JPH0341094A - Ｄｎａポリメラーゼに対する選択的阻害 - Google Patents
Ｄｎａポリメラーゼに対する選択的阻害Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ＡＰＧＤＥＰＡＰＰＹおよびＡＧＡＴＡＥＥ
ＴＲＹのアミノ酸配列を有し、それらに対する抗体の生
成に用いうる２つのペプチド、Ｐ６およびＰ７に関する
。それらの抗体はＨＳＶ１およびＨＳＶ−２のＤＮＡポ
リメラーゼを特異的に中和することができ、したがって
、本発明は該抗体を用いてＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２
ポリメラーゼの阻害因子のスクリーニング法も提供する
ものである。
ＴＲＹのアミノ酸配列を有し、それらに対する抗体の生
成に用いうる２つのペプチド、Ｐ６およびＰ７に関する
。それらの抗体はＨＳＶ１およびＨＳＶ−２のＤＮＡポ
リメラーゼを特異的に中和することができ、したがって
、本発明は該抗体を用いてＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２
ポリメラーゼの阻害因子のスクリーニング法も提供する
ものである。
発明の構成と効果
本発明は、単純ヘルペスウィルスｌ型（Ｈ９ＶＩ）の２
つの特異的カルボキシ末端ペプチド（１１００〜１１０
８残基および１２１６〜１２２４残基）に対する抗血清
が、ＨＳＶ−１および単純ヘルペスウィルス２型（ＨＳ
Ｖ−２）のＤ Ｎ Ａポリメラーゼの活性を特異的に中
和することかできること、またこれらのペプチド配列は
ｌ（Ｓ Ｖに特有であり、他のヘルペスウィルスまたは
真核生物のポリメラーゼにはないとの知見にもとづいて
なされたものであり、それらに対する抗体の土岐に用い
うる、ＡＰＧＤＥＰＡＰＰＹおよびＡＧＡＴＡＥＥＴＲ
Ｙのアミノ酸配列を有する２つのペプチド、Ｐ６および
Ｐ７を提供するものである。それらの抗体は）（ＳＶ−
１およびＨＳＶ−２のＤＮＡポリメラーゼを特異的に中
和することができ、該抗体を利用してＨＳＶ−１お上び
ＨＳ Ｖ −２のポリメラーゼの阻害因子をスクリーニ
ングすることができる。
つの特異的カルボキシ末端ペプチド（１１００〜１１０
８残基および１２１６〜１２２４残基）に対する抗血清
が、ＨＳＶ−１および単純ヘルペスウィルス２型（ＨＳ
Ｖ−２）のＤ Ｎ Ａポリメラーゼの活性を特異的に中
和することかできること、またこれらのペプチド配列は
ｌ（Ｓ Ｖに特有であり、他のヘルペスウィルスまたは
真核生物のポリメラーゼにはないとの知見にもとづいて
なされたものであり、それらに対する抗体の土岐に用い
うる、ＡＰＧＤＥＰＡＰＰＹおよびＡＧＡＴＡＥＥＴＲ
Ｙのアミノ酸配列を有する２つのペプチド、Ｐ６および
Ｐ７を提供するものである。それらの抗体は）（ＳＶ−
１およびＨＳＶ−２のＤＮＡポリメラーゼを特異的に中
和することができ、該抗体を利用してＨＳＶ−１お上び
ＨＳ Ｖ −２のポリメラーゼの阻害因子をスクリーニ
ングすることができる。
単純ヘルペスウィルスｌ型（ＨＳＶ−ＩＸＫＯ３種）お
よびＨＳＶ−２（１８６種）のＤＮＡポリメラーゼのポ
リペプチドに存在するアミノ酸配列に対応する種々の合
成ペプチドを、特定の特異性を持つウサギのポリクロー
ン抗血清の生産に用いた。該ペプチドを公知のＨＳ Ｖ
ポリメラーゼ配列に基づいて同定した［ギップス（Ｇ
１ｂｂｓ）、 Ｊ 、 Ｓ 。
よびＨＳＶ−２（１８６種）のＤＮＡポリメラーゼのポ
リペプチドに存在するアミノ酸配列に対応する種々の合
成ペプチドを、特定の特異性を持つウサギのポリクロー
ン抗血清の生産に用いた。該ペプチドを公知のＨＳ Ｖ
ポリメラーゼ配列に基づいて同定した［ギップス（Ｇ
１ｂｂｓ）、 Ｊ 、 Ｓ 。
らの「Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
Ｊ、８２．７９６９〜７９７３頁、１９８５年）、ノ
ツプ（Ｋｎｏｐ「）。
Ｊ、８２．７９６９〜７９７３頁、１９８５年）、ノ
ツプ（Ｋｎｏｐ「）。
Ｃ，Ｗ、 らのｒＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ
、Ｊ、 Ｉ ４．８２２５〜８２２６頁、１９８６年、
ラーダー（Ｌａｒｄｅｒ）、Ｂ、 Ａ、 らのｒＥＭ
Ｂｏ ＪＪ、６，１６９〜１７５頁、１９８７年、キ
ン（Ｑｕｉｎｎ）、 Ｊ 、 Ｐ らのｒＮｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 Ｊ、ｌ ３．８１４３
〜８１６３頁、１９８５年、およびツルミ（Ｔ ｓｕｒ
ｕｍｉ）、 ＴらのｒＧｅｎｅＪ、５２．Ｉ ２９−１
３７頁、１９８７年に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ポ
リメラーゼのオーブンリーディングフレームの長さは、
それぞれ１２３５と１２４０アミノ酸であると記載され
ている］。ペプチドは、（１）ヘルペスウィルス特異性
、（２）株保有性、および（３）相対的現水性などのい
くつかの判定基準に基づいて選択した。３つのペプチド
を検討し、それらのうちの２つのペプチド（Ｐ６および
Ｐ７と命名した）はＩ−ｔ Ｓ Ｖ−１の配列に由来の
アミノ酸残基１１００〜１１０８および１２１６〜１２
２４を有し、ＨＳＶ−Ｉ ＤＮＡポリメラーゼの活性を
用量依Ｕ的に中和することができる抗血清を製造するこ
とを見出たした。
、Ｊ、 Ｉ ４．８２２５〜８２２６頁、１９８６年、
ラーダー（Ｌａｒｄｅｒ）、Ｂ、 Ａ、 らのｒＥＭ
Ｂｏ ＪＪ、６，１６９〜１７５頁、１９８７年、キ
ン（Ｑｕｉｎｎ）、 Ｊ 、 Ｐ らのｒＮｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 Ｊ、ｌ ３．８１４３
〜８１６３頁、１９８５年、およびツルミ（Ｔ ｓｕｒ
ｕｍｉ）、 ＴらのｒＧｅｎｅＪ、５２．Ｉ ２９−１
３７頁、１９８７年に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ポ
リメラーゼのオーブンリーディングフレームの長さは、
それぞれ１２３５と１２４０アミノ酸であると記載され
ている］。ペプチドは、（１）ヘルペスウィルス特異性
、（２）株保有性、および（３）相対的現水性などのい
くつかの判定基準に基づいて選択した。３つのペプチド
を検討し、それらのうちの２つのペプチド（Ｐ６および
Ｐ７と命名した）はＩ−ｔ Ｓ Ｖ−１の配列に由来の
アミノ酸残基１１００〜１１０８および１２１６〜１２
２４を有し、ＨＳＶ−Ｉ ＤＮＡポリメラーゼの活性を
用量依Ｕ的に中和することができる抗血清を製造するこ
とを見出たした。
これらの抗血清は、やや有効性は劣るが、ＨＳ Ｖ２ポ
リメラーゼも中和することができる。哺乳動物の内因性
アルファポリメラーゼ居住は、これらの抗体の阻害効果
に対して完全に感応しない。
リメラーゼも中和することができる。哺乳動物の内因性
アルファポリメラーゼ居住は、これらの抗体の阻害効果
に対して完全に感応しない。
一方、抗ベプチドカ価はＰ６およびＰ７抗直清に匹敵す
るにもかかわらず、ペプチドＰ３（残基５４８〜５５６
）に対応する抗血清は、免疫沈降できず、Ｈ９Ｖ−１ポ
リメラーゼ活性を中和することができない。
るにもかかわらず、ペプチドＰ３（残基５４８〜５５６
）に対応する抗血清は、免疫沈降できず、Ｈ９Ｖ−１ポ
リメラーゼ活性を中和することができない。
９個あるいはそれ以下の数のアミノ酸からなる２つの中
和部位の位置は、Ｈ９Ｖ−１およびＨ５Ｖ−２ＤＮＡポ
リメラーゼのカルボキシ末端領域に存在する。
和部位の位置は、Ｈ９Ｖ−１およびＨ５Ｖ−２ＤＮＡポ
リメラーゼのカルボキシ末端領域に存在する。
［抗ペプチド抗体の生産と特異性コ
抗ペプチド抗体の産生のために本研究に用いた３つのペ
プチド配列を下記表１に示す。
プチド配列を下記表１に示す。
表１
ＨＳＶＤＮＡポリメラーゼに対するペプチド抗体対照
配列１ 残基 同族 Ｈ５Ｖ−１ペプチド
ポリメラーゼ ０ ３ ＬＫＤＫＫＫＤＬＳＹ ５４８−５５６ ００００ ６ ＡＰＧＤＥＰＡＰＰＹ １１００−１１０８２０００ ０００ Ｐ７ ＡＧＡＴＡＥＥＴＲＹ１２１６−１２２４ １
２０００ ２０００１）１文字アミノ酸コードで
表記した。
ポリメラーゼ ０ ３ ＬＫＤＫＫＫＤＬＳＹ ５４８−５５６ ００００ ６ ＡＰＧＤＥＰＡＰＰＹ １１００−１１０８２０００ ０００ Ｐ７ ＡＧＡＴＡＥＥＴＲＹ１２１６−１２２４ １
２０００ ２０００１）１文字アミノ酸コードで
表記した。
Ｌ：ロイシン、Ｋ：リジン、Ｄ：アスパラギン酸塩、Ｓ
：セリン、Ｙ：チロシン、Ａ：アラニン、Ｐプロリン、
Ｇニゲリシン、Ｅ：グルタミン酸塩、Ｔ：スレオニン、
Ｒ：アルギニン。
：セリン、Ｙ：チロシン、Ａ：アラニン、Ｐプロリン、
Ｇニゲリシン、Ｅ：グルタミン酸塩、Ｔ：スレオニン、
Ｒ：アルギニン。
チロシン残基（Ｙ）はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と
チログロブリンの結合を促進するために加えられている
。結合を促進するために、適当な残基のどれでも用いる
ことができる。もし産生された抗体が、親ペプチドに対
抗して産生された抗体と同じ機能を持つならば、適当な
アミノ酸のどれとも置換することができる。
チログロブリンの結合を促進するために加えられている
。結合を促進するために、適当な残基のどれでも用いる
ことができる。もし産生された抗体が、親ペプチドに対
抗して産生された抗体と同じ機能を持つならば、適当な
アミノ酸のどれとも置換することができる。
’）ＥＬｒＳＡ定量での逆終点希釈による。
後記実施例２の記載に準じて、ペプチドをＢＳＡおよび
チログロブリンと結合させ、数箇月間ウサギに接種する
。この結合もまた他の適当な担体のどれとでも行なうこ
とがでＪｌあるいは本発明の具体例のいずれかにおいて
、ペプチドは担体と共有的に結合する必要はなく、むし
ろ単独で用いられるかまたは適当な免疫源に受動的に吸
収されうる。２匹のウサギに担体抗原単独で接種して、
超免疫対照血清を生産する。微量検定ウェルに直接吸着
させたペプチド（Ｉ ｕｇ）を用いたＥＬ Ｉ ＳＡに
より、得られる血清を抗ペプチド抗体のスクリニングに
付す。対応プレ免疫血清および超免疫血清（１：ｌＯＯ
希釈）よりも３〜４倍大きな信号としてＥＬＩＳＡの終
点を任意に定める。各々のペプチドに対して産生される
抗体力価を前記表１に示した。これらの抗血清は、！・
１００希釈における検定の際でも関係のないペプチドと
は反応しない。続いてこれらの抗体を、精製Ｈ９Ｖ（ｍ
Ｐ種）ＤＮＡポリメラーゼ（実施例７参照）をコートし
たｉ量検定ウェルを用いる一連のＥＬｒＳＡ検定に付す
（実施例３参照）。超免疫対照血清およびＰ３血清は、
この検定では無反応である。抗ペプチドＰ６血清および
Ｐ７血清は、両方とも表１の抗原に対して約１：１００
０〜Ｉ：２０００の力価を示す。これらの抗血清の特異
性をさらに説明するためにペプチド競合検定を行う。こ
れらの実験では、超免疫血清、抗ペプチド６および７直
清から精製した総てのｒｇＧを、対応ペプチドとともに
３０分間ブレインキュベートした後、ポリメラーゼコー
トウェルに添加する。単独で用いた場合に、感知しうる
信号（０，２５０〜０．３０００Ｄ、）の生成に充分な
量のＩｇＧをこの検定用に用いる。第１図において、総
ウサギＩｇＧ（約２．５μｇ）を、０．０１．０．ＩＳ
１．０およびＩ Ｏ，０μ９の対応ペプチドとともに
容ｆｆ１１００μ９にし、３０分間室温にてインキュベ
ートする。３０分後、反応物を精製Ｈ９Ｖポリメラーゼ
をコートした微量検定ウェルに添加し、活性残量をＥＬ
ＩＳＡ検定にて定量する。第「図に示すように、ＩｇＧ
を対応ペプチドとブレインキュベートすると、ペプチド
の量が増加するにつれてＥＬ Ｉ ＳＡ倍信号減少する
。図中、黒塗部はＰ６ｒｇＧとＰ６ベプチドを用いた結
果であり、白塗部はＰ７ＴｇＧ、！：Ｐ７ベプチドを用
いた結果である。Ｐ７と抗Ｐ６血清、またはＰ６とＰ７
血清を組み合わせてブレインキュベートしてもＥＬ Ｉ
ＳＡ倍信号減少は起こらない。
チログロブリンと結合させ、数箇月間ウサギに接種する
。この結合もまた他の適当な担体のどれとでも行なうこ
とがでＪｌあるいは本発明の具体例のいずれかにおいて
、ペプチドは担体と共有的に結合する必要はなく、むし
ろ単独で用いられるかまたは適当な免疫源に受動的に吸
収されうる。２匹のウサギに担体抗原単独で接種して、
超免疫対照血清を生産する。微量検定ウェルに直接吸着
させたペプチド（Ｉ ｕｇ）を用いたＥＬ Ｉ ＳＡに
より、得られる血清を抗ペプチド抗体のスクリニングに
付す。対応プレ免疫血清および超免疫血清（１：ｌＯＯ
希釈）よりも３〜４倍大きな信号としてＥＬＩＳＡの終
点を任意に定める。各々のペプチドに対して産生される
抗体力価を前記表１に示した。これらの抗血清は、！・
１００希釈における検定の際でも関係のないペプチドと
は反応しない。続いてこれらの抗体を、精製Ｈ９Ｖ（ｍ
Ｐ種）ＤＮＡポリメラーゼ（実施例７参照）をコートし
たｉ量検定ウェルを用いる一連のＥＬｒＳＡ検定に付す
（実施例３参照）。超免疫対照血清およびＰ３血清は、
この検定では無反応である。抗ペプチドＰ６血清および
Ｐ７血清は、両方とも表１の抗原に対して約１：１００
０〜Ｉ：２０００の力価を示す。これらの抗血清の特異
性をさらに説明するためにペプチド競合検定を行う。こ
れらの実験では、超免疫血清、抗ペプチド６および７直
清から精製した総てのｒｇＧを、対応ペプチドとともに
３０分間ブレインキュベートした後、ポリメラーゼコー
トウェルに添加する。単独で用いた場合に、感知しうる
信号（０，２５０〜０．３０００Ｄ、）の生成に充分な
量のＩｇＧをこの検定用に用いる。第１図において、総
ウサギＩｇＧ（約２．５μｇ）を、０．０１．０．ＩＳ
１．０およびＩ Ｏ，０μ９の対応ペプチドとともに
容ｆｆ１１００μ９にし、３０分間室温にてインキュベ
ートする。３０分後、反応物を精製Ｈ９Ｖポリメラーゼ
をコートした微量検定ウェルに添加し、活性残量をＥＬ
ＩＳＡ検定にて定量する。第「図に示すように、ＩｇＧ
を対応ペプチドとブレインキュベートすると、ペプチド
の量が増加するにつれてＥＬ Ｉ ＳＡ倍信号減少する
。図中、黒塗部はＰ６ｒｇＧとＰ６ベプチドを用いた結
果であり、白塗部はＰ７ＴｇＧ、！：Ｐ７ベプチドを用
いた結果である。Ｐ７と抗Ｐ６血清、またはＰ６とＰ７
血清を組み合わせてブレインキュベートしてもＥＬ Ｉ
ＳＡ倍信号減少は起こらない。
［免疫沈降とＤＮＡポリメラーゼ活性の中和］この実験
の目的は、ＥＬＩＳＡ検定においてＨ８Ｖポリメラーゼ
を特異的に認識する抗体が、■ＩＳｖポリメラーゼ活性
に影響を及ぼすことができるかどうかを２種類の検定で
測定することである。
の目的は、ＥＬＩＳＡ検定においてＨ８Ｖポリメラーゼ
を特異的に認識する抗体が、■ＩＳｖポリメラーゼ活性
に影響を及ぼすことができるかどうかを２種類の検定で
測定することである。
第１の実験では、免疫沈降により抽出液からＤＮＡポリ
メラーゼ活性を消耗する。第２図に示すように、感染細
胞抽出液（５μＱ画分）は、別々の濃度の適当な抗血清
とともに１時間別々にインキュベートする。複合体がス
タフィロコッカス・アウレウス（Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）−プロティンＡ（Ｓｔａｐ
ｈＡと称する）と沈降し、上澄液中の残留Ｈ９Ｖポリメ
ラーゼ活性を測定する。第２図は抽出液を対照超免疫１
８Ｇ、抗Ｐ３１ｇＧ、抗Ｐ６１ｇＧまたは抗Ｐ７１ｇＧ
で免疫沈降した後の残留ポリメラーゼ活性を示している
。標準（１００％）対照ポリメラーゼ活性は、ＩｇＧを
添加していない抽出液から測定する。その結果、超免疫
対照ｒｇＧまたはＰ３１ｇＧ２．０μ９の添加により、
それぞれ活性は約２５〜３０％減少することがわかる。
メラーゼ活性を消耗する。第２図に示すように、感染細
胞抽出液（５μＱ画分）は、別々の濃度の適当な抗血清
とともに１時間別々にインキュベートする。複合体がス
タフィロコッカス・アウレウス（Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）−プロティンＡ（Ｓｔａｐ
ｈＡと称する）と沈降し、上澄液中の残留Ｈ９Ｖポリメ
ラーゼ活性を測定する。第２図は抽出液を対照超免疫１
８Ｇ、抗Ｐ３１ｇＧ、抗Ｐ６１ｇＧまたは抗Ｐ７１ｇＧ
で免疫沈降した後の残留ポリメラーゼ活性を示している
。標準（１００％）対照ポリメラーゼ活性は、ＩｇＧを
添加していない抽出液から測定する。その結果、超免疫
対照ｒｇＧまたはＰ３１ｇＧ２．０μ９の添加により、
それぞれ活性は約２５〜３０％減少することがわかる。
一方、抗ペプチドＩｇＧ（Ｐ６およびＰ７）２．０μ９
の添加により、活性はそれぞれ７０％および６５％減少
する。これらの結果は、ポリメラーゼＥＬＩＳＡと一致
し、抗Ｐ６１ｇＧおよび抗Ｐ７ ＩｇＧによるＨ８Ｖポ
リメラーゼの特異的な認識を示唆するものである。しか
し、この種の実験は５ｔａ１）ｈ Ａの沈降促進効果が
可変的であること、さらに前吸着された５ｔａｐｈＡで
も、非特異的反応や細胞壁への吸着に起因して、無関係
な抗原に対する抗血清を用いるときでも、吸着ポリメラ
ーゼ活性の明らかな減少をもたらすことから、複雑であ
る。このような事実は、超免疫対照ＬｇＧまたはＰ３１
ｇＧにもみられる。これらの問題を回避し、本研究１ｇ
Ｇによる直接の中和効果を評価するために、ＤＮＡポリ
メラーゼ検定に用いる他の反応物を添加する前に、酵素
抽出液を生成ＩｇＧとともにブレインキュベートする。
の添加により、活性はそれぞれ７０％および６５％減少
する。これらの結果は、ポリメラーゼＥＬＩＳＡと一致
し、抗Ｐ６１ｇＧおよび抗Ｐ７ ＩｇＧによるＨ８Ｖポ
リメラーゼの特異的な認識を示唆するものである。しか
し、この種の実験は５ｔａ１）ｈ Ａの沈降促進効果が
可変的であること、さらに前吸着された５ｔａｐｈＡで
も、非特異的反応や細胞壁への吸着に起因して、無関係
な抗原に対する抗血清を用いるときでも、吸着ポリメラ
ーゼ活性の明らかな減少をもたらすことから、複雑であ
る。このような事実は、超免疫対照ＬｇＧまたはＰ３１
ｇＧにもみられる。これらの問題を回避し、本研究１ｇ
Ｇによる直接の中和効果を評価するために、ＤＮＡポリ
メラーゼ検定に用いる他の反応物を添加する前に、酵素
抽出液を生成ＩｇＧとともにブレインキュベートする。
第３図に示すように、ＨＳＶ−１感染細胞からの抽出液
を１，２または４μ９の対照超免疫１ｇＧ、抗Ｐ６ｒｇ
Ｇおよび抗Ｐ７１ｇＧとともに１時間氷上でブレインキ
ュベートする。抗Ｐ６１ｇＧと抗Ｐ７１ｇＧの両方を合
わせ、ＩｇＧａ度を１．２または４μ９にして加える実
験も行う。インキュベート後、他の反応成分を加え、’
Ｈ−ｄＴＴＰの取り込み量を測定する。
を１，２または４μ９の対照超免疫１ｇＧ、抗Ｐ６ｒｇ
Ｇおよび抗Ｐ７１ｇＧとともに１時間氷上でブレインキ
ュベートする。抗Ｐ６１ｇＧと抗Ｐ７１ｇＧの両方を合
わせ、ＩｇＧａ度を１．２または４μ９にして加える実
験も行う。インキュベート後、他の反応成分を加え、’
Ｈ−ｄＴＴＰの取り込み量を測定する。
次いでポリメラーゼ活性の中和を直接評価する。
第３図は０．１．２または４μ９の超免疫対照、０．１
，２または４μ９の抗Ｐ６１ｇＧまたは抗Ｐ７１８Ｇを
細胞抽出液に加えたときの結果を示している。４μ９以
上超免疫対照を加えても、ポリメラーゼ活性は実質的あ
るいは確実には減少しない。Ｐ３１ｇＧにおいても同様
の結果が得られる（データは記載せず）。一方、抗Ｐ６
１ｇＧと抗Ｐ７１ｇＧを４μ９加えるとポリメラーゼ活
性がそれぞれ約４９％および３５％まで減少する。さら
に、抗Ｐ６１ｇＧと抗Ｐ７ｒｇＧを、合計最終濃度が１
．２および４μ２になるように当ｆｌｉ３度ずつ加える
場合、Ｈ３Ｖポリメラーゼ活性が対照値の約８゜〜８５
％まで最終的に減少して、中和される。
，２または４μ９の抗Ｐ６１ｇＧまたは抗Ｐ７１８Ｇを
細胞抽出液に加えたときの結果を示している。４μ９以
上超免疫対照を加えても、ポリメラーゼ活性は実質的あ
るいは確実には減少しない。Ｐ３１ｇＧにおいても同様
の結果が得られる（データは記載せず）。一方、抗Ｐ６
１ｇＧと抗Ｐ７１ｇＧを４μ９加えるとポリメラーゼ活
性がそれぞれ約４９％および３５％まで減少する。さら
に、抗Ｐ６１ｇＧと抗Ｐ７ｒｇＧを、合計最終濃度が１
．２および４μ２になるように当ｆｌｉ３度ずつ加える
場合、Ｈ３Ｖポリメラーゼ活性が対照値の約８゜〜８５
％まで最終的に減少して、中和される。
Ｐ６配列とＰ７配列はＨＳＶ−１とＨＳＶ−２に保存さ
れているので、ＨＳＶ−２ポリメラーゼもこれらのＩｇ
Ｇで中和されるかどうかをテストするための実験を行う
。ＨＳＶ−１およびＨ８Ｖ２感染細胞の無細胞抽出液を
ＩｇＧとともに氷上で１時間インキュベートする。イン
キュベートに続いて、他の反応成分を加え、酸沈随性Ｄ
ＮＡに取り込まれた放射能量を定量する。第４図は超免
疫対照１ｇＧ、抗Ｐ６１ｇＧおよび抗Ｐ７１ｇＧでブレ
インキュベートした後のＨＳＶ−１ポリメラーゼの活性
（白塗部）およびＨＳＶ−２ポリメラーゼの活性（黒塗
部）の比較を示している。この実験と前述の実験との総
取り込み量における相違は、細胞抽出液タンパク質濃度
の相違を反映している。
れているので、ＨＳＶ−２ポリメラーゼもこれらのＩｇ
Ｇで中和されるかどうかをテストするための実験を行う
。ＨＳＶ−１およびＨ８Ｖ２感染細胞の無細胞抽出液を
ＩｇＧとともに氷上で１時間インキュベートする。イン
キュベートに続いて、他の反応成分を加え、酸沈随性Ｄ
ＮＡに取り込まれた放射能量を定量する。第４図は超免
疫対照１ｇＧ、抗Ｐ６１ｇＧおよび抗Ｐ７１ｇＧでブレ
インキュベートした後のＨＳＶ−１ポリメラーゼの活性
（白塗部）およびＨＳＶ−２ポリメラーゼの活性（黒塗
部）の比較を示している。この実験と前述の実験との総
取り込み量における相違は、細胞抽出液タンパク質濃度
の相違を反映している。
実験結果から、抗Ｐ６ｒｇＧおよび抗Ｐ ７ ＩｇＧ（
４μ９）が、ＨＳＶ−２ポリメラーゼ活性の減少の方が
やや少ないとはいえ、ＨＳＶ−１ポリメラーゼ活性とＨ
ＳＶ−２ポリメラーゼ活性の両方を中和できることが判
る。
４μ９）が、ＨＳＶ−２ポリメラーゼ活性の減少の方が
やや少ないとはいえ、ＨＳＶ−１ポリメラーゼ活性とＨ
ＳＶ−２ポリメラーゼ活性の両方を中和できることが判
る。
抗Ｐ６１ｇＧおよび抗Ｐ７１ｇＧの配列特異性を説明す
るために、本実験で用いている抽出液中の内因性アルフ
ァポリメラーゼ活性に対する両１８Ｇの中和能力を評価
する。非感染細胞抽出液を１．２または４μ９の対照超
免疫１ｇＧ、抗Ｐ６１ｇＧおよび抗Ｐ７１ｇＧとともに
１時間水上でブレインキュベートする。インキュベート
後、他の反応成分を加え、’Ｈ−ｄＴＴＰの取り込み量
を測定する。第５図はアルファポリメラーゼ条件下で行
う反応に、０，１，２または４μ９の超免疫対照、０．
１，２または４μ９の抗Ｐ６１ｇＧまたは抗Ｐ７［ｇＧ
を添加した効果を示している。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２ポリメラーゼ活性の結果とは異なって、リゼイト中
のアルファポリメラーゼ活性を中和するＩｇＧはみられ
ない。このような結果は、アルファポリメラーゼ配列（
ウオン（Ｗｏｎｇ）。
るために、本実験で用いている抽出液中の内因性アルフ
ァポリメラーゼ活性に対する両１８Ｇの中和能力を評価
する。非感染細胞抽出液を１．２または４μ９の対照超
免疫１ｇＧ、抗Ｐ６１ｇＧおよび抗Ｐ７１ｇＧとともに
１時間水上でブレインキュベートする。インキュベート
後、他の反応成分を加え、’Ｈ−ｄＴＴＰの取り込み量
を測定する。第５図はアルファポリメラーゼ条件下で行
う反応に、０，１，２または４μ９の超免疫対照、０．
１，２または４μ９の抗Ｐ６１ｇＧまたは抗Ｐ７［ｇＧ
を添加した効果を示している。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２ポリメラーゼ活性の結果とは異なって、リゼイト中
のアルファポリメラーゼ活性を中和するＩｇＧはみられ
ない。このような結果は、アルファポリメラーゼ配列（
ウオン（Ｗｏｎｇ）。
Ｓ、Ｗ、らのｒＥＭＢＯＪｌ、７．３７〜４７頁、１９
８８年に記載）にＰ６とＰ７配列がないことから予想で
きる。
８８年に記載）にＰ６とＰ７配列がないことから予想で
きる。
最後に、中和反応の特異性をさらにテストするため、酵
素中和と特異的に競合するペプチドの能力を検定する。
素中和と特異的に競合するペプチドの能力を検定する。
超免疫対照ｒｇＧ、抗Ｐ６ｒｇＧまたは抗Ｐ７１ｇＧ（
４μ７）をペプチドなしで、またはＰ３、Ｐ６またはＰ
７ベプチド（５μｇ）とともに水上で３０分間ブレイン
キュベートする。ブレインキュベート後、ペプチド抗体
混合物を細胞抽出液とともにインキュベートする。次い
で他のポリメラーゼ反応成分を加え、３Ｈ−ｄＴＴＰの
取り込み量を測定する。第６図に示すように、抗ペプチ
ド血清と同族ペプチドとをブレインキュベートしたもの
だけが、対照レベル近くまでポリメラーゼ活性を回復し
ている。抽出液とペプチド単独（５μ９）をブレインキ
ュベートしたしのは取り込みを阻害しない（データは記
載せず）。
４μ７）をペプチドなしで、またはＰ３、Ｐ６またはＰ
７ベプチド（５μｇ）とともに水上で３０分間ブレイン
キュベートする。ブレインキュベート後、ペプチド抗体
混合物を細胞抽出液とともにインキュベートする。次い
で他のポリメラーゼ反応成分を加え、３Ｈ−ｄＴＴＰの
取り込み量を測定する。第６図に示すように、抗ペプチ
ド血清と同族ペプチドとをブレインキュベートしたもの
だけが、対照レベル近くまでポリメラーゼ活性を回復し
ている。抽出液とペプチド単独（５μ９）をブレインキ
ュベートしたしのは取り込みを阻害しない（データは記
載せず）。
Ｈ３ＶＤＮＡポリメラーゼのＰ６またはＰ７エビトープ
（抗原決定基）に結合する抗体は、ポリメラーゼ活性を
中和することができるので、Ｐ６またはＰ７ベプチドは
、ＨＳＶＤＮＡポリメラーゼに結合してそれを中和する
天然生成物抽出液から化合物を濃縮あるいは精製するた
めの固定化親和試薬として使用できる。
（抗原決定基）に結合する抗体は、ポリメラーゼ活性を
中和することができるので、Ｐ６またはＰ７ベプチドは
、ＨＳＶＤＮＡポリメラーゼに結合してそれを中和する
天然生成物抽出液から化合物を濃縮あるいは精製するた
めの固定化親和試薬として使用できる。
また、抗Ｐ６抗体および抗Ｐ７抗体は、Ｈ８ＶＤＮＡポ
リメラーゼの２つの決定基を認識することができる中和
に関与すると思われるので、抗Ｐ６抗体および抗Ｐ７抗
体に対する抗イディオタイプ抗体は、Ｐ６またはＰ７結
合化合物を天然生成物抽出液から濃縮あるいは精製する
ための親和試薬として有用である。
リメラーゼの２つの決定基を認識することができる中和
に関与すると思われるので、抗Ｐ６抗体および抗Ｐ７抗
体に対する抗イディオタイプ抗体は、Ｐ６またはＰ７結
合化合物を天然生成物抽出液から濃縮あるいは精製する
ための親和試薬として有用である。
本発明の好ましい具体例において、Ｐ６およびＰ７抗体
は、Ｐ６およびＰ７エビトープに結合し１、その後の同
族抗体の結合を妨げることのできる化合物のスクリーン
として用いられる。Ｐ６またはＰ７エピトープのどちら
かｔ・の抗体の結合は、Ｈ９ＶＤＮＡポリメラーゼ活性
の中和をもたらすため、本発明阻害検定は新しい抗ウィ
ルス剤の同定に有用である。
は、Ｐ６およびＰ７エビトープに結合し１、その後の同
族抗体の結合を妨げることのできる化合物のスクリーン
として用いられる。Ｐ６またはＰ７エピトープのどちら
かｔ・の抗体の結合は、Ｈ９ＶＤＮＡポリメラーゼ活性
の中和をもたらすため、本発明阻害検定は新しい抗ウィ
ルス剤の同定に有用である。
好ましい具体例の一つにおいて、Ｐ６およびＰ７ペプチ
ドを、微量検定プレートに別々に吸着させる。各ペプチ
ド（６または７）は、互いに他のベプチ）−′（それぞ
れ７または６）の反応特異性の対照となる。
ドを、微量検定プレートに別々に吸着させる。各ペプチ
ド（６または７）は、互いに他のベプチ）−′（それぞ
れ７または６）の反応特異性の対照となる。
ブロッキング後、プレートをバッファー単独、または天
然生成物の緩衝抽出液あるいは合成化合物のいずれかと
ともにインキュベートする。
然生成物の緩衝抽出液あるいは合成化合物のいずれかと
ともにインキュベートする。
よく洗浄した後、１次抗体（超免疫対照、抗Ｐ６および
抗Ｐ７）を適当に希釈してコートウェルに加え、インキ
ュベートする。
抗Ｐ７）を適当に希釈してコートウェルに加え、インキ
ュベートする。
よく洗浄した後、複合２次抗体を加え、結合１次抗体の
量を検定する。バッファーのみを入れｆこウェルから得
られる信号と合成または天然生成物を入れたウェルから
得られる信号を比較する。
量を検定する。バッファーのみを入れｆこウェルから得
られる信号と合成または天然生成物を入れたウェルから
得られる信号を比較する。
検定を行う多くの別法がある。その一つは、コーティン
グ用抗体として、ペプチドの代わりにＨＳＶまたはアル
ファＤＮＡポリメラーゼを用いる。
グ用抗体として、ペプチドの代わりにＨＳＶまたはアル
ファＤＮＡポリメラーゼを用いる。
この場合、検定は微量検定ウェルよりも膜上で行うのが
好ましい。２次抗体は、酵素標識するかまたは微粒指示
分子へ複合するかどちらかであってよい。天然生成物の
緩衝抽出液または合成化合物を１次抗体のあとに加えて
もよい。
好ましい。２次抗体は、酵素標識するかまたは微粒指示
分子へ複合するかどちらかであってよい。天然生成物の
緩衝抽出液または合成化合物を１次抗体のあとに加えて
もよい。
実施例１
ウィルスおよび細胞
ＨＳ Ｖ −１（Ｓ ｃｈｏｏｌｅｒ株またはＫＯＳ株
）およびＨＳＶ−２（１８６）を繁殖させ、ベロ細胞モ
ルイヤー中で検定する。使用する前にウィルスを２回プ
ラーク精製する。
）およびＨＳＶ−２（１８６）を繁殖させ、ベロ細胞モ
ルイヤー中で検定する。使用する前にウィルスを２回プ
ラーク精製する。
実施例２
ウサギ抗血清の調製
バシリ（Ｂａｓｓｉｒｉ）の記載（Ｂ、Ｍ、ジャフィー
（ＪａｆＴｅｅ）およびＨ，Ｒ，バーマン（Ｂｅｈｒｍ
ａｎ）編の「メソッズ・オプ・ホルモン・ラジオイムノ
アッセイ」、アカデミツク・プレス・インコーホレイテ
ッド。
（ＪａｆＴｅｅ）およびＨ，Ｒ，バーマン（Ｂｅｈｒｍ
ａｎ）編の「メソッズ・オプ・ホルモン・ラジオイムノ
アッセイ」、アカデミツク・プレス・インコーホレイテ
ッド。
ニューヨーク、１９７９年；４６〜４７頁、バシリ。
Ｒ３ら）に準じて、ペプチドをビスージアゾ化ベンゼジ
ンを介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とブタチログ
ロブリンの混合物に結合させる。最初の免疫化のため、
ニューシーラント白ウサギにこれらの複合体をフロイン
ドアシュンバントとともに、皮下および皮肉の複数箇所
に接種する。ウサギを免疫化後、約２〜５週間で血液を
採取する。ｔｇＧ画分を硫酸アンモニウムで沈降させ、
仕様書にしたがって、バーフレックスカラム（デュポン
社製）を用いたタンパク質Ａアフィニティークロマトグ
ラフィーにて精製する。
ンを介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とブタチログ
ロブリンの混合物に結合させる。最初の免疫化のため、
ニューシーラント白ウサギにこれらの複合体をフロイン
ドアシュンバントとともに、皮下および皮肉の複数箇所
に接種する。ウサギを免疫化後、約２〜５週間で血液を
採取する。ｔｇＧ画分を硫酸アンモニウムで沈降させ、
仕様書にしたがって、バーフレックスカラム（デュポン
社製）を用いたタンパク質Ａアフィニティークロマトグ
ラフィーにて精製する。
実施例３
ＥＬＩＳＡ検定
標準ペプチドＥＬＩＳＡ検定のために、ノービイ（Ｎｏ
ｒｒｂｙ）らの記載（ノービイ、ＥらのｒＰｒｏｃ。
ｒｒｂｙ）らの記載（ノービイ、ＥらのｒＰｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡＪ、８４．６
５７２〜６５７６頁、１９８７年）に準じて、ペプチド
をＰＢＳ中でイムロン−２ウエル（グイナテック社製）
上に置いて風乾し、メタノールで固定する。標準ポリメ
ラーゼＥＬ ｒ ＳＡ検定のために、精製ポリメラーゼ
（ｍＰＸ後記実施例７参照）を炭酸塩バッファー（ｐＨ
９，６）中でイムロン−ｌウェル（グイナテック社製）
に置き、４℃で一夜コートする。使用する前に両方の感
作プレートをＩＸ ＥＬＩＳＡ ＷＡＳＨ（カークガー
ド・ベリー・ラボラトリーズＫＰＬ）で洗浄し、ｔＸカ
ゼインブロックバッファー（ＫＰＬ製）で、３７℃にて
１時間ブロックする。
５７２〜６５７６頁、１９８７年）に準じて、ペプチド
をＰＢＳ中でイムロン−２ウエル（グイナテック社製）
上に置いて風乾し、メタノールで固定する。標準ポリメ
ラーゼＥＬ ｒ ＳＡ検定のために、精製ポリメラーゼ
（ｍＰＸ後記実施例７参照）を炭酸塩バッファー（ｐＨ
９，６）中でイムロン−ｌウェル（グイナテック社製）
に置き、４℃で一夜コートする。使用する前に両方の感
作プレートをＩＸ ＥＬＩＳＡ ＷＡＳＨ（カークガー
ド・ベリー・ラボラトリーズＫＰＬ）で洗浄し、ｔＸカ
ゼインブロックバッファー（ＫＰＬ製）で、３７℃にて
１時間ブロックする。
洗浄後、ＩＸカゼインブロックバッファーに１次抗体を
加え、３７℃で１時間反応させる。プレートを洗浄し、
アフィニティー精製したヤギ抗ウサギＩ ｇＧ （Ｋ
Ｐ ｔ、製）と複合したアルカリホスファターゼを１時
間加える。プレートをよく洗浄し、ｐ−ニトロフェニル
ホスフェート基質を室温で３０分間加える。反応を停止
せずに４０５ｎｍの吸光度を迅速に読み取る（マルチス
キャン）。ペプチド含有対応プレ免疫血清（１：ｔｏｏ
）およびペプチド不合超免疫血清（１：ｌ００）よりも
３〜４倍大きな信号としてＥＬＩＳＡの終点を任意に定
める。
加え、３７℃で１時間反応させる。プレートを洗浄し、
アフィニティー精製したヤギ抗ウサギＩ ｇＧ （Ｋ
Ｐ ｔ、製）と複合したアルカリホスファターゼを１時
間加える。プレートをよく洗浄し、ｐ−ニトロフェニル
ホスフェート基質を室温で３０分間加える。反応を停止
せずに４０５ｎｍの吸光度を迅速に読み取る（マルチス
キャン）。ペプチド含有対応プレ免疫血清（１：ｔｏｏ
）およびペプチド不合超免疫血清（１：ｌ００）よりも
３〜４倍大きな信号としてＥＬＩＳＡの終点を任意に定
める。
実施例４
ＤＮＡポリメラーゼ抽出液
模擬感染または感染細胞抽出液をカーカス（Ｋａｒｋａ
ｓ）らの記載（カーカス、Ｊ、Ｄ、らのｒＪ、Ｍｅｄ。
ｓ）らの記載（カーカス、Ｊ、Ｄ、らのｒＪ、Ｍｅｄ。
Ｃｈｅａ、Ｊ、２９，８４２〜８４８頁、１９８６年）
に準じて調製する。ヒラＳ３細胞は、本質的にＨＳＶ−
１（Ｓ ｃｈｏｏｌｅｒまたはＫＯＳ）またはＨＳＶ２
（１８６）に対し、１細胞あたりｌＯプラークを形成す
る感染の多重度で模擬感染するか感染するかどちらかで
あり、感染後１６時間で採取する。
に準じて調製する。ヒラＳ３細胞は、本質的にＨＳＶ−
１（Ｓ ｃｈｏｏｌｅｒまたはＫＯＳ）またはＨＳＶ２
（１８６）に対し、１細胞あたりｌＯプラークを形成す
る感染の多重度で模擬感染するか感染するかどちらかで
あり、感染後１６時間で採取する。
細胞ペレット（Ｉ ｘ ｆ Ｏｓ細胞）を−８０℃で凍
結する。細胞を氷上で解凍し、低張ｓｊｉ［１０ｍＭＫ
。
結する。細胞を氷上で解凍し、低張ｓｊｉ［１０ｍＭＫ
。
ＰＯ，、ｐＨ７，０，Ｉ ０ｍＭＫＣｌ、ＩｍＭＰＭＳ
Ｆ。
Ｆ。
１ｍＭジチオスレイトール（Ｄ Ｔ Ｔ ）］に再懸濁
し、水上で３０分間、ときどき旋回撹拌しながらインキ
ュベートする。同量の７００ｍＭＫ、ＰＯ，、ｐＨ７，
０，２８％グリセロール、６ｍＭＤＴＴ、０４％ＮＰ−
４０、ＩｍＭＰＭＳＦを加え、混合物を水上でさらに３
０分間、ときどき旋回撹拌しながらインキュベートする
。混合物を１２５０００×ｇで１時間遠心分離し、上澄
液にＮＰ−４０を最終濃度が０．４％になるように加え
る。アリコートを一８０℃で保管する。Ｂｉｏ−Ｒａｄ
ブラッドフォード検定で検定した抽出液の最終タンパク
質濃度は約５．Ｏｒｔｔｇ／ｘ（ｌである。
し、水上で３０分間、ときどき旋回撹拌しながらインキ
ュベートする。同量の７００ｍＭＫ、ＰＯ，、ｐＨ７，
０，２８％グリセロール、６ｍＭＤＴＴ、０４％ＮＰ−
４０、ＩｍＭＰＭＳＦを加え、混合物を水上でさらに３
０分間、ときどき旋回撹拌しながらインキュベートする
。混合物を１２５０００×ｇで１時間遠心分離し、上澄
液にＮＰ−４０を最終濃度が０．４％になるように加え
る。アリコートを一８０℃で保管する。Ｂｉｏ−Ｒａｄ
ブラッドフォード検定で検定した抽出液の最終タンパク
質濃度は約５．Ｏｒｔｔｇ／ｘ（ｌである。
実施例５
ＤＮＡポリメラーゼ活性の免疫沈降
非特異的結合を最小にするために、前処理として、スタ
フォロコブカス・アウレウス由来のタンパク質Ａ（パン
ソルビン、ベージング・ダイアグノスティックス製）を
細胞＠濁液Ｉ５μＱをＢ５Ａ３００μ２とともに４℃で
一夜インキユベートする。次の日、細胞をベレット化し
、リンスし、２５ｍＭ）リスＨｃｌ（ｐＨ８，０）１２
５μ＆に再懸濁する。Ｈ９Ｖ感染細胞抽出液（５μｇ）
を精製Ｔｇ０２μ９とともに氷上で１時間インキュベー
トする。
フォロコブカス・アウレウス由来のタンパク質Ａ（パン
ソルビン、ベージング・ダイアグノスティックス製）を
細胞＠濁液Ｉ５μＱをＢ５Ａ３００μ２とともに４℃で
一夜インキユベートする。次の日、細胞をベレット化し
、リンスし、２５ｍＭ）リスＨｃｌ（ｐＨ８，０）１２
５μ＆に再懸濁する。Ｈ９Ｖ感染細胞抽出液（５μｇ）
を精製Ｔｇ０２μ９とともに氷上で１時間インキュベー
トする。
先に吸着しておいたスタフｔロコッカス懸濁液（５μＱ
）を加え、水上で１時間インキュベートを継続した。混
合物をエッペンドルフ・マイクロフユージを用いて６５
００ ｒｐｍｃ〜３０００Ｘｇ）で遠心分離し、上澄液
を以下に記載するＤＮＡポリメラーゼ活性の検定に用い
る。ＩｇＧを用いないかあるいはＩｇＧとスタフォロコ
ッカス・アウレウスの両方を用いない系で行った検定結
果の平均値を対照値（１００％）とする。
）を加え、水上で１時間インキュベートを継続した。混
合物をエッペンドルフ・マイクロフユージを用いて６５
００ ｒｐｍｃ〜３０００Ｘｇ）で遠心分離し、上澄液
を以下に記載するＤＮＡポリメラーゼ活性の検定に用い
る。ＩｇＧを用いないかあるいはＩｇＧとスタフォロコ
ッカス・アウレウスの両方を用いない系で行った検定結
果の平均値を対照値（１００％）とする。
実施例６
ＤＮＡポリメラーゼ検定
アルファＤＮＡポリメラーゼ活性の検定は、バッフイー
（ＨａｆＴｅｙ）、Ｍ、Ｌ、らのｒＪ、 Ｖｉｒｏｌ、
Ｊ、６２．４４９３〜４４９８頁、１９８８年およびカ
ーカス、Ｊ、Ｄ、らのｒＪ、 Ｍｅｄ、 ＣｈｅＩＤ、
Ｊ、２９，８４２〜８４８頁、１９８６年記載に準じて
行う。
（ＨａｆＴｅｙ）、Ｍ、Ｌ、らのｒＪ、 Ｖｉｒｏｌ、
Ｊ、６２．４４９３〜４４９８頁、１９８８年およびカ
ーカス、Ｊ、Ｄ、らのｒＪ、 Ｍｅｄ、 ＣｈｅＩＤ、
Ｊ、２９，８４２〜８４８頁、１９８６年記載に準じて
行う。
反応混合物は、最終容量５０μＱ中にトリス）（Ｃ１１
０ｍＭ中の細胞抽出液（タンパク質２５μｇ）５μ（！
、ｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇＣ１ｔ、Ｉ ＱｍＭ（ＮＨ
４）ｔＳＯ，、Ｏ，ＩｍＭＤＴＴ、各１００μｍのｄＡ
Ｔ Ｐ 。
０ｍＭ中の細胞抽出液（タンパク質２５μｇ）５μ（！
、ｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇＣ１ｔ、Ｉ ＱｍＭ（ＮＨ
４）ｔＳＯ，、Ｏ，ＩｍＭＤＴＴ、各１００μｍのｄＡ
Ｔ Ｐ 。
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、１００ μＭ３Ｈ−ＴＴＰ（１０
ｃｐｉ／ ｐｍｏ Ｉ ）、４０μｇ／ｊ！１２のニッ
ク子牛胴線ＤＮＡおよび２ｍＭスペルミジンを含有する
。Ｈ８ＶＤＮＡポリメラーゼ活性は、最終容量５０μＱ
中にトリスＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ８，５，５ｍＭＭｇＣ
］ｔ。
ｃｐｉ／ ｐｍｏ Ｉ ）、４０μｇ／ｊ！１２のニッ
ク子牛胴線ＤＮＡおよび２ｍＭスペルミジンを含有する
。Ｈ８ＶＤＮＡポリメラーゼ活性は、最終容量５０μＱ
中にトリスＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ８，５，５ｍＭＭｇＣ
］ｔ。
ＩｍＭＤＴＴ、１００ｍＭ（ＮＨ４）ｚｓｏ４、各５μ
ＭのｄＡ Ｔ Ｐ 、ｄＣＴ Ｐ 、ｄＧ Ｔ Ｐ 、
５μＭ［’Ｈ］ｄＴＴＰ （２００ｃｐｍ／ ｐｍ
ｏｌ）、３０ｔ、ｔ９／ＩＱのＤ Ｎ Ａ Ｓｅ １活
性化子牛胸線ＤＮＡおよびＩ Ｏｕ９／ｒｔ（ＩＢＳ
Ａを含有する。すべてのＤＮＡ検定は反応物を３７°Ｃ
で、１５分間インキュベートして行なう。反応物をグラ
スファイバーフィルター上に置き、５％ＴＣＡ中１０ｍ
Ｍのビロリン酸ナトリウムを加えて反応を停止する。フ
ィルターをＩＮＨｃＩで３回、９５％エタノールで１回
洗浄し、シンチレーションカウンター（Ｌ Ｋ Ｂ Ｉ
２１４ Ｒａｃｋｂｅｔａカウンター、計数効率６３
％）で計測する。すべての検定は２回行なう。免疫沈降
検定のために、抗体および抽出液を水上で７０分間イン
キュベートし、次いでＳ・アウレウスタンパク質Ａをさ
らに６０分間にわたって加え、抽出液をエッペンドルフ
・マイクロフユージ（６５００ｒｐｍ、〜３０００Ｘｇ
）中で清澄化し、上澄液中の残りのポリメラーゼ活性を
検定する。酵素中和検定のために、抽出液に他の成分を
加える前に、図面中に記載する抗体とともに水上で６０
分間ブレインキュベートする。
ＭのｄＡ Ｔ Ｐ 、ｄＣＴ Ｐ 、ｄＧ Ｔ Ｐ 、
５μＭ［’Ｈ］ｄＴＴＰ （２００ｃｐｍ／ ｐｍ
ｏｌ）、３０ｔ、ｔ９／ＩＱのＤ Ｎ Ａ Ｓｅ １活
性化子牛胸線ＤＮＡおよびＩ Ｏｕ９／ｒｔ（ＩＢＳ
Ａを含有する。すべてのＤＮＡ検定は反応物を３７°Ｃ
で、１５分間インキュベートして行なう。反応物をグラ
スファイバーフィルター上に置き、５％ＴＣＡ中１０ｍ
Ｍのビロリン酸ナトリウムを加えて反応を停止する。フ
ィルターをＩＮＨｃＩで３回、９５％エタノールで１回
洗浄し、シンチレーションカウンター（Ｌ Ｋ Ｂ Ｉ
２１４ Ｒａｃｋｂｅｔａカウンター、計数効率６３
％）で計測する。すべての検定は２回行なう。免疫沈降
検定のために、抗体および抽出液を水上で７０分間イン
キュベートし、次いでＳ・アウレウスタンパク質Ａをさ
らに６０分間にわたって加え、抽出液をエッペンドルフ
・マイクロフユージ（６５００ｒｐｍ、〜３０００Ｘｇ
）中で清澄化し、上澄液中の残りのポリメラーゼ活性を
検定する。酵素中和検定のために、抽出液に他の成分を
加える前に、図面中に記載する抗体とともに水上で６０
分間ブレインキュベートする。
競合検定のために、反応混合物を加える前に、抗体およ
びペプチドを氷上で６０分間インキュベートする。
びペプチドを氷上で６０分間インキュベートする。
実施例７
試薬
ペプチドをバイオサーチ社から購入し、逆相（０１８、
Ｖ ｙｄａｃ）クロマトグラフィーに付すとペプチド部
の図形に一つの主要ピークが現れる。合成ペプチドの分
子量の実測値は、スクイブ社の医学研究所分析化学部門
のＧ、Ｃ，ディトナト（ＤｉＤｏｎａｔＯ）がＦＡＢ−
ＭＳによって、計算値と同じであることを証明している
。ポリメラーゼＥＬｒＳＡ検定に用いるＨＳＶＤＮＡポ
リメラーゼ（ｍＰ）は、Ｗ、リュエチャン（Ｒ，ｕｙｅ
ｃｈａｎ） （総合サービスユニバーシティ）の寄贈に
よるものである。この調製法の特徴は、リュエチャン１
ｗ、らのｒＪ、 Ｖｉｒｃｌ。
Ｖ ｙｄａｃ）クロマトグラフィーに付すとペプチド部
の図形に一つの主要ピークが現れる。合成ペプチドの分
子量の実測値は、スクイブ社の医学研究所分析化学部門
のＧ、Ｃ，ディトナト（ＤｉＤｏｎａｔＯ）がＦＡＢ−
ＭＳによって、計算値と同じであることを証明している
。ポリメラーゼＥＬｒＳＡ検定に用いるＨＳＶＤＮＡポ
リメラーゼ（ｍＰ）は、Ｗ、リュエチャン（Ｒ，ｕｙｅ
ｃｈａｎ） （総合サービスユニバーシティ）の寄贈に
よるものである。この調製法の特徴は、リュエチャン１
ｗ、らのｒＪ、 Ｖｉｒｃｌ。
」、４３ユ、７２７〜７３３頁、１９８４年に記載され
ている。
ている。
第１図はペプチド競合ＥＬ Ｉ ＳＡを示す。
第２図はＨＳＶポリメラーゼ活性の免疫沈降を示す。
第３図はＨＳＶ−１ポリメラーゼ活性の中和を示す。
第４図は比較Ｈ９Ｖ中和を示す。
第５図は内因性アルファポリメラーゼ活性の中和を示す
。 第６図はＨ９Ｖポリメラーゼ酵素中和のベプチド競合を
示す。
。 第６図はＨ９Ｖポリメラーゼ酵素中和のベプチド競合を
示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アミノ酸配列ＡＰＧＤＥＰＡＰＰＹ（Ｙは結合およ
び機能を促進するために付加する適当な残基）を持つペ
プチド（Ｐ６）。 ２、アミノ酸配列ＡＧＡＴＡＥＥＴＲＹ（Ｙは結合およ
び機能を促進するために付加する適当な残基）を持つペ
プチド（Ｐ７）。 ３、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のＤＮＡポリメラーゼ
を特異的に中和する、請求項１のペプチドに対する抗体
（抗ペプチド６抗体）。 ４、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のＤＮＡポリメラーゼ
を特異的に中和する、請求項２のペプチドに対する抗体
（抗ペプチド７抗体）。 ５、抗ペプチド６抗体を前記ポリメラーゼに加えるステ
ップからなることを特徴とするＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２のＤＮＡポリメラーゼの中和方法。 ６、抗ペプチド７抗体を前記ポリメラーゼに加えるステ
ップからなることを特徴とするＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２のＤＮＡポリメラーゼの中和法。 ７、潜在的阻害因子を加えることにより、抗ペプチド６
抗体がペプチド６またはポリメラーゼに結合するのを妨
げ、その後結合した抗ペプチド６抗体の量を測定するス
テップからなることを特徴とするＨＳＶ−１およびＨＳ
Ｖ−２のＤＮＡポリメラーゼの阻害因子のスクリーニン
グ法。 ８、潜在的阻害因子を加えることにより、抗ペプチド７
抗体がペプチド７またはポリメラーゼに結合するのを妨
げ、その後結合した抗ペプチド７抗体の量を測定するス
テップからなることを特徴とするＨＳＶ−１およびＨＳ
Ｖ−２のＤＮＡポリメラーゼの阻害因子のスクリーニン
グ法。 ９、潜在的阻害因子を加えることにより、すでにペプチ
ド６またはポリメラーゼに結合した抗ペプチド６抗体の
結合を阻害し、遊離した抗体の１を測定するステップか
らなることを特徴とするＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の
ＤＮＡポリメラーゼの阻害因子のスクリーニング法。 １０、潜在的阻害因子を加えることにより、すでにペプ
チド７またはポリメラーゼに結合した抗ペプチド７抗体
の結合を阻害し、遊離した抗体の量を測定するステップ
からなることを特徴とするＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２
のＤＮＡポリメラーゼの阻害因子のスクリーニング法。 １１、請求項１および請求項２のペプチドの機能的変異
体。 １２、Ｐ６およびＰ７ペプチドを固定化親和試薬として
用い、ＨＳＶＤＮＡポリメラーゼに結合する化合物を該
試薬に通すことによる該化合物の濃縮法。 １３、抗Ｐ６落体および抗Ｐ７抗体に対する抗イディオ
タイプ抗体をを固定化親和試薬として用い、ＨＳＶＤＮ
Ａポリメラーゼに結合する化合物を該試薬に通すことに
よる該化合物の濃縮法。
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