JPH0344555A - グルコース濃度の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、血液、特に血ｌ＃中のグルコース濃度（いわ
ゆる血糖値）の測定方法、詳しくは全血状態で血糖値を
迅速かつ誤差無く測定する方法に関する。

［従来の技術］ 医療分野、医学研究分野などにおいで、血糖値の測定が
必要とされ、そのために種々の測定方法か提供され、実
施されている。

中でも一般的に採用されている方法にバイオセンナによ
る血糖値測定方法がある。この測定方法は、酵素グルコ
ースオキシダーゼ（ＣＯＤ）を固定化した膜と過酸化水
素電極とを組み合ｈｄ−た測定方法であり、グルコース
センサ法と呼ばれる。

グルコースセンサ法は、グルコースオキシダーゼの持つ
基質特異性と検出原理の特異性により、前処理をぜすに
高感度でグルコース濃度を測定できるので、特に糖尿病
の診断や治療に幅広く実用化されている。

し述のようなバイオセ゛／すを使用しζ血糖値を測定す
る場合、血液を遠心分離しＣ上澄み（血漿または血清）
を得、これを適当な緩衝液により希釈し、血清中のグル
コース、酸素および水を固定化グルコースオキシダーゼ
を用いて反応させ、生成する過酸化水素を過酸化水素電
極の出力（Ｗ流）として得、グルコース分解速度（過酸
化水素生成速度）を測定する。

第１図にバイオセンナを使用したグルコース濃度測定装
置の概略図を示す。グルコース濃度測定セル１はＣＯＤ
固定化過酸化水素電極２を有し、セル内の液はスターラ
３および撹袢子４により充分に撹拌されるようになって
いる。ポンプ５により緩衝液がバルブ６を介してセル内
に供給され、測定が終了すると、ポンプ７によりバルブ
８を介して測定液は排出される。グルコース濃度を測定
すべき試料はザンブラ−９によりセル内に供給される。

グルコースオキシダーゼによるグルコースの分解反応速
度は緩衝夜中のグルコース濃度に比例するが、酔素によ
るグルコースの分解量は＠量であるのでグルコース濃度
の変化は殆どない。従って、定常状態では過酸化水素の
生成速度は一定となり、血清試料を緩衝液に注入すると
、過酸化水素電極の出力は、例えば第２図に示すように
なる。試料の注入の後、出力、即ち、過酸化水素電極の
電流値は約ＩＯ秒程度でほぼ一定となる。

従って、グルコース水溶液を用いてグルコース濃度と試
料注入の１０〜２０秒位後の過酸化水素電極の出力との
関係の検量線を予め求めておくと、未知のグルコース濃
度の血清試料について電極出力から緩衝液中のグルコー
ス濃度を測定できることになる。このようにしてグルコ
ース濃度を測定する方法を「平衡点法」と呼ぶ。

一般的に試料中のグルコース濃度を測定する場合、上述
のように試料を緩衝液により希釈して測定する。以下、
本明細書では検量線を求めるのに使用した標準液である
グルコース水溶液を用いた時の電極出力に対する試料測
定時のｉ極出力に基づいて換算した濃度を「測定グルコ
ース濃度」と呼ぶ。

また、グルコースセンサ法において、過酸化水素電極の
出力（第２図）を時間で一次微分すると第３図のような
グラフが得られ、この極大値（即ち、過酸化水素Ｍ極の
電流値の変化速度の最大値）も緩衝夜中のグルコース濃
度に比例する。従って、平衡点法の場合と同様に、グル
コース濃度と極大値との関係の検量線を予め求めておけ
ば、未知のグルコース濃度の試料について過酸化水素電
極の電流値の変化速度の極大値を求めることに上り、測
定グルコース濃度が得られる。このようにして試料中の
グルコース濃度を測定する方法を「−次微分法」と呼ぶ
。この方法では、血清試料を緩衝液に注入した後、約２
〜３秒程度でグルコース濃度を測定できるという利点が
ある。

第２図の過酸化水素電極の電流値を時間で二次微分した
グラフを第４図に示すが、この極大値も緩衝液中のグル
コース濃度に比例する。従って、−次微分法の場合と同
様に、極大値から緩衝液中のグルコース濃度を求めるこ
とができ、−次微分法の場合と同様に換算して、測定グ
ルコース濃度が得られる。このようにしてグルコース濃
度を測定する方法を「二次微分法」と呼ぶ。この方法で
は、−次微分法より更に短い時間でグルコース濃度を測
定できる利点がある。

尚、第２図および第３図の破線ならびに第３図および第
４図の一点鎖線は、時間が対応していることを示す。

［発明か解決しようとする課題］ 」二連のような方法を使用して測定できるグルコース濃
度は、いずれも均−溶酸、例えば血清を希釈した緩衝液
中のグルコース濃度である。従って、予め例えば遠心分
離により血液から血球を分離除去して血清のみを得る必
要がある。この遠心分離には例えば１０−１５分程度を
要し、この上うな操作を必要とする限り、グルコース濃
度の迅速な測定は不可能である。

全血状態であっても上記バイオセンサ法を適用できれば
短時間に血糖値を測定できるので望ましいが、上述のい
ずれの方法を適用する場合であっても、次のような問題
点が生じる。

血液は血清と血球とから成り、血球はその内部に液体分
を含んでいる。グルコースの濃度は血球の内外で等しい
。また、血液中の固形分は、主として血球に起因する固
形分であり、その量は無視できるほど小さくはなく、通
常２５〜４５％程度である。

例えば、平衡点法を適用して全血試料をほぼ等張の緩衝
液に注入して血糖値を測定する場合、血球内のグルコー
スは、約１０秒程度で緩衝液中に移動して平衡状態とな
り、緩衝液中のグルコース濃度と血球内のグルコース濃
度か等しくなる。従って、この方法では、全血中の血清
性および血球内の液体分が緩衝液により希釈されたこと
になるので、全血中のグルコースが測定の対象となるが
、血球の割合が未知であるため、（固形分を考慮した）
真のグルコース濃度を求めることができない。

血球体積の平均的な割合を使用して測定グルコース濃度
を修正することも世界保健機関により示唆されている（
１９８０年）が、血液中の血球の割合は個人差が大きく
、そのような値を使用して換算した場合、相当の誤差を
含むことになる。

また、−次微分法を適用する場合、注入後の短時間内、
例えば２〜３秒で極大値に達するので、この方法により
測定される測定グルコース濃度は、全血中の血清性およ
び血球内から流出した少量のグルコースが緩衝液に希釈
された状態のグルコース濃度である。従って、この場合
も、全血中に血球が占める割合が判らないので、真のグ
ルコース濃度を得ることはできない。この場合も平均的
な血球の占める割合（ヘマトクリット値）を使用して換
算グルコース濃度を求めることは可能であるが、ヘマト
クリット値には個人差があり、換算グルコース濃度か相
当程度の誤差を含むことは免れ得ない。

更に、二次微分法ら血ｔａ中のグルコースおよび血球内
から流出した少量のグルコースを測定することになるが
、−次微分法と同様の問題点が存在するのは容易に理解
されよう。

尚、血球内から流出するグルコース量は、試料注入後、
測定までの時間か短い二次微分法の方が一次微分法より
少ないが、いずれらごく少量に過ぎず、後に述べる換算
時に誤差が吸収されるので本発明では影響を受（すない
。

このようにグルコースセンサ法は、グルコース濃度の測
定自体については迅速に実施できる有効な方法であるが
、全血中の血球の割合等が判らない以上、結局はＩｎ液
を遠心分離して血ｌｎを得る操作を省略できず、全血状
態で真の血糖値を測定できないことになる。

従って、本発明が解決しようとする課題は、バイオセン
サ法により全曲状態で血糖値を測定するに際し、血族中
の血球の割合に付随する問題点を克服して測定グルコー
ス濃度から真のグルコースａ度を迅速かつ正確に求める
方法を提供することである。

［課題を解決するための手段］ 上記課題は、グルコース濃度を測定すべき全血試料につ
いて平衡点法と一次微分法または二次微分法を用いて測
定グルコース濃度を得、得られた２種のθ１１定グルコ
ース濃度の割合から全血試料中の血球の割合を求めて全
血試料の換算係数を求め、求めた換算係数に基づいて平
衡点法により得られた測定グルコース濃度または一次微
分法もしくは二次微分法により得られた測定グルコース
濃度を換算して全血中のグルコース濃度を求めることを
特徴とするグルコースΩ度測定方法により解決されるこ
とが見出された。

本発明において、平衡点法、−次微分法および二次微分
法なる語は、先に従来技術の箇所において説明した固定
化グルコースオキンダーゼと過酸化水素電極の組み合わ
Ｕ゛を使用するそれぞれのグルコースセンサ法を意味す
るものとして使用している。

本発明は以下の考え方に基づくものである。

上述のように、いずれのグルコースセンサ法を適用する
場合であっても、全血中に血球分（または固形分）が存
在づ−るため真の面糖（ｌｌ１１（液体０中のグルコー
ス濃度）から偏分した測定グルコース濃度となる。従っ
て、＋ｆｎ球（または固形分）が全血中に存在する割合
に応じてどの程度の偏分が生しるかを予め求めておくと
、逆に、測定値の偏分の程度から血球（または固形分）
の割合を求めることができる。

全血を用いてグルコースセンサ法を適用して血糖値を測
定する場合、所定ｆｉＡ（例えば２０μｍ２）の全血試
料を所定量Ｂ（例えば１　、５　ｘｆ２）の緩衝液によ
り希釈する。従って、この場合、見掛けの希釈倍率は（
Ａ＋Ｂ）／Ａ倍となる。試料中に血球分が全く存在しな
い場合（即ち、血清のみの場合）、真の希釈倍率と見掛
けの希釈倍率は等しくなり、測定グルコース濃度は真の
グルコース濃度と一致する。

しかしながら、平衡点法を適用して（固形分ａおよび液
体分すから戚ろ血球、ならびに血清Ｃから戊る、即ち、
Ａ＝ａ＋ｂ＋ｃである）全血について血糖値を測定する
場合、見掛けの希釈倍率は（Ａ＋Ｂ）／Ａであるにも拘
わらず、（血球の液体分す中のグルコースおよび血ｆｌ
ｔｃ中のグルコースについて測定されるので）真の希釈
倍率は（ｂ＋ｃ＋　Ｂ）／（ｂ＋ｃ）倍となる。−次微
分法または二次微分法を適用する場合は、血清ｃ内のグ
ルコースのみが測定の対象となるので、真の希釈倍率は
（ｃ＋Ｂ）／ｃ倍となる。ここで、血液中の固形分は血
球に起因するので、血液中の血球の割合を求めることが
できれば、測定グルコース濃度を真の血糖値に換算する
ことができる。

本発明では、以下に説明するようにして血球の割合（即
ち、ａ＋ｂ）を求めることができ、換算係数を得ること
ができ、従って、測定グルコース濃度を換算した換算グ
ルコース濃度を真の血糖値として求めろことができる。

最初に、本発明の血球割合を求める方法について詐細に
説明する。

一定講度（例えば血清中８４Ｈ／ｄ１２）のグルコース
を含む血球と血清の割合を種々変えた全血試料中のグル
コース濃度を平衡点法により測定すると、第５図に示す
ような結果が得られる。第５図のグラフの横軸Ｘは体積
基準の（血清／（血清＋血球））Ｘ１００（％）であり
、縦軸は測定グルコース濃度である。

このグラフから明らかなように、血球の割合が大きくな
るほど、固形分の割合も増加して（従って、Ｃが小さく
なり）真の希釈倍率が大きくなるにも拘わらず、見掛け
の希釈倍率は変化しないので、測定グルコース濃度Ｃｘ
は小さい値として得られまた、同じ試料について一次微
分法により測定すると、同じく第４図にｃｙで示すよう
な結果が得られる。−次微分法の場合、先に説明したよ
うに血球中のグルコースか緩衝液中に移動する前に極大
値に達するので、全血を緩衝液により希釈しているにも
拘わらず、実際には血清中のグルコースのみが希釈され
た状態にほぼ等しい状態でグルコース濃度の測定をして
いることになる。従って、採取した全血試料および緩衝
液の量は（平衡点法の場合と）同ｑでめ０、（血球内の
液体分す中のグルコースは測定の対象とならないので）
真の希釈倍率は平衡点法σ１場合より大きいにＬ拘イっ
らず、見掛−ヒの希釈倍率（よ同じであるので、測定グ
ルコース濃度ＣｙｌＪ（平衡点法により得られろ測定値
より）相当中さい値となる。また、血球の割合が大きく
なるほど、曲Ｗｆ中のグルコース肴が減少する（Ｃが小
さくなり、希釈倍率が大きくなるにも拘わらず、見掛け
の希釈倍率は同じである）ので測定グルコース濃度は小
さくなる。

い４′れの測定グルコース濃度も真のグルコース濃度Ｃ
ｏ（Ｘ＝　ｌ　Ｏ０％の場合）から偏分しており、その
程度は、平衡点法の場合はＣｘ／　Ｃｏ（＝　ＲＸ）で
あり、−次微分法の場合はＣｙ／Ｃｏ（＝Ｒｙ）となる
。従って、これらの偏分の比をμとするとμ＝Ｒｘ／Ｒ
ｙ＝Ｃに／Ｃｙとなる。従って、血清／（血球＋血ｆ＃
）比Ｘ（−ｃ／（ａ＋ｂ＋ｃ））が種々光なる標準試料
についてＣｙおよびＣｙを測定しておくと、Ｘとμとの
関係； Ｘ＝ｆｎ（μ）　　　　　　　　　　　（１）１式中、
ｒｎは関数を意味する。］ が得られる。

第５図に示すようにそれぞれの方法による測定グルコー
ス濃度とＸとの関係を一次関数で近似できるなら、Ｘと
μとの関係は双ｌｌ１Ｉ線となる。より厳密な関係が必
要であれば、適当な数学的手法により双曲線以外の近似
式を得ることも容易である。

第５図に示したデータに基づいてμとＸとの関係を第６
図に示す。第６図のような関係が予め判っていると、２
種の測定方法からμを求めることによって、第６図から
容易にＸが得られる。

本発明の方法では全血試料についてＣＸおよびＣｙを得
ることができ、従って、μを容易に求めることができる
。求めたμを用いて式（１）（または例えば第６図）か
らＸを求める。

Ｘと換算係数との関係は試料の濃度に依らないので一度
定めるたけで上く、その−例を第７図に示す。第７図は
、血ｔｎのグルコースａ＋ｔｃｏと平衡点法によるグル
コース濃度Ｃにとの比、即ち、Ｇｏ／Ｃｘの対ｒ１１．
値と血球のｉ１合、即ち、（血球／（血ｍ＋血球））Ｘ
１００（％）との関係を表したもので、はぼ直線関係か
成り文っている。第７図を用いてＸより換算係数を得（
第７図では、横軸は血球の割合であるので実際にはＸか
ら血球の割合を求めてから換算係数を得る）、平衡点法
に」こるグルコース濃度に乗ずれば真のグルコース濃度
を求めることができる。また、−次微分法による測定グ
ルコース濃度に乗じる方法も、換算係数の算出にむいて
Ｃｎ／　Ｃｘの代わりにＣ６／Ｃｙを使用して１１■記
と同様に実施可能であることは容易に理解されよ更に、
二次微分法を用いる場合においても、−次微分法と同様
に血球量に影響を受ける。試料注入後測定までの時間が
一次微分法に比べて短いため、血球内から流出するグル
コース量は二次微分性の方が少なく、その分、血球量の
影響を強く受ける。しか１．なから、影響の受は方が血
球量に比例するのは一次微分法の場合と同様であるので
、血球がと平衡点法による測定値／二次微分法に上る測
定値との関係を一次微分法の場合と同様に１゜て求めて
さえおけば、後は第７図からグルコース濃度を求めるこ
とができる。

本発明の方法の基本原理は、上述のような順を追ったデ
ータ処理が必要であるが、このような処理は本発明の思
想さえあれば容易にソフト化でき、コンピューター処理
できるのは当然である。従って、予め検量線を求めてお
くと実際にはリアルタイムでグルコース濃度を、測定す
ることが可能となる。

［発明の効果〕 従来、グルコースセンサ法を使用する場合であっても、
血液から血清を分離する操作を必要としていたグルコー
ス濃度測定を、本発明の方法に上り全血状態で実施する
ことが可能となり、油液から血清を分離する操作が不要
とべろ。その結果、分離操作の時間を節約でき、グルコ
ース濃度のホ１１定時間が大幅に短縮できる。

「実施例１ （準備） 既存のグルコース濃度測定装置（株式会社京都第−科学
製ＧＡ−，Ｉ　１４０）を改造して実験を行なった。上
記装置は、過酸化水素電極（株式会社京都第−科学製Ｅ
−０８型）にグルコースオキシダーゼ固定化膜を装着し
たセンサを有するもので、ターンテーブルにセットされ
たザンブルカップより自動的に試料を吸引し、測定する
ことができる。

１回当たりの測定には緩衝液（０，０７５Ｍ−リン酸緩
衝液ｐＨ６，７）１．７ｘ１２および試料２０１１（！
が用いられる。測定に用いた装置は一次微分法によりグ
ルコース濃度を測定するものであるが、本実施例のため
に過酸化水素電極の出力（Ｔｒｉ流（ｐ゛０をインター
フェースを介してｔ＜　　’、、／ナルコンピューター
（日本電気製ｐｃ９８０１］、−人力し、デー３＋処理
′４−ること（二より平衡点法の測定Ｃつ同時に？ｊな
えるよつにした。

測定に際り、−ｉ：は、まず、グルコース１５０乃／′
ｄｃの標準液を試料として用い、十換ｒ点法、−次微分
法におｌＪ゛る装置の校Ｉを’ｔｆｉ：ｉ１、ｔ、。

次いで、血液試料を遠心分離して血清と血球成分とに分
離し、血清のグルコース濃度を平衡点法および一次微分
法により測定ｉ、八ところ、いずれの方法を用いてもグ
ルコースａＩｆは８４　ｏ／ｄ＋２であった。

遠心分離ｊ５た試料の血ｔｕと血球をそれぞれ採取し、
血球体積の割合が０．２０．４０、朽０および８０％と
なる試料を調製１５た。それぞれの試［Ｉを平衡点法お
上び一次微分法により測定１−た結果が第５図の結果で
ある。

第６図は、第５図よ？）（Ｓ（ｉ微意法２こよるゲルコ
ース濃度）／（−次微分法にに　Ｚ　′７′ル：コー・
ス濃度）を求め、血球割合との関係を示すものである。

第７図は、換算係数−（血清グルコース濃度−８４＊９
／ｄＩ２）／各血球体積における平衡点法グルコース濃
度）を対数変換した値と血球／血清比との関係を示すグ
ラフである。

（測定） ３０種の全血試料について以下の手順に従ってグルコー
ス濃度を測定した。

（１）各試料を２つの容器に分割して入れた。

（１１）一方の試料を遠心分離し、得られた血清のグル
コース濃度を一次微分法により測定した。

（ｉｉｉ　）他方の試料は全血のまま、平衡点法および
一次微分法によりグルコース濃度を測定した。

（ｉｖ）　平衡点法による測定グルコース濃度と一次微
分法による測定グルコース濃度との比（μ）を求め、第
６図から血球割合（Ｘ）を求めた。

（ｖ）次に、求めた直球割合に対応する換算係数を求め
、換算グルコース濃度を得た。

（結果） 上記工程（１１）において得られたグルコース濃度をｙ
軸に、（ｉｉｉ）において平衡点法により得られたグル
コース濃度をｙ軸にとり、相関を求めたところ、ｙ：＝
ｏ、９０４ｘ、　γ＝０．９６２であった。

工程（１１）において得られたグルコース濃度をｙ軸に
、（Ｖ）において得られた換算グルコース濃度をｙ軸に
とり、相関を求めたところ、ｙ＝０．９９８Ｘ、７＝０
．９９５であった。

以上、本発明およびその実施例について詳細に述べたが
、本発明の技術思想の範囲内で種々の変更が可能である
。センサは過酸化水素ｍ＋’Ａの他、例えば酸素電極、
Ｆ　Ｅ　’Ｉ’センセンを使用できる。

酵素は、センサの検知部分に固定化したちのだけでなく
、緩衝液中に存？’ＥさＵ・たちのでもよい。また、微
分法として一次および二次微分法について示したが、更
に高次に微分した場合にも適用可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法を実施するグルコースセンサ法
の概略図、第２図は最大反応速度法を示すグラフ、第３
図は最大反応加速度法を示すグラフ、第４図は反応加速
度微分法を示すグラフ、第５図は換算グルコース濃度と
血清／（血清＋血球）との関係を示すグラフ、第６図は
換算グルコース濃度比と血清／（血清＋血球）との関係
を示すグラフ、第７図は換算係数と血球／（血清士血球
）との関係を示すグラフである。 １・・グルコース濃度測定セル、

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、グルコース濃度を測定すべき全血試料について平衡
   点法と一次微分法または二次微分法を用いて測定グルコ
   ース濃度を得、得られた２種の測定グルコース濃度の割
   合から全血試料中の血球の割合を求めて全血試料の換算
   係数を求め、求めた換算係数に基づいて平衡点法により
   得られた測定グルコース濃度または一次微分法もしくは
   二次微分法により得られた測定グルコース濃度を換算し
   て全血中のグルコース濃度を求めることを特徴とするグ
   ルコース濃度の測定方法。