JPH0337713B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は癌関連糖鎖の測定法及び癌診断用試
薬、詳しくは、α−フコピラノシル−（１→３）
−、−（１→４）−又は−（１→６）−ガラクトピラ
ノシル基を特異的に認識できる抗体を利用して免
疫反応（抗原抗体反応）によつて、癌細胞に特異
的に発現するα−フコピラノシル−（１→３）−、
−（１→４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシ
ル基を有する癌関連糖鎖を測定する方法、これに
よつて癌を診断する方法並びにこれら方法に用い
る癌診断用試薬に関する。 最近細胞分化のある段階において、哺乳動物細
胞表面上に特異な糖抗原が表現され、かかる糖抗
原と反応性を有する抗体として、全細胞をイムノ
ーゲンとして用いた細胞融合技術により得られる
モノクロナール抗体〔Cell、Vol.14、775−783
（1978）、Proc.、Natl.、Acad.、USA、Vol.75、
No.11、5565−5569（1978）及びNature、
Vol.292、156−158（1981）〕及びある患者の血清
中に存在する抗体〔Exp.Cell Res.、131、185−
195（1981）〕が提案された。本発明者らは上記各
報告に関連して、独自に研究を重ねる過程におい
て、特定の糖鎖を有機合成し、これをハプテン基
として糖抗原を作成した所、該糖抗原由来の抗体
が消化器癌等の癌細胞特にヒト大腸癌及びマウス
テトラカルシノーマ細胞と特異選択的に反応
し、従つて該抗体の利用によれば癌細胞の認識、
測定等及びこれによる癌の診断が行ない得るとい
う新しい知見を得た。本発明はこの知見を基礎と
して完成されたものである。 即ち本発明はα−フコピラシル−（１→３）−、
−（１→４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシ
ル基を特異的に認識できる抗体を用い、免疫反応
によりα−フコピラノシル−（１→３）−、−（１→
４）又は−（１→６）−ガラクトピラノシル基を有
する癌関連糖鎖を測定することを特徴とする癌関
連糖鎖の測定法及びα−フコピラノシル−（１→
３）−、−（１→４）−又は−（１→６）−ガラクトピ
ラノシル基を特異的に認識できる抗体を含有する
癌診断用試薬に係る。 以下本発明におけるフコース抗原の製造、該抗
原からの抗体の製造並びに該抗体を含む癌診断用
キツト、その利用による癌関連糖鎖の測定乃至癌
の診断法につき順次説明する。 本発明に係るフコース抗原の製造においては、
ハプテンとしてα−フコピラノシル−（１→３）
−、−（１→４）−又は−（１→６）−ガラクトピラ
ノシル基を含有するオリゴ糖を用いることを必須
とする。上記オリゴ糖の必須構成糖とするフコピ
ラノースとガラクトピラノースとの結合は、α1
→３、α1→４又はα1−６結合を示し、特にα1→
３結合が好ましい。また上記オリゴ糖はそのガラ
クトピラノシル基に更に他の糖鎖が結合していて
いもよく、該他の糖鎖を構成する糖としては代表
的には例えばグルコピラノースを挙げることがで
きる。該ガラクトピラノースとグルコピラノース
との結合は、α又はβのいずれでもよい。また、
上記各構成糖は、Ｄ体又はＬ体のいずれであつも
よい。 本発明に好適なオリゴ糖の具体例としては、例
えば以下のものを例示できる。 ●Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−α−
Ｄ−グルコピラノース（3′−α−Ｌ−フコピラ
ノシル−α−ラクトース） ●Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−α−
Ｄ−グルコピラノース（4′−α−Ｌ−フコピラ
ノシル−α−ラクトース） ●Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−α−
Ｄ−グルコピラノース（6′−α−Ｌ−フコピラ
ノシル−α−ラクトース） 上記オリゴ糖は公知であるかまたは公知の各種
方法により容易に製造することができる〔Chem.
Pharm.Bull.29(4)1076−1082（1981）及び第３回
糖質シンポジウム講演要旨第90〜91頁、演題43
「人乳オリゴ糖の合成」、昭和55年８月参照〕。 上記オリゴ糖をハプテンとし、これに結合され
るキヤリアー蛋白としては、通常抗原の作成に当
り慣用される高分子の天然もしくは合成の蛋白質
を広く使用できる。例えば馬血清アルブミン、牛
血清アルブミン（BSA）、ウサギ血清アルブミ
ン、ヒト血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミ
ン、卵白アルブミン等の動物のアルブミン類、馬
血清グロブリン、牛血清グロブリン、ウサギ血清
グロブリン、ヒト血清グロブリン、ヒツジ血清グ
ロブリン、卵グロブリン等の動物のグロブリン
類、馬チログロブリン、牛チログロブリン、ウサ
ギチログロブリン、ヒトチログロブリン、ヒツジ
チログロブリン等の動物のチログロブリン類、馬
ヘモグロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモ
グロブリン、ヒトヘモグロブリン、ヒツジヘモグ
ロブリン等の動物のヘモグロブリン類、動物のヘ
モシアニン類、回虫より抽出された蛋白質（アス
カーリス抽出物、特開昭56−16414号参照）、エデ
スチン（edestin）、ポリリジン、ポリグルタミン
酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン又は
オルニチンを含む共重合体等を挙げることができ
る。 上記ハプテン（オリゴ糖）とキヤリアー蛋白と
の反応は公知の各種方法例えば(A)イソチオシアネ
ートカツプリング法、(B)ジアゾカツプリング法、
(C)アミド結合法、(D)還元的アミノ化法、(E)グアニ
ジンカツプリング法等に従い実施できる
〔Advances in Carbohydrate Chemistry and
Biochemistry、Vol.37、p225−281（1980）、
Methods in Enzymology、Vol1、Complex
Carbohydrates、Part Ｃ、p155−175（1978）、蛋
白質核酸酵素Vol.25、No.8、p707−724（1980）
及びArchives of Biochemistry and
Biophysics、Vol.205、No.2、p338−395
（1980）〕。 上記イソチオシアネートカツプリング法（Ａ
法）は、還元的アミノ化反応（例えばハプテンに
β−（ｐ−アミノフエニル）エチルアミン等のジ
アミン誘導体及びNaBH₄、NaBH₃CN等の還元
剤を反応させる）により製造される化合物にチオ
フオスゲンを反応させたのち、得られるイソチオ
シアネート体にキヤリアー蛋白をカツプリング反
応させることにより実施される。上記還元的アミ
ノ化反応は、適当な不活性溶媒例えば0.2モルリ
ン酸カルシムウム（PH＝８）等の緩衝液、水、生
理食塩水又はメタノール、エタノール等のアルコ
ール中、０〜40℃にて３時間〜３日間で好適に進
行する。また還元的アミノ化反応により得られる
化合物とチオフオスゲンとの反応は、適当な不活
性溶媒例えば水、0.1モル炭酸水素ナトリウム水
溶液（PH＝８）又は生理食塩水中−10℃〜室温に
て30〜２時間で好適に進行する。更にイソチオシ
アネート体とキヤリアー蛋白との反応は、適当な
不活性溶媒例えば水、生理食塩水又は0.1モル炭
酸水素ナトリウム水溶液（PH＝9.5）中で−10℃
〜室温にて15〜20時間で好適に進行する。 ジアゾカツプリング法（Ｂ法）は、例えば上記
Ａ法の還元的アミノ化反応により製造された化合
物に亜硝酸ナトリウムと塩酸又は硫酸等のジアゾ
化剤を反応させて製造されるジアゾ化合物に、キ
ヤリアー蛋白をカツプリング反応させることによ
り実施される。上記ジアゾ化反応は、適当な不活
性溶媒例えば水、生理食塩水又は塩酸水溶液等の
鉱酸水溶液中、−10〜−20℃にて10〜60分で好適
に進行する。またジアゾ化合物とキヤリアー蛋白
とのカツプリング反応は−10〜20℃にて２〜６時
間で好適に進行する。 アミド結合法（Ｃ法）は例えばハプテンのアル
デヒド基を酸化銀等の酸化剤で酸化して糖カルボ
ン酸としたのち、該糖カルボン酸とキヤリアー蛋
白のアミノ基とをアミド結合反応させることによ
り実施される。アミド結合反応は、通常のペプタ
イドのアミド結合生成反応により、例えば１−エ
チル−３（ジメチルイミノプロピル）−カルボジイ
ミド等の脱水剤を用いた脱水縮合反応により実施
できる。この脱水縮合反応は、適当な不活性溶媒
例えば１モル酢酸ナトリウム緩衝液（PH＝5.5）
等の緩衝液中、０℃〜室温にて３〜12時間で好適
に進行する。 還元的アミノ化法（Ｄ法）は例えばハプテンに
キヤリアー蛋白及びNaBH₄、NaBH₃CN等の還
元剤を反応させることにより実施される。還元的
アミノ化反応の条件としては、前記Ａ法の還元的
アミノ化反応の条件を採用できる。 上記Ａ〜Ｄ法において各試薬の使用量は、原料
に対して少なくとも等モル量程度、通常好ましく
は過剰量とされる。 かくしてオリゴ糖とキヤリアー蛋白とが結合し
た所望の糖抗原（フコース抗原）を製造できる。
反応終了後得られる糖抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル濾過法、分別沈澱等により容易に単
離精製できる。上記のごとくして得られる糖抗原
のうちでは、特にキヤリアー蛋白１モルに対して
オリゴ糖が平均20〜25モル結合したものが好適で
ある。 上記で得られる糖抗原による抗体の作成は、常
法に従い該抗原を哺乳動物に投与し、生体内に産
生される抗体を採取する方法を採用できる。抗体
の製造に供される哺乳動物としては、特に制限は
なく例えばウサギ、モルモツト、マウス、ヒツ
ジ、ヤギ、ウシ、ウマ等を例示できる。抗体の産
生は例えば上記抗原の所定量を生理食塩水で適当
濃度に希釈し、これに必要に応じてフロインドの
不完全アジユバント又はフロインドの完全アジユ
バント等のアジユバントを混合し、得られる懸濁
液を投与することにより行なわれる。上記投与は
皮下、筋注、腹腔内、静脈内、経口等、好ましく
は皮下、腹腔内、静脈内経路で行なわれる。投与
回数、投与量等は常法に従い適宜に決定できる。
例えばウサギに上記懸濁液を皮内注射（抗原の量
として0.05〜５mg／回）し、以後２週間毎に１〜
10ケ月、好ましくは１〜３ケ月間投与し免疫化さ
せればよい。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投
与後抗体が多量産生される時期、通常上記最終投
与の１〜２週間後経過、免疫化された動物から採
血し、これらを遠心分離後血清を分離採取するこ
とにより行われる。また上記血清は更に塩析、吸
収法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常
の精製手段により精製してもよい。 かくして精製された抗体は、α−フコピラノシ
ル−（１→３）−、−（１→４）−又は−（１→６）−
ガラクトピラノシル基を特異的に認識できる抗体
である。特に本発明においてハプテンとして3′−
α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトースを用い
た時には、Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→
３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を認識
できる特異性の高い抗体が、ハプテンとして4′−
α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトースを用い
た時には、Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→
４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を認識
できる特異抗体が、またハプテンとして6′−α−
Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトースを用いた時
には、Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を認識できる
特異抗体が各々製造できる。 上記で製造された抗体は、消化器癌等の癌細胞
例えばヒト大腸癌細胞及びマウス テラトカルシ
ノーマ幹細胞とは結合するが、正常組織例えば大
腸粘膜、肝臓、胆嚢、膵臓、肺臓、甲状腺、胸
腺、リンパ節、筋肉、結合組織、血管等のヒト正
常組織や小腸、大腸、肝臓、腎臓、副睾丸、卵巣
等のマウス正常組織等とは結合しない特徴を有し
ている。 更に本発明者らの研究によれば、消化器癌等の
癌腫特に大腸癌細胞によつて、α−フコピラノシ
ル−（１→３）−、（１→４）−又は−（１→６）−ガ
ラクトピラノシル基を有する癌関連糖鎖が産生さ
れ、かつ癌患者の体液中にもこれが存在すること
が見出された。従つてα−フコピラノシル−（１
→３）−、−（１→４）−又は−（１→６）−ガラクト
ピラノシル基を特異的に認識できる抗体の利用に
よれば、癌細胞もしくは癌組織上の又は体液中の
癌関連糖鎖を免疫反応（抗原抗体反応）により測
定することができ、これにより癌の診断をするこ
とができる。本発明はかかる癌関連糖鎖の測定方
法乃至癌の診断方法及びこれらに利用する癌診断
用試薬をも提供するものである。 本発明の上記癌関連糖鎖の測定及び癌の診断に
利用される抗体としては、前記のごとくして得ら
れる抗体即ちα−フコピラノシル−（１→３）−、
−（１→４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシ
ル基を特異的に認識できる抗体をいずれも使用で
きる。具体的にはＯ−α−Ｌ−フコピラノシル−
（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を
認識する抗体（以下「抗体−」とする）、Ｏ−
α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル基を認識する抗体（以下
「抗体−」とする）、Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→６）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
基を認識する抗体（以下「抗体−」とする）を
挙げることができる。これらのうちでは抗体−
が好ましい。また癌関連糖鎖とは、α−フコピラ
ノシル−（１→３）−、−（１→４）−又は−（１→
６）−ガラクトピラノシル基を有する糖蛋白及
び／又は糖脂質を挙げることができる。 本発明の癌関連糖鎖の測定は、通常の方法に従
い、例えば具体的には以下の如くして行なわれ
る。即ち測定材料として細胞及び／又は組織片を
使用する場合は、通常の間接免疫法に従い行われ
る。この方法によれば、生理食塩水又は通常のリ
ン酸塩緩衝液（PBS）等の緩衝液中に浮遊した
細胞に、又はガラススライド上に固定化した組織
切片に、本発明の抗体を免疫反応させ、細胞又は
組織片を上記緩衝液で充分に洗浄後、常法通りに
標識抗体法により、又は標識プロテインＡの使用
により、細胞又は組織片に結合した本発明抗体の
有無を調べればよい。 標識抗体法においては、本発明の抗体を製造し
た動物種の抗原に対する標識抗体、例えば標識抗
ウサギ免疫グロブリンＧ抗体、同抗マウス免疫グ
ロブリンＧ抗体、同抗ヤギ免疫グロブリンＧ抗体
等を適宜選択して使用することができる。上記標
識抗体及び標識プロテインＡの標識剤としては、
各種の螢光標識物質又は酵素標識物質を利用でき
る。代表的螢光物質としては、例えばフルオレツ
セイン・イソチオシアナート（FITC）、テトラ
メチルローダミン・イソチオシアナート
（TRITC）、置換ローダミン・イソチオシアナー
ト（XRITC）、ローダミンＢ・イソチオシアナー
ト、ジクロロトリアジンフルオレツセイン
（DTAF）等を、酵素標識物質としては、例えば
パーオキシダーゼ（POX）、マイクロパーオキシ
ダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシ
ペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−
Nase、Ｐ−Nase等をそれぞれ挙げることができ
る。これらで標識化された抗体又はプロテインＡ
としては、市販のもの又は常法に従つて作成した
もののいずれを使用してもよい〔Acta.
Endocrinol.Suppl.、168、206（1972）及びProc.
Nat.Acad.Sci.、USA、57、713（1967）参照］。
本法においては、前記本発明の抗体で処理した細
胞又は組織片に、前記と同様の緩衝液で予め希釈
した標識抗体あるいは標識プロテインＡを反応さ
せ、前記と同様にして細胞又は組織片を充分に洗
浄後、細胞又は組織片に存在する標識活性（螢光
活性又は酵素活性）を常法に従い測定する。 測定材料として体液を使用する場合もまた常法
に従うことができる。ここで体液としは例えば血
液、細胞組織液、リンパ液、胸水、腹水、羊水、
胃液、尿、膵液、髄液睡液等又は前記の細胞又は
組織片の可溶化後の遠心上清等を使用することが
できる。上記細胞又は組織片の可溶化後の遠心上
清は、通常の方法例えばホモジネート法や可溶化
剤を用いる可溶化の後、これを遠心分離して上清
を採取することにより得ることができる。また血
液を使用する場合は、通常血清又は血漿として使
用するのが好ましい。測定に用いられる体液の量
は、0.1〜10ml程度採取すればよい。 上記各種体液を測定材料とする本発明方法は、
通常の競合法によるラジオイムノアツセイ法
（RIA）又は酵素免疫測定法（EIA）により行う
のが好ましい。これら方法の操作、手順等は通常
の方法に従うことができる。即ち通常の溶媒中、
一定量の標準抗原、標識抗原及び抗体を競合反応
させ、次いで抗原抗体結合物（免疫複合体）及び
非結合抗原を分離し、そのいずれか一方の標識活
性を測定し、既知濃度の標準抗原に対する標準曲
線を作成する。同様に標準抗原の代りに濃度未知
の被検試料（体液）を使用してその標準活性を測
定し、前記標準曲線より被検試料中の使用した抗
体に対する免疫感受性物質（癌関連糖鎖）量を定
量することができる。 標準抗原としては、使用する抗体に免疫感受性
を有する物質（抗原乃至そのハプテン）を使用す
ることができる。該ハプテンとしては、例えば抗
体−を使用する場合には、3′−α−Ｌ−フコピ
ラノシル−α−ラクトースを、抗体−を使用す
る場合には、4′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−
ラクトースを、抗体−を使用する場合には、
6′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトースを
例示できる。また抗原としては上記各ハプテンに
対応する抗原、具体的には後記する抗原の製造例
で得られる如き上記ハプテンとキヤリアー蛋白、
例えばPIP−BSAとの結合物を例示することがで
きる。 標識抗原としては、標準抗原を例えば ¹²⁵Iも
しくは ³H等の放射性物質又は前述した各種酵素
標識物質等で標識化したものを使用すればよい。
標準抗原に上記放射性ヨードを導入して標識化す
る場合は、例えば前記抗原の製造において説明し
たイソチオシアネート体（ハプテン−イソチオシ
アネート結合物）又はこれとキヤリアー蛋白との
結合物、具体的には後記する抗原の製造例で得ら
れる如き3′−、4′−又はα−Ｌ−フコピラノシル
−α−ラクトース−PIP、又はこれとBSAとの結
合物を、ボルトン−ハンター（Bolton−Hunter）
試薬を用いて常法通りに標識化することができる
〔J.Biol.Chem.、254、9349−9351（1791）参照〕。
またクロラミンＴを用いる酸化的ヨード化法
〔Nature、194、495頁（1962）、Bichem.J.89、
114頁（1963）〕によつてヨード化されたチロシン
基を前記のイソチオシアネートカツプリング法に
より前記PIP基に結合させたもの、あるいはBSA
基のチロシン残基を同様にヨード化したものを使
用することもできる。また、 ³Hを導入する場合
も常法に従い、前記標準抗原を例えばNaB³H₄を
用いた還元反応に付すことにより又は
（C³H₃CO）₂Oによりアセチル化することにより標
識化された標識抗原を得ることができる。前記測
定系の溶媒としては、免疫反応に悪影響を与えな
いもの、例えば水、生理食塩水、0.1モルトリス
塩酸緩衝液（PH＝7.5）、0.1モルリン酸塩緩衝液
（PH＝7.4）等のPHが６〜7.8の緩衝液が好ましい。
上記免疫反応は、常法に従い45℃以下、好ましく
は４〜40℃、１〜40時間程度で行われる。反応に
よつて生成した免疫複合体と非結合抗原との分離
は、公知の方法によつて例えばデキストラン−活
性炭法の後、あるいは前記抗体に対する第２抗体
例えば上記方法においてウサギ抗体を使用する場
合はヤギ抗ウサギIgG抗体等を反応させた後、遠
心分離法によつて分離すればよい。 以下、上記測定法の一具体例を挙げて更に詳述
する。 後記抗原の製造例で得られる3′−α−Ｌ−フコ
ピラノシル−α−ラクトース−PIPの５〜10μｇ
をボルトンハンター試薬を用い ¹²⁵Iで標識して
（室温、約60秒）、標識抗原を製造する。標準抗原
として3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクト
ースを、また抗体として抗体−Ｉを使用する。
0.5％BSA及び0.02％NaN₃を含む0.1Mリン酸塩
緩衝液（PH＝７）0.2ml、上記標識抗原0.1ml（約
10000cpm）、適当濃度の抗体−I0.1ml及び各種濃
度の標準抗原0.1mlを４℃、24時間インキユベー
トする。次いで、0.1ml正常ブタ血清及び0.5mlデ
キストラン−活性炭懸濁液を加えて４℃下30分放
置後遠心分離（3000rpm、30分）するかあるい
は、適当濃度のヤギ抗ウサギIgG抗体0.1mlを加え
４℃、24時間インキユベート後同様にして遠心分
離して、免疫複合体及び非結合抗原を分離し、そ
の放射活性を測定する。標準抗原の各濃度に対し
てその放射活性を求めるか、あるいは用いた抗体
の力価に相当する抗体と標準抗原との結合率
（B0）を100％としたときの抗体と標識ペプチド
との結合体Ｂの百分率Ｂを求め、標準曲線を作成
する。また濃度未知の試料を標準抗原の代りに使
用して同様にして放射活性又は百分率を求め、こ
の値から前記標準曲線を利用して、試料中の癌関
連糖鎖の定量を行なうことができる。また上記方
法によつて、体液中の3′−α−Ｌ−フコピラノシ
ル−α−ガラクトピラノシル基を有する癌関連糖
鎖の測定が可能である。更に上記において抗体−
又は抗体−を使用し、対応する抗原系（標識
抗原及び標準抗原）を使用して同様にして測定す
ることにより、体液中の4′−α−Ｌ−フコピラノ
シル−α−ガラクトピラノシル基又は6′−α−Ｌ
−フコピラノシル−α−ガラクトピラノシル基を
有する癌関連糖鎖を測定できる。 本発明の上記測定を実施するのに特に便利な方
法は、血漿や血清のような体液中の癌関連糖鎖量
を決定するための試薬を使用する方法である。こ
のような試薬には、癌関連糖鎖と特異的に抗原抗
体反応をする抗体、即ち、α−フコピラノシル−
（１→３）−、−（１→４）−又は−（１→６）−ガラ
クトピラノシル基を特異的に認識できる抗体を含
有せしめることが重要である。この抗体を含有す
る試薬には、グリセロールやウシ血清蛋白のよう
な安定化剤及び／又は保存剤を添加することがで
きる。好ましくは、この抗体を含有する試薬は凍
結融解したものであり、この試薬には水溶性もし
くは水と混和しうる溶媒を含有させることができ
る。更にこの抗体を含有する試薬には、再構成さ
れた試薬系を一定のPHに保つための緩衝液及び／
又は使用前に試料が悪化するのを防ぐための保存
剤及び／又は安定剤を添加することができる。緩
衝液は試薬の必須成分とは考えられないが、本発
明の測定法を実施する際に、PHを６〜7.8とする
ものを用いるのが好ましい。また再構成剤は好ま
しくは水を含んだものであるが、水の一部又は全
部を水と混和しうる溶媒で置き換えることもでき
る。水と混和しうる溶媒は当業者に周知であり、
例えばグリセリン、アルコール類、グリコール
類、グリコールエーテル類等を使用できるが、も
ちろんこれに限定されない。 かくして本発明によれば癌関連糖鎖を有利に測
定することができる。測定された癌関連糖鎖レベ
ルを健康人の当該レベルと比較することにより、
被検者におけるえ初期から末期の消化器等の癌
腫、特に大腸癌を診断することができる。従つて
本方法は特に癌の早期発見に極めて有用である。 以下本発明を更に詳しく説明するため糖抗原
（フコース抗原）及び抗体の製造例を挙げる。 抗原の製造例 １ (1) 3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトー
ス−フエネチルアミン誘導体の製造 3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトー
ス0.1ミリモル及びβ−（ｐ−アミノフエニル）
エチルアミン3.5ミリモルを密閉容器に入れ、
室温で15時間撹拌して反応させた。純エタノー
ル0.5mlを反応混合液に加え、次いで水素化ホ
ウ素ナトリウム12mgを懸濁させた純エタノール
１mlを加え室温で５時間撹拌した。次いで水４
mlを加えて希釈し、氷冷下に氷酢酸を滴下して
PH5.6に調整した。減圧下にエタノールを留去
後水を加えて５mlとした反応混合液をセフアデ
ツクスＧ−10カラム（2.5×100cm）に通し、
1M酢酸−ピリジン緩衝液（PH＝5.0）で溶出し
た。溶出液を５mlづつ分画して、各画分につき
フエノール硫酸反応による中性糖の測定及び
OD₂₈₅nｍでの吸光度測定を行ない、それぞれ
のピークが一致する画分を集めて凍結乾燥し
た。 凍結試料を２ｍＭ酢酸−ピリジン緩衝液（PH
5.0）に溶解し、ワツトマンCM52カラム（0.5
×20cm）に通じ、同緩衝液で未反応原料（3′−
α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトース）を
溶出後、0.1Nアンモニウム水で溶出した。溶
出液を20滴（約0.6ml）づつ分画し、各画分に
つき上記と同様にして中性糖測定、及び
OD₂₈₅nｍでの吸光度測定を行ない、ピークが
一致する画分を採取し凍結乾燥した。 かくして3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−
ラクトース−フエネチルアミン誘導体を得た。
このものの糖組成は、ガスクロマトグラフイー
〔Biochem.Biophys.Acta.、222、339−347〕及
び高速液体クロマトグラフイー
〔Developmental Biology.、99、441−444
（1982）〕により確認できた。 (2) 3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトー
ス−ｐ−イソチオシアネート−フエネチルアミ
ン誘導体（3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−
ラクトース−PIP）の製造 上記(1)で得た3′−α−Ｌ−フコピラノシル−
α−ラクトース−フエネチルアミン誘導体の
25μモルを、0.1M炭酸水素ナトリム水溶液（PH
＝8.0）２mlに溶解して、チオホスゲン65μモル
を含むクロロホルム2.5ml上に重層し、１時間
激しく撹拌した。反応混合物を遠沈管に移し、
クロロホルム２mlで２回抽出し、過剰のチオホ
スゲンを除去し、水層を集め、窒素ガスを通し
て残存するクロロホルムを除去した。 かくして3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−
クラトース−ｐ−イソチオシアネート−フエネ
チルアミン誘導体を水性液として収得した。 (3) 3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトー
ス−ｐ−イソチオシアネート−フエネチルアミ
ン誘導体と牛血清アルブミンとのカツプリング
反応による糖抗原（3′−α−Ｌ−フコピラノシ
ル−α−クラトース−PIP−BSA）の製造 上記(2)で得た水性液を、牛血清アルブミン
（BSA）0.2μモルを含む0.5M塩化ナトリウム−
0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液（PH＝9.5）に
加え、室温で18時間撹拌して反応させた。反応
混合液をダルベツコー処理のPBS（−）（生理
食塩水−リン酸塩緩衝液）21に対して透析し
て、未反応の3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α
−クラトース−ｐ−イソチオシアネート−フエ
ネチルアミン誘導体を除去した。透析液を12時
間毎に３回交換後、透析された液につき、ロー
リー法及びフエノール硫酸反応を行ない、それ
ぞれの蛋白量及び中性糖の定量を行なつた。そ
の結果得られた糖抗原は、牛血清アルブミン
（BSA）１モルに対して3′−α−Ｌ−フコピラ
ノシル糖鎖が約20モル結合していた。 かくして目的とする糖抗原液を得た。これを凍
結保存した（これを「抗原−」とする）。 抗原の製造例 ２ 前記抗原の製造例１において、3′−α−Ｌ−フ
コピラノシル−α−クラトースに変えて4′−α−
Ｌ−フコピラノシル−α−クラトースを用いて同
様にして目的とする糖抗原液を得た。これを凍結
保存した（これを「抗原−」とする）。 この糖抗原は、牛血清アルブミン（BSA）１
モルに対して4′−α−Ｌ−フコピラノシル糖鎖が
約25モル結合していた。 抗原の製造例 ３ 前記抗原の製造例１において、3′−α−Ｌ−フ
コピラノシル−α−クラトースに変えて6′−α−
Ｌ−フコピラノシル−α−クラトースを用いて同
様にして目的とする糖抗原液を得た。これを凍結
保存した（これを「抗原−」とする）。 この糖抗原は、牛血清アルブミン（BSA）１
モルに対して6′−α−Ｌ−フコピラノシル糖鎖が
約23モル結合していた。 抗体の製造例 １ ニユージーランド白兎のフツトパツド（foot
pads）に、上記抗原の製造例１で得た抗原−
の0.4mgを含むフロインド完全補助液１mlを注射
した。３週間後同量の抗原−含有フロインド完
了補助液を注射し、この操作を２週間毎に３回繰
り返した。第３回目（最後）の注射から10日後
に、試験動物から採血し、遠心分離して抗血清を
採取して目的の抗体を得た。これを「抗体−」
とする。抗体−は−70℃に保存される。また上
記で得られた抗血清を凍結乾燥して抗体−の乾
燥品を得た。 抗体の製造例 ２ 前記抗原の製造例２で得た抗原−を用い、抗
体の製造例１と同様にして目的の抗体（抗血清）
を得た。これを「抗体−」とする。 抗体の製造例 ３ 前記抗原の製造例３で得た抗原−を用い、抗
体の製造例１と同様にして目的の抗体（抗血清）
を得た。これを「抗体−」とする。 以下、抗体の特異性試験例につき詳述する。 ＜抗体の特異性試験＞ (1) 各種細胞を遠心分離（500×ｇ）し、リン酸
塩緩衝生理食塩水（カルシウムイオン及びマグ
ネシウムイオン含有、PH＝7.2）の50倍量で２
回洗浄する。得られる細胞を上記リン酸塩緩衝
生理食塩水に１％（Ｖ／Ｖ）濃度となるように
懸濁させ、この懸濁液50μに、抗体の製造例
１〜３で得た抗体（抗体−〜−）のそれぞ
れを予めリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウム
イオン及びマグネシウムイオン含有）で20容積
倍に希釈したもの、又は対照として同様に希釈
された正常兎血清を混合し、各混合液を４℃下
１時間インキユベートする。その後各細胞をリ
ン酸塩緩衝生理食塩水（カルシムウイオン及び
マグネシウムイオン含有、PH＝7.2）の100倍量
で洗浄し、次にFITCが共有した羊抗兎IgG〔マ
イルス−イエーダ（Miles−Yeda）社製〕の
１／１０希釈液を用いて４℃下１時間インキユベー
トする。引き続き、上記リン酸塩緩衝生理食塩
水（PH＝7.2）の100倍量で２回洗浄後、各細胞
を落射螢光顕微鏡（オリンパスモデルBH−
RFL−LB、オリンパス光学社製）で観察し、
富士カラーフイルムASA100（富士フイルム社
製）で撮影する。 (2) 癌又は正常組織を迅速に凍結し、クリオスタ
ツト（American Optical社製）により、超薄
切片を得る。これをガラススライド上にアセト
ンで１分間固定して検体とし、更にFITC−羊
抗兎IgGの代りにFITC−羊抗兎IgG−Ｆ
（ab）′₂（Cappel社製）を使用して、上記と同
様にして試験する。 上記(1)及び(2)において、用いた各細胞又は組
織片と抗体−〜−との反応性を調べた結果
を各抗体毎に下記第１表に示す。第１表におけ
る各反応性についての評価記号は、それぞれ次
のことを示す。 ＋……染色像が認められる。 −……染色像が認められない。

【表】 カルシノーマ ＋ ＋ ＋
(手術片)
尚上記において抗体−〜−の代りに対照
として使用した正常兎血清の場合は、すべて染
色像は認められなかつた。 (3) 上記(2)の試験で染色像が認められたヒト大腸
アデノカルシノーマ（手術片）を検体として、
抗体−を使用し、第一反応時に0.2M3′−α
−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトース、
0.2Mラクトース、0.2Mフコース又は10mg／ml
BSAを存在させ、上記(2)と同様にして試験し
た。その結果、染色像は3′−α−Ｌ−フコピラ
ノシル−α−ラクトースにより減弱されるが、
ラクトース、フコース及びBSAでは染色像に
変化は認められなかつた。 ＜抗体の特異性試験＞ オーチテロニイ（Ouchterlony）二重拡散分析
法により、抗体−〜抗体−の特異性を以下の
通り調べた。即ち、１％寒天ゲル（0.01モルトリ
ス塩酸緩衝液（PH＝7.6）中に２％トリトンＸ−
100、0.15M−NaCl、フエニルメチルスルホニル
フルオライド50μｇ／ml及び0.05％NaN₃を含む
寒天ゲル）をスライドグラス上に積層し、その中
央に抗体を置き、周辺にそれぞれ20μｇの、3′−
α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトース−PIP
−BSA、4′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラク
トース−PIP−BSA、6′−α−Ｌ−フコピラノシ
ル−α−ラクトース−PIP−BSA、α−ラクトー
ス−PIP−BSA及びBSAを含む水溶液を置き、
拡散試験を行なつた。 結果を第１図〜第３図に示す。第１図は抗体−
の拡散状態を示す図であり、第２図は抗体−
の拡散状態を示す図であり、また第３図は抗体−
の拡散状態を示す図である。各図においてａは
3′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトース−
PIP−BSA、ｂは4′−α−Ｌ−フコピラノシル−
α−ラクトース−PIP−BSA、ｃは6′−α−Ｌ−
フコピラノシル−α−ラクトース−PIP−BSA、
ｄはα−ラクトース−PIP−BSA及びｅはBSA
をそれぞれ示す。各図より次のことが判る。即
ち、抗体−は、3′−α−Ｌ−フコピラノシル−
α−ラクトース−PIP−BSAとは沈降線を形成す
るが、他の抗原とは沈降線を形成しない。抗体−
は、4′−α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクト
ース−PIP−BSAとは沈降線を形成するが、他の
抗原とは沈降線を形成しない。抗体−は、6′−
α−Ｌ−フコピラノシル−α−ラクトース−PIP
−BSAとは沈降線を形成するが、他の抗原とは
沈降線を形成しない。尚上記試験において、抗体
−は前記抗体の製造例で得られたもの１ml当り
0.4mgのBSAを加えて４℃、一晩放置後遠心分離
して上清を採取し、抗BSA抗体を除去した後に、
上記試験に使用した。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は、本発明の抗体−〜抗体
−の二重拡散分析法による拡散状態を示す図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ α−フコピラノシル−（１→３）−、−（１→
   ４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシル基を
   特異的に認識できる抗体を用い、免疫反応により
   α−フコピラノシル−（１→３）−、−（１→４）−
   又は−（１→６）−ガラクトピラノシル基を有する
   癌関連糖鎖を測定することを特徴とする癌関連糖
   鎖の測定法。 ２ α−フコピラノシル−（１→３）−、−（１→
   ４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシル基を
   特異的に認識できる抗体を含有する癌診断用試
   薬。