡＣ−ＯＮ
ｐｐの針状結晶（融点９４〜９６℃）が沈殿され、高い
収率及び純度で分離された。 この手順をＭｐｐに応用した場合、生成物は得られなか
った。 奥王 当業者ならば、せいぜい日常の実験を用いて、本明細書
中に記載する発明の多くの均等物を認識し、或は確認す
ることができるものと思う。かかる均等物は本発明の範
囲内に含まれる意図である。 手糸売だ甫正書 平底２年７月２５日 特許庁長官 植 松 敏 殿 事件の表示 特願平２ １４７５３３号 発明の名称 固相ペプチド合成用活性エステル補正を
する者 事件との関係 特許出願人名 称
ミリボア・コーポレイション代理人 〒１０３ 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 １ 明細書３４頁５行の「低く、」を「低い。」に訂正
１−る。 ２、同同頁５〜６行の「この内の一層低いデイビジョン
はＭＩ）ｐエステルであり、」を「−層低いデイビジョ
ンの内にＭｐｐエステルかあり、」に訂正する。 手続補正書 平成２年８月３日 特許庁長官 植 松 敏 殿 事件の表示 平成２年特許願第１４７５３３号 発明の名称 固相ペプチド合成用活性エステル 補正をする者 事件との関係 特許出願人名 称
ミリボア・コーポレイション代 理 人 〒１０３ １ 特許請求の範囲を別紙の通りに訂正する。 ２、明細書１５頁最下行の「ウラン」を［ウロニウム（
Ｓ−メチル−２−チオ尿素）」に訂正する。 ３、同１６頁１行の「テトラメチルウラン」を「テトラ
メチルウロニウム」に訂正する。 ４ 同４１頁下から２行の「ウラン」を「ウロニウム」
に訂正する。 ５、同４２頁１行の「テトラアルキルウラン」を「テト
ラアルキルウロニウム」に訂正する。 ６、同同頁８行の「テトラメチルウランクロリド」を「
テトラメチルウロニウムクロリト」に訂正する。 ７、同４５頁６行の「ウラン」を「ウロニウム」に訂正
する。 「２、特許請求の範囲 １、下記の一般式を有する化合物： ここで、 ａ、Ｒ，は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エチ
ル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロロ
フェニル及びベンジル：ｂ−Ｒ，は下記からなる群より
選ぶ：Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、フェニル１
．ニトロフェニル、クロロフェニル、ベンジル、ハロゲ
ン、Ｎ Ｏ２及びアゾ誘導体： ｃ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅば下記からなる群より選ぶ：
Ｈ，Ｎｏ２．ハロゲン及び５Ｏ３Ｈ：ｄ、Ｘは下記から
なる群より選ぶ：ホルミル、アセチル、ベンゾイル、フ
ェノキシアセチル、ｌ・ルエンスルホニル、２．４．６
−ドリメチルベンセンスルホニル、ホスホニウム塩、つ
免三皇込塩、アミノ酸及びアミン保護アミノ酸誘導体 Ｒ２、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅが全てＨならば、Ｒ＋はメ
チルでない。 ２ Ｒ１及びＲ２が更にピラゾリン−オン環の３及び４
位の間のブリッジを含み、該ブリッジはメチレン基３〜
８を有する特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３ ｘが下記の一般式を有する保護アミノ酸誘導体であ
る Ｒ’ ０ １１ Ｙ−ＮＨ−ＣＨ−（＞ＯＨ ここで、Ｒ゛はアミノ酸側鎖であり、Ｙは下記からなる
群より選ぶ：Ｆｍｏｃ ｔＢｏｃＢｐｏｃ及びＮｐｙ
ｓ特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ４、ａ、ｂ、ｄ及びｅがＨてあり、ＣがＮ ０２であり
、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＣＨ３或はフェニルである特
許請求の範囲第１項記載の化合物。 ５、ｃ、ｂ、ｄ及びｅがＨであり、Ｃかｃ９．であり、
Ｒ２がＨであり、ＲｏがＣＨ３或はフェニルである特許
請求の範囲第１項記載の化合物。 ６、 ａ及びＣが共にＣＩ２であり、ｂ、ｄ及びｅが
Ｈであり、Ｒ２がＨであり、ＲＩがＣＨ３或はフェニル
である特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ？、 ａ及びＣが共にＮ Ｏ２であり、ｂ、ｄ及びｅ
がＨであり、Ｒ２がＩ］であり、Ｒ１がＣＨ３或はフェ
ニルである特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ８、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅがＨであり、Ｒ２がＨてあり
、Ｒ１がフェニル或は４−ニトロフェニルである特許請
求の範囲第１項記載の化合物。 ９、ａ、ｂ、ｃ＋及びｅが１１であり、ｅがＮ Ｏ２で
あり、Ｒ１及びＲ２が虚位３及び４を結合する４つのメ
チレン基を表わす特許請求の範囲第２項記載の化合物。 １０、ｘが１〜リス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘ
キサフルオロホスフェ−１・或はテトラフルオロホレー
トである特許請求の範囲第１項記戦の化合物。 １１、 Ｘがテト之メチルウロニウムへキザフルオロ
ホスフェート或はテトラフルオロホレートである特許請
求の範囲第１項記載の化合物。 １２、下記の一般式を有する、固相ペプチド合成におい
て用いるための活性化アミノ酸エステル：ここで、 ａ、ＲＩは下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エチ
ル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロロ
フェニル及びベンジル：ｂ、Ｒ２は下記からなる群より
選ぶ：Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、フェニル、
二１〜口フェニル、クロロフェニル、ベンジル、ハロゲ
ン、ＮＯ□及びアゾ誘導体 ｃ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは各々下記からなる群より選
ぶ・Ｈ，ＮＯ２、ハロゲン及び５０３Ｈ： ｄ、Ｙは下記からなる群より選び：Ｆｍｏｃ。 ｔＢｏｃ、Ｂｐｏｃ及びＮｐｙｓ ； ｅ、Ｒ“はアミノ酸側鎖を表わす。 １３、ａ、ｂ、ｄ及びｅがＨであり、ＣがＮｏ２であり
、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＣＨ３或はフェニルであり、
ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１２
項記載の活性化アミノ酸エステル。 １４、ａ、ｂ、ｄ及びｅがＨであり、ＣがＣＩ２であり
、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＣＨ３或はフェニルであり、
ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１２
項記載の活性化アミノ酸エステル。 １５、 ａ及びＣがＣＸであり、ｂ、ｄ及びｅがＨで
あり、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＣＨｓ或はフェニルてあ
り、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第
１２項記載の活性化アミノ酸エステル。 １６、ａ及びＣがＮＯ２であり、ｂ、ｄ及びｅがＨてあ
り、Ｒ１がフェニル或は４−ニトロフェニルであり、Ｙ
がＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１２項
記載の活性化アミノ酸エステル。 １７、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅがＨであり、Ｒ２がＨであ
り、Ｒ，がフェニル或は４−ニトロフェニルであり、Ｙ
がＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１２項
記載の活性化アミノ酸エステル。 １８、Ｒ，及びＲ２が更にピラゾリン−オン環の３及び
４位の間のブリッジを含み、該ブリッジはメチレン基３
〜８を有する特許請求の範囲第１２項記載の活性化アミ
ノ酸エステル。 １９、ａ、ｂ、ｄ及びＣがＨであり、ｅがＮＯ２であり
、Ｒ１及びＲ２が虚位３及び４を結合する４つのメチレ
ン基を表わし、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請
求の範囲第１８項記載の活性化アミノ酸エステル。 ２０、下記の工程を含む固相ペプチド合成に１６８−Ｊ
るカップリング反応をモニターする方法 ａ、第］α−アミン保護アミノ酸を結合させた合成樹脂
を準備し： ｂ、（ａ）における樹脂と第２０−アミン保護アミノ酸
とを、第２アミノ酸の第１アミノ酸へのカップリングを
引き起こすのに適した条件下で接触させ： ｃ、（ｂ）における樹脂と下記の一般式を有する１−フ
ェニル−ピラゾリン−５−オン化合物とを接触させ、そ
れで赤色を出現させ： ここで、 （ｉ）Ｒ，は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エ
チル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロ
ロフェニル及びペンシル：（ｉｉ） Ｒ２は下記からな
る群より選ふ：■１、メチル、エチル、イソプロピル、
フェニル、二ｌ・ロフェニル、クロロフェニル、ベンジ
ル、ハロゲン、ＮＯ２及びアゾ誘導体 （ｉｉｉ）ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは下記からなる群より
選ぶ： Ｈ，ＮＯ２，ハロゲン及び５Ｏ３Ｈ；（ｉｖ）
Ｘは下記からなる群より選ぶ：ホルミル、アセチル、
ベンゾイル、フェノキシアセデル、トルエンスルホニル
、２，４．６−ドリメチルベンゼンスルホニル、ホスホ
ニウム塩、ウロニウム塩：ｄ、工程（ｂ）を繰り返して
ペプチド鎖を形成し ｅ カップリング反応の色をモニターする。 ２１、モニター工程（ｅ）を分光測光法により行う特許
請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、自動化させた特許請求の範囲第２１項記載の方法
。 ２３．１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合物がＮ
ｐｐである特許請求の範囲第２０項記載の方法。」
ピラゾリン−５−オンのエノールエステル誘導体をベー
スにした化合物、それらの固相ペプチド合成におりるア
ミノ酸用活性化基としての用途、それらの固相ペプヂト
合戊におけるカップリング試薬としての用途及びそれら
のカップリング反応をモニターする際の使用効果に関す
る。 発明は、更に、本化合物を有する活性化アミノ酸エステ
ル、固相ペブヂト合成におＧづる化合物及び活性化アミ
ノ酸の製造及び使用方法に関する。 従来の共蘭 ペプチドば固相合成とアミノ末端ブロック［・アミノ酸
なペブヂト鎖に段階的に加え、それらのカルボニル末端
を固体支持体に結合させることを伴う複２１１なプロセ
スである。 固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、第１アルフアーアミ
ン保護アミノ酸を有機リンカ−ニＪ：っで不溶性樹脂合
成ヘットに共有結合させることから始めるのが代表的で
ある。次に、一般的な合成サイクルは最後のアミノ酸の
アルファーアくン基を脱保護し、洗浄し、必要ならば中
和した後に、加える次のアルファーアミン保護アミノ酸
のカルホキシル活性化形と反応させることから／ｌる。 各々の連続したアミノ酸をカルボン酸基のカルボニル炭
素によって末端窒素に結合させる。 最も最近のベブヂト合成装置はカルボシ−イミ１〜試薬
との（例えばジシクロへキシルカルホシイミ１ｊ（ＤＣ
ＣＩ）との）、或はシイソブロビルカルホシイミド（Ｄ
ＴＰＣＤＩ）とのカップリングを行う。合成は、合成８
Ｊ脂を中に入れた反応容器で行う。 カップリング反応か完了した後に、カルホン酸火によっ
て合成樹脂に結合させた保護アミノ酸を脱ブロッキング
剤１例えＣＪトリフルオロ酢醍（ＴＦＡ）或はピペリジ
ンで脱ブロックし、（ＴＦＡを使用する場合）塩基で洗
浄し、次の活性アミノ酸残基を反応容器に加える。所望
のペプチド残基を得たら、ペプチドを、通常無水フッ化
水素（ＨＦ ）か或はＴＥＡのいずれかで合成支持体か
ら切断させる。 カップリングを自動５ｐｐｓで行う方法は基本的に２つ
あり、活性アミノ酸誘導体を用いるか或はカップリング
の前に活性化させた遊離アミノ酸誘導体を用いる。活性
誘導体、活性なエステルを用いることの１つの利点は、
それらが結晶性ならば、高純度になり、清浄なカップリ
ングをもたらし得ることである。活性なエステルの不利
な点は、それらが反応性の高い場合、溶解した際に及び
固体状態で長期貯蔵した際に不安定になることである。 よって、活性なエステルは粉末として貯蔵し、カップリ
ングの前に溶解しなければならない。 ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）活性なエステルが現
在固相ペプチド合成及び溶液合成において用いられてい
る。これらの誘４体は下記の点て不利な悩みがある。す
なわち毒性の高い、値段の高い吸湿性物質であるペンタ
フルオロフェノールから作られる。廃棄物の処理が問題
である。ＰＰＰは危険なジオキシン様物質を含有し或は
貯蔵時にこのような物質を生じ得、この反応において遊
離するペンタフルオロフェノールは極めて酸性であり、
樹脂に（−１いたアミノ基をプロトン付化して最終のカ
ップリング段階の速度を減しさせると考えられる。これ
は平衡プロセスであるので、この温和な酸にあるプロト
ン付化はカップリングか完結に至るのを妨げないが、プ
ロセスの速度を減じさせ得る；２つのＰＰＰエステル、
セリン（Ｓ ｅ ｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）は非結
晶性であり、そのためこれらに代えて代りの結晶性エス
テルを用いる。ＰＰＰエステルの溶液安定性は不十分で
あると考えられる。すなわち、ＰＰＰ活性エステルを用
いる代りの有用な代替法が必要とされる。 同相ペプチド合成について利用可能な系は、例えは米国
特許Ｌ３６２，６９９号、同４，５３１．２５８号、同
３．６４７．３９０号及び３．５５７．０７７号に記載
されている。理想的には、系は次のアミノ酸をペプチド
鎖に加える前に、各々のアミノ酸付加が完全であること
をモニターする方法を含む。このような系はペプチドの
できるだけ最良の収率な確実にする。 アミノ酸合成反応をモニターするいくつかの利用可能な
方法は、Ｇ、 Ｂａｒａｎｙ及びＢ、Ｍａｎｉｆｉｅｌ
ｄがＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ、 ２巻、１５０〜１５４
頁（１９７９年） 、 ”５ｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａＳｏｌｉ
ｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
”に載せている。 同相ペプチド合成をモニターする種々の方法の内、今日
利用可能な最も効率的かつ感度のよい方法はアミノ基を
検出することによって未反応の或は遊離のアミノ酸の存
在を求めるものである。これらの方法は、通常、反応を
停止させ、樹脂結合したアミノ基なアミノ基と反応性の
試薬で滴定することを伴い、検出し得る応答（例えば比
色測定或は電位差測定）を示す。これらの滴定方法は、
過塩素酸或はピクリン酸のような或ばハライド＋；、Ｘ
ｙ例えはビリジンーヒトロクロリ１−を形成するハロゲ
ン化合物を用いるのが普通である。これらの方法はカッ
プリング反応を停止させることを必要とし、アミノ基の
内のいくつかを破壊し、ペプチド釦自体と反応性である
ことを含むいくつかの欠点を有する。 発明の構成 本発明の化合物は下記の一般式を有する１−フェニル−
ピラゾリン−５−オンのエノールエステルである ここでＲ１は下記からなる群より選ぶ Ｈ、メチル（Ｃ
Ｈ３）、エチル（ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ＣＨ
（ＣＨ３） ２ ） 、フェニル、ニトロフェニル、ク
ロロフェニル及びヘンシル、或はこれらの簡単な変形。 簡単な変形は、例えば芳香族環に付いた１或はそれ以上
の置換基を含む。 Ｒ２は下記からなる群より選ふ：Ｈ、メチル（ＣＨ３）
、エチル（ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ＣＨ（ＣＨ
３） ２ ） 、フェニル、ニトロフェニル、クロロフ
ェニル、ベンジル、ハロゲン（例えば、Ｃ，Ｃ，Ｂｒ）
、 ニトロ（ＮＯ２）及びアゾ誘導体（例えば、Ｐｈ−
Ｎ＝Ｎ−）或はこれらの簡単な変形。加えて、Ｒ１及び
Ｒ２はピラゾール環の３及び４環位置の間のブリッジを
表わすことができ、該ブリッジはメチレン基約３〜約８
を有する。置換基ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは下記からなる
群より選ぶ・Ｈ，ＮＯ２、ハロゲン及び５０３Ｈ；Ｘは
下記からなる群より選ぶ ホルミル、アセチル、ベンゾ
イル、フェノキシアセチル及びトルエンスルホニル、２
，４．６−ドリメチルベンセンスルホニル。Ｘは、また
、下記にすることができる：ホスホニウム塩、例えばト
リス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホ
スフェート或はテトラフルオロポレート、ウラン塩、例
えばテトラメヂルウランヘキサフルオロホスフェート或
はテトラフルオロボレート及びこれらの化合物の誘導体
。加えて、Ｘはアミノ酸及びアミン保護アミノ酸誘導体
を表わし、それで活性アミノ酸誘導体を形成する。しか
し、Ｒ２ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅが全てＨによって表わさ
れるならば、Ｒ＋はメチルになることができない、とい
うのは、この構造を有する化合物Ｍｐｐは低い活性を有
し、通常低い収率で生成され、自己指示しないからであ
る。 本１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合物をアミノ
酸のカルボキシル基によってエステル化して活性アミノ
酸誘導体を生成する。アミノ酸は通常下記の一般式を有
するアミン保護アミノ酸誘導体である Ｒ’ ０ １］Ｉ Ｙ −Ｎ Ｈ−ＣＨ−Ｃ−ＯＨ ここで、Ｒｏはアミノ酸側鎖を表わし、Ｙは保護基、例
えばα−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍ
ｏｃ） 、ｔ−ブチルオキシ−カルボニル（ｔＢｏｃ）
、２− （４−ビフェニリル）＝２−プロビルオキシ
カルホニル（Ｂｐｏｃ）及び２−ニトロピリジルスルフ
ェニル（Ｎｐｙｓ）である。 本化合物は固相ペプチド合成用の優れた性質を有する。 化合物は５ｐｐｓ系に加えた場合、比色指示薬として働
く。本化合物から作る活性アミノ酸エステルは純粋、結
晶性、安定であり、自己指示性である。例えば、３−メ
チル−１＝（４′ニトロフエニル）２ピラゾリン−５−
オン（Ｎｐｐ）のアミノ酸エステルは高度の結晶性であ
り、５ｐｐｓ用に通常用いられる溶媒（例えば、ＤＭＦ
）の溶液において安定であり、ヒドロキシル基に対して
非反応性である。カップリングの間に遊離するＮｐｐを
未反応アミノ基でイオン化して強いべんがら着色を支持
体にもたらし、これは、カップリングが完了した際に、
色があせて非イオン化Ｎｐｐの金色になる。この色の変
化を用いて反応の完結をモニターすることができる。 本ｌ−フェニル−ピラゾリン−５−オン誘導体は既知の
カップリング試薬への添加剤として用いることができ、
新規なカップリング試薬を構成することができ或はアミ
ノ酸の活性なエステルとして用いることができる。例え
ば、固相ペプチド合成において、新規カップリング試薬
として、Ｘがホスホニウム塩である、例えばトリス（ジ
メチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェー
ト組成物を、非予備活性化α−アミン保護アミノ酸誘導
体（また、「遊離」保護アミノ酸とも呼ぶ）に対しｌ当
量の第三塩基と共に、５ｐｐｓ系に加える。生成した活
性種を次いで支持体に結合したペプチドに加えてカップ
リング及び連鎖伸長を行なわせ、同時に１−フェニル−
ピラゾリン−５−オン成分を遊離し、これが比色指示薬
として作用する。また、本１−フェニル−ピラゾリン−
５−オン化合物のホスホニウム誘導体をＤＣＣＩ手順の
別法として用いることができる。 それらの製法については本明細書中下記に記載する。 本１−フェニル−ピラゾリン−５−オン誘導体を用いて
下記を含むいくつかの所望の性質を有する活性アミノ酸
エステルを生成する・安価な非毒性物質から作ることが
できる；カップリングの間に遊離する副生物は低い活性
及び未反応活性エステルとの区別を可能にし、それでカ
ップリングの定量を可能にするスペクトル特性を有する
；高度の結晶性であり、ＤＭＦに可溶性であり、ジシク
ロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＴ）縮合法を含む種
々の方法によって高い収率及び純度で製造することがで
きる。 本化合物から生成する活性アミノ酸誘導体の性質は下記
を含む：高い結晶性及び反応性、安定性及び加水分解よ
りもむしろアミノリシスへの選択性。これらの化合物の
アミノ酸エステルはヒドロキシル基の存在に対して比較
的不活性であるので、水素結合した分断（ｄｉｓｒｕｐ
ｔｉｎｇ）アルコール、例えば２，２．２− トリフル
オロエタノールの存在において有利に用い、それでペプ
チド第二構造及び凝集によって妨げられる困難な反応を
完了に至らせることができる。これらのアルコールを用
いることは、ヒドロキシルによる作用に対し不活性でな
いＰＰＰ或はその他のエステルを用いる場合、５ｐｐｓ
において適していない。本活性アミノ酸エステルは自己
指示性てあり、固相ペプチド・合成の分光測光モニター
リング及び自動化を容易にする。 憩１Ｂ榎圧募４０４里 本発明は１−フェニル−ピラゾリン−５−オンに基づく
化学誘導体及び固相ペプチド合成（ｓｐｐｓ）における
それらの使用方法に関する。組成物は１−フェニル−ピ
ラゾリン−５−オンのエノールエステル誘導体及びこれ
らの化合物を含有するアミノ酸活性なエステルである。 ５ｐｐｓ用の他のエステル及びヘースの１フェニル−ピ
ラゾリン−５−オン構造に置換することによって生成す
る誘導体に比へて１−フェニル−ピラゾリン−５−オン
エステルの活性か高いことは本発明の主題である。 本発明の化合物は下記の一般式を有する１ ０ フェニル−ピラゾリン オンのエノールニス チルである・ ここでＲ１は下記からなる群より選ぶ・Ｈ、メチル（Ｃ
Ｈ３）、エチル（ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ＣＨ
（ＣＨ３） ｚ ） 、フェニル、ニトロフェニル、ク
ロロフェニル及びベンジル、或はこれらの簡単な変形。 簡単な変形は、例えば芳香族環に付いた１或はそれ以上
の置換基を含む。 Ｒ２は下記からなる群より選ぶ Ｈ、メチル（ＣＨ３）
、エチル（ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ＣＨ（ＣＨ
３） ２ ） 、フェニル、ニトロフェニル、クロロフ
ェニル、ヘンシル、ハロゲン（例えば、Ｃ３，Ｂｒ）、
ニトロ（ＮＯ□）及びアゾ誘導体（例えば、Ｐｈ−Ｎ＝
Ｎ−）或はこれらの簡単な変形。加えて、Ｒ８及びＲ２
はピラゾル環の３及び４環位置の間のブリッジを表わす
ことができ、該ブリッジはメヂレン基約３〜約８を有す
る。置換基ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは下記からなる群より
選ぶ・Ｈ，ＮＯ３、ハロゲン及び５Ｏ３Ｈ，Ｘは下記か
らなる群より選ぶ、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、
フェノキシアセチル及びトルエンスルホニル、２，４．
６−１−リメチルベンゼンスルホニル。Ｘは、また、下
記にすることができる：ホスホニウム塩、例えばトリス
（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフ
ェート或はテトラフルオロボレート、ウロニウム塩、例
えばテトラメチルウロニウムヘキサフルオロボスフェ−
１・或はテトラフルオロボレー１〜及びこれらの化合物
の誘導体。加えて、Ｘはアミノ酸及びアミン保護アミノ
酸誘導体を表わす。しかし、Ｒ２及びａ、ｂ、ｃ、ｄ及
びｅが全て１１によって表わされるならば、Ｒ１はメチ
ルに１（ることができない、というのは、この構造を有
する化合物Ｍｐｐは低い活性を有し、通常低い収率て生
成され、自己指示しないからである。 Ｍｐｐは木１−フェニルー３−メチルー２ピラゾリン−
５−オン物質のメチル誘導体である。Ｍｐｌ）及びそれ
から作るアミノ酸エステルについては、Ｇ、ｌ＋ｏｓｓ
ｅ等がＰｅｐｔｉｄｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｍ１ｔＣａｒ
ｂｏｘｙｌａｋｔｉｖｉｅｒｔｅｎ Ｃｂｏ−Ａｍｉｎ
ｏｓａｕｒｅｎ、 ２３６〜２４２頁（１９６４年）に
、溶液合成法によってジペプチドを製造するために記載
した。Ｍｐｐは低い活性を有し、５ｐｐｓにおいて用い
る場合に、自己指示、比色性を持たない。 本明細書中に記載する化合物は同じ物質のエノール及び
ケト形を含む。エノール形を構造式で表わし、名前はケ
ト形に基づいて挙げる。 本化合物の好ましい組合せは下記を含むｃ ＝ Ｎ Ｏ
２、ａ ＝ ｂ ＝ ｄ ＝ ｅ ＝ Ｈ、Ｒ２＝ Ｈ
及びＲ，＝メチル或はフェニル Ｃ−ハロゲン、ａ＝ｂ＝ｄ＝ｅ＝ＨＲ２＝Ｈ及びＲ１−
メチル或はフェニル Ｃ＝ａ−ハロゲン ｂ ＝ ｄ ＝ ｅ ＝ ＨＲ２Ｈ
、及びＲ１−メチル或はフェニル ｃ＝ａ＝ＮＯ２、ｂ＝ｄ＝ｅ＝ＨＲ２＝Ｈ及びＲ，−メ
チル或はフェニル ａ ＝ ｂ ＝ ｃ ＝ ｄ ＝ ｅ ＝ Ｈ、Ｒ２＝
Ｈ、及びＲ１＝フェニル或は４−ニトロフェニル、及
びａ＝ｂ＝ｄ＝ｅ＝Ｈ，ｃ−ニトロ、Ｒ１及びＲ２は３
及び４位を結合する４つのメチレン基を表わし：Ｘは上
に挙げた基の内のいずれかである。 これらの化合物は下記を含む・ 菟−１名−−１ Ｉ）ｐｐ １．３−ジフェニル−２−ピラゾリン
５−オン Ｐｐｍ １−フェニル−３−（４′−二トロフェ
ニル）−２−ピラゾリン−５− オン Ｎｐｐ Ｐｎｐ （、ｊ２ｍｐ ３−メチルー］−（４′−二トロフェニル）−２−ピラ
ゾリン−５−オン ３−フェニル−］−（４＝−二トロフェニル）−２−ピ
ラゾリン−５−才ン ３−メチル−１−（４′−クロロフェニ ４ ル）−２−ピラゾリン−５−オン ＰＣＪ２ｐ ３−フェニル−１−（４′−クロロフ
ェニル）−２−ピラゾリン−５−オン ＤＣｕｍｐ ３−メチル−１−（２’、４’−ジクロ
ロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン ＤＣｊ２ｐｐ ３−フェニル−１−（２°、４°−ジ
クロロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オ ン ＤＮｍｐ ３−メチル−１−（２’、４’−ジニト
ロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン ＤＮｐｐ ３−フェニル−１−（２’、４°−ジニ
トロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オ ン 本１−フェニル−ピラゾリン−５−オン誘導体はフェニ
ルヒドラジンとアシルアセテートエステルとを反応させ
て作る。この方法によって、１−フェニル環及びＲ，へ
の改良を行う。フェニル環に付いた置換基（ａ−ｅ）は
例えばＨ、ニトロ、ハロゲン或は５Ｏ３Ｈにすることが
できる。 Ｎｐｐを作るのに、例えは、４−ニトロフェニルヒドラ
ジンとエチルアセトアセテートとを反応させ、ＰＣｆｔ
ｐを作るのに、４−クロロフェニルヒドラジンとエチル
ベンゾイルアセテートとを反応させる。この方法ては、
フェニルヒドラジン誘導体を適した極性溶媒（例えば、
ジメチルホルムア主ド、ジメチルスルホキシド、メタノ
ール、エタノール或は任意の簡単なアルコール或は氷酢
酸）中で、必要に応じて酸（例えばＨＣｌ２）或は塩基
（例えばピリジン或はトリエチルアよン）の存在におい
て攪拌する。完全な溶解を行うのに暖めることが必要な
場合がしばしばあり、そうする場合、混合物を室温に冷
却した後に、アシルアセトアセテートのアリール或はア
ルキルエステル（例えばエチルアセトアセテート或はエ
チルベンゾイルアセテート）１当量を加える。アシル基
の性質が置換基Ｒ１を指図し、例えば、Ｎｐｐを必要と
するならば、エチルアセトアセテートを用い、Ｐｎｐを
必要とするならば、エチルベンゾイルアセテートを用い
る。エステル基の性質は作られる生成物に影響を与えず
、エステル婁はメチル、エチル、任意の簡単なアルキル
エステル、フェニル、ベンジル或はアリール含有基にす
ることができる。混合物をゆっくり加熱して約８５〜９
０℃にする。反応を一晩放置し、その場合、温度を（約
６０℃に）下げるのが普通である。生成物は高い温度の
反応から晶出し、室温に冷却した際に完全に溶液から出
て来る。生成物の結晶を反応混合から分離しく例えば濾
過によって）、結晶を溶媒（例えばアルコール、酢酸或
は水）で濾液が無色になるまで洗浄する。次いて、結晶
を乾燥する。 活性アミノ酸エステルは、本１−フェニル−ピラゾリン
−５−オン化合物をアミノ酸のカルボキシル基によって
エステル化して作る。アミノ酸は通常下記の一般式を有
するアミン保護アミノ酸である。 Ｒ゛ ○ ｌ ＩＩ Ｙ−Ｎ Ｈ−ＣＨ−Ｃ−ＯＨ ここで、Ｒ゛はアミノ酸側鎖を表わし、Ｙは保護基であ
る。本発明の好ましい実施態様では、Ｙは下記からなる
群より選ふ保護基であるａ−フルオレニルメチルーオギ
シカルポニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−プチルオキシ力ルホニ
ル（ｔＢｏｃ） 、２−（４−ビフェニリル）−２−プ
ロビルオキシカルホニル（Ｂｐｏｃ）及び二１〜口ビリ
ジルスルフェニル（Ｎｐｙｓ）。下記の一般式を有する
活性アミノ酸エステルが形成されるに こで、Ｒ，、Ｒ２、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｒ及びＹは前
に規定した通りの基である。上記一般式を有する活性エ
ステルは既知のＬ−或はＤ−アミノ酸或はそれらの誘導
体の内のいずれかから作ることができる。例えば、アミ
ド側鎖を有するアミノ酸（例えば、グルタミン、アスパ
ラギン）はａ−アミン基についての保護基に加えてアミ
ド側鎖についての保護基を有し得る。１９８９年 ８ ２月２７日に出願した同時係属米国特許出願０７／３１
６．５７０号に記載する通りのＴａｏｂ （ｌ−リアル
コキシヘンジル）をベースにした保護基は固相ペプチド
合成における本目的に有用である。本活性エステルは、
Ｆｍｏｃがα−アミノ保護基であるＦｍｏｃ固相ベプヂ
ド合成において特に有用である。 活性アミノ酸エステルは、種々の方法により、例えば、
直接フェニルピラゾリジノンホスホニウム塩を経て或は
中間の非対称無水物を通して、或はカップリング試薬、
例えばジイソブロビル力ルポジイミト（Ｄ Ｉ ＰＣＤ
Ｉ）、ＤＣＣＩ或はジフェニルホスホロアジドを用い
て作る。カップリング試薬方法では、選んだ１−フェニ
ル−ピラゾリン−５−オン誘導体（例えば、Ｎｐｐ或は
Ｐｎｐ）を有機溶媒、例えばジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）に加え、必要ならば、化合物を完全に溶解させる
まで暖める。溶液を冷却して室温にし、アミン保護アミ
ノ酸にすることができる選択のアミノ酸を混合物に加え
、溶解するまで攪拌する。１−フェニル−ピラゾリン−
５−オン化合物をわずかに過剰に用いるのが普通である
。次いて、混合物を冷却して約−１０°〜約２０°Ｃと
し、カップリング剤、例えばジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣＤＩ）を加える。カップリング試薬の添
加量はアミノ酸の量に等しいか、或はそれよりわずかに
過剰にする。次いて、反応混合物を攪拌する。攪拌は、
カップリング剤及びエステル化の副生物から沈殿が形成
されるまで続８−Ｊる。例えば、ＤＣＣＤ Ｉを用いる
場合、沈殿はジシクロヘキシルウレアになる。沈殿を取
り去り（例えば、濾過により）、濾液を蒸発させる。蒸
発した際に、活性アミノ酸エステルが残分から晶出され
る。結晶を次いで必要に応して、例えばアセトニトリル
から再晶出させて更に精製することができる。 上述した手順と同様の方法を用いて、Ｆｍｏｃバリンの
２７の異なる活性エステルを作った。 これらの活性エステルを、それらの特性及び比活性と共
に表１に掲げる（活性の順に掲記する）。 活性を比較するのに用いる方法は、本質的にり、１４ｕ
ｄｓｏｎがＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒＬ５３巻、６１７頁（１９８８年）に記
載している方法に従って異なるカップリング試薬の効率
を比較する。この手順にいくつかの改良を行って、Ｆｍ
ｏ ｃ−アミノ酸活性エステルを比較するためのその適
性を改良する。この方法では、試験エステルと等モル量
のＦｍｏｃ−Ｉ ｊ２ｅ−ＯＰＦＰエステルとを混合し
、ＤＭＦ （ジメチルホルムアミド）にＤＭＦ ： ト
リフルオロエタノール３：１で溶解し、注射器カラム反
応装置系に収容する膨潤Ｇ １ ｎ （Ｔｍｏｂ）−Ａ
１ ａ−ＰＡＣ−樹脂のサンプルに加えた。２時間し
た後に、カップリングを停止させ、末端Ｆｍｏｃ基を取
り去り、ＶａＩ２及び■βｅの相対加入を樹脂加水分解
の後にアミノ酸分析によって求めた。結果を活性なエス
テルのいくつかの物理的特性と共に表１に挙げる。 Ｆｍｏｃ−Ｖａ １−ＯＦＦＰは５６．８％で加入され
たので、バリンをこれより多く加入した活性エステル↓
ゴＰＦＰエステルより一層活′性になる。 このことは、また、Ｄｈｏｂｔ （シヒ１〜ロヒトロキ
シオキソベンゾトリアジン）及びＤＮＴ （ジニトロフ
ェニル）エステルにもあてはまる。高効率とみなされる
多くを含む他の全ての候補は著しく活性が低く、この内
の一層低いデイビジョンはＭｐｌ）エステルであり、こ
れは３２２％の加入において、ＰＰＰの活性の半分より
わずかに高い活性を有する。が、本化学的誘導体は驚く
べきかつ有用な性質を有する。 表２で種々の本改良１−フェニル−ピラゾリン５−オン
エノールエステルの効率データを揚泥する。前に試験し
たエステルを中央として載せ、別の実験における値の間
の厳密な対応を得た。 −、Ｃ 匡 山 、ｆ：、ｅ Ｑ、ＣＬ ｍ： 、Ｃ（１） Ｚ （：ｌＩ＋ Σ ０ 咄 山 山 Σ ＊ Ｆｍｏｃ−Ｖａ １−Ｏｐｎｐに代えてｔＢの
ｃ−Ｖａｌ−ＯＰｎｐ（融点］、 ２０】２２）を用い
た場合に、同じ値か得られた。 ＊＊＊＊ 室温のＤＭＦに超音波処理（ｓｏｎｉｃａ
ｔｉｏｎ） ’ｖないで０２Ｍ可溶性。 ＊＊＊ 室温のＤＭＦに２分超音波処理して０．２Ｍ
可溶性。 ＊＊ 室温のＤＭＦに５分超音波処理して０２Ｍ可溶
性。 表２に示す通りに、１つの変形の他の全てはＰＦＰに比
べて活性が高い。２−カルボエトキシシクロヘキサノン
と４−二トロフェニルヒドラジンとを反応させて形成し
たＮｐｃ誘導体ては、Ｒ１及びＲ２を４−メチレン基で
ブリッジすることによって引き起こされるピラゾール環
の変形は系の芳香族性を減少させ、その活性を著しく低
下させた。対応して、最少の変化、フェニルによるメチ
ルの置換は結合及び著しい活性の増大をもたらし、良好
な溶解度及び高い結晶度を保留する。 ６ 塩素化シリーズにおいて、Ｄ（１２ｐｐとＰＣβｐとを
比較すれば、４−モノクロロ誘導体は２．４ジクロロ誘
導体に比べてはるかに活性が高い。これは、おそらく、
２−ＣＩ２基のバルク及び電子富化性が入ってくるアミ
ン基とピラゾール環の窒素との水素結合を抑制するから
であろう。 Ｎ１）ｐ及びＰｎｐは、共に、超活性であるが比較的不
安定なりｎｐ誘導体に比べて、実際極めて活性の高い誘
導体である。ＰｎｐはＮｐｐと比べてわずかに活性が高
く、かつ溶解度が大きい。また、ｔＢｏｃ−Ｃａ ｌ
０Ｏｐｎｐエステルは良好な結晶度を示し、活性が同じ
である。 本エステルはＰＰＰに比べて１０〜２０倍活性が高く、
結晶性が高く、貯蔵安定性であり、ヒドロキシル基に対
して比較的不活性であり、自己指示性を有する。ＤＭＦ
溶液中のＮｐｐアニオンは４８８ｎｍにおける吸光係数
５．３ＸＩＯ３（これが不完全なカップリングにおいて
へんがる色が観察される理由である）、任意の可能な干
渉源（例えば未反応エステルによって）から十分に離れ
た波長を有する。 表２は、また、競合方法において変法を導入する 通常
の手順（加入するＶａ１％、最後から２番目の欄）にお
いて、混合成分を完全に溶解した後に、競合実験をＤＭ
Ｐにおいて行う。改良法（最終欄）では、溶解をＤ Ｍ
Ｆ ／ ｌ−リフルオロエタノール（ＴＦＥ）の３・
１混合物で変化させ、競合を２分の後に行った。ＰＰＰ
対照における相対加入を変化させなかった。カップリン
グは依然完結に至る。が、１−フェニル−ピラゾリン−
５−オン誘導体の相対加入は、Ｐｎｐ及びＮｐｐの場合
の他は、増大する。増大はこの混合物におけるＰＰＰエ
ステルの部分分解に基因させることかでき、１−フェニ
ル−ピラゾリン−５−オン誘導体は一層安定である。こ
の溶媒の組合せを用いれば、ロジン結合ペプチドの水素
結合した第二構造を破壊し、はとんどのカップリングが
均一な速度になるのを確実にし、活性誘導と８■合せた
際に、この速度は非常に大きくなる。 本コーフェニルービラゾリンー５−オン誘導体ば既知の
カップリング試薬への添加剤として用いることかでき、
新規なカップリング試薬を構成することができ或はアミ
ノ酸の活性エステルとして用いることができる。例えば
、固相ペプチド合成において、新規カップリング試薬と
して、Ｘがホスホニウム塩である、例えばトリス（ジメ
チルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
紹成物を、非予備活性化α−アミン保護アミノ酸誘導体
（また、「遊離」保護アミノ酸とも呼ぶ）に対し１当量
の第三塩基と共に、５ｐｐｓ系に加える。生成した活性
種を次いて支持体に結合したペプチドに加えてカップリ
ング及び連鎖伸長を行なわせ、同時に１−フェニル−ピ
ラゾリン−５オン成分を遊離し、これが比色指示薬とし
て作用する。また、本１−フェニル−ピラゾリン−５オ
ン化合物のホスホニウム誘導体をＤＣＣＩ手順の別法と
して用いることができる。それらの製法については本明
細書中下記に記載する。 上述したプロセスによって作った活性アミノ酸な固相ペ
プチド合成において用いる。この方法 ９ ては、第１アミノ酸（通常、ａ−アミン保護アミノ酸）
をそのカルホキシル基によって合成（６（脂或はヘッド
に共有結合させる。合成樹脂の例は下記を含む Ｆｍｏ
ｃ相溶性ポリスチレンＰＡＣ及びＰＡＬ樹脂（カリフォ
ルニア、ノハト、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃ
ｈｍ）、 ｔ Ｂ ｏ ｃ相溶性ポリスチレン樹脂、Ｍ
ＢＨＡ及びＰＡＭ樹脂、並びに封入形（Ｐｅｐｓｙｎｋ
）或はフリー形のポリジメヂルアクリルアミン、機能化
セラミック粒子、ＨＰ ＣＣ及び他のシリカ、調節され
た細孔のガラス、ポリエチレングリコールーボリスヂレ
ンコボリマー −数的な合成ザイクルはアミノ酸のα−
アミン基を脱保護し、洗浄し、適している場合には中和
し、次いて加える次のカルボキシル活性化アミノ酸と反
応させることからなる。各々の連続したアミノ酸を樹脂
結合したアミノ酸或はペプチド鎖の末端窒素にそのカル
ボン酸基のカルホニル炭素によって結合させる。活性化
基がカップリング反応の間に遊離され、反応媒体に開放
され、系内に存在する未反応アミノ基によってイオン化
されることから、 ０ 反応の完了をモニターする指示薬として作用する。例え
ば、Ｎｐｐ保訊アミノ酸を用いる場合、カップリング反
応の間に遊離されるＮｐｐは未反応アミン基によってイ
オン化され、イオン化した状態で強い赤色になる。反応
を完了した際に、遊離アミノ基が全て消費されるにつれ
て、ｒ”Ｊｐｐは非イオン化されるようになり、色があ
ぜで金色になる。このように、反応は自己指示的であり
、遊離アミン基の試験をするために反応を停止する必要
を排除する。 上記の方法の別の実施態様では、エノール形（すなわち
、Ｘ＝Ｈ）の１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合
物をアミノ酸活性化基として用いずに、比色指示薬とし
て５ＰＰＳ系に別途加えて反応の完了をモニターする。 ５ＰＰＳ法の別の実施態様では、Ｘが陽に荷電した種で
ある１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合物をカッ
プリング試薬として作る。有用な試薬１．Ｊ下記を含む
ホスホニウム及びウラン塩、例えばｌ・リス（シアル
ギルアミノ）ホスホニウム塩及びテＩ〜ラアルキルウラ
ン塩にテトラフルオロボレート或はヘキサフルオロホス
フェート対イオンを配合したもの。アルキル基はメチル
或はエチル基が普通であるが、また小さい環系、例えば
ピロリジン、ピペリジンにすることもてきる。１フェニ
ル−ピラゾリン−５−オンアニオンと活性誘導体（例え
ばヘキサメチルホスホニウムクロリド或はテトラメチル
ウランクロリド）とを反応させて付加体を形成して所望
のカップリング試薬とする。このハイブリットを次いで
遊離のアミノ酸に加えてカップリング用に活性化しかつ
１−フェニル−ピラゾリン−５−オン成分を遊離させ、
これは、次いで樹脂に結合したペプチドのアミン基との
反応の程度の比色モニターリングになる。 カップリングが完了した際に、アニオンの赤色はあぜで
金色になる。これらのハイゾリン１〜カップリング試薬
ば５ＰＰＳにおＧづる効率的かつ自己指示性カップリン
グ試薬であり、実際の活性なカスデルそれら臼体を直接
合成する僅れた方ｉ’７３な提（ｐ（する。上述したＤ
ＣＣ１法は実施しかつスケールアップするのが比較的困
難である。ハイブリット試薬を用い、次いでアミノ酸誘
導体をアミン基の不存在において活性化すると活性なエ
ステルを生じ、該エステルを次いで水から沈殿させ、濾
過して分離する。 本方法の別の実施態様では、溶液相か或は固相のいずれ
かの合成におけるカップリングの程度をモニターし、完
了を指示した後に、ペプチドのアセンブリープロセスに
おける次の工程を開始することができる。これにより、
高品質のペプチドを必要とする最少の時間で合成するこ
とになる。エノールアニオンが吸収する波長が高いこと
、例えばＮｐｐの場合の４８８ｎｍは、他の吸収種が測
定を妨げないことを意味する。例として、○ １ｍモル
のスケールで、カップリングが９９％完了した場合、４
８８ｎｍにおける吸収は２０．Ｄ。 ユニットになるべきである。よって、この完了度にモニ
ターして、なお−層高い完了のレベルに近づき得る。こ
れはいくつかの方法によって達成することができ、例え
ば、光源、フィルター及び光 ３ 電池を線状様式で配置し、反応室を直接路に置くことが
できる。別法として、反応装置のガラス表面から反射す
る先の吸収の変化を用いることができ、或は光源を透明
な反応装置内に埋封し、ディレクターを反応装置のまわ
りにシリンダーとして配置することができ、これは最も
感度がよい。 本ｌ−フェニル−ピラゾリン−５−オン誘導体の用途の
内のいくつかは下記を含む・溶液及び固相の両方の合成
における全てのＮ−保護アミノ酸の活性エステルとして
；カルボジイミド、（ベンゾトリアゾリルオキシ）トリ
ス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート（ＢＯＰ）及び活性なエステルカップリングへ
の添加剤として、ハイブリット試薬の成分として任意の
タイプのペプチドカップリング用のカップリング完了指
示薬として。本化合物のアシル誘導体も、また、ペプチ
ド及びＤＮＡの両方の合成において、連鎖停止及びキャ
ッピング試薬として用いることができる。このような誘
導体は、加え ４ て、ヌクレオシドモノマーを直接製造する際に重要にな
り得る。アルキル置換されたホスホルアミダイト及びウ
レアに関する誘導体は、自己指示性であり、向上した反
応性及び安定性を有するＢＯＰ及びＨＢＴＵ （２−（
Ｉ Ｈ−ベンゾトリアゾル１−イル）−１，１，３，３
−テトラメチル−ウランへキサフルオロ−ホスフェート
）カップリング剤の類似物を生じる。例えば、本１−フ
ェニル−ピラゾリン−５−オンのスルホニル誘導体はホ
スフェート−トリエステル媒介ＤＮＡ合成における良好
なカップリング剤になる。例えば、メシチレンスルホニ
ル３−メチル−１−（４′−二トロフェニル）−２−ピ
ラゾリン−５−オン（Ｍ Ｓ−Ｎ ｐｐ）を使用した場
合、優れた結果を生じる。適したｐＫを有するそれらの
誘導体、例えばＮｐｐは有用なアミダイト活性剤として
働くことができる。 発明を更に下記の例によって示す。 例」２ 】−フェニル−ピラゾリン−５−オンの調製置換された
フェニルヒドラジンとアシルアセトアセテートアリール
或はアルキルエステルとを加熱によって縮合させて所望
の誘導体をもたらす。 これを下記に挙げるＮｐｐの調製によって説明する。 ４−ニトロフェニルヒドラジン（水１０％を含有する。 １．７ｇ、１０ｍモル）を氷酢酸（２０ｍ℃）中で攪拌
し、完全な溶液が生じるまで３５℃に暖めた。攪拌した
混合物を室温に冷却し、エチルアセトアセテ−ｈ（１，
３０ｇ１．２７ｒｎＪ２．１０ｍモル）を迅速に加えた
。室温で１０分した後に、フラスコを油浴に入れ、加熱
を始めて３０分かけて８５℃にした。この温度において
更に３０分した後に、稠密な黄色沈殿が生成した。反応
を８０℃において２時間放置し、次いで６０℃において
一晩攪拌し、室温に冷却した。結晶を濾過によって捕集
し、酢酸のいくつかの小部分て濾液が無色になるまで洗
浄し、次いでエーテルで洗浄し、風乾して融点２１９°
〜２２０℃ノＮ ｐ ｐ２．ｏＯｇを収率９１％で得た
。 鯉塁 フェニルピラゾリノンアミノ酸エステルの調製この方法
は任意のＮ−及び側−鎖保護アミノ酸及び全てのエステ
ル成分に応用可能である。方法はジシクロへキシル力ル
ホジイミト及びジメチルホルムアミド溶媒中の２成分を
用いる。下記の例で、Ｆｍ０ｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＮｐｐ
を下記の通りにして調製する ３−メチル−１−（４′−ニトロフェニル）２−ピラゾ
リン−５−オン（１，１２ｇ、５．１ｍモル）をＤＭＦ
（２５ｒｎＪ２）に、約４５℃に暖めて溶解した。透明
な暗オレンジ色溶液が生威し、これを攪拌し、室温に冷
却し、Ｆｍ０ｃ−Ｌバリン（１，７ｇ、５ｍモル）を加
えた。これが全て溶解した際に、混合物を１５℃の浴に
入れ、激しく混合する反応にジシクロへキシルー力ルホ
ジイミト（１０７ｇ、５．０５ｍモル）を加えた。攪拌
を１５°Ｃにおいて２日間続けた。沈殿したジシクロへ
キシルウレアを濾過によって取り去り、濾液な蒸発させ
た。Ｎｐｐエステルが直 ７ ちに晶出した。それを高い真空において短Ｉ時間乾燥し
、次いて熱アセトニトリル１００ｍＩｌから再晶出させ
て、融点１９５’ 〜１９７℃のＦｍｏｃＶａｌ ０
Ｎｐｐ２．２Ｈを収率８０％で得た。 下記の表３は上記の方法によって調製したＦｍｏｃ−ア
ミノ酸ＮｐＩＩ）エステル（−ＯＮｐｐと表示する）を
更にいくつか示す 表３：活性Ｆｍｏｃ−アミノ酸Ｎｐｐエステルアミノ酸
分工屡−収崖 融点（℃）Ｆｍｏｃ″′Ｇ
ｌｙ−ＯＮｐｐ ４９１１ ８６％
１６４〜１６７Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＮｐｐ
５１２ ７８％ １８５〜１８
７Ｆｍｏｃ−Ｌ−１１ｅ−ＯＮｐｐ
５５４ ８３％ １７２〜１７３Ｆｍｏｃ−Ｌ
−八５ｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＮｐｐ ６１２ ５３
％ １３２〜１３３Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｂｕ
ｔ）−ＯＮｐｐ ６６０ ７３％ １３９〜１４１Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｍｏｂ）−ＯＮｐｐ ７５０
７５％ １６６〜１６７Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＮ
ｐｐ Ｆ＋４０ ８０％ １９５
〜＋９７促旦 合成を、Ｅｘｃｅｌｌベブヂド合成装置で、注記した他
は標準の試薬及び操作プロトコルを用いて行った。全て
のＮ−メチルモルホリン及びＨＯＢｔ溶液（活性剤及び
プリウォッシュ）をＨＰＬＣグレードＤＭＦに替えた。 この方法では活性化或はプリウォッシュを必要としない
。各々のカートリッジにＮｐｐエステル単独を０．５ｍ
モル（ＢＯＰ或はＨＯＢｔを必要としない）充填した。 カップリングの間目視検査して、カップリングが５分以
内で完了したことを示した。金色の活性なエステル溶液
が反応カラムに入った際に樹脂を強い赤色に変えさせ、
強い赤色はカップリングが進行するにつれてあぜで金色
になった。合成を完了した後に、樹脂を、金色の存在に
よって示される通りに、Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ （ＴＦＡ
／ＤＭＳ／ＤＣＭ、１４：Ｉ・５）によって２時間の間
切断させた。樹脂を濾過し、濾液を蒸発させ、生成物の
ペプチドを氷酢酸から凍結乾燥した。これは、高純度に
一致するＨＰＬＣ及びＡＡＡ挙動を存するペプチド１２
０ｍｇ （１００％）をもたらした。 例」− 固相ペプチド合成における指示薬としてのＮｐＰの使用 例３に記載する方法を改良してＤＭＦ２００ｍ、Ｑ中Ｎ
ｐｌ）Ｉｇの溶ン夜でプリウォッシュをもたらした。カ
ートリッジにＩ’Ｊｐｐエステル単独を０．２５ｍモル
（２，５倍過剰）充填した。カップリングを３０分間行
わせた。カラムはブリウォッシュの間に強い赤色になり
、カップリングの間に色があせて金色になった。これは
ｔ’ｌｐｐを指示薬として用いる例である。この特定の
例はＮｐｐエステルをカップリング用に使用したが、Ｎ
ｐｐを使用する他の方法は全て同し変化を示したてあろ
う。カップリングは５〜１０分以内て完了した。切断及
び分析して、例３て得られたのに匹敵する収率及び分析
データを得た。 剋Ｅ 例２の方法に正確に従い、Ｎｐｐ （１，１２ｇ、５．
０５ｍモル）をＤＭＦ （２５ｍｎ）に溶解し、フェノ
キシ酢酸（０，７６ｇ、５ｍモル）を攪拌する溶液に加
えて１５°Ｃで置いた。 Ｄ ＣＣＩ （１，、０７ｇ ）を加え、混合物を一晩
攪拌した。懸濁液を４℃において２時間放置し、次いで
濾過し、濾液を蒸発させた。残分を無水エーテル２０ｍ
℃に溶解して４℃において一晩放置した。ＰＡＣ−ＯＮ
ｐｐの針状結晶（融点９４〜９６℃）が沈殿され、高い
収率及び純度で分離された。 この手順をＭｐｐに応用した場合、生成物は得られなか
った。 奥王 当業者ならば、せいぜい日常の実験を用いて、本明細書
中に記載する発明の多くの均等物を認識し、或は確認す
ることができるものと思う。かかる均等物は本発明の範
囲内に含まれる意図である。 手糸売だ甫正書 平底２年７月２５日 特許庁長官 植 松 敏 殿 事件の表示 特願平２ １４７５３３号 発明の名称 固相ペプチド合成用活性エステル補正を
する者 事件との関係 特許出願人名 称
ミリボア・コーポレイション代理人 〒１０３ 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 １ 明細書３４頁５行の「低く、」を「低い。」に訂正
１−る。 ２、同同頁５〜６行の「この内の一層低いデイビジョン
はＭＩ）ｐエステルであり、」を「−層低いデイビジョ
ンの内にＭｐｐエステルかあり、」に訂正する。 手続補正書 平成２年８月３日 特許庁長官 植 松 敏 殿 事件の表示 平成２年特許願第１４７５３３号 発明の名称 固相ペプチド合成用活性エステル 補正をする者 事件との関係 特許出願人名 称
ミリボア・コーポレイション代 理 人 〒１０３ １ 特許請求の範囲を別紙の通りに訂正する。 ２、明細書１５頁最下行の「ウラン」を［ウロニウム（
Ｓ−メチル−２−チオ尿素）」に訂正する。 ３、同１６頁１行の「テトラメチルウラン」を「テトラ
メチルウロニウム」に訂正する。 ４ 同４１頁下から２行の「ウラン」を「ウロニウム」
に訂正する。 ５、同４２頁１行の「テトラアルキルウラン」を「テト
ラアルキルウロニウム」に訂正する。 ６、同同頁８行の「テトラメチルウランクロリド」を「
テトラメチルウロニウムクロリト」に訂正する。 ７、同４５頁６行の「ウラン」を「ウロニウム」に訂正
する。 「２、特許請求の範囲 １、下記の一般式を有する化合物： ここで、 ａ、Ｒ，は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エチ
ル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロロ
フェニル及びベンジル：ｂ−Ｒ，は下記からなる群より
選ぶ：Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、フェニル１
．ニトロフェニル、クロロフェニル、ベンジル、ハロゲ
ン、Ｎ Ｏ２及びアゾ誘導体： ｃ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅば下記からなる群より選ぶ：
Ｈ，Ｎｏ２．ハロゲン及び５Ｏ３Ｈ：ｄ、Ｘは下記から
なる群より選ぶ：ホルミル、アセチル、ベンゾイル、フ
ェノキシアセチル、ｌ・ルエンスルホニル、２．４．６
−ドリメチルベンセンスルホニル、ホスホニウム塩、つ
免三皇込塩、アミノ酸及びアミン保護アミノ酸誘導体 Ｒ２、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅが全てＨならば、Ｒ＋はメ
チルでない。 ２ Ｒ１及びＲ２が更にピラゾリン−オン環の３及び４
位の間のブリッジを含み、該ブリッジはメチレン基３〜
８を有する特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３ ｘが下記の一般式を有する保護アミノ酸誘導体であ
る Ｒ’ ０ １１ Ｙ−ＮＨ−ＣＨ−（＞ＯＨ ここで、Ｒ゛はアミノ酸側鎖であり、Ｙは下記からなる
群より選ぶ：Ｆｍｏｃ ｔＢｏｃＢｐｏｃ及びＮｐｙ
ｓ特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ４、ａ、ｂ、ｄ及びｅがＨてあり、ＣがＮ ０２であり
、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＣＨ３或はフェニルである特
許請求の範囲第１項記載の化合物。 ５、ｃ、ｂ、ｄ及びｅがＨであり、Ｃかｃ９．であり、
Ｒ２がＨであり、ＲｏがＣＨ３或はフェニルである特許
請求の範囲第１項記載の化合物。 ６、 ａ及びＣが共にＣＩ２であり、ｂ、ｄ及びｅが
Ｈであり、Ｒ２がＨであり、ＲＩがＣＨ３或はフェニル
である特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ？、 ａ及びＣが共にＮ Ｏ２であり、ｂ、ｄ及びｅ
がＨであり、Ｒ２がＩ］であり、Ｒ１がＣＨ３或はフェ
ニルである特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ８、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅがＨであり、Ｒ２がＨてあり
、Ｒ１がフェニル或は４−ニトロフェニルである特許請
求の範囲第１項記載の化合物。 ９、ａ、ｂ、ｃ＋及びｅが１１であり、ｅがＮ Ｏ２で
あり、Ｒ１及びＲ２が虚位３及び４を結合する４つのメ
チレン基を表わす特許請求の範囲第２項記載の化合物。 １０、ｘが１〜リス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘ
キサフルオロホスフェ−１・或はテトラフルオロホレー
トである特許請求の範囲第１項記戦の化合物。 １１、 Ｘがテト之メチルウロニウムへキザフルオロ
ホスフェート或はテトラフルオロホレートである特許請
求の範囲第１項記載の化合物。 １２、下記の一般式を有する、固相ペプチド合成におい
て用いるための活性化アミノ酸エステル：ここで、 ａ、ＲＩは下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エチ
ル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロロ
フェニル及びベンジル：ｂ、Ｒ２は下記からなる群より
選ぶ：Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、フェニル、
二１〜口フェニル、クロロフェニル、ベンジル、ハロゲ
ン、ＮＯ□及びアゾ誘導体 ｃ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは各々下記からなる群より選
ぶ・Ｈ，ＮＯ２、ハロゲン及び５０３Ｈ： ｄ、Ｙは下記からなる群より選び：Ｆｍｏｃ。 ｔＢｏｃ、Ｂｐｏｃ及びＮｐｙｓ ； ｅ、Ｒ“はアミノ酸側鎖を表わす。 １３、ａ、ｂ、ｄ及びｅがＨであり、ＣがＮｏ２であり
、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＣＨ３或はフェニルであり、
ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１２
項記載の活性化アミノ酸エステル。 １４、ａ、ｂ、ｄ及びｅがＨであり、ＣがＣＩ２であり
、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＣＨ３或はフェニルであり、
ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１２
項記載の活性化アミノ酸エステル。 １５、 ａ及びＣがＣＸであり、ｂ、ｄ及びｅがＨで
あり、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＣＨｓ或はフェニルてあ
り、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第
１２項記載の活性化アミノ酸エステル。 １６、ａ及びＣがＮＯ２であり、ｂ、ｄ及びｅがＨてあ
り、Ｒ１がフェニル或は４−ニトロフェニルであり、Ｙ
がＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１２項
記載の活性化アミノ酸エステル。 １７、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅがＨであり、Ｒ２がＨであ
り、Ｒ，がフェニル或は４−ニトロフェニルであり、Ｙ
がＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１２項
記載の活性化アミノ酸エステル。 １８、Ｒ，及びＲ２が更にピラゾリン−オン環の３及び
４位の間のブリッジを含み、該ブリッジはメチレン基３
〜８を有する特許請求の範囲第１２項記載の活性化アミ
ノ酸エステル。 １９、ａ、ｂ、ｄ及びＣがＨであり、ｅがＮＯ２であり
、Ｒ１及びＲ２が虚位３及び４を結合する４つのメチレ
ン基を表わし、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請
求の範囲第１８項記載の活性化アミノ酸エステル。 ２０、下記の工程を含む固相ペプチド合成に１６８−Ｊ
るカップリング反応をモニターする方法 ａ、第］α−アミン保護アミノ酸を結合させた合成樹脂
を準備し： ｂ、（ａ）における樹脂と第２０−アミン保護アミノ酸
とを、第２アミノ酸の第１アミノ酸へのカップリングを
引き起こすのに適した条件下で接触させ： ｃ、（ｂ）における樹脂と下記の一般式を有する１−フ
ェニル−ピラゾリン−５−オン化合物とを接触させ、そ
れで赤色を出現させ： ここで、 （ｉ）Ｒ，は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エ
チル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロ
ロフェニル及びペンシル：（ｉｉ） Ｒ２は下記からな
る群より選ふ：■１、メチル、エチル、イソプロピル、
フェニル、二ｌ・ロフェニル、クロロフェニル、ベンジ
ル、ハロゲン、ＮＯ２及びアゾ誘導体 （ｉｉｉ）ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは下記からなる群より
選ぶ： Ｈ，ＮＯ２，ハロゲン及び５Ｏ３Ｈ；（ｉｖ）
Ｘは下記からなる群より選ぶ：ホルミル、アセチル、
ベンゾイル、フェノキシアセデル、トルエンスルホニル
、２，４．６−ドリメチルベンゼンスルホニル、ホスホ
ニウム塩、ウロニウム塩：ｄ、工程（ｂ）を繰り返して
ペプチド鎖を形成し ｅ カップリング反応の色をモニターする。 ２１、モニター工程（ｅ）を分光測光法により行う特許
請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、自動化させた特許請求の範囲第２１項記載の方法
。 ２３．１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合物がＮ
ｐｐである特許請求の範囲第２０項記載の方法。」
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記の一般式を有する化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、 ａ、Ｒ＿１は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エ
チル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロ
ロフェニル及びベンジル； ｂ、Ｒ＿２は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エ
チル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロ
ロフェニル、ベンジル、ハロゲン、ＮＯ＿２、及びアゾ
誘導体； ｃ、ａ，ｂ，ｃ，ｄ及びｅは下記からなる群より選ぶ：
Ｈ、ＮＯ＿２、ハロゲン及びＳＯ＿３Ｈ：ｄ、Ｘは下記
からなる群より選ぶ：ホルミル、アセチル、ベンゾイル
、フェノキシアセチル、トルエンスルホニル、２，４，
６−トリメチルベンゼンスルホニル、ホスホニウム塩、
ウラン塩、アミノ酸及びアミン保護アミノ酸誘導体； Ｒ＿２，ａ，ｂ，ｃ，ｄ及びｅが全てＨならば、Ｒ＿１
はメチルでない。 ２、Ｒ＿１及びＲ＿２が更にピラゾリン−オン環の３及
び４位の間のブリッジを含み、該ブリッジはメチレン基
３〜８を有する特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３、Ｘが下記の一般式を有する保護アミノ酸誘導体であ
る： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ’はアミノ酸側鎖であり、Ｙは下記からなる
群より選ぶ：Ｆｍｏｃ、ｔＢｏｃ、Ｂｐｏｃ及びＮｐｙ
ｓ特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ４、ａ，ｂ，ｄ及びｅがＨであり、ｃがＮＯ＿２であり
、Ｒ＿２がＨであり、Ｒ＿１がＣＨ＿３或はフェニルで
ある特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ５、ｃ，ｂ，ｄ及びｅがＨであり、ｃがＣｌであり、Ｒ
＿２がＨであり、Ｒ＿１がＣＨ＿３或はフェニルである
特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ６、ａ及びｃが共にＣｌであり、ｂ，ｄ及びｅがＨであ
り、Ｒ＿２がＨであり、Ｒ＿１がＣＨ＿３或はフェニル
である特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ７、ａ及びｃが共にＮＯ＿２であり、ｂ，ｄ及びｅがＨ
であり、Ｒ＿２がＨであり、Ｒ＿１がＣＨ＿３或はフェ
ニルである特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ８、ａ，ｂ，ｃ，ｄ及びｅがＨであり、Ｒ＿２がＨであ
り、Ｒ＿１がフェニル或は４−ニトロフェニルである特
許請求の範囲第１項記載の化合物。 ９、ａ，ｂ，ｄ及びｅがＨであり、ｅがＮＯ＿２であり
、Ｒ＿１及びＲ＿２が環位３及び４を結合する４つのメ
チレン基を表わす特許請求の範囲第２項記載の化合物。 １０、Ｘがトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキ
サフルオロホスフェート或はテトラフルオロボレートで
ある特許請求の範囲第１項記載の化合物。 １１、Ｘがテトメチルウランヘキサフルオロホスフェー
ト或はテトラフルオロボレートである特許請求の範囲第
１項記載の化合物。 １２、下記の一般式を有する、固相ペプチド合成におい
て用いるための活性化アミノ酸エステル：▲数式、化学
式、表等があります▼ ここで、 ａ、Ｒ＿１は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エ
チル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロ
ロフェニル及びベンジル； ｂ、Ｒ＿２は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、エ
チル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、クロ
ロフェニル、ベンジル、ハロゲン、ＮＯ＿２及びアゾ誘
導体； ｃ、ａ，ｂ，ｃ，ｄ及びｅは各々下記からなる群より選
ぶ：Ｈ、ＮＯ＿２、ハロゲン及びＳＯ＿３Ｈ； ｄ、Ｙは下記からなる群より選び：Ｆｍｏｃ、ｔＢｏｃ
、Ｂｐｏｃ及びＮｐｙｓ； ｅ、Ｒ’はアミノ酸側鎖を表わす。 １３、ａ，ｂ，ｄ及びｅがＨであり、ｃがＮＯ＿２であ
り、Ｒ＿２がＨであり、Ｒ＿１がＣＨ＿３或はフェニル
であり、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範
囲第１２項記載の活性化アミノ酸エステル。 １４、ａ，ｂ，ｄ及びｅがＨであり、ｃがＣｌであり、
Ｒ＿２がＨであり、Ｒ＿１がＣＨ＿３或はフェニルであ
り、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第
１２項記載の活性化アミノ酸エステル。 １５、ａ及びｃがＣｌであり、ｂ，ｄ及びｅがＨであり
、Ｒ＿２がＨであり、Ｒ＿１がＣＨ＿３或はフェニルで
あり、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲
第１２項記載の活性化アミノ酸エステル。 １６、ａ及びｃがＮＯ＿２であり、ｂ，ｄ及びｅがＨで
あり、Ｒ＿１がフェニル或は４−ニトロフェニルであり
、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１
２項記載の活性化アミノ酸エステル。 １７、ａ，ｂ，ｃ，ｄ及びｅがＨであり、Ｒ＿２がＨで
あり、Ｒ＿１がフェニル或は４−ニトロフェニルであり
、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである特許請求の範囲第１
２項記載の活性化アミノ酸エステル。 １８、Ｒ＿１及びＲ＿２が更にピラゾリン−オン環の３
及び４位の間のブリッジを含み、該ブリッジはメチレン
基３〜８を有する特許請求の範囲第１２項記載の活性化
アミノ酸エステル。 １９、ａ，ｂ，ｄ及びｃがＨであり、ｅがＮＯ＿２であ
り、Ｒ＿１及びＲ＿２が環位３及び４を結合する４つの
メチレン基を表わし、ＹがＦｍｏｃ或はｔＢｏｃである
特許請求の範囲第１８項記載の活性化アミノ酸エステル
。 ２０、下記の工程を含む固相ペプチド合成におけるカッ
プリング反応をモニターする方法： ａ、第１α−アミン保護アミノ酸を結合させた合成樹能
を準備し； ｂ、（ａ）における樹脂と第２α−アミン保護アミノ酸
とを、第２アミノ酸の第１アミノ酸へのカップリングを
引き起こすのに適した条件下で接触させ； ｃ、（ｂ）における樹脂と下記の一般式を有する１−フ
ェニル−ビラゾリン−５−オン化合物とを接触させ、そ
れで赤色を出現させ； ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、 （ｉ）Ｒ＿１は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル、
エチル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、ク
ロロフェニル及びベンジル； （ｉｉ）Ｒ＿２は下記からなる群より選ぶ：Ｈ、メチル
、エチル、イソプロピル、フェニル、ニトロフェニル、
クロロフェニル、ベンジル、ハロゲン、ＮＯ＿２及びア
ゾ誘導体； （ｉｉｉ）ａ，ｂ，ｃ，ｄ及びｅは下記からなる群より
選ぶ：Ｈ、ＮＯ＿２、ハロゲン及びＳＯ＿３Ｈ；（ｉｖ
）Ｘは下記からなる群より選ぶ：ホルミル、アセチル、
ベンゾイル、フェノキシアセチル、トルエンスルホニル
、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ホスホ
ニウム塩、ウラン塩； ｄ、工程（ｂ）を繰り返してペプチド鎖を形成し； ｅ、カップリング反応の色をモニターする。 ２１、モニター工程（ｅ）を分光測光法により行う特許
請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、自動化させた特許請求の範囲第２１項記載の方法
。 ２３、１−フェニル−ピラゾリン−５−オン化合物がＮ
ｐｐである特許請求の範囲第２０項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36298089A | 1989-06-08 | 1989-06-08 | |
| US362980 | 1989-06-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0334971A true JPH0334971A (ja) | 1991-02-14 |
Family
ID=23428299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14753390A Pending JPH0334971A (ja) | 1989-06-08 | 1990-06-07 | 固相ペプチド合成用活性エステル |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0401797A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0334971A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010088184A (ko) * | 2000-03-11 | 2001-09-26 | 밍 루 | 자동차 스티어링 칼럼 샤프트의 유격방지구조 |
| US6530366B2 (en) | 2000-08-07 | 2003-03-11 | Filterwerk Mann & Hummel Gmbh | Apparatus for gas recirculation in an internal combustion engine |
Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO1995029921A1 (en) * | 1994-04-29 | 1995-11-09 | Perseptive Biosystems, Inc. | Activated esters of 1-phenylpyrazolin-5-one for labelling amine-functionalized molecules |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8518144D0 (en) * | 1985-07-18 | 1985-08-21 | Univ Belfast | Solid phase peptide synthesis |
| EP0322348B1 (de) * | 1987-12-22 | 1994-02-02 | Hoechst Aktiengesellschaft | Säurelabile Ankergruppen zur Synthese von Peptidamiden mittels Festphasenmethode |
-
1990
- 1990-06-06 EP EP90110722A patent/EP0401797A1/en not_active Withdrawn
- 1990-06-07 JP JP14753390A patent/JPH0334971A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010088184A (ko) * | 2000-03-11 | 2001-09-26 | 밍 루 | 자동차 스티어링 칼럼 샤프트의 유격방지구조 |
| US6530366B2 (en) | 2000-08-07 | 2003-03-11 | Filterwerk Mann & Hummel Gmbh | Apparatus for gas recirculation in an internal combustion engine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0401797A1 (en) | 1990-12-12 |
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