JPH0343097A - 染色体ｄｎａフラグメントのパルスフィールドゲル電気泳動法によるミコバクテリアの識別法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、原核生物の染色体ＤＮＡを制限酵素でフラ
グメント化することによる原核生物の特性決定法に関す
る。さらに詳しくは、この発明は。

ＤＮＡ特性決定の改良された方法を用いるミコバクテリ
アの識別法に関する。

（従来の技術） ミコバクテリアの種および菌株を決定することができる
ということは多くの擬似疾患（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄｄｉ
ｓｅａｓｅ）の臨床分析において重要である。′、コバ
クチ３７アは、ヒトや、他４の動物に多種の疾病を起こ
し得る０例えば、慢性の致命的な下痢を伴うヨーネ病は
９反弼動物、主として、ウシ、ヒツジおよびヤギが通常
遭遇する疾患であり、ミコバクテリウム・パララベルク
ローシス（Ｍ、　　ａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ
以下エム・パララベルクローシスと呼ぶ）が原因で起こ
る。またエム・パララベルクローシスは。

スタンプテールのマカック属のサル（ｓｔｕｓ＋ｐ−ｔ
ａｉｌＭａｃａｑｕｅ　ｍｏｎｋｅｙｓ）に感染するこ
とが知られており。

クローン病と診断されたヒトの腸から単離されている。

ヒトと動物の感染症に関連するその他の種としては、エ
ム・アビウム（Ｍ、　ａｖｘｕ＊）　＋エム・イントラ
セルラーレ（Ｍ、　　１ｎｔｒａｄｅｌｌｕｌａｒｅ）
およびエム・スクロフラセウム（Ｍ、　　５ｃｒｏｆｕ
ｌａｃｅｕｓＩ）が挙げられるが、これらは、　　”Ｍ
ＡＩＳ”血清複合体のメンバーである。

擬似ミコバクテリアの分離菌株（５ｕｓｐｅｃｔｅｄｓ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　１ｓｏｌａｔｅｓ）の臨床
医学上および獣医学上の分析としては、従来、動物の病
原性、成長速度９包素の生成、コロニーの形態および微
生物の培地懸濁物の物質性のような表現型特性の分析が
行われてきた。より正確な特性決定は、硝酸塩の還元反
応、ツイーン８０　（Ｔｗｅｅｎ８０）の加水分解反応
、アリールスルファターゼの産生反応、カタラーゼの産
生反応と不活性化反応、塩化ナトリウム耐性、ウレアー
ゼの産生反応、亜テルル酸塩のソー２−カルボン酸ヒド
ラジドに対する感受性のような特性決定反応を用いてな
されている。さらに。

ガス液体クロマトグラフィーと薄層クロマトグラフィー
を含むクロマトグラフィー法が、細菌脂質の抽出物から
得た脂肪酸の溶出プロフィールに基づいてミコバクテリ
ア菌株の特性を決定するのに用いられている。

上記の方法はいずれも、増殖に必要な培養時間が長いこ
とと、貯蔵および処理の繰返しにより分離菌株の特性が
不安定になる可能性があることなどいくつかの要因があ
るため充分に証明されていない０例えば、ミコバクチン
依存性が、エム・−パララベルクローシスの分類特性と
して利用されているが、いくつかの分離菌株は連続継代
培養の際にそのごコバクチン依存性を失う、エム・アビ
ウムのいくつかの菌株は、ミコバクチン依存゛性である
。ＭＡＩＳ複合体のメンバーの特性決定に用いられる血
清学的方法は、多くのＭＡＩＳ菌株が反応性を欠いてい
ることと、その自発凝集性によって妨害されている。表
現型の結果によれば、エム・パララベルクローシスが実
際にＭＡＩＳ複合体のメンバーであるか否か不明確であ
った。

各種の遺伝子分析法をミコバクテリアに適用する試みが
なされている（ミコバクテリアのゲノムが２．５〜４．
５　Ｘ　１０９ダルトンの範囲にあることが知られてい
る）。これらの方法としては９次のようなことに基づい
た特性決定法が挙げられる。すなわちＧ−Ｃ含量（Ｗａ
ｙｎｅ　、　Ｌ、Ｇ、ら、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
。

並巻、　１９１５〜１９１９頁、　１９８６年）；溶液
中でのＤＮＡ：ＤＮＡ雑種形戒形成ｏｓｈｉｍｕｒａ、
　Ｈ，Ｈ，ら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
。

紐巻、４５〜５１頁、　１９８７年；Ｂｒａｄｌｅｙ　
、　Ｓ、Ｇ、ら、ハ。

シ■」恒」し■襲−、■ｍ巻、１２２〜１２４頁、　　
１９７２年）およびその方法を用いてＤＮＡ　：　ＤＮ
Ａの雑種形成パターンを広範囲にわたって研究した他の
多くの文献がある。この発明に一層関連が深いのは、ミ
コバクテリアＤＮＡでプローブされたサザンプロットを
利用する方法である（ＭｃＣｌｕｒｅ、　Ｈ，Ｍ、ら、
　Ｊ、ＩｎｆｅＣｔｉＯｎＳＤｉｓｅａｓｅｓ、　１５
５巻、　１０１１〜１０１９頁、　１９８７年；　Ｍｃ
Ｆａｄｄｅｎ。

Ｊ、Ｔ、ら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、
　２５巻、　　７９６〜８０１頁。

１９８７年；Ｄｒａｋｅ　、　Ｔ、Ａ、ら、　Ｊ、Ｃ１
ｔｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　。

並巻、　１４４２〜１４４５頁、　１９８７年；　Ｋｉ
ｅｈｎ、　Ｔ、Ｅ、　　ら。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２５巻、　１
５５１〜１５５２頁、　１９８７年；ＭｃＦａｄｄｅｎ
、　Ｊ、Ｔ、ら、　Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、上
巻、２８３〜２９１頁、　１９８７年；　Ｅｌｌｎｅｎ
、　Ｐ、Ｄ、ら、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、。

並巻、　１３４９〜１３５２頁、　１９８８年；　Ｐｉ
ｃｋｅｎ、　Ｒ，Ｎ、ら。

Ｍｏ１．ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　、　　２４
巻、　１１１〜１２４頁、　１９８８年）。ミコバクテ
リア由来のＤＮＡが液体中の懸濁物として単離された場
合の該ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼのパターンも研
究されている（Ｃｏｌｌｉｎｓ。

Ｄ、Ｍ、ら、　Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、、、１
３０巻、　１０１９〜１０２１頁。

１９８４年；　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、　Ｄ、Ｍ、　　ら、　
Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、　、　１０巻、　２２２６
〜２２２Ｂ頁、　１９８６年；　Ｇａｒｃｉａ、　Ｍ、
Ｊ、ら、ムＧｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．．１３２巻、
　２２６５〜２２６９頁、　１９８６年；Ｐａｔｅｌ、
Ｒ，ら、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１
３２巻、　５４１〜５５１頁、　１９８６年ＨＳｈｕｍ
ａｋｅｒ、　Ｓ、Ａ、ら、　Ａｓ、Ｒｅｖ、Ｒｅｓ　ｉ
ｒ、Ｄｔｓ。

１３４巻、、２１０〜２１３頁、　１９８６年；　Ｗａ
ｒｄｓ、　Ｂ、Ｊ、　　ら。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、　２５巻、　
２３０９〜２３１３頁、　１９８７年：　Ｗｈｉｐｐｌ
ｅ、Ｄ、Ｌ、ら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、、　２５巻。

１５１１〜１５１５頁、　１９８７年）。

これらの従来技術の遺伝子分析法から得られた結果は必
ずしも満足すべきものではなかった。例えば、クローン
病の患者から回収されたエム・パララベルクローシスが
、エム・アビウムの血？［と９０％を超える割合で相同
性を有し、エム・アビウムのいくつかの菌株間に見られ
るよりも相同性が高いことが判明した。さらに、　ＭＡ
ＩＳ複合体のメンバーは、より低い相同性を示した。す
なわち。

エム・アビウムとエム・イントラセルラーレは６０％の
ＤＮＡ相同性しか示さず、また、エム・スクロフラセウ
ムはこれらいずれの菌株とも５０％未満のハイブリダイ
ゼーションを示した。制限エンドヌクレアーゼのパター
ンを用いる特性決定法もまた。

上記文献に述べられているように、ミコバクテリアに適
用されたが、これらのパターンは、その方法が欠陥を有
するため、不明確である。ＤＮＡの抽出は、一般に水溶
液で行われ、高分子量のＤＮＡを切断する条件（例えば
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）が
知られている。従来のゲル元気泳動法の分解能は、スペ
クトル上において最大分子量を示す端部に、３０〜５０
ｋｂまでのＤＮＡ分子が位置するような分解能に制限さ
れる。従っておよそ０．５〜１０ｋｂのＤＮＡフラグメ
ントを生成する制限酵素だけが従来は使用可能で、多数
の小さなバンドがスミア（ｓ＋５ｅａｒｓ）として現れ
る。

この従来の方法が、困難であるということば、−文献（
Ｍａｃ−Ｆａｄｄｅｎ　Ｊ、Ｔ、ら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

並巻、７９６〜８０１頁、　１９８７年（前記文献）〕
に述べられているが、制限酵素のパターンによってミコ
バクテリアの菌種を区別することができ、かつこの方法
がミコバクテリア菌株の差異を検出するのに充分鋭敏で
ある（Ｐａｔｅｌ、Ｒ，ら、　Ｊ、Ｇｅｎ０Ｍ１ｃｒｏ
ｂｉｏ１．。

１３２巻、　５４１〜５５１真、　１９８６年；　Ｓｈ
ｕｍａｋｅｒ、　Ｓ、Ａ、ら。

Ａｍ、Ｒｅｖ、Ｒｅｓ　ｉｒ、Ｄｉｓ、、　１３４巻、
　２１０〜２ｉ３２ｌ　１９８６年；（いずれも前記し
た文献）〕と主張されている。

しかし、リポソームのＤＮＡプローブを制限フラグメン
トパターンを検出するために用いると、クローン病患者
から単離されたエム・パララベルクローシスと、スタン
プテールのマカック属のサルから単離されたエム・バラ
ラベルクローシスとの差異を検出することはできなかっ
たが、エム・バララベルクローシスとエム・アビウムと
の間にハ小さな差異が得られた。エム・パラツベルク口
−シスと、エム・アビウムの血液型亜型（ｓｅｒｏｖａ
ｒｓ）　２と３との間にも差異が見出された。

いくつかのパルスフィールドゲル電気泳動法によって非
常に大きなりＮＡフラグメントを有効に分離できること
が報告されている。パルスフィールドゲル電気泳動法は
９例えばＳｃｈｗａｒｔｚ、　Ｄ、Ｃ，ら。

偽旦、幽巻、６７〜７５頁、　１９８４年に報告されて
おり。

またいくつかの関連した研究（Ｂｉｒｒｅｎ、　Ｂ、Ｗ
、ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１
６巻、　７５６３〜７５８２頁。

１９８８年ＨＣ１ａｒｋ、Ｓ、Ｍ、ら、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ、　２４１巻、１２０３〜１２０５頁、　１９８８年
）に応用されている。この方法を用いて、　９０００ｋ
ｂもの大きなフラグメントを成功裡に分画できることが
上記文献に証明されている。

その上、パルスフィールドゲル電気泳動法は、　Ｃａｒ
ｌｅら、米国特許第４．７２７，２５１号；　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　２３２巻。

６５〜６８頁、　１９８６年に述べられているように、
−次元において利用されている。これらの方法の、微生
物の遺伝子分析への応用も、　ＷＯ３７１０２０６５に
概説されている。

この発明は、上記の技術に見られる。藁コバクチリアの
同定および特性決定のための方法よりも信頼性が高く好
結果が得られる方法を提供する。

（以下余白） （発明の要旨） この発明は、ミコバクテリアの様々な種および菌株を区
別する方法の改良法を提供する。ここに示されている本
発明の方法の応用により９本発明の方法が将来実施され
た時に得られる結果と比較するためのフラグメント化パ
ターンの参照ライブラリーが提供される。本願の参照ラ
イブラリー。

および、その他の菌株および種に関する付加的なデータ
は、適切な特性決定パターンが得られる改良を組合せる
ことによって、得ることができる。

この発明の方法では、ミコバクテリア培養物の染色体Ｄ
ＮＡを少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで処理
し１次に、得られたフラグメントをサイズによって分離
する必要がある。このサイズによる分離はパルスフィー
ルドゲル電気泳動法によって行われる。この方法によれ
ば、簡単な消化パターンで比較的大きなフラグメントが
得られる。

ＤＮＡは、ミコバクテリア細胞をアガロースのプラグに
埋包し、他の細胞成分を抽出して、完全なりＮＡを残す
ことによって得られる。次にプラグを制限エンドヌクレ
アーゼで直接処理し、パルスフィールドゲル電気泳動法
に付し、エチジウムプロミドで染色する。培養物の増殖
条件は、　ＤＮＡを単離する効力を強化するように調節
される二 したがっ、て、１つの局面において１本発明は。

ミコバクテリアの菌株もしくは種の特性決定法に関する
。この方法は、他の細胞成分が除去されたミコバクテリ
ア培養物中の細胞の染色体口８八を。

少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼで消化してフ
ラグメントを得、得られたフラグメント−をサイズによ
って分離し、そして、得られたフラグメントを検出する
ことを包含する。上記分離は一般にパルスフィールドゲ
ル電気泳動法を用いて行われ、フラグメントはエチジウ
ムプロミドのような適切な染料を用いて検出される。電
気泳動されるＤＮＡは、電気泳動に用いられるゲルと相
溶性を有するゲルプラグに細胞を埋包し、他の細胞成分
をすべて抽出して、電気泳動のゲルに直接適用されるプ
ラグ中にＤＮＡを残すことによって得られる。

（発明の構成〉 本願で用いられる。　“パルスフィールドゲル電気泳動
法”という用語は１分離すべきフラグメントがゲルによ
って遅延されるようなゲル多孔度の条件下において、電
気泳動ゲルを横断する不均質な電場（ｆｉｅｌｄ）を用
いることによる。　ＤＮＡの大きなフラグメントを得る
のに適切な分離法を意味する。非対称のパターンの電場
を付与することは。

−次元に利用したり、上記の従来の技術の項で述べたよ
うに、電場のパターンを横方向に付与するために用いる
のに利用され得る。電場付与の各種のプロトコルとパタ
ーンは、当該技術分野で理解されているように利用され
得る。

この発明の方法をミコバクテリアに利用する場合には、
被検生物試料の培養物は、　ＤＮＡの抽出を容易にする
ような培養条件下で増殖される。一般に、菌株は、ミド
ルプルツク　（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）　０ＡＤＣ強
化剤（ＧＩＢＣＯ０３００１）が補充されたミドルプル
ツク７Ｈ９培地ｐｉ（５，９［：菌株によっては２ｍｇ
／　１のミコバクチン−Ｊ　（Ａｌｌｉｅｄ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、米国、コロラド州）を培地に添加す
る〕の静置ブイヨン培養物として増殖する。接種材料は
産生を拡大して得られ、最終培養物には＋　５４０ｎｍ
での濃度が、０．２〜０．５に達する最終濃度１ｍｇ／
−になるようＤ−シクロセリンが添加される（Ｄ−シク
ロセリンは、ペプチドグリカン合成反応でＤ−アラニン
と拮抗して細胞壁を弱くする：他の細胞壁を弱める薬剤
も使用され得る）。ｐｉ（は、菌株に依存し、増殖は一
般に３７℃で行われる。

細胞を遠心分離で採取し、好ましくは５０ｍＭ）！Ｊス
ーＨＣＩ　ｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＢＤＴＡ、　１５
０ｍＭ　ＮａＣ１（ＴＥＮ）の緩衝塩溶液に、約１００
〜２００　ｍｇ　（湿重量）／ｍｊ！で懸濁させ、リパ
ーゼで少なくとも２時間３７℃で消化する。次に同体積
の１．５％ゲル化アガロース　（低温）を０．２５Ｍ　
ＢＤＴＡとともに細胞懸濁液に添加すると、その混合物
がインサートモールド（型）内でゲル化する。

４℃で冷却後、その成形体を取出してインサート当り１
．０−の緩衝液中に置く。この緩衝液は。

細胞成分を消化する酵素を含有している。−船釣な調製
法では、この緩衝液は６ｍＭ）！ＪスＨＣＩ　ｐＨ７，
６；　ＩＭ　ＮａＣ１，０，５％のブリジー５８　（Ｂ
ｒｉｊ−５８）、　　１１００ｆｆ１　ＢＤＴＡ、　　
ｐ）１７，５　；　０．２％のデオキシコール酸塩；０
．５％サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　　；　ＤＮ７
−ゼを含有しないＲＮアーゼ２０μｇ／１ｒ１１および
２■／−のりゾチームを含有している。インサートを約
２４時間３７℃でインキコベートシ、さらに消化培地で
処理する。代表的な培地は、２０倍体積の０．５Ｍ　Ｂ
ＤＴＡ　ｐＨ９，０゜１％のサルコシルおよび２ｍｇ／
−のプロテア−ゼにで構成されている。上記型に流し込
んで得られた成形体を振盪しながら、５０℃で４８時間
インキュベートする。消化したインサートを上記の溶液
中に４℃で貯蔵してもよく、またはプロテアーゼ阻害剤
、好ましくはフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｐ
ＭＳＦ）を含有する緩衝液で洗浄し、さらに緩衝液内で
洗浄してＰＭＳＦを除き、これを制限エンドヌクレアー
ゼによる消化および電気泳動に用いてもよい。

制限エンドヌクレアーゼによる消化は、　ＥＤＴＡ。

スペルミジンＨＣＩ、およびＢＳＡのような安定化タン
パク質を含有する緩衝液中で標準条件を用いてインサー
トに直接行われる。インサートを氷上で充分な時間保持
して酵素をブロックした状態で拡散させ９次に酵素メー
カーの指示にしたがって特定の酵素について推奨された
温度でイシキュベートする。

消化されたインサートを１次に市販の装置を用いてパル
スフィールドゲル電気泳動法に付して制限パターンを得
る。

以下の実施例は９本発明を例示することを目的とするも
のであって１本発明を限定するものではない。

（以下余白） 亥１１生上 初代培養物は、初代分離株、凍結細胞もしくは凍結乾燥
細胞として入手される。

ミコバクテリアは２例えば、’Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”（１９８５年）　ｌｌ５Ｄ
Ａ。

Ａ＋ｍｅｓ、　Ｉｏａｖａに記載された方法の改良法に
よってウシ糞原料から単離された。得られた試料を、室
温で４８時間インキュベートして、真菌胞子を発芽させ
、得られた試料の１ｇを、キャップ付き遠心分離管中の
０．３％（Ｗ／Ｖ）塩化ベンザルコニウム４０ｄに添加
し９回転子で３０分間混合した。得られた混合物を室温
で２時間インキユベートシ、沈降物の約２〜ｓＩＩ＆の
上澄み液を取出して試験管に入れ。

室温でさらに１８時間インキュベートした。沈降物が含
まれていない、得られた上澄み液を、ヘロルド（Ｈｅｒ
ｒｏｌｄ）の卵培地（ＨＥＹＭ）を含有し、ミコバクチ
ン−Ｊを４滴／スラントの割合で添加したアガロースス
ラントと添加していないアガローススラントに接種する
のに用いた。３７℃での６〜７週間のインキュベーショ
ン後に、コロニーが現われる。

凍結乾燥された培養物を、アメリカンタイプカルチャー
コレクションが推奨するプロトコル、すなわち乾燥細胞
を適切な培地に再懸濁させ振盪せずに３７℃でインキュ
ベートすることを包含する方法で蘇生させる。これらの
培養物を凍結（−８０℃）細胞懸濁物として保管する。

次にこの初代培養物を以下のようにしてブロス培養物と
して増殖させた。

エム・アビウムとエム・バラッペルクローシスを、ミド
ルプルツク０ＡＤＣ濃縮物（ｅｎｒｉｃｈ＋５ｅｎｔ）
　（ＧＩＢＣＯ０３００１）と２■／ｌミコバ４クチン
ーＪで補充した藁ドルプルツク７Ｈ９、ｐｔｌｓ、！１
１培地で増殖させた。単コロニーもしくは１−の解凍細
胞懸濁物を、２５ｄの組織培養フラスコ中の最終体積Ｉ
Ｏ−の培地に接種するのに用いた。インキュベーション
は３７℃で行った。濁った培養物が得られた場合、その
ＩＪｄを。

１７５　Ｃ４の組織培養フラスコ中の５０１ｄの培地に
接種するのに用いた。Ｄ−シクロセリンを培地に添加し
て、　５４０ｎｓで０．２〜０．５の濁度で、最終濃度
が１■／ｄになるようにした０次に３７℃でのインキュ
ベーションをさらに１８〜２４時間続けた。

エム・フレイ０１．Ｐｈ１ｅｉ）の培養については、培
地からミコバクチン−Ｊを除き、この培地をｐＨ６，７
に保持し、その培養物を、１１のエルトンマイヤーフラ
スコ中１００Ｉ１１の体積でインキュベートした。

Ｄ−シクロセリンを添加した後、２．５〜４時間の短時
間のインキュベーションを行った。

パルスフィールドゲル電気泳動法用のインサートを、　
Ｗｈｉｐｐｌｅ、　ｏ、ｔ、、ら、　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９８７）２５巻、　１５１１〜１
５１５頁；　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｄ、Ｃ，ら、蝕旦。

（１９８４）３７巻、　６７−７５頁、およびＩＪＢ　
２０１５　Ｐｕ１ｓａｐｈｏｒ”Ｓｙｓ　ｔｅＩＩＩの
ＬＫＢ　社のマニュアルに記載された方法の改良法によ
って調製した。

要約すると次のとおりである。細胞を１５００Ｘｇで１
０分間４°Ｃにて遠心分離して採取し、５０ｍＭ）リス
ＨＣＩ　ｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１５
０ｍＭ　ＮａＣＩ（ＴＥＮ）中に再懸濁してペレットに
した。細胞を、　　１００〜２００■の湿重量／Ｉ１１
でＴＥＮに再懸濁させ、リパーゼ（Ｓｉｇｍａ社Ｌ−４
３８５）を添加して最終濃度２０，０００単位／ｄとし
た。得られた懸濁物を、最低２時間３７℃でインキュベ
ー）Ｌ、０．２５モルのＨＤＴＡに溶解した１、５％の
低ゲル化温度アガロース（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ）を等
容量添加した。生成した混合物を、２Ｘ５Ｘ１０ｍ＋ａ
のインサート型内に入れた。

この方法は、　Ｓｍ１ｔｈ　、　Ｃ，Ｌ、ら、“Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｉｎｇ、　（１９８６）
第８巻、４５〜７１頁、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

米国、ニエージャジー゛州、ニュヮークと、　Ｎｅ御Ｅ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ、　１９８８〜１９８９年カ
タログとに記載された方法の組合わせである。

要約すると次のとおりである。インサートを０℃に冷却
し、火炎でシールしたパスツールピペットを使って型か
ら取出し、６ｍＭ）リスＨＣＩ、　ｐＨ７，６；Ｉ　Ｍ
　ＮａＣ１；　　０．５％ブリジー５８（Ｂｒｉｊ−５
８）　；　１００ｍＭ　；ＥＤＴＡ　ｐＨ’１．５：　
　０．２％デオキシコール酸塩；ｏ、５％サルコシル（
Ｓａｒｋｏｓｙり　；　２０　ｔｌ　ｇ　／　ｌ１ｄｌ
のＤＮアーゼを含有しないＲＮアーゼおよび２　ｍｇ　
／　ｒｔｒｌリゾチームを含有する０、５ｄの緩衝液中
に入れた。インサートを３７℃で２４時間緩衝液中でイ
ンキュベートし、２０倍体積の０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　、
　ｐｉ　９．０　；　１％サルコシル；２■／　ｍｌプ
ロティナーゼーＫを含有する溶液中に入れた。これらの
溶液を、ゆるやかに振盪しながら。

５０″Ｃで４８時間インキュベートした。得られたイン
サートは、この溶液中４°Ｃで貯蔵できる。

Ａ、実施例１〜３に記載されたようにして、エム・フレ
イのＡＴＣＣ１１７５８号、　ＡＴＣＣ２７０８６号お
よびＡＴＣＣ３５７Ｆ１４号から抽出したＤＮＡを含有
するインサートを制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩで以
下のように消化した。インサートを１０１１ＭトリスＨ
ＣＩ　ｐＨ８，０と、１ｍＭフェニルメチルスルホニル
フルオリド（ＰＭＳＦ）含有の１　ｍＭ　ＥＤＴＡとを
含有する緩衝液の１０倍体積中で、１時間室温で２回洗
浄し、　ＰＭＳＰなしの緩衝液（１０ｍＭ　）リスＨＣ
Ｉ、　ｐＨ８，０；　　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８，０）中で３回洗浄した。インサートを、５０倍
体積のＴＥ１１衝液（１０ｍＭ　）リスＨＣＩ、　ｐＨ
８，０；　０．１ｍＭＥｌ）ＴＡ、　ｐＨ８，０）中テ
３０分間洗浄した。メーカーが推奨するように、４ｍＭ
のスペルミジン塩酸と１００μｇ／−のウシ血清アルブ
ミンとを含有する緩衝液を用いて１．５ｄの微小遠心分
離管で、消化を実施した。得られたインサートを、３０
分間氷上でインキュベートして、エンドヌクレアーゼを
ブロックした状態で拡散させた反応管に添加し１次いで
反応混合物を推奨される温度で３時間保持した。

インサートを、六角形の電極アレーを取付けたＬＫＢ　
Ｐｕ１ｓａｐｈｏｒ”装置に直接充填した。λウィルス
ＤＮＡのオリゴマーを分子量の標準として用いた。

ゲルはトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中１％アガロー
スの流延物（ｃａｓ　ｔ）であり、電気泳動を、パルス
時間が１０秒の一定電圧１７０ボルトで、緩衝液の温度
１２°Ｃにて２０もしくは４０時間実施した。

得られたゲルを、１■／ｌのエチジウムプロミドを含有
する水１．５１中で３０分間染色し、　Ｐｏ１ａｒｏｉ
ｄ６６５フイルムを用いて３００ｎｍの紫外線光下で撮
影した。

Ｂ、　Ａ節の方法を用いて、以下の各菌株の５ｓｐＴに
よる消化物を含有するインサートを調製し、前述のよう
に、２０時間、パルスゲル法に付した。エム・アビニウ
ム血清型２　、　ＡＴＣＣ３５７１２号；エム・バララ
ベルクローシスの菌株、　ＡＴＣＣ１９６９８号と。

Ｅ、Ａ、　Ｓｕｇｄｅｎ博士（Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅ
ａｓｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　、カ
ナダ、オンタリオ州、ネピーン）提供の菌株Ｃ２８６；
エム・フレイの菌株、　ＡＴＣＣ１１７５８号；エム・
イントラセルラーレの菌株、　ＡＴＣＣ１３９５０号の
ＳｓｐＩによる消化物を用いた。結果を第１図に示す。

第１図に示すように、５グループの全バンドパターンは
明確に目視できる。各々の種について検討した。レーン
１：エム・アビウム血清型２　（ＡＴＣＣ３５７１２号
）；レーン２：エム・パララベルクローシス（ＡＴＣＣ
１９６９８号）；レーン３：エム・バララベルクローシ
スＣ２８６；レーン４；エム・フレイ（ＡＴＣＣ１１７
５８号）；レーン５：λコンカナマー；レーン６：エム
・イントラセルラーレ（ＡＴＣＣ１３９５０号）。制限
フラグメントパターンは１個々のパターンの各バンドを
キロベース（ｋｂ）単位の長さによって記載することも
きる。このようにして得られたパターンを第１表に示す
。

（以下余白） 里１表 ９０ ０ ８ 傘キロベース（ｋｂ）で表わしたおおよそのフラグメン
ト長標準曲線の範囲をはずれたバンドは含まれていない
。重要なのは、全バンドパターンを比較することである
が、いくつかの個々のバンドは、特定の種の指標として
使用できる０例えば、　１３２ｋｂのバンドによって、
エム・バララベルクローシス１９６９８が、同じ領域に
１３５ｋｂのバンドを有するエム・アビウム血清型２と
区別される。

Ｃ，Ａ節の方法を用いて、下記の各菌株を５ａｐｌで消
化した消化物を含有するインサートを調製した。エム・
バララベルクローシス菌株１Ｂ　（ｗ、ｏ。

Ｒｉｃｈａｒｄｓ提供＋　Ａ１１ｉｅｄ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、　　米国、コｏ−ｙ　ト州）　、　ＣＢ
Ｍ　３１３号；エム・アビウム血清型２　、　ＡＴＣＣ
３５７１２号；エム・パララベル。クローシス菌株、　
ＡＴＣＣ１９６９８号；Ｃ８Ｍ３２７　　（２つの別の
インサートのＩＩ）　　：およびエム・バララベルクロ
ーシス菌株リング（Ｌｉｎｄａ）　、ＡＴＣＣ４３０１
５号の消化物である。菌株０８Ｍ３１３号とＣ８Ｍ３２
７号は、ヨーネ病（Ｊｏｈｎｅ’　５ｄｉｓｅａｓｅ）
にかかっていると診断された雌ウシ由来の初代分離株で
ある。２０時間のパルスフィールドゲル電気泳動法の実
験結果を第２図に示す、レーン１：エム・バララベルク
ローシス菌株１８：レーン２：初代ウシ分離株ＣＢ？１
Ｉ３１３　；レーン３：エム・アビウム血清型２　（Ａ
ＴＣＣ３５７１２号）：レース４；エム・パララベルク
ローシス１９６９８号；レーン５：初代ウシ分離株ＣＢ
Ｍ　３２７　　：レーン６：初代ウシ分離株ＣＢＭ３２
７　　：レーン７：エム・パララベルクローシス菌株リ
ンダ；レーン８：λコンカテマー第２図に示すように、
エム・バララベルクローシス菌株１８は、エム・パララ
ベルクローシスＡＴＣＣ１９６９１のパターンよりも、
エム・アビウム血清型２に似たパターンを示す、エム・
パララベルクローシスＡＴＣＣ１９６９８号のパターン
は、エム・アビウム血清型２のパターンとは明らかに異
なる。それ故に、エム・パララベルクローンシス菌株１
８をエム・アビウムとしての再分類することを考慮すべ
きであろう、２つの初代分離株であるＣ８Ｍ３１３とＣ
８Ｍ３２７は、パターンが似ていない、またＣ８Ｍ３２
７のパターンはＡＴＣＣ１９６９Ｂのパターンと似てお
り、　ＣＢ？＋３１３のパターンはエム・アビウム血清
型２のパターンに似ている（従来の典型的な方法を用い
た場合にはＣ８Ｍ３１３はエム・バララベルクローシス
の菌株であることが示されていた〉。

ヒトの分離株、エム・バララベルクローシス−菌株リン
グ（ＡＴＣＣ４３０１５号）は、もともとクローン病に
かかうている患者から培養されたものである。

第２図に示すように、この分離株は、エム・パララベル
クローシス１９６９８号と初代ウシ分離株ＣＢＭ３２７
との両者によく似たＤＮＡフラグメントパターンを有し
ている。それ故にこの方法は、逅コバクチリアのヒト分
離株の種を識別するのに有用であケ。

臨床上重要になるであろう。

パルスフィールドゲル電気泳動法に４０時間付した後、
　Ｃ８Ｍ３１３とＣ８Ｍ３２７とを、エム・アビウム血
清型２と比較した結果を第３図に示す、レー゛ン１は初
代ウシ分離株ＣＢ？’１３１３　；レーン２はエム・ア
ビウム血清型２　（ＡＴＣＣ３５７１２号）；レーン３
はブランク；レーン４は初代ウシ分離株ＣＢＭ３２７　
：レーン５はλコンカテマーである。第３図は、　Ｃ８
Ｍ３］３をエム・アビウム血清型２と比較すると、小さ
な制限フラグメント長の差があることを示している。例
えば、　Ｃ８Ｍ３１３のパターンの１１０ｋｂの領域に
は余分なバンドがあり、このバンドは、エム・アビウム
血清型２のパターンには存在しない。

Ｄ、Ａ１ｆｆの方法を用いて、エム・フレイの３種の菌
株（ＡＴＣＣ１１７５８号、　ＡＴＣＣ３５７８４号お
よびＡＴＣＣ２７０８６号）の５ｓｐｌ消化物を含有す
るインサートを調製した。結果を第４図に示す。レーン
１はλコンカナマー：レーン２はエム・フレイ（ＡＴＣ
Ｃ１１７５８号）；レーン３はエム・フレイ（ＡＴＣＣ
３５７８４号）；レーン４はエム・フレイ（ＡＴＣＣ２
７０８６号）である。

第４図に示すように、パターン間の類似度は大きい。し
かし、独特のバンドも分離され、このよウナバンドは、
　　１００キロベースの領域に最も容易に観測される。

独特のバンドは、エム・プレイの個々の菌株の固定指標
になる。バンドパターンを。

第２表に、キロベース単位のフラグメント長で記載する
。

（以下余白） 第１表 フラグメントパ　−ンバンドのフラグメント６ ５２　　　　　　　　　５２ ０ このように２本発明の方法は２個々のミコバクリア菌種
の構成菌種を識別するのに用いることができる。

（発明の効果） ミコバクテリアの様々な菌株および種は、バクテリアの
染色体を消化して、比較的大きなりＮＡフラグメントを
得る工程、および得られたフラグメントをパルスフィー
ルドゲル電気泳動法を用いて分離する工程を包含する改
良法を用いて、特性決定することができる。得られた泳
動パターンは。

特定の果コバクチリアに特有である。この染色体ＤＮＡ
は、ゲルプラグの中に細胞を埋包しており。

ＤＮＡ以外の細胞成分を抽出することにより、該染色体
ＤＮＡがゲルプラグ自体から好都合に得られる。

そして、このプラグを直接用いて、該染色体ＤＮＡをサ
イズにより分離することができる。

１−属国ｍ象洗里 第１図は、ミコバクテリアの５つの種を、　５ｓｐｌで
消化した後、パルスフィールドゲル電気泳動法に付して
得られた制限フラグメントパターンを示す図である。

第２図は、ウシとヒトの分離株を、　５ｓｐｌで消化後
、パルスフィールドゲル電気泳動法で分離して得られた
制限フラグメントパターンを示す図である。

第３図は、ウシの分離株とエム・アビウムとのＳｓｐＩ
制限フラグメントパターンを比較した図である。

第４図は、エム・フレイを５ｓｐｌで消化後、パルスフ
ィールドゲル電気泳動法に付して得られた制限フラグメ
ントパターンを示す図である。

以 上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、マイコバクテリアの菌株の特性を決定する方法であ
   って、 マイコバクテリア培養物の細胞から得られた染色体ＤＮ
   Ａを少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼで消化さ
   せる工程； 得られたフラグメントを該フラグメントのサイズにした
   がって分離する工程；および 得られた該フラグメントを検出する工程 を包含する方法。 ２、前記分離工程が、パルスフィールドゲル電気泳動を
   用いて行われる請求項１に記載の方法。 ３、前記検出工程が分離された該フラグメントを染料で
   処理することを包含する請求項１に記載の方法。 ４、前記染料がエチジウムプロミドである請求項３に記
   載の方法。 ５、前記制限エンドヌクレアーゼがＳｓｐＩである請求
   項１に記載の方法。 ６、前記染色体ＤＮＡが以下のようにして調製される請
   求項１に記載の方法： ゲル化固体培地に含有されている細胞懸濁物を試薬で処
   理して、ＤＮＡ以外の細胞成分を可溶化させ；そして 該ゲル化固形物を洗浄して該試薬および可溶化した細胞
   成分を除去して、該染色体ＤＮＡを該ゲル化固形物中に
   保持する。 ７、前記試薬が、少なくとも１種のリパーゼ、少なくと
   も１種のプロテアーゼ、少なくとも１種の溶剤およびＲ
   Ｎアーゼを含有する請求項６に記載の方法。 ８、前記ゲル化固体に保持された前記染色体ＤＮＡを、
   少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼを含有する該
   ゲル化固体と接触させることにより該制限エンドヌクレ
   アーゼで消化させ、 得られたゲルプラグを、パルスフィールドゲル電気泳動
   にかけることにより前記分離を行う、請求項６に記載の
   方法。