JPH0341477B2

JPH0341477B2 -

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Publication number: JPH0341477B2
Application number: JP57027572A
Authority: JP
Priority date: 1981-04-03
Filing date: 1982-02-24
Publication date: 1991-06-24
Also published as: US4341768A; JPS57171925A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なペプチド抗生物質錯体ならびに
その生産、採取および４種の生物活性抗生物質成
分への分類に関する。本発明のBu−2470抗生物質錯体は共生産され
た個々の抗生物質因子の混合物からなる。４種の
生物活性因子のうち、１種は非アシル化オクタペ
プチド抗生物質であり、また３種は脂肪酸残基で
アシル化されたオクタペプチド抗生物質である。
新規抗生物質はバチルス・サーキユランス
（Bacillus circulans）菌株G493−B6
（ATCC31805）と称するバチルスの新菌株の培養
によつて生産される。数種のアシル化オクタペプチド抗生物質が文献
に開示されている。バチルス・サーキユランス菌
株の醗酵によつて生産される抗生物質には次のよ
うなものが包含される。１米国特許第3880994号に開示されている抗生
物質Bu−1880は３−ヒドロキシ−８−メチル
デカン酸脂肪酸残基でアシル化されたオクタペ
プチドである。Bu−1880はバチルス・サーキ
ユランスATCC21828の醗酵により生産され、
アミノ酸フエニルアラニン、ロイシンおよび
α，γ−ジアミノ酪酸を１：２：５の比で含有
している。Bu−1880の構造は未決定であるが、
Bu−1880はその物理化学的性質および脂肪酸
部分を基にして抗生物質Bu−2470A，B_2aおよ
びB_2bとは明確に区別することができる。２特開昭50−160491号には、バチルス・サーキ
ユランスNo.333−25（FERM−P2362）の醗酵に
より生産されるアシル化オクタペプチド抗生物
質333−25が開示されている〔J.アンタイバイ
オテイクス（J.Antibiotics）、第29巻、第516−
520頁、1976年も参照〕。抗生物質333−25はJ.
アンタイバイオテイクス、第29巻、(12)、第1339
−1340（1976年）には構造（式中Dabはα，γ−ジアミノ酪酸であり、
Pheはフエニルアラニンであり、そしてLeuは
ロイシンである）を有すると記載されている。
抗生物質333−25はβ−ヒドロキシアンテイソ
ノナノイル脂肪酸部分の存在により本発明の抗
生物質と区別することができる。３抗生物質錯体EM−49は米国特許第3856938
号にバチルス・サーキユランスATCC21656の
醗酵により生産される旨開示されている。この
錯体は４種の主要成分、α，β，γおよびδか
らなり、これらはβ−ヒドロキシ脂肪酸でモノ
アシル化された環状オクタペプチドである。４
種の成分はそれらのアミノ酸組成および脂肪酸
部分の構造の変化により区別し得る。EM−
49αおよびβはフエニルアラニンを含有せず、
２，４−ジアミノ酪酸残基５個、ロイシン残基
３個を含有している。EM−49γおよびδはフ
エニルアラニン残基１個、ロイシン残基２個お
よび２，４−ジアミノ酪酸残基５個を有してい
る。EM−49αおよびβは脂肪酸部分の構造で
相互に異つている。EM−49γおよびδも同じ
く相互に異つている〔J.クロマトグラフイー
（J.Chromatography）、第97巻、第112−114頁
（1974年）およびJ.アンタイバイオテイクス、
第26巻、第444−448頁（1973年）をも参照〕。
J.アンタイバイオテイクス、第28巻、第379−
389頁（1975年）およびJ.アンタイバイオテイ
クス、第29巻、第1241−1242（1976年）による
と、EM−49抗生物質（αおよびγのサブ・フ
アクターをも包含する）は次のとおり表わされ
る。 EM49抗生物質はそのアミノ酸組成において本
発明の化合物とは異つている。バチルス・ブンゴエンシス（Bacillus
bungoensis）（FERM−P2143）の醗酵によつて
生産される抗生物質Ｙ−8495が特開昭50−25795
号に開示されている。Ｙ−8495はオクタペプチド
抗生物質であるが、その物理化学的性質に基いて
本発明の化合物と区別することができる。本発明によれば、Bu−2470と称する塩基性ペ
プチド抗生物質の新規な錯体が提供され、前記錯
体は深部好気条件下に炭素および窒素の同化可能
源を含む水性栄養培地でバチルス・サーキユラン
スのバチルス・サーキユランス（Bacillus
circulans）菌株G493−B6（ATCC31805）と称す
る新菌株を、該菌株により該培地に実質量のBu
−2470錯体が生産されるまで、培養し、そして次
に培地からBu−2470錯体を採取するによつて生
産される。本発明によれば、また実質的に共生産
物質を含有しない個々のペプチド抗生物質として
Bu−2470A，B₁，B_2aおよびB_2bと称するBu−
2470の４種の生物活性因子を提供する操作が提供
される。Bu−2470錯体および個々のペプチド抗
生物質因子は遊離塩基としてまたはその製薬上許
容し得る酸付加塩として得ることができる。本発明は以下本文においてBu−2470と称する
塩基性ペプチド抗生物質の新規な錯体ならびにバ
チルス・サーキユランス菌株G493−B6と称する
バチルスの新菌株の醗酵によるその製造に関す
る。生産微生物はインドで採取した土壌サンプル
から単離された好気性、胞子形成性桿状細菌であ
る。本微生物のサンプルは米国、ワシントン、ア
メリカン・タイプ・カルチユア・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）にブダ
ペスト条約に基づいて寄託され、その永久微生物
保存にATCC30805として加えられている。生産菌の分類菌株G493−B6の菌学的、培養および生理学的
特性をそれぞれ以下の表１，２および３に示す。表１菌株G493−B6の菌学的特徴栄養細胞形状：棒状、円い端、多形性なしサイズ：0.5〜0.7×2.0〜4.0μ 運動性：陽性胞子形状およびサイズ：楕円形、0.8×1.6μ 胞子のうの膨張：胞子部位で膨張位置
：末端またはやゝ末端寄り、稀には中心部グラム−染色：陰性表２菌株G493−B6の培養特性サブロー・デキストロース・ブロス
：貧弱な生育グルコース・ペプトン・ブロス
：粘張性沈降物を伴つて混濁。菌膜無。PH5.5 栄養寒天スラント
：普通の生育。薄く、不透明な、平滑な、微粘
張性のかつクリーム様栄養寒天上のコロニー
：円形または若干不規則。不規則な縁を伴つて
盛り上り。不透明密度および滑から表面。直径
２〜４mm。若干粘張性でかつクリーム色を帯び
た白色。サテライトコロニー無。（37℃で24時間培養）表３菌株G493−B6の生理学的特徴生育温度生育：20〜45℃ 生育しない：10℃および50℃ グルコース、アラビノース、キシロースまたは
マンニツトからのガス：− アラビノース、キシロロースまたはマンニツト
からの酸：＋グルコースからのアセトイン：− でんぷんの加水分解：＋インドール生成：− 硝酸塩からの亜硝酸塩：＋ゼラチンの液化：＋カタラーゼ：＋フエニルアラニンの脱アミノ化：− 0.001％リゾチーム中の生育：＋嫌気性寒天での生育（ヒユー・レイフソン培
地）：＋クエン酸利用：＋ミルクでの反応：ペプトン化および凝固尿素の分解：＋ NaCl耐性：３％で生育、４％で生育しない上記の点から、バチルス・サーキユランス菌株
G493−B6は次の診断特性を有していることがわ
かる。すなわち、(1)グラム陰性菌株、(2)内生胞子
部位で膨張した胞子のう、(3)末端または末端近く
の部位に形成される胞子、(4)楕円形胞子、(5)グル
コース、アラビノース、キシロースまたはマンニ
ツトからの酸生成、但しガス形成無、(6)でんぷん
加水分解、(7)アセトインが生成されない、(8)イン
ドールが生成されない、(9)通常培地例えば栄養寒
天で普通の生育が生じる。上記特徴から、本菌は
バチルス（Bacillus）属に属すると分類された。バージエイ・マニユアル（Bergey′s Manual）
（第８版、1974年）に記載のバチルス属の22の種
のうち、５種は通常の培地では生育せず、それ故
に菌株G493−B6と区別することができる。残り
の17の種のうち、８種〔B.アルベイ（B.alvei）、
B.ブレビス（B.brevis）、B.サーキユランス、B.
コアギユランス（B.coagulans）、B.ラテロスボ
ラス（B.laterosporus）、B.マセランス（B.
macerans）、B.ポリミキサ（B.polymyxa）およ
びB.ステアロサーモフイルス（B.
stearothermophilus）〕は生産菌株と若干の菌学
的類似性を有している。それ故、菌株G493−B6
を８種の各々と比較した。菌株G493−B6の微生
物学的特徴はB.サーキユランスの特徴と非常に
似ている。しかしながら、菌株G493−B6はグル
コースからガスの発生を誘起する能力において
B.ポリミキサおよびB.マセランスと異り、内生
胞子部位での胞子のう膨張および50℃での発育欠
除においてB.ステアロサーモフイルスおよびB.
コアギユランスと異り、アラビノース、キシロー
スまたはマンニツトからの酸の形成およびインド
ール生成の欠除においてB.アルベイと異り、ま
たアラビノースまたはキシロースからの酸形成お
よびでんぷんの加水分解においてB.ラテロスポ
ラスおよびB.ブレビスと異つている。従つて、
生産菌をバチルス・サーキユランス（Bacillus
circulans）の菌株であると決定した。その他の微生物の場合のように、菌株G493−
B6の特徴は変化を受け得る。例えば、G493−B6
菌株の人工変異株は種々の既知の変異誘発原例え
ば紫外線、Ｘ線、高周波、放射線および化学薬品
での処理によつて得ることができる。Bu−2470
抗生物質を生産するバチルス・サーキユランス
G493−B6の全ての天然および人工変異株（以下
変異株と称する）は本発明の範囲内に包含される
ものと企図されている。抗生物質生産抗生物質錯体Bu−2470は、水性栄養培地で深
部好気性条件下にバチルス・サーキユランスの
Bu−2470生産菌株、最も好ましくはATCC31805
の同定指標を有する菌株バチルス・キユランス菌
株G493−B6またはその変異株の培養により生産
される。菌株は同化可能な炭素源例えば同化可能
な炭化水素を含む栄養培地で発育する。適当な炭
素源の例にはグルコース、リボース、ガラクトー
ス、フルクトース、マンノース、シユクロース、
ラクトース、可溶性でんぷんおよびグリセロール
が包含される。栄養培地はまた例えば魚粉、大豆
粉、コーン・スチープ・リカー、ペプトン、肉エ
キス、落花生粉、酵母エキスまたはアンモニウム
塩のような同化可能な窒素源を含有しなければな
らない。無機塩例えば塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン
酸塩等を必要に応じて加えてよい。微量元素例え
ば銅、マンガン、鉄、亜鉛、等を所望により培地
に加えてよいし、または培地の他の成分の不純物
として供給してもよい。培養温度はBu−2470生
産菌株が生育し得る任意の温度例えば20〜45℃で
あり得るが、醗酵を25〜35℃、特に27〜32℃で実
施するのが好ましい。中性もしくは中性近辺の当
初PH例えばPH６〜７を培地に使用するのが好まし
く、また抗生物質の生産は普通約２〜７日の間実
施する。普通、最適の生産は４〜６日で達成され
る。比較的小量の生産には、振とうフラスコおよ
び表面培養を使用することができるが、より大量
の製造には滅菌タンクでの深部好気性培養が好ま
しい。タンク醗酵を実施する場合、微生物の胞子
をブロス培地に接種し、そして若い活性のある栄
養接種体が得られた場合に接種体を醗酵タンク培
地に無菌的に移すことにより栄養ロス中に栄養接
種体を生産するのが望ましい。タンクおよびびん
での通気は無菌空気を醗酵中の培地中にまたはそ
の表面に圧入することによつて提供することがで
きる。その上のかくはんは機械的羽根車により提
供することができる。必要に応じて、消泡剤例え
ばラード油をも添加してもよい。醗酵培地中でのBu−2470の生産は、醗酵の過
程で、バチルス・スブチリス（Bacillus
subtilis）PCI219およびE.コリ（E.coli）NIHJを
供試菌として使用するペーパー・デイスク−寒天
拡散検定法により容易に追跡することができる。 Bu−2470の抗生物質の単離最適のブロス力価が得られた後、菌糸体および
未溶解残渣を通常の手段例えば過または遠心分
離により醗酵ブロスから分離する。抗生物質活性
は上澄液（または液）に含まれ、そして塩基性
抗生物質を単離するための常法例えば溶媒抽出お
よび吸着技術を用いて採取することができる。本発明の個々の抗生物質因子を単離するための
一つの操作を具体的に説明するに、、上澄液また
は液（菌糸体ケーキを除去した後）を陽イオン
交換樹脂例えばアンバーライト
（AMBERLITE）IRC−50に吸着させ、次に樹脂
を鉱酸溶液で溶離してBu−2470抗生物質を遊離
させることができる。次に溶離液を中和し、活性
炭に吸着させる。吸着された抗生物質を活性炭か
ら例えば酸性PHで水性ｎ−ブタノールで溶離す
る。ブタノール層を分離し、凍結乾燥もしくは真
空濃縮するとBu−2470B成分（B₁，B_2aおよび
B_2b）の混合物が得られる。酸性水層を中和し、
次にｎ−ブタノールで抽出し、ｎ−ブタノール抽
出液を蒸発すると追加のBu−2470B成分が得ら
れる。中性ｎ−ブタノール抽出からの水層を塩基
性となし（例えば、PH10）、ｎ−ブタノールで再
度抽出し、真空濃縮および（または）ｎ−ブタノ
ール層の凍結乾燥するとBu−2470Aが得られる。因子Bu−2470Aは適当な吸着剤例えばダイア
イオン（DIAION）HP−20での吸着クロマトグ
ラフイーにより精製することができる。例とし
て、粗製Bu−2470AをダイアイオンHP−20のカ
ラムにかけ、次に水、水性メタノールおよび酸性
水性メタノールで順次溶離することができる。実
質的に純粋なBu−2470Aは一般に水性メタノー
ルフラクシヨンから得られ、これらのフラククシ
ヨンは所望によりクロマトグラフイー操作の反覆
により更に精製することができる。上記のとおり得られたBu−2470B成分は通常
の吸着操作により個々のB₁，B_2aおよびB_2b成分
に分離することができる。例えば、Bu−2470B
混合物をCM−セルロース（Cellulose）Ｃ−25の
カラムに吸着させ、そしてカラムを0.1M NaCl
で展開する。検定して、適切なフラクシヨンをプ
ールし、ｎ−ブタノールで抽出すると精製Bu−
2470B₁およびBu−2470B_2aおよびBu−2470B_2bの
混合物が得られる。B_2aおよびB_2bの分離は逆相
カラム例えばLiChrosorb RP−18を用いる高速
液体クロマトグラフイー（HPLC）により達成す
ることができる。 Bu−2470抗生物質の特徴以下の記載において、成分B₂は亜成分B_2aおよ
びB_2bの混合物を意味し、一方成分B₁およびB₂を
集合的にBu−2470Bと称する。 Bu−2470A，B₁およびB₂は塩酸塩としてまた
は遊離塩基として単離すると白色無定形固体であ
る。これらは表４に示すようにTLCおよびPPC
（ペーパー・分配クロマトグラフイー）により相
互にまた関係したオクタペプチド抗生物質と区別
することができる。

【表】 Bu−2470Aは広いPH領域にわたつて水、水性
低級アルコール、水性ジオキサン、ジメチルスル
ホキサイドおよびジメチルホルムアミドに易溶で
あり、低級アルコールに難溶であり、また他の有
機溶媒には現実に不溶である。Bu−2470Bは酸
性水、水性低級アルコール、水性ジオキサン、ジ
メチルスルホキサイドおよびジメチルホルムアミ
ドに可溶であり、中性およびアルカリ性水および
低級アルコールに難溶であり、そして他の有機溶
媒に不溶である。Bu−2470AおよびＢはニンヒ
ドリン試薬に陽性反応を示すが、アンスロン、フ
エーリング、坂口およびFeCl₃反応に関しては陰
性である。 Bu−2470Aの遊離塩基および塩酸塩は明確な
融点を示さず、230℃以上で分解する。Bu−
2470B₁およびB₂は220℃以上で徐々に分解する。
Bu−2470成分の塩酸塩の微量分析データおよび
旋光度を表５に示す。

【表】 Bu−2470AおよびＢはUVスペクトルで末端吸
収のみを示す。Bu−2470A，B₁およびB₂のIRス
ペクトルをそれぞれ第１，２および３図に示す。
Bu−2470A，B₁およびB₂のプロトンNMRスペ
クトルをそれぞれ第４，５および６図に示し、い
ずれもδ：7.23ppmにおいて特徴のある５プロト
ン・シングレツトを含有し、これはBu−2470成
分のいずれにもフエニル基の存在を示唆するもの
である。 Bu−2470A，B₁，B_2aおよびB_2bの構造は次の
とおり決定された。

【表】式中、Dabはα，γ−ジアミノ酪酸であり、
Leuはロイシンであり、そしてPheはフエニルア
ラニンである。構造決定に使用した操作は以下の
操作１〜４に記載する。構成アミノ酸 Bu−2470Aの酸加水分解物のアミノ酸分折に
より、モル比１：２：５でフエニルアラニン、ロ
イシンおよびα，γ−ジアミノ酪酸の存在が判つ
た。単離アミノ酸の比旋光度値（5N HCl）は
Leuについて＋16゜、Pheについて＋5゜およびDab
について＋11゜であり、これによりBu−2470Aは
２個のＬ−Leu、１個のＤ−Pheおよび１個のＤ
−および４個のＬ−Dabからなつていることがわ
かる。加水分解物には脂肪酸が検出されなかつ
た。 Bu−2470Aを炭酸ナトリウム中２，４−ジニ
トロフルオロベンゼンで処理するとBu−2470A
のペンタ−Ｎ−２，４−ジニトロフエニル
（DNP）誘導体が得られた。6N HCl中でのDNP
誘導体の酸加水分解によりα，γ−ビス−DNP
−Dab、γ−DNP−Dab、Dab、LeuおよびPhe
が得られた。同定の目的のために、ビス−DNP
−Dabの標品を公知の方法〔J.Am.Chem.Soc.，
第76巻、第1328〜1331頁、1954年〕で合成し、ま
たγ−DNP−DabはDNP−コリスチンの酸加水
分解物〔J.Chem.Soc.、1964年、第4107〜4125
頁〕から得られた。DNP−Bu−2470Aから遊離
Dabおよびビス−DNP−Dabの遊離により、有
枝鎖を有する環状ペプチド構造が示唆され、１個
のDabはペプチド環と連結しており、他のDabは
有枝鎖のＮ−終末端にある。それで、Bu−
2470Aのアミノ酸組成（数および偏光力）ならび
に上記の２個のDab構成分の位置は抗生物質335
−25について文献に報告されているのと同一であ
る。脂肪酸部分 Bu−2470B₁およびB₂を16時間6N HClで加熱
した。加水分解物のアミノ酸分析によれば、Bu
−2470B₁およびB₁のアミノ酸構成分はBu−
2470Aのそれと同一であることがわかつた。更
に、Bu−2470B₁およびB₂の加水分解物中には親
油性、酸性物質の存在が示された。 Bu−2470B₁を30分間6N HClで簡単に加水分
解し、加水分解物をジエチルエーテルで抽出し
た。エーテル抽出液を蒸発すると脂肪酸が得ら
れ、このものはそのメチルエステルのGC−MS
分折により３−ヒドロキシ−８−メチルデカン酸
と同定された。同様にして、Bu−2470B₂の加水
分解物から２個の脂肪酸が得られ、これらの酸は
３−ヒドロキシ−８−メチル−ノナン酸および３
−ヒドロキシ−ｎ−デカン酸と同定された。従つ
て、Bu−2470B₂は異つた脂肪酸部分を有する２
個の亜成分からなることがわかつた。２個の亜成
分（subcomponent）をBu−2470B_2a（３−ヒドロ
キシ−８−メチル−ノナン酸を含有している）お
よびBu−2470B_2b（３−ヒドロキシ−ｎ−デカン
酸を含有している）と命名した。酵素的脱アシル化武庫川女子大学記要（Bulletin of Mukogawa
Women′s University）、第14巻、第243〜252頁、
（1966年）に木村および平井が、シユードモナス
（Pseudomonas）sp.菌株Ｍ−６−３の細胞がポ
リミキシンを脱アシル化する酵素活性を有するこ
とを報告している。この酵素はポリミキシンアシ
ラーゼと命名された。シユードモナス・エルギノ
ーザ（Pseudomonas aeruginosa）Ｋ−102（本出
願人の菌株Pa−74）菌株はコリスチンおよびポ
リミキシンを脱アシル化し得る同タイプの酵素を
生産することが見い出された。反対説も報告され
ているが、ポリミキシンアシラーゼは抗生物質の
オクタペプチン基を脱アシル化し得ることが見い
出された。 Bu−2470BをPH７りん酸塩緩衝液に懸濁し、
ポリミキシンアシラーゼの製剤と混合した。懸濁
液を３日間振とうしながら37℃で培養した。酵素
反応混合物を過し、PH２でｎ−ブタノールで抽
出すると未変化のBu−2470Bが除去された。次
に、水相をアルカリ性（PH9.5）となし、ｎ−ブ
タノールで再度抽出した。第二のブタノール抽出
液を蒸発させ、残渣をクロマトグラフイー（ダイ
アイオンHP−20）により精製すると生物活性を
有するフラグメントが得られ、このものはBu−
2470Aと同定された。Bu−2470B₁およびB₂の酵
素脱アシル化により同一生成物Bu−2470Aが得
られた。それだ、Bu−2470A，B₁およびB₂は同
一のオクタペプチド構造を有することがわかり、
成分Ａは非アシル化であり、また成分B₁および
B₂は異つた脂肪酸部分でアシル化されている。 EM−49錯体および抗生物質333−25もまた５
日間37℃でポリミキシンアシラーゼで処理すると
それらの脱アシル化生成物が得られた。脱アシル
333−25はTLC，IRおよびNMRスペクトルによ
りBu−2470Aと同定された。それ故、Bu−2470成分の各々のペプチド構造
は抗生物質333−25のそれと同一であつた。塩形成 Bu−2470抗生物質は塩基性ペプチドであり、
それ故有機および無機酸と塩を形成する。本発明
の範囲内に含有される製薬上許容し得る酸付加塩
には例えば塩酸、硫酸、りん酸、酢酸、ステアリ
ン酸、プロピオン酸、酒石酸、マレイン酸、安息
香酸、コハク酸等のような有機酸および無機酸と
の無毒性塩があげられる。塩形成は塩基性抗生物
質（例、EM−49）で使用される常法例えば遊離
塩基を所望の酸で処理し次いで凍結乾燥または溶
媒沈降により達成される。生物学的特性抗生物質錯体Bu−2470およびこれから得られ
る生物活性ペプチドフラクシヨンは顕著な抗菌活
性を有している。試験管内試験では、Bu−
2470Aは一般には供試微生物に対して成分B₁およ
びB₂よりも活性が低い。但し、E.コリ（E.coli）
およびサルモネラ（Salmonella）種を除く（こ
れらは３種のBu−2470成分に対してほゞ同等の
感受性を有している）。試験管内試験でのBu−
2470B₁およびB₂（B_2a＋B_2b）はシユードモナス
（Pseudomonas）種を包含するグラム陽性および
陰性細菌に対して広い抗菌活性を示すが、プロテ
ウス（Proteus）種を阻害しなかつた。 Bu−2470A，B₁およびB₂の最小阻止濃度
（MIC）を37℃での一昼夜培養を伴うミユーラー
−ヒントン（Mueller−Hinton）寒天培地を用い
る２倍系列希釈法により測定した。一昼夜培養物
の10⁴希釈を接種体として使用した。Bu−
2470A，B₁およびB₂の抗菌スペクトラムを以下
の表６に示す。

【表】表７に示したように、Bu−2470A，B₁および
B₂は、シユードモナス（Pseudomonas）種のい
ろいろなもの〔P.エルギノーザ（aeruginosa）、
P.セパシア（cepacia）、P.マルトフイリア
（maltophilia）、P.メラノゲナム
（melanogenum）およびP.プテイダ（putida）を
包含する〕に対して活性であつた。Bu−2470A
はシユードモナス種に対してBu−2470B₁および
B₂と同等または若干一層活性であることがわか
つた。

【表】

【表】 Bu−2470A，B₁およびB₂の生体内抗菌活性を、
E.コリ、K.ニユーモニアおよびP.エルギノーザに
因るマウスの実験感染症で評価した。マウスは豚
胃液ムチンの５％懸濁液中の病源体の100LD₅₀投
与量で腹腔内に接種された。Bu−2470は細菌攻
撃直後に筋肉内経路で投与した。各投与量レベル
について１群５匹のマウスを使用し、動物を５日
間観察して50％防御量（PD₅₀）を求めた。結果
を表８に示す。 Bu−2470Aは、成分B₁およびB₂に比して、試
験管内よりも生体内で比較的一層の活性があるこ
とが見い出された。

【表】 Bu−2470AおよびB₁の急性毒性を静脈内（iv）
および皮下（sc）経路によりマウスで測定した。
コリスチンを対照化合物として相対して試験し
た。表９に示すように、Bu−2470B₁はivおよび
sc経路共にコリスチンよりも毒性がより低く、一
方Bu−2470Aはiv経路によりコリスチンよりも
毒性が低いが、sc経路では毒性がより高いもので
あつた。

【表】上掲の生体内および試験管内スクリーニング・
データから明らかなように、Bu−2470およびそ
の生物活性成分Bu−2470A，Ｂ，B₁，B_2aおよび
B_2bは抗菌剤として、動物飼料中の栄養補助剤と
してまた人を包含する家きんおよび動物での治療
剤として有用である。これら抗生物質はBu−
2470抗生物質に対して感受性を有するグラム陽性
およびグラム陰性細菌によつて生じる動物（特に
家きんおよび哺乳動物）の感染疾病の治療に殊に
有用である。本発明はその範囲内に不活性製薬上許容し得る
担体または希釈剤と組合さつて有効な抗菌量の
Bu−2470A，B₁，B_2aまたはB_2b（その製薬上許容
し得る酸付加塩を包含する）あるいはその混合物
を含有する製薬組成物を包含している。該組成物
は問題の投与経路に適した任意の製薬形態に調製
することができる。該組成物の例には経口投与の
ための固形組成物例えば錠剤、カプセル剤、丸
剤、散剤および顆粒剤、経口投与のための液体組
成物例えば液剤、懸濁剤、シロツプ剤またはエリ
キシール剤ならびに非経口投与のための製剤例え
ば無菌溶液、懸濁剤または乳濁剤が包含される。
非経口組成物はまた使用直前に滅菌水、生理食塩
水またはいくつかの他の無菌の注射可能な媒質に
溶解し得る無菌の固形組成物の形態で製造するこ
ともできる。本発明の抗生物質（その製薬上許容し得る酸付
加塩を包含する）を投与してその結果抗生物質の
濃度が処置されている特別の微生物に対する
MICよりも大きくなる。使用する抗生物質の実
際の投与量は、例えば年令、体重、性別、食事、
投与経路、排泄速度、患者の条件、薬物組合せな
らびに処置されている特別の部位および疾病のよ
うな要素を考慮した後医師または獣医師により定
められることは言うまでもない。本発明はまたグラム陽性またはグラム陰性細菌
により侵されている動物宿主（特に家きんおよび
人を包含する哺乳動物）に有効な抗菌投与量の
Bu−2470（Bu−2470A，B₁，B_2aおよびB_2bの
個々の成分またはその混合物を包含する）または
その製薬上許容し得る酸付加塩を投与することを
特徴とする前記宿主を治療的に処置する方法を提
供する。以下の実施例は具体的な説明のためにのみ掲げ
るものであり、本発明の範囲の限定を企図してい
るものではない。アンバーライト
（AMBERLITE）IRC−50〔ペンシルバニア、フ
イラデルフイア、ローム・アンドハース・カンパ
ニー（Rohm and Haas Co.）の商品名）〕はカ
ルボン酸−ポリメタクリル酸タイプの弱酸性陽イ
オン交換樹脂である。アンバーライトIR−45（ロ
ーム・アンド・ハース・カンパニーの商品名）は
弱塩基性陰イオン交換樹脂である。ダイアイオン
HP−20（三菱化成株式会社の商品名）は非イオ
ン性巨網状（多孔性）重合体樹脂である。ダウエ
ツクス（DOWEX）50W〔ダウ・ケミカル・カン
パニー（Dow Chemical Co.）の商品名〕はスル
ホン酸官能価を有する強酸性陽イオン交換樹脂で
ある。LiChrosorb〔E.メルク（Merck）の商品
名〕RP−18は微顆粒HPLCカラムパツキングで
ある。構造決定実験操作１−Bu−2470Aの加水分解 6N HCl15ml中のBu−2470A（300mg）の溶液を
密封管中で15時間105℃に加熱した。反応混合物
を真空で濃縮乾涸した。残渣を水１mlに溶解し、
そしてダウエツクス50W×４のカラム（12×250
mm）でクロマトグラフを行つた。カラムを増加す
る濃度の塩酸（0.1N−1.0N）で展開し、溶離を
ニンヒドリン試験およびTLC^*で監視した。適当
なフラクシヨンを採取し、真空濃縮すると次の３
種のアミノ酸が得られた。

【表】

【表】操作２−ペンタ−（２，４−ジニトロフエニル）−
Bu−2470Aの製造および酸加水分解エタノール２ml中のジニトロフルオロベンゼン
（236mg）の溶液をBu−2470A（100mg）および
NaHCO₃（134mg）の水溶液（４ml）に加え、そ
して混合物を暗室で20℃で1.5時間かくはんした。
沈殿した黄色固体を集し、水およびベンゼンで
洗い、次いで真空乾燥した。粗生成物をシリカゲ
ルクロマトグラフイーにより精製した。カラム
（10×200mm）をCHCl₃：CH₃OH（93：７）で溶
離し、そして溶離を特徴のある黄色およびTLC
で監視した。適当なフラクシヨンを採集し、真空
蒸発するとBu−2470AのDNP誘導体111mgが得ら
れた。 λ_nax（５％ジオキサン−CH₃OH）：347nm（Ｅ１％１cm
472）。TLC（SD−105）^*：Rf0.43。 DNP−Bu−2470Aの試料（５mg）を密封管中
で15時間6N HCl0.5mlと共に105℃に加熱した。
反応混合物を真空濃縮し、凍結乾燥した。このよ
うにして得られた黄色固体をTLCで分折し、そ
して次の５種の化合物が同定された。

【表】操作３−Bu−2470B₁およびB₂、Bu−1880および
EM−49からの脂肪酸の単離 6N HClの0.5ml中のBu−2470B₁（10mg）の溶液
を封管で0.5時間105℃に加熱した。加水分解物に
水５mlを加え、ジエチルエーテル５ml宛２部分量
で抽出した。エーテル溶液を無水Na₂SO₄で乾燥
し、真空濃縮すると油状残渣（２mg）が得られ
た。この油をエーテル３mlにとり、エーテル溶液
中過剰のジアゾメタンで処理した。溶媒を蒸発す
るとメチルエステル（２mg）が得られ、このもの
をGCおよびGC−MS（ガスクロマトグラフイーお
よびガスクロマトグラフイー−マススペクトロメ
トリー）により分折した。同様にして、Bu−2470B₂（10mg）、Bu−1880
（10mg）およびEM−49（10mg）を加水分解し、そ
して脂肪酸部分をメチルエステルに変換した。こ
れらのメチルエステルのGCおよびGC−MS分析
を以下に示す。

【表】操作４−デアシルBu−2470B、デアシルEM−49
およびデアシル333−25の単離ゼレンゼンりん酸塩緩衝剤（PH7.0）30ml中の
Bu−2470B（100mg）の懸濁液をポリミキシンア
シラーゼ（120mg）と組合せ、そして混合物を振
とうしながら３日間37℃で培養した。酵素反応混
合物を遠心分離し、そして透明な上澄液をPH2.0
に調節し、ｎ−ブタノール20ml２部分量で抽出し
た。抽出液を蒸発すると未変化のBu−2470Bの
26mgが得られた。水層を2N NH₄OHでPH9.5に調
節し、ｎ−ブタノール20ml秤取量２部分で再度抽
出した。第二のブタノール抽出液を合し、そして
真空濃縮するとデアシルBu−2470Bの粗製固体
（55mg）が得られた。固体を水２mlに溶解し、1N
HClでPH2.0に調節し、そしてダイアイオンHP−
20のカラム（10×160mm）でクロマトグラフを行
つた。カラムを水で展開し、そしてフラクシヨン
をニンヒドリン検定およびTLC^*により監視し
た。デアシルBu−2470Bの収量は32mgであつた。上記実験に記載したのと同じ操作に本質的に従
つて、EM−49錯体（10mg）をポリミキシンアシ
ラーゼ（12mg）で処理するとデアシルEM−49の
5.0mgが得られ、EM−49の1.5mgが共に回収され
た。同じく、抗生物質333−25（10mg）をポリミキ
シンアシラーゼ（12mg）で脱アシル化するとデア
シル333−25の4.9mgおよび未変化の333−25の2.5
mgが得られた。＊ SiO₂，CHCl₃：CH₃OH：28％NH₄OH （１：２：1v／ｖ）実施例１ Bu−2470錯体の醗酵十分に生育したバチルス・サーキユランス菌株
G493−B6の寒天スラントを使用して、グリセロ
ール２％、コーン・スチープ・リカー１％、フア
ルマメデイア（PHARMAMEDIA）（綿実粉の
商品名）１％、（NH₄）₂SO₄の0.3％、ZnSO₄・
7H₂Oの0.003％、CaCO₃の0.4％を含む栄養培地
（滅菌前PHを7.0に調節）に接種した。種培地を回
転振とう機（250rpm）で72時間28℃で培養し、
そして培地５mlを500mlエルレンマイヤーフラス
コに移した。このフラスコには、グリセロール３
％、大豆粉３％、（NH₄）₂SO₄の0.3％、ZnSO₄・
7H₂Oの0.003％およびCaCO₃の0.4％からなる醗
酵培地100ml（PH7.0）が入つていた。醗酵を回転
振とう機で５〜７日間28℃で実施した。醗酵ブロ
ス中の抗菌活性を供試菌としてバチルス・スブチ
リスPCI219およびエツシエリヒア・コリNIHJを
使用するペーパ・デイスク−寒天拡散検定法で測
定した。抗生物質生産が６日目に最高に達し、こ
の時点で醗酵ブロスは一般に粘張性となつた。抗
生物質濃度は約1000mcｇ／mlであつた。実施例２ Bu−2470成分の採取実施例１からの粘張性醗酵ブロス（10L、PH
7.5）を水および小量の消泡剤で25Lに希釈した。
菌糸体ケーキを連続遠心分離で除去し、透明なブ
ロス上澄液をアンバーライトIRC−50（NH₄ ⁺，
2L）と共にかくはんした。樹脂を水（20L）で洗
い、次に0.5N HClの2.5L部分量で３回溶離して
抗生物質活性体を遊離させた。活性溶離液を合し
（9L）、PH7.0に調節し、そして活性炭（180ｇ）と
共にかくはんした。活性炭を分離し、活性体をｎ
−ブタノールと水との混合物（１：1v／ｖ，2L）
で２回溶離し、溶離液のPHを6N HClで2.0に調
節した。ｎ−ブタノール層（1.5L）を分離し、真
空濃縮するとBu−2470B成分（B₁，B_2aおよび
B_2b）の粗製混合物（1.35ｇ）が得られた。酸性
水層をアンバーライトIR−45（OH^-）で中和し、
そしてｎ−ブタノールの1L部分量で２回抽出し
た。ｎ−ブタノール抽出液を蒸発させると追加の
量のBu−2470B混合物（440mg）が得られた。次
に水層を濃NH₄OHでアルカリ性（PH10.0）とな
し、ｎ−ブタノール（1L×３）で再び抽出した。
後者のｎ−ブタノール抽出液を合し、真空濃縮し
そして凍結乾燥するとBu−2470Aの粗製固体
（4.65ｇ）が得られた。 Bu−2470A（5.5ｇ）の粗調製物をダイアイオン
HP−20のカラム（800ml、使用前0.1N NH₄OH
で洗う）にかけ、このカラムを水（3.5L）、50％
メタノール（5.5L）および酸性50％メタノール
（PH２，3.5L）で順次展開した。溶離をバイオア
ツセイ（対シユードモナス菌株Pss−１）および
TLC（薄層クロマトグラフイー）（シリカゲルプ
レート、CHCl₃：CH₃OH：28％NH₄OH1：２：
1v／ｖ）によつて監視した。まず50％メタノー
ルで溶離された生物活性フラクシヨンをプール
し、濃縮するとBu−2470A（788mg）の純粋な調
製物が得られた。次の活性フラクシヨンは痕跡量
の不純物を含有し、そして更に同じクロマトグラ
フイーの反覆により精製すると追加量の純粋な
Bu−2470A（1.0ｇ）が得られた。成分Ｂ混合物（500mg）の粗製サンプルをCM
−セルロースＣ−25のカラム（400ml、0.1M
NaClで予備処理した）に充填した。カラムを
0.1M NaClで展開し、そして溶離液をB.スブチ
リスPCI−219に対するバイオアツセイにより検
討した。適当なフラクシヨンをプールし、ｎ−ブ
タノールで抽出した。Bu−2470B₂（75mg）がまず
溶離され、次いでBu−2470B₁およびB₂の混合物
（89mg）次いで純粋なBu−2470B₁（89mg）が溶離
された。Bu−2470B₂は後で２種の亜成分、Bu−
2470B_2aおよびBu−2470B_2bの混合物であること
が決定された。実施例３ Bu−2470B₂亜成分の分離 Bu−2470のB₂成分を、ウオーターズ・アソシ
エーツ・インコーポレーテツド（Waters
Associates Inc.）モデル6000A装置（U6Kイン
ジエクターおよび440UVデイテクター付き）お
よび逆相カラム（LiChrosorb RP−18、φ4×30
mm）を用いてHPLC技術により、２種の亜成分、
Bu−2470B_2aおよびBu−2470B_2bに更に分離し
た。クロマトグラフを流速1.0ml／分および導入
圧2500psiで実施した。移動相は36：64v／ｖの比
のアセトニトリルおよび0.005M酒石酸塩緩衝剤
の混合物であり、緩衝液を硫酸ナトリウム
（0.05M）およびヘプタン酸ナトリウム
（0.005M）で補充した。溶離を254nmでのUV吸
収によりモニターした。Bu−2470B_2aが滞留時間
（Rt）7.42分で溶出され、次いでRt8.17分でBu−
2470B_2b、同一条件下でBu−2470B₁がRt12.42分
で出現した。

【図面の簡単な説明】

第１図は臭化カリウムにペレツトとしたBu−
2470A塩酸塩の赤外吸収スペクトルを示す。第２
図は臭化カリウムにペレツトとしたBu−2470B₁
塩酸塩の赤外吸収スペクトルを示す。第３図は臭
化カリウムにペレツトとしたBu−2470B₂の赤外
吸収スペクトルを示す。第４図は内部標準として
TMSを用い、JEOL60MHzNMR分光計で測定し
たD₂Oに溶解したBu−2470A塩酸塩のNMRスペ
クトルを示す。第５図は内部標準としてTMSを
用い、JE0L60MHzNMR分光計で測定したD₂Oに
溶解したBu−2470B₁塩酸塩のNMRスペクトル
を示す。第６図は内部標準としてTMSを用い、
JE0L60MHzNMR分光計で測定したD₂Oに溶解し
たBu−2470B₂（B_2a＋B_2b）塩酸塩のNMRスペク
トルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１式（式中Ｒは水素、
【式】【式】または【式】あるいはその製薬上許容し得る酸付加塩であり、
また式中Dabはα，γ−ジアミノ酪酸を示し、
Leuはロイシンを示し、そしてPheはフエニルア
ラニンを示す）を有するペプチド抗生物質化合
物。２式（式中Dabはα，γ−ジアミノ酪酸を示し、
Leuはロイシンを示し、そしてPheはフエニルア
ラニンを示す）のペプチド抗生物質Bu−2470A
またはその製薬上許容し得る酸付加塩である特許
請求の範囲第１項記載のペプチド抗生物質化合
物。３遊離塩基の形態である特許請求の範囲第２項
記載のペプチド抗生物質化合物。４塩酸塩の形態である特許請求の範囲第２項記
載のペプチド抗生物質化合物。５式（式中Ｒは【式】であり、Dabはα，γ−ジアミノ酪酸を示し、
Leuはロイシンを示し、そしてPheはフエニルア
ラニンを示す）を有するペプチド抗生物質Bu−
2470B₁またはその製薬上許容し得る酸付加塩で
ある特許請求の範囲第１項記載のペプチド抗生物
質化合物。６遊離塩基の形態である特許請求の範囲第５項
記載のペプチド抗生物質化合物。７塩酸塩の形態である特許請求の範囲第５項記
載のペプチド抗生物質化合物。８式（式中、Ｒは【式】であり、Dabはα，γ−ジアミノ酪酸を示し、Leu
はロイシンを示し、そしてPheはフエニルアラニ
ンを示す）を有するペプチド抗生物質Bu−
2470B_2aまたはその製薬上許容し得る酸付加塩で
ある特許請求の範囲第１項記載のペプチド抗生物
質化合物。９遊離塩基の形態の特許請求の範囲第８項記載
のペプチド抗生物質化合物。１０塩酸塩の形態である特許請求の範囲第８項
記載のペプチド抗生物質化合物。１１式（式中、Ｒは【式】であり、Dabはα，γ−ジアミノ酪酸を示し、Leuは
ロイシンを示し、そしてPheはフエニルアラニン
を示す）を有するペプチド抗生物質Bu−2470B_2b
またはその製薬上許容し得る酸付加塩である特許
請求の範囲第１項記載のペプチド抗生物質化合
物。１２遊離塩基の形態の特許請求の範囲第１１項
記載のペプチド抗生物質化合物。１３塩酸塩の形態である特許請求の範囲第１１
項記載のペプチド抗生物質化合物。１４窒素および炭素の同化可能な源を含有する
水性栄養培地で深部好気的条件下にバチルス・サ
ーキユランスのBu−2470A生産菌株を、前記培
地に該菌株により実質的な量のBu−2470Aが生
産されるまで、培養し、そして次に培地から共生
産物質を実質的に含むことなくBu−2470A抗生
物質を採取することを特徴とするペプチド抗生物
質Bu−2470Aの製造方法。１５ Bu−2470A生産菌株がATCC31805の同定
指標を有する特許請求の範囲第１４項記載の方
法。１６ペプチド抗生物質をその製薬上許容し得る
酸付加塩に変換する特許請求の範囲第１４項また
は第１５項記載の方法。１７窒素および炭素の同化可能な源を含有する
水性栄養培地で深部好気的条件下にバチルス・サ
ーキユランスのBu−2470B₁生産菌株を、前記培
地に該菌株により実質的な量のBu−2470B₁が生
産されるまで、培養し、そして次に培地から共生
産物質を実質的に含むことなくBu−2470B₁抗生
物質を採取することを特徴とするペプチド抗生物
質Bu−2470B₁の製造方法。１８ Bu−2470B₁生産菌株がATCC31805の同定
指標を有する特許請求の範囲第１７項記載の方
法。１９ペプチド抗生物質をその製薬上許容し得る
酸付加塩に変換する特許請求の範囲第１７項また
は第１８項記載の方法。２０窒素および炭素の同化可能な源を含有する
水性栄養培地で深部好気的条件下にバチルス・サ
ーキユランスのBu−2470B_2a生産菌株を、前記培
地に該菌株により実質的な量のBu−2470B_2aが生
産されるまで、培養し、そして次に培地から共生
産物質を実質的に含むことなくBu−2470B_2a抗生
物質を採取することを特徴とするペプチド抗生物
質Bu−2470B_2aの製造方法。２１ Bu−2470B_2a生産菌株がATCC31805の同
定指標を有する特許請求の範囲第２０項記載の方
法。２２ペプチド抗生物質をその製薬上許容し得る
酸付加塩に変換する特許請求の範囲第２０項また
は第２１項記載の方法。２３窒素および炭素の同化可能な源を含有する
水性栄養培地で深部好気的条件下にバチルス・サ
ーキユランスのBu−2470B_2b生産菌株を、前記培
地に該菌株により実質的な量のBu−2470B_2bが生
産されるまで、培養し、そして次に培地から共生
産物質を実質的に含むことなくBu−2470B_2b抗生
物質を採取することを特徴とするペプチド抗生物
質Bu−2470B_2bの製造方法。２４ Bu−2470B_2b生産菌株がATCC31805の同
定指標を有する特許請求の範囲第２３項記載の方
法。２５ペプチド抗生物質をその製薬上許容し得る
酸付加塩に変換する特許請求の範囲第２３項また
は第２４項記載の方法。２６不活性製薬上許容し得る担体または希釈剤
と組合わされてBu−2470A，Bu−2470B₁，Bu−
2470B_2a，Bu−2470B_2bおよびその製薬上許容し
得る酸付加塩からなる群から選択される少なくと
も１種の抗生物質を有効な抗菌量で含有する抗菌
組成物。