JPH0339019A - 植物胚の貯蔵方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は植物の体細胞胚又は接合体肝の貯蔵方法に関す
る。

従来の技　および発明が解　しようとする多くの種は＄
［胞懸濁体、カルス又は分裂！］組織形も低温で貯蔵で
きる。

胚の低温貯蔵は多くの場合、例えば季ｌｌ１）性植物の
生産を調整したり又はり］」−ン系を維持するために正
当とされる。

胚を低温貯蔵することにＪ：り一時的に胚の発育を停止
させうるし、苗床へのこれらの輸送又はη蔵に要する時
間を与えることができまた遺伝的素質が徐々に低落する
のをＷｉＪるために遺伝丁型のバンクをＢ１成しうる。

体細胞胚は植物の増加に対しある利点を有する。

これらは原則として１個の細胞に由来するから、遺伝学
的に均一な植物を供する。これらの形成期＋１１Ｊから
、体細胞胚は二分裂極構造を右する。即ち、植物の生産
に必要な幹および根の２つの分裂１１械を有する。従っ
て、体Ｉ８胞不定胚形成は植物の増殖にス４し興味あ、
る別径路と思われる：生産経費のかかる種又は試１管培
養に由来する高性能固体又は例えば、交配により取扱い
が困難な形質転換植物の急速ｔｔｉ殖に使用できる。

胚の貯蔵時におきる問題は複雑である。特に、根や幹の
仲良および器′占形成を再開しつる２つの分裂組織の分
裂極は生ぎた状態で保ｑしなければならない。

胚には各種の既知の低温貯蔵方法がある。

これらの方法のうちの１つは、ンルごトール、プロリン
又はマンニ１−−ルを強化した培地に胚を予備培養し、
０℃でジメチルスルホキシドおよび／又はグリｌ？ロー
ルを添加したＩｇ地に含浸し、−４０℃まで緩慢凍結し
、次に液体窒素中で急速凍結するものである。解凍後、
不定胚形成過程を再ＤｉＩするには、培地に２，４−ジ
クｒ−Ｉ　Ｃｌフェノキシ酢酸を添加り゛る必要がある
。

寒天培地で１８養する体細胞胚に適用できる別法は、１
週間蔗糖強化培地で胚をｒ備培養し、液体窒素で冷却管
中に乾燥状態に入れた胚を直接凍結するものである。

別の既知方法では、休［ｌ胞胚は少なくと６２．５％の
ジメチルスルホキシドを徐々に添加する培地で予備培養
し、次に一１００℃に緩慢凍結し、次に液体窒素中で急
速凍結する。不定胚形成過程を再開するには、０．１ｍ
ｇ１−’２．４−ジクロロフェノキシ酢酸を含りする培
地で培養することにより促進される。

ジメチルスルホキシド又はグリセ１」−ルのような冷が
保護剤の機能ｌｅｔ凍結凍結中形成を防止す゛ることで
ある。しかし、このような物質の使用にはある不利があ
る。一つは、−・般に易昇革性ではないから、次の凍結
乾燥処理には供しえない。他方、ｔ／ｆＪ胞障害を示し
うる。

２．４−ジクロロフェノキシ酢酸のようなオーキシンの
機能は、カルス形成（Ｃａ　ｌ　Ｉｏｇｅｎｅｓ　ｉ　
Ｓ　）小中性状態にｍ胞を保持し、胚の解ｍ後細胞増殖
の再開を促進することである。凍結により胚の発生が停
止すると、しばしば異常な成育再開を誘発する。オーキ
シンは不定胚形成過程の再開中細脂分ｇｌＩ、１′より
不定胚の形成を助長し、第２不定胚形成の危険性を増大
しうる。

課題を解決するための手段 従来技術の不利を除くために、本発明は凍結により胚の
発生を停止し、次に第２不定胚形成又はカルス形成のよ
うな形態形成の他の形態を出現させずに再開できる体細
胞胚又は接合体肢の貯蔵方法を供するものである。

このために、本発明方法は −胚を浸透圧上界剤含右予備処理培地で予備処理し、そ
の後 一予備処理胚を冷却し、−１５〜−４０℃の湿度に凍結
することを特徴とする。

１５〜−４０℃に凍結した胚はその温度で貯蔵でき、又
Ｉよ次に液体冷媒に浸漬し、かつ低温で貯蔵できる。

この方法の１利点は、６毒および／又は非昇華性冷却保
護剤の使用を回避することである。別の利点は凍ｔｉ！
１ｉｙｉおよび解凍後の成育再開小便用培地にオーキシ
ンの使用を回避することである。この方法の別の利点は
高価な装釘を何ら必要とじずに容易に到達しうる低温（
−１５／−４０℃〉　（例えば家庭用フリーシーで）で
貯蔵できることである。

本発明の別の利点は急速かつ容易に実施しうる貯蔵方法
を供することである。

別の利点は胚をその後の凍結乾燥に供することである。

本発明の貯蔵方法により、胚は成育促進剤を必要とせず
に通常の成育再開を示し、偶生附増加をしない胚を得る
ことができる。何／＆なら第２不定胚形成は生成物の産
業的分配に有害であるが（望まない多肢種子が得られる
ので）本貯蔵方？λ口生産種子の品質を改良するからで
ある。

本発明で使用する胚は任意種および各種配属のものでよ
い。例えば、胚１．１にんじんの胚でよい。

胚は体細胞胚又（よ接合体肢でよい。

体細胞胚は未分化ＩＩ胞懸濁体から１ｑることができる
。この場合、例えば、バイブリドペアレントの種子は無
菌的に発芽させることができる。胚軸を切断し、次にオ
ーキシン含有培地に置くことができる。得たカルスは次
に液体培地中で解離できる。これにより数回の継代培養
後培地に移すことができる未分化細胞懸濁体を得る。約
１０日後、細胞懸濁液を濾過して、所ａの大きさの細胞
塊のみを保持することができる。これらの集塊【よ数１
１間オーキシンを含まない培地で培養し、胚の形成を誘
発できる。

接合体肢は成熟又は僅かに未熟の段階で種子を切開して
試料を採取することにより得ることができる。

得た体細胞胚ａ３よび接合体肢【よこれらの発生の段階
に従って分類できる。好ましい胚はこれらの大きさが１
５０〜６００μ肌である場合の発生の初ＩＩ段階にある
もので、この段階では凍結に苅し−・府安定であるから
である。これらの大きさは体１［胞胚発生の心１１ａ型
胚（１５０〜３００ｕＴｒＬ）又は魚雷を胚（３００〜
６００μＴｒＬ）段階に相γ１する。

次に得た胚は予備処理培地と呼ばれる培地で予備処理す
る。この培地は例えばＨｕｒａｓｈｉｇｅ　ｌ′３よび
５ｔｔｏｏａ培地のような胚培養分野における代表的培
地で、この培地に浸透圧上昇剤を添加し、ビタミンＢ１
、ニコチン酸又【Ｊアデニンのような有機物質も添加で
きる。

凍結中直接胚をＪｆｌ（Ｍさせない場合でも、解凍中破
壊的再結晶を誘発できる細胞内水の形成を防止すること
は低温貯蔵方法で必要である。本発明り法では、胚は浸
透圧上昇剤を含右寸−る培地で予備処理することにより
部分脱水するので受【）うる伺らかの罰傷が軽減される
。

組織に浸透し、十分な浸透圧を供し、膜透過性に彰費を
与えずに細胞の正しい脱水をなしＩる物質のうらから、
この上昇剤は専門家により選択できる。さらに、この剤
は胚に対し決して有毒であって【よならない。この剤は
蔗糖又はトレハロースのような粘又は同じ機能を果しう
る任息の他の既知物質でよい。

予備処理培地における浸透圧上昇剤の濃度は細胞の正し
い脱水を確保するために低すぎてはならない。胚に損傷
を与えずに、又は解凍後これらの成育再開を阻害しない
ために高すぎてもならない。

本発明による貯蔵方法の好ましい−・態様では、予備処
理培地ｔよ７５〜１９０ｇｌ”の濃度、好ましくは１０
０〜１５０ｇｌ−’の濃度の蔗糖を含有する。

単に予備処理を行ない、次いで指示温度までの凍結工程
により所望の目的を簡単、有効で信頼しつる仕方で達成
しうることが分った。

予備処理は３０秒〜３６ｒＲ間継続できる。予備処理は
浸透圧上昇剤によりｍ　＋ａを部分脱水し、凍結に対す
るこれらの安定性を増加させるために短かすぎてはなら
ない。予備ＩｊＢＪ！ｌ！が３６時１Ｍ＋を越える場合
、解凍後肢の生存数の減少に反映するように、凍結に対
する胚の安定性が低下づるので、予備処理は長ずぎては
ならない。艮峙間予偏処即の場合には、胚は多分形態学
的変化を受けるのであろう。これは胚が成長を続（Ｊ、
凍結に対し適合性の少ないｇ２階に到達する事から凍結
に対する安定性が減少する。他方、長時間の予備処即中
に浸透圧上昇剤の保護効果が減少するのは、浸透圧上？
？効果を減少させる予備処理培地に胚を適応させること
により説明することもできる。

予備処理は環境温度、すなわら約１８°〜２４℃、例工
Ｇｆ　１５０〜２５０　）Ｌ／　”／　クス＋７）　ｅ
　ｉｌ　（７）照明下で行なうことが好ましい。

予備処理胚は冷却し、次に−１５６〜−４０℃の温度に
凍結する。これらは約−２０℃の湿度に凍結することが
好ましい。凍結方法は胚を予備処理培地と共に冷Ｗ管に
移し、冷却管を例えば家庭用フリーザーに入れることに
より行なうことができる。凍結中適用する冷却速度ｕ１
氷が生成する速度および氷が形成するその時の胚の脱水
度に彰費する。冷却速度は胚の続く成長再開を促進する
ために一６°〜−４０℃の温度範囲では０．１゜〜１℃
／分の穏かなものが好ましい、、環塊温度から一６℃の
温度までの冷却では、冷却速度は一府急速で、例えば１
″〜５℃／分でよい。

−１５°〜−４０℃の範囲の温度に凍結した胚は少なく
とも１ケ月そのまま貯蔵できる。−層長用の貯蔵時間に
対しては、胚は更に低温で、例えば液体冷媒中でｙ？蔵
することが好ましい。これは・−１５°／−４０℃の長
期貯ｉは成長再ｂ１、そのための解凍後の胚の生存能力
に適合しないらしいからである。−１５°／−４０℃の
温度は胚の代謝の完全な停止を確保するには高すぎるら
しい。

長期貯蔵が必要の場合、−１５°／−４０℃の凍結は第
１工程と見做すべきで、・−層低温の液体冷媒中で凍結
するのがよい。

この場合、凍結を全うするように、胚を一１５°／−４
０℃で、１８・〜２４時間保持することが好ましい。

次に胚を例えば−７０℃のメタノール浴中に、又は−１
９６℃の液体窒素浴中に、又は仔魚の他の手段により非
常にＯ（い温度に冷却した、液体冷媒中に直接浸漬でき
る。

この場合凍結胚は数年までの長１！１１間悟゛蔵できる
。

次に凍結肝は人工又ロ天然ポリマー、例えＬｌ’フルギ
ネートタイプのポリマーによりカブヒル化し、人］ニ挿
子を得ることができる。

胚は例えば４０℃の水浴中に２分片ＪＪＩ管を浸Ｗｌす
ることにより解凍できる。管は氷が完やに１．１１！解
する前に水浴か１３回収して温ｌαの過大り魚汁−１ｙ
Ｉを回避づることができる。完全解凍後、Ｉｌ＋【よ曲
中な洗滌により予備処理培地を除くことができ、洗滌肝
は例えばＨｕｒａｓｈｉｇｃ　６３よび５ｋＯＯｆＪ　
Ｉ８地のような胚培養分野にお番ノる代表的ｉｔｓ　養
Ｍに入れることがて”きる。

この培地は蔗糖のような同化竹炭系−含１−ＪｊＪ貿を
例えば１〜１０’ＪＩ”の濃度で含有でさる。

このＪｔＳ＃！Ｉはオーキシンを含まない点で注０ずべ
きである。

この再培養後、胚は非凍結胚に匹敵しうる発生を再開す
る。

凍結および再培養後の生存は胚の二分裂槓成長に反映す
る。胚はカルス形成又は不定胚形成のような形態形成の
他の形態を現わづことなく次の発生中その構造の完全性
を４効に保有り゛る。

従って、本発明による貯蔵７Ｊ法Ｕ一方でほらとのまま
の形堰学的完全竹を右する胚の生存を供し、他方胚は苗
を再生する能力をｈ効に保持できる。

本発明は法例に上りさらに：を糟に説明する。これらの
例にタ、立って１．１存能力試験の記載おＪ：び好まし
いｆ廂処即Ｊ３よび培地の組成を示す第１表により、体
肢の通例的製造例を示す。

体［１胞胚の製造例 にんじん細胞（Ｄａｕｃｕｓ　Ｃａｒｏｔａ　Ｌ、　）
の未分化細ｗＡｍ濁体は第１表に示す組成を有するＨＵ
ｒａＳｈｉＯｅＲヨヒ５ｋｏｏａ　液体１ｍ　（、：　
しＴｓニー　２０　！７１−’１ｐｔｔ？よび０．１Ｍ
１ｌ−１２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を添加）に１
２日毎に継代ｊ８養したく１００ＩＩｌの培地に１９の
バイオマス〉。すべでの操作は病魔フードの下で無菌條
件下で行１３う。懸濁体は１００　ｒ、ｐ、ｍ、の偏心
回転運動する度拌機上に置き、２４℃で２００ルツクス
の照明下で１６時間の照明時間培養する。

８〜１０日の培養後、ＩＩＩ胞懸濁体は５０〜１８０μ
汎の大きざのａ胞塊のみを保苗するように濾過する。こ
れらの小集塊は心臓型胚、魚雷型肝および苗木段階まで
発生を継続ダる胚の前肢段階を表わす。小塊は洗滌し、
約１．５Ｘ１０３小塊／ｄ培地の吊で２．４−ジクロロ
フェノキシ酢酸を含有しないＨｕｒａｓｈｉｇｅおよび
５ｋＯＯ（＋培地に入れる。

１０日間培養後、胚が形成した。ｍＮ４体は１５０〜６
００μ流の大ぎさの胚のみを保菌するように濾過する。

生存能力試験 急速かつ簡単な生存能力試験は凍結後肢の生存能力割合
を評価するために開発された。

胚の生存能力割合を評価するために使用できる各種基準
のうち、 一胚の大ぎさの増加、および クロロフィル着色の外観、 は特に適する。

これらの基準は各種方法、例えば目にＪ：る計数又番よ
生化学試験（例えば着色試験）により評価できる。

この試験の原理下で、解凍胚↓よ液体培！！ｉ基に入れ
る。１０日間の培ａｖＡ、大きさが増加し、クロロフィ
ル着色の徴候を示す胚の数を記録１゛る。この数と存在
する胚の総数間の比は胚の生存能力割合を決定できる。

次に胚はこれらが苗木段階までその発生を継続できるよ
うに前記液体培地と同じ組成を有する固体培？１基に入
れる。

この同体ｊ８地で１０日間培養後、再生割合は苗木段階
まで発生した胚の数と胚の総数間の比として測定する。

第１表 ＨｔｌｒａＳｈｉ（ｌｅおよびＳｋｏｏｇ培地（ｐ＋１
５．８〜６）の組成 多ｆｆｉ要素 Ｎ＋１４ＮＯ３ Ｃ，ａｃｔ　　　　　−２１１２０ ＭｑＳｏ　　・７１１２０ Ｎ０３ Ｋ　ト１２　　Ｐ　Ｏ４ 機番要素 ０Ｃ１２ ＣｕＳＯ−５１２０ Ｆｅ５０　　　　−７　１１２　０ Ｎａ２−ＥＤＴＡ ＭｎＳＯ４・４０２０ ｌ Ｎａ２Ｍ０Ｏ４ ＺｎＳＯ−７０，Ｏ ３ＢＯ３ 他の要素 ニコチン酸 ヂアミン（ビタミンＢ１） アデニン ＋　浸透圧上昇剤（予備処Ｉ！Ｉ！培地）■１ ６５０ ４０ １０ ９００ ７０ ０２５ ０．０２５ ２７゜８ ３１．３ ２２．３ ０．８３ ０．２５ ０６ ６．２ 素含有基質（培養Ｍ） 上記のように得た平均的大きさが５５０μｍの魚雷型胚
の段階にあるにんじん体細胞胚は１３５９１”の蔗糖を
含有し、オーキシンを含まないベトリ佃の液体Ｈｕｒａ
Ｓｈｉｇｅ　ａ３よび５ｋＯＯ（ｌ予備処理培地に約１
００個の胚／１０ｄ培地の開で入れる。

これらの胚は１時＋２！］　２０℃で２００ルツクス照
明下で予備処理する。次にこれら１１１．８−の予備処
理培地を含有する冷Ｎ１管に移す。寒冷管は家庭用フリ
ーザーに入れ、これらの内容物を１℃／分の割合で一６
℃に冷却し、次に０．４℃／分の割合で一６℃から一２
０℃に冷却する。

−２０℃で２４時間後、冷却管は２群に分離する。第１
群は２分間４０℃の水浴中に凍結冷却管を浸漬すること
により解凍する。第２群は一１９６℃の液体窒素に浸漬
し、そこで１時間保持してから第１群と同じ方法で解凍
する。

全体の解凍後、胚は洗滌して予備処理培地を除き、５３
Ｆ　Ｉｌ−１１Ａを含有し、オーキシンを含まない液体
ＨｕｒａＳｈｉＱｅおよび５ｋＯＯ（ｌ培！１基に１０
日問置く。次にこれらは同じ組成を有ケる固体培ａ基に
移す。

予備処理又は凍結しなかった対照胚は同じ培養基に置く
。

固体培地で１０日培養後、にｌυじん苗を再生刀る胚の
能力を比較する。

対照胚のうち、４６％は苗を再生できる。−２０℃およ
び−１９６℃に凍結した胚では、再生割合はそれぞれ４
４％および４３％である。

苗を再生する胚の能力は予備処理することを条件として
凍結により彰胃を受けない。

毀１ ＤａｌｌＣｔｌＳ　ＣａｒＯｔａ　Ｌ、にんじん体ｌｆ
Ｉ胞訃の２詳を選択する。

１群は平均的大きさ３００μ卯を有する心臓３ＩＪ胚段
階の胚から成り、もう１つの群は平均的大ぎさ５００μ
風を有する魚雷５°Ｊ胚段階の胚から成る。

約１００個の胚を含有する各５試料（Ａ、Ｂ。

Ｃ，Ｄおよび対照）を胚の各群から採取する。

心臓型胚段階の胚の試料Ａｈ、Ｂｈおよびｃｈおよび魚
雷型胚段階の胚の試料Ａｔ、Ｂ仁およｃｔは１３５　！
７　！　−’蔗糖を含有するＮｕｒａｓｈｉｇｃヨヒ５
ｋｏｏ（１１ＢａＭテ１　ＲＦｊ、２０℃で２ｏｏルク
ス照明下で予備処理Ｊ゛る。

次に試ＦＩＡｈ、ｎｈ、ＡｔおよびＦ３ｔは約０．５℃
／分の割合で一２０℃に冷却する。次これらは一２０℃
に２４時間保持する。試料ＡおよびＡｔは解凍し、一方
試料ＢｈおよびＢｔ−１９６℃の液体窒素に浸漬し、そ
こで解凍前時間保持する。

比較するため、試料ｃｈおよびＣｔは予備処Ｊ後−１９
６℃の液体′ｉＭ素にＩ７Ｊ′接浸漬する。比較するた
め、試１４ｏ１”ｌＦ３よびＤｔは予備処理せずにＩＯ
，５℃／分の割合で一２０℃に冷却する。こ才らは２４
時間後解凍する。

心Ｎ型胚および魚雷型胚試料は″Ｐ備処理も原本もしな
い。

次に各種胚試料を５９１　”１蔗糖を含有するＨｕｒａ
ｓｈｉｇｅ　ｌよび５ｋＯＯＱ　’ａ体培地に再培養す
る。

１０日ｕ！ｉ養後、次の結果を得る： 胚の生作能力の割合（％） 試料 比較 予備処理を行なわないと、−２０’Ｃの凍結胚（０）は
生存しないが、予備処Ｐ！！培地に１時間含浸すると一
２０℃に凍結した心臓型胚および魚雷型胚段階のほとん
どすべての肝（Ａ＞の生存が確保される。同様に、液体
窒素に直接浸油した胚は１時間予備処理後でさえ生存し
ない（Ｃ）。

予備処理し、−２０℃に速結後−１９６℃に凍結した胚
（８）は非常に満足できる生存能力′Ａ１１合を有する
。

従って、胚を一１９６℃で貯蔵したい場合、これらは予
備ＩＩＢ理し、−２０℃に凍結４”る段階を経な番ブれ
ばならない。

次に胚は液体培地と同じｌｆｌ成を有する固体培地に入
れる。

１０日Ｉ８養後、試ＦＩＡおよびＢ、および対照試料の
胚の大部分は明白な分化根ｎＩおよびクロロフィルイ菓
頂点をｆする苗段階に発生した。

これらの肝はカルス形成又は第２胚形成の徴候を全く示
さない。

１４３ 心臓型胚段帛および魚ｆｆｌ型胚段階のにんじん体１１
ｆ　ＬＪ　２００　ルッ’）　ス照ＩＱ　下テ２０　’
Ｃ”Ｃ−各種１ｆｌ閤１３５　！Ｊ　１　”１Ｍ糖を含
有するＨｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ液体Ｊ８ａ
基で予備処理する。

次にこれらの胚は約０．５℃／分の割合で一２０℃に冷
却する。−２０℃で２４時間後、いくつかの胚は液体窒
素に浸漬し、１時間保持する。

解凍後、胚（よ５９１　”の蔗糖を含有するＨｕｒａｓ
ｈｉｇｅおよび５ｋｏｏａ液体培地上に冑く。

予＃！処理又は凍結しなかった対照胚も培養する胚の生
存能力割合は１０日培！ｌ後測定する。

次の結果を得る： 心臓型胚段階の胚の生存能力割合（％〉対照胚は９０％
の生存能１１割合を右する。

魚雷型胚段階の胚の生存能力割合、（％）対照胚１より
１％の生存能力割合を有する。

１０日ｊＦ養後生存能力割合は心Ｍ型胚段階ｉｓよび魚
雷型胚段階の双方の胚に対し３０分、１ａｌｌｖ間又は
２４時間の予備処］！Ｉ！時間では実際上同一であるこ
とがわかる。

対照的に、２４時間を超えると、生存能カ割ｔは予備処
理時間の増加につれて徐々に但十する。

この割合【よ７２時間の予備処理時間後約３５％ε下に
なる。従って、凍結に対づる胚の耐性は長Ｗ間の予備処
理の場合減少する。

姓１ 魚雷型胚段階のにんじん体細胞胚は１３５グ１−１の蔗
糖を含有するＨｕｒａｓｈｉｇｃおよびＳｋｏｏｇ液体
培地で２００ルツクス照明■で２０’Ｃで各種時間予備
処理する。

これらの胚ｌよ冷ｕ１シ、約０．５℃／分の９１合で一
２０℃に凍結する。

一２０℃で７２時間後、胚は解凍し、５ｇ１〜１の蔗糖
を含有するＨｕｒａｓｈｉｇｅおよび５ｋＯＱ（ｌ液体
培養塁に入れる。

予備処理又は凍結しなかった対照胚も培養する胚の生存
能力割合は１０ＢＩ５ｉ培養後測定する。

次の結果を得る： 予備処＠！Ｒ１ｍ　（分）　　１　１５　３０　４５　
６０生存能力削合（％）８６　８５　７３　６８　８３
　８０２０℃に凍結後、胚の生存能力割合はこれらのす
べての予備処理時間で良好であることがわかる。凍結に
対する胚の安定例は非常に急速に得られる。

例５ ５５０μ扉の平均的大きさを有する魚雷夕１胚段階のに
んじん体ｍ胞胚を予備処理し、−２０℃に凍結する。次
にいくつかの胚は例１記載の方法により液体窒素中に浸
漬する。

胚はこれらの温度で各種時間貯蔵する。次にこれらをＷ
凍し、５　ｇＩ−’のグルコースを含有するＨｔｌｒａ
Ｓｈｉ（１０および５ｋｏｏＯ液体培地に入れる。胚の
生存能力割合は一２０℃又は−１９６℃でこれらの貯蔵
時間のＩＩ数として測定する。

予備処理又は？＠結しなかった対照胚は７２％の生存能
力割合を有する。

次の結果を得るニ −２０℃に凍結した胚の場合： 貯Ｒ時間　　　　　　２４　　　１ケ　　　２ケ月生存
能力割合（％）　　　６１１　　　６９　　　０１９６
℃に凍結した胚の場合： 貯ａ時　　　　　　　　２４　　間　　１ケ月　　２ケ
月生存能力割合（％）　　　６６　　　６７　　　６７
−２０℃又は−１９６℃に凍結後平均生存能力割合は１
日以下の貯ＮＩ時１８１では約６７％である。

この割合は一２０’Ｃ又は−１９６℃で１ケ月貯蔵後も
変らない。２ケ月貯蔵後、−２０’Ｃで貯蔵した胚のう
ちには生存はないが・、−１９６℃で貯蔵した胚では生
存能力割合（よ尚変らない。

Ｋ１ ５００μ屏の平均的大きさを有する魚雷ｆｉｌｌ肝段１ Ｍ（１）ニ１ｖＵｋＡ／ｌｊｆＰｆＡｉ３５ｇ１　〜２
０５’ＪＪｌ−１６）ａｔｓｒＪ度を含有するＨｕｒａ
ｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ液体培地で２００ルツクス
照明下で１時間２０”Ｃで予備処理する。

次に胚４よ冷却し、−２０”Ｃに凍結ηる。−２０℃で
１時間後、胚は解凍し、５ｇＩ　　蔗糖を含有するＨｕ
ｒａｓｈ＋ｇｅおよびＳｋｏｏｇ液体培地に入れる。

予備処理又は諌結しなかった対照胚も培養する。

胚の生存能力割合は予備処理培地の蔗糖濃度の１廁数と
して１０日培養後脚１足する。

次の結果を得る： 生存能力割合（Ｘ）　２２　４１　７７　８２　６５　
１４　８８１３５　ｇＩ　”の蔗糖を含１−Ｊする培地
で予備処理した胚の生存能力割合（よ対照胚のものに匹
敵でさる。

この割合は１００又は１７０！？ｊ！”の蔗１１濃度で
は尚かなり高い。

胚の生存能力は蔗ｇＩｉｍ度が高すぎるが（２ｏ５１ ’１１　　’）又は低すぎる（３５ｇ１　　＞場合影響
を受ける。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）胚を浸透圧上昇剤を含有する培地で予備処理し、
   予備処理後冷却し、−１５〜−４０℃の範囲の温度に凍
   結することを特徴とする、植物胚の貯蔵方法。
2. （２）浸透圧上昇剤は蔗糖である、請求項１記載の方法
   。
3. （３）予備処理培地は７５〜１９０ｇｌ＾−＾１の濃度
   の蔗糖を含有する、請求項２記載の方法。
4. （４）−１５／−４０℃に凍結した胚は液体冷媒に浸漬
   する、請求項１記載の方法。
5. （５）予備処理は３０秒〜３６時間行なう、請求項１記
   載の方法。
6. （６）−６〜−４０℃問の冷却速度は０．１〜１℃／分
   である、請求項１記載の方法。
7. （７）予備処理培地は浸透圧上昇剤を添加したＨｕｒａ
   ｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地である、請求項１記載
   の方法。
8. （８）凍結胚を解凍し、洗滌して予備処理培地を除去し
   、洗滌胚を培地で培養して苗に発育させることを特徴と
   する、苗の生産に請求項１記載の方法の適用。
9. （９）凍結胚を人工又は天然ポリマーにカプセル化する
   ことを特徴とする、人工種子の生産に請求項１記載の方
   法の適用。
10. （１０）請求項９により得た人工種子。