JPH0339592B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は液体クロマトグラフ法に関する。 従来、液体クロマトグラフ法によつて糖類を分
析する方法としては、(1)アミノ基等を化学結合し
た充てん剤（例えばジエチルアミノエチルセルロ
ース等）を用いた分配型の分離、(2)架橋デキスト
ランゲル等を用いた分子ふるいによる分離、(3)陰
イオン交換樹脂を用いたホウ酸錯イオンとしての
分離、(4)塩型陽イオン交換樹脂をカラム充てん剤
として用いた分子ふるいと分配の折衷モードによ
る分離などが知られている。これらのうち(2)およ
び(4)の方法は溶離液として水を使用するため操作
が容易である。 しかし、上記(2)の方法では、同一分子量の異な
る糖の分離は不可能である。これに対し、上記(4)
の方法では可能である。 しかし、本発明者らが上記(4)の方法についてさ
らに検討をした結果、水を溶離液として使用した
場合、長時間の使用により、分離能が低下するこ
とがわかつた。すなわち、上記(4)の方法におい
て、水を溶離液とした場合、カラム充てん剤の寿
命が短いという欠点があつた。 本発明は、このような問題点を解決するもので
ある。 すなわち、本発明は、SO^- ₃基およびその対イオ
ンとして二価の金属陽イオンを有する多孔性スチ
レン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子をカラム
充てん剤として使用し糖を分析する液体クロマト
グラフ法において、溶離液として、アルカリ性物
質濃度が５×10^-5〜10^-2M／の水溶液を使用す
ることを特徴とする糖を分析する液体クロマトグ
ラフ法に関する。 本発明のカラム充てん剤は、SO^- ₃基の対イオン
として、Ca⁺⁺、Sr⁺⁺、Pb⁺⁺、Ba⁺⁺、Mg⁺⁺等の
二価の金属陽イオンを有する。 特に、対イオンとして (a) Ca⁺⁺およびSr⁺⁺からなる群から選ばれた少
なくとも一種のイオン 並びに (b) Pb⁺⁺およびBa⁺⁺からなる群から選ばれた少
なくとも一種のイオン を(a)のイオンと(b)のイオンの当量比が(a)／(b)で
１／２〜２／１の割合で有することが好ましい。
この場合、分子量が同一であるグルコース、ガラ
クトース、マンノースおよびフルクトースを分離
することができる。 また、Ca⁺⁺またはSr⁺⁺を対イオンとした場合、
グルコース、マンノースおよびフルクトースを分
離することができ、Pd⁺⁺またはBa⁺⁺を対イオン
としたときは、グルコース、ガラクトースおよび
マンノースを分離することができる。 本発明におけるカラム充てん剤はSO^- ₃基をカラ
ム充てん剤１ｇ当り２ミリ当量（meq／ｇ）以上
有するのが好ましく、特に３〜5meq／ｇ有する
のが好ましい。2meq／ｇ未満になると親水性が
不充分となる傾向がある。 また、本発明のカラム充てん剤の粒子径は、液
体クロマトグラフイー分析用としては１〜20μｍ
および液体クロマトグラフイーによる分取用とし
ては20〜300μｍであるものが好ましい。 また、本発明のカラム充てん剤の細孔の程度に
特に制限はないが、排除限界が400〜１×10⁷の範
囲になるようにするのが好ましい。 上記したSO^- ₃基は、スチレン−ジビニルベンゼ
ン系共重合体に結合しているが、該共重合体は、
ジビニルベンゼンとスチレン系単量体の共重合体
であり、ジビニルベンゼンを５〜60重量％含むの
が好ましい。該スチレン系単量体としてはスチレ
ン、エチルモノビニルベンゼン、ビニルトルエ
ン、α−Me−スチレン等があり、酢酸ビニル、
メタアクリル酸、アクリル酸等の他のモノマーを
５重量％以下の範囲で使用してもよい。 本発明のカラム充てん剤は、スルホン化多孔性
スチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子と一
般式（） Ｍ（OH）₂ （） （ただし、式中、Ｍは二価の陽イオンに成り得る
金属である）で表わされる水酸化物を反応させて
得ることができる。上記ＭとしてはCa、St、Pd、
Ba、Mg等がある。 さらに詳しくは、上記水酸化物を溶解した水溶
液とスルホン化多孔性スチレン−ジビニルベンゼ
ン系共重合体粒子またはその塩を混合し、ロ過
し、さらに同様の操作を繰り返えして得ることが
できる。また、スルホン化多孔性スチレン−ジビ
ニルベンゼン系共重合体粒子またはその塩をカラ
ムに充てんするかロート上において、これに上記
と同様の水溶液を通液する方法により得ることが
できる。この場合、スルホン化多孔性スチレン−
ジビニルベンゼン系共重合体粒子中のSO^- ₃基に対
し、上記水酸化物の金属の陽イオンが等当量以上
になるように使用するのが好ましい。 スルホン化多孔性スチレン−ジビニルベンゼン
系共重合体粒子は、従来公知の方法で製造され
る。例えば、ジビニルベンゼンおよびスチレン系
単量体、さらに場合により他のモノマーをアミル
アルコール、トルエン等の非水溶性有基溶剤の存
在下に懸濁重合させ、得られる粒子を単離してジ
クロルエタン、トリクロルエタン等の膨潤剤で膨
潤させ、濃硫酸またはクロル硫酸等を添加し、室
温〜120℃でスルホン化反応させることにより得
ることができる。上記したイオン交換容量は、濃
硫酸またはクロル硫酸との反応時に、その反応条
件を適宜調整することにより調整することがで
き、本発明におけるカラム充てん剤の細孔の程度
は、上記懸濁重合時に、その条件、主に排水溶性
有機溶剤の種類および量を調整することにより調
整することができ、粒径は懸濁重合条件を適宜選
択して調整できる。 また、上記スルホン化多孔性スチレン−ジビニ
ルベンゼン系共重合体は、イオン交換容量が
2meq／ｇ以上のものが好ましく、特に３〜
5meq／ｇのものが好ましい。 また、本発明のカラム充てん剤は、SO^- ₃基を有
する多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系共重合
体粒子の各々が、SO^- ₃基の対イオンとして上記(a)
のイオンおよび(b)のイオンを有しているのが分離
性能の点で好ましいが、次のようなものでもよ
い。すなわち、 SO^- ₃基およびその対イオンとしてCa⁺⁺または
Sr⁺⁺（(a)のイオン）を有してなる多孔性スチレン
−ジビニルベンゼン系共重合体粒子(A) 並びに SO^- ₃基およびその対イオンとしてPb⁺⁺または
Ba⁺⁺（(b)のイオン）を有してなる多孔性スチレン
−ジビニルベンゼン系共重合体粒子(B) を(a)のイオンと(b)のイオンが(a)／(b)（当量比）で
１／２〜２／１になるように配合したものを本発
明のカラム充てん剤として使用できる。 共重合体粒子(A)および(B)はできるだけ均一に混
合されるのが好ましく、各共重合体粒子の粒子
径、細孔の程度、膨潤度およびSO^- ₃基の含有量が
同等のものを使用するのが好ましい。このため
に、共重合体粒子(A)および(B)は、同一ロツトのス
ルホン化多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系共
重合体粒子を使用し、上記したのと同様な方法で
中和するのが好ましい。このような共重合体粒子
(A)および(B)を使用する場合、それらは体積比で
(A)／(B)が１／２〜２／１になるように配合すれば
よく、混合操作が容易になる。 本発明のカラム充てん剤において、(a)のイオン
と(b)のイオンを対イオンとして有する場合、SO^- ₃
基を有する多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系
共重合体粒子の各々の粒子に(a)および(b)のイオン
が均一に分布して存在するのが最も好ましい。こ
のためには、カラム充てん剤はスルホン化多孔性
スチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子を (c) Ca（OH）₂およびSr（OH）₂からなる群から選
ばれた少なくとも一種の化合物 並びに (d) Pb（OH）₂およびSr（OH）₂からなる群から選
ばれた少なくとも一種の化合物 を(c)／(d)がモル比で１／２〜２／１の割合で溶解
されてなる水溶液で中和される。 本発明に使用される溶離液は、アルカリ性物質
の水溶液である。アルカリ性物質とは、アルカリ
金属、アルカリ土類金属等の水酸化物、炭酸水素
塩、炭酸塩等の水溶液としたときにアルカリ性を
示すものであり、具体的には、LiOH、NaOH、
KOH、Sr（OH）₂、Ba（OH）₂、NaHCO₃、
KHCO₃、NA₂CO₃、K₂CO₃等がある。これらの
アルカリ性物質は、５×10^-5〜10^-2M／の濃度
で使用される。濃度が５×10^-5未満では、カラム
充てん剤の寿命が短くなり、10^-2M／を越える
とカラム充てん剤の対イオンとのイオン交換が無
視できなくなり、分離能が変化する。 本発明のカラム充てん剤として、スルホン化多
孔性スチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子
またはその塩と上記一般式（）で表わされる水
酸化物を反応させて得られるものを使用したとき
に、寿命の問題が特に顕著である。 本発明のカラム充てん剤は、スルホン化多孔性
スチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子と
MCl₂、MBr₂（ここで、Ｍは一般式（）の場合
と同様である）等のハロゲン化金属を反応させて
得ることができるが、この場合は、上記の水酸化
物を使用したとき程、寿命の問題は顕著でない
が、本発明の溶離液を使用するのが好ましい。 本発明に係る液体クロマトグラフ法は、サンプ
ル注入口より試料を注入し、上記カラム充てん剤
を充てんしたカラム内を上記溶離液を通液しつつ
通過させ、通過物を検知器により検知させて、ク
ロマトグラムを書かせる高速液体クロマトグラフ
イー分析、カラム充てん剤を充てんしたカラム内
に試料を通過させ、分画毎に採取する分取等に適
用される。 次に、本発明の実施例を示す。 実施例 １ 粒径８〜15μｍ、イオン交換容量4.3meq／ｇお
よび架橋度（共重合体中のジビニルベンゼン成分
の重合割合、以下同様）10％であるスルホン化多
孔性スチレン−エチルモノビニルベンゼン−ジビ
ニルベンゼン共重合体粒子24.0ｇを約150ｇの水
に膨潤させてスラリー状とし、これにSr
（OH）₂・8H₂O13.7ｇを水に溶解させて500mlとし
た水溶液を混合し、１時間撹拌した。なお、スル
ホン基とSr⁺⁺が当量比１／１になるように配合
した。この後、ロ過水洗し、排除限界1000のカラ
ム充てん剤を得た。得られたカラム充てん剤を水
で膨潤させスラリー状にして10.7mmφ×30cmのス
テンレス製カラムに充てんし、これを高速液体ク
ロマトグラフイー用分析装置にセツトし、ラフイ
ノース、マルトース、グルコース、ガラクトー
ス、マンノースおよびフルクトースを含有する試
料（試料）を分析に供した。分析条件は、流量
1.0ml／分、溶離液は10^-4M／NaOH水溶液お
よびカラム温度60℃とし、検知器は示差屈折計を
用いて、クロマトグラムを得た。なお、溶離液は
連続して通液した。 溶離液の通液開始直後にサンプリングして得ら
れたクロマトグラムを第１図に、３時間後にサン
プリングして得られたクロマトグラムを第２図
に、理論段数の経時変化を表１に示す。第１図お
よび第２図において、ピーク１はラフイノース、
ピーク２はマルトース、ピーク３はグルコース、
ピース４はガラクトース、ピーク５はマンノース
およびピーク６はフルクトースである。ピークの
形状、分離性に変化はみられず、表１において、
理論段数の低下はみられないことがわかる。 実施例 ２ 実施例１において、Sr（OH）₂・8H₂O13.7ｇの
代わりにBa（OH）₂・8H₂O16.2ｇを使用した以外
は実施例１と同様にして、排除限界1000のカラム
充てん剤を得た。なお、ここで、スルホン基と
Ba⁺⁺が当量比で１／１になるように配合された。
この後、実施例１と同様にして、カラムに充てん
し、高速液体クロマトグラフイーによる分析を行
なつた。 溶離液の通液開始直後にサンプリングして得ら
れたクロマトグラムを第３図に、３時間後にサン
プリングして得られたクロマトグラムを第４図
に、理論段数の経時変化を表１に示す。第３図お
よび第４図において各ピーク名は実施例１と同じ
である。ピークの形状、分離性に変化はみられ
ず、表１において理論段数の低下はみられないこ
とがわかる。 実施例 ３ 実施例１において、Sr（OH）₂・8H₂O13.7ｇの
代わりに、Sr（OH）₂・8H₂O6.9ｇおよびBa
（OH）₂8.1ｇを使用したこと以外実施例１と同様
にして、カラム充てん剤を製造した。なお、ここ
で、Sr⁺⁺およびBa⁺⁺の総量とスルホン基が当量
比で１／１になるようにおよびSr⁺⁺とBa⁺⁺の当
量比も１／１になるように使用した。この後、実
施例１と同様にして、カラムに充てんし、高速液
体クロマトグラフイーによる分析を行なつた。分
析用試料は試料とマンノース、アラビノースお
よびフルクトースを含有する試料（試料）を分
析に供した。 試料についての溶離液の通液開始直後にサン
プリングして得られたクロマトグラムを第５図
に、３時間後にサンプリングして得られたクロマ
トグラムを第６図に、また、試料について同様
に第７図および第８図にクロマトグラムを示す。
また、理論段数の経時変化を表１に示す。 第５図および第６図において、各ピークは実施
例１と同じである。第７図および第８図におい
て、ピーク７はマンノース、ピーク８はアラビノ
ースおよびピーク９はフルクトースである。経過
時間によりピークの形状、分離性に変化はみられ
ず、表１において、理論段数の低下はみられない
ことがわかる。 比較例 １ 実施例１と同様にしてカラム充てん剤を製造し
た。この後、実施例１と同様にして、カラムに充
てんし、実施例１と同様にして高速液体クロマト
グラフイーによる分析を行なつた。分析条件は、
流量1.0ml／分、溶離液は水およびカラム温度60
℃とし、検知器は示差屈折計を用いてクロマトグ
ラムを得た。溶離液の通液開始後３時間目にサン
プリングして得られたクロマトグラムを第９図
に、理論段数の経時変化を表１に示す。 第９図において、各ピークは実施例１と同じで
ある。ピーク４のガラクトースとピーク５のマン
ノースの分離性が悪くなつていること、表１にお
いて、理論段数が３時間後で約25％低下している
ことがわかる。 比較例 ２ 実施例２と同様にしてカラム充てん剤を製造し
た。この後、実施例１と同様にして、カラムに充
てんし、比較例１と同様の分析条件により液体ク
ロマトグラフイーの分析を行なつた。 溶離液の通液開始後、３時間目にサンプリング
して得られたクロマトグラムを第１０図に、理論
段数の経時変化を表１に示す。第１０図におい
て、各ピークは実施例１と同じである。ピーク形
状がブロードとなり、ピーク５のマンノースとピ
ーク６のフルクトースの分離性が著しく悪くなつ
ていること、表１において、理論段数が３時間後
で約45％低下していることがわかる。 比較例 ３ 実施例３と同様にしてカラム充てん剤を製造し
た。この後、実施例１と同様にして、カラムに充
てんし、比較例１と同様の分析条件により液体ク
ロマトグラフイーの分析を行なつた。 分析用試料は試料と試料を分析に供した。
試料について溶離液の通液開始後３時間目にサ
ンプリングして得られたクロマトグラムを第１１
図に、試料について同様に第１２図に示す。ま
た、理論段数の経時変化を表１に示す。第１１図
において、各ピークは実施例１と同じであり、第
１２図において各ピークは実施例３と同じであ
る。経過時間により、ピーク形状がブロードとな
り、分離性が悪くなること、特に試料について
は、分離性が著しく悪くなることがわかる。表１
において、理論段数が３時間後で約50％低下して
いることがわかる。

【表】 ＊ 対イオンの原料
注）理論段数は通液開始後一定時間後にフルクト
ースをサンプリングし、得られたクロマトグラ
ムのフルクトースのピークを用いて次式により
算出した。 Ｎ＝5.54×（t_R／Ｗ）² （但し、t_Rは試料注入点からピーク頂点までの
長さ（mm） Ｗはピークの半値幅（mm）） なお、以上の分析に用いた装置の模式図を第１
３図に示す。溶離液が容器１０に蓄えられ、溶離
液はポンプ１１によりパイプ１２を通して、カラ
ム１３および検知器１４を通して容器１５に廃液
される。試料は、注入口１６（例えば三方コツ
ク）より導入され、検知器１４にはクロマトグラ
ムの記録計１７が連結される。 以上より明らかなように、SO^- ₃基およびその対
イオンとして二価の金属陽イオンを有する多孔性
スチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子をカ
ラム充てん剤として使用するとき、本発明に係る
液体クロマトグラフ法によれば、該カラム充てん
剤の寿命を長くすることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、各々実施例１におい
て、溶離液の通液開始直後および３時間後にサン
プリングして得られたクロマトグラム、第３図お
よび第４図は、各々実施例２における実施例１と
同様の結果を示すクロマトグラム、第５図および
第６図は、各々実施例３において、試料（）を
使用したときの実施例１と同様の結果を示すクロ
マトグラム、第７図および第８図は、各々実施例
３において、試料（）を使用したときの実施例
１と同様の結果を示すクロマトグラム、第９図は
比較例１の結果を示すクロマトグラム、第１０図
は比較例２の結果を示すクロマトグラム、第１１
図および第１２図は比較例３において、実施例１
と同様の結果を示すクロマトグラム並びに第１３
図は、実施例および比較例で用いた分析装置の模
式図を示す。 符号の説明、１……ラフイノースのピーク、２
……マルトースのピーク、３……グルコースのピ
ーク、４……ガラクトースのピーク、５……マン
ノースのピーク、６……フルクトースのピーク、
７……マンノースのピーク、８……アラビノース
のピーク、９……フルクトースのピーク。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ SO^- ₃基およびその対イオンとして二価の金属
   陽イオンを有する多孔性スチレン−ジビニルベン
   ゼン系共重合体粒子をカラム充てん剤として使用
   し糖を分析する液体クロマトグラフ法において、
   溶離液として、アルカリ性物質濃度が５×10^-5〜
   10^-2M／の水溶液を使用することを特徴とする
   糖を分析する液体クロマトグラフ法。 ２ カラム充てん剤が、スルホン化多孔性スチレ
   ン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子またはその
   塩と一般式（） Ｍ（OH）₂ （） （ただし、式中、Ｍは二価の陽イオンに成り得る
   金属である）で表わされる水酸化物を反応させて
   得られるものである特許請求の範囲第１項記載の
   糖を分析する液体クロマトグラフ法。