JPH0346560A

JPH0346560A - 細胞組織塊の調製

Info

Publication number: JPH0346560A
Application number: JP2181375A
Authority: JP
Inventors: Graham M Smalley; グラハム・マーク・スモーリー; Alan Heywood; アラン・ヘイウッド
Original assignee: Shandon Scientific Ltd
Current assignee: Shandon Diagnostics Ltd
Priority date: 1989-07-10
Filing date: 1990-07-09
Publication date: 1991-02-27
Also published as: DE69012008D1; DE69012008T2; GB8915759D0; EP0408225B1; EP0408225A3; EP0408225A2; US5137710A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、診断用試料、特に微細針吸引試料の検査のた
めの細胞組織塊の調製に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］悪性腫
瘍の診断に関する穿刺吸引細胞診断学は、十分に確立さ
れた手法である。細胞診断学的染色法用のスライドガラ
ス標本は、穿刺針からの直接的な塗抹としてしばしば作
製される。この技法は、多量の専門的知識を必要とし、
通常、臨床医師、細胞診断学の専門家、又は他の有資格
者によって実施される。この結果、検査室に運ばれるス
ライドガラスの質が、大きく異なる。スライドガラス上
への材料の塗抹法、意図しない風乾、及び不十分な固定
に起因する細胞の損傷が、よく起こる。

更に、診断の観点からすると、少量の材料しか、線維組
織（例えば、そこから大部分の吸引物が採取される胸部
腫瘍）から吸引されない。細胞組織塊技法は、多数のこ
れらの不利を補償する。

細胞組織塊技法（ｃｅｌｌ　ｂｌｏｃｋ　ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅ）は、それ自身は新しいものではなく、組織学的
な技法と細胞診断学的な技法との中間に位置する。細胞
の汚物及び脆い組織片は、遠心操作によって漿液から分
離される。沈渣は、細胞診断学的標本用のスライドガラ
ス上に直接的に塗抹又は遠心操作（例えばＥＰ−Ａ−０
，０４７，８４０号もしくはＥＰ−Ａ−０，２０５，１
０６号に開示されているような遠心機を用いて）され得
る。あるいは、その同じ沈渣から（特に、細胞の凝塊及
び組織の小片が目で見える場合）、組織学的標本が、次
のようにして作製される。即ち、材料をゲル化母材中に
手作業で封埋し、得られた細胞組織塊をパラフィンワッ
クス処理することにより、薄い切片がもたらされ得、も
って、組織学的標本が作製される。後者の技法の病理学
者に対する主要な利点は、細胞が組織学で見られるもの
と似ているということである。細胞組織塊が穿刺針吸引
（ＦＮＡ）によって調製されるためには、材料は、検査
室に、流体（好ましくは、中性緩衝ホルマリンのような
固定剤）中で運ばれなければならない。

細胞診断学的流体を処理するための細胞組織塊の使用は
、Ｃｈａｐｍａｎ及びＷｈａｌｅｎ　（Ｎ、　Ｅｎｇ、
　Ｊ。

Ｍｅｄ、　２３７：１５．１９４７）が漿液に関する技
法を最初に記載した１９４７年以来、報告されてきてい
る。

それ以来、多くの方法が開発されてきたが、万人の共感
を得たものは殆どなかった。いくつかは、沈積した細胞
と組織の粒子とを結び付ける寒天を使用している（Ｋｕ
ｎｇ　１．　Ｔ、　Ｍ、、　Ｙｕｅｎ　Ｒ，Ｍ、　Ｓ、
。

Ａｃｔａ　Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ　３３：５３−６０．
１９８８；　０１ｓｏｎ　Ｎ、　Ｊ。

ｅｔ、　　ａｌ、　　Ａｃｔａ　Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ
　３０：４０９−４１２．　１９８６）　が、　５　− 寒天は熱く保たれなければならないので、操作が面倒で
ある。大部分の方法は、長時間を必要とするので、多数
の試料片に対しては実際的ではない。

例えば、Ｋｒｏｇｅｒｕｓ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（Ａｃ
ｔａ　Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ３２：５８５−５８７．１
９８８）は、試料を再ベレット化し且つ処理流体をデカ
ンタすることにより、材料を遠心機から取り外すことな
く、沈積した細胞をワックス処理することを提案してい
る。その他、トロンビン凝塊法（Ｋａｒｎａｕｃｈｏｗ
　Ｐ、　Ｎ、、　Ｂｏｎｉｎ　Ｒ，Ｅ、。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ、　３５：６８８．１９８
２）において使用される高価な試薬は、この短時間の技
法が確立されるのを妨げてきた。

細胞を支持するための閉込め材としてのアルギン・ゲル
の使用は、科学論文の主題になっており、それらの著者
は、パラフィン処理された材料への組織学的な及び免疫
化学的な染色を成功裏に行ってきた（Ｌｉｍ　Ｆ、、　
Ｓｕｎ　Ａ、　Ｍ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１０：９０
８−９１０、１９８０）。

本発明の目的は、そのような技法に使用される細胞組織
塊の調製を容易にすることである。

　６− ［課題を解決するための手段］本発明は、一形態において、細胞組織塊を調製する方法
を提供し、該方法は、支持ウェブによって画成されてい
るエンクロージャ内に、試料と硬化可能なゲル材とを沈
積させ、上記ゲル材を硬化させて上記試料を閉じ込め、
その後、上記ゲル材と閉じ込められた上記試料とを組織
標本風に処理して封埋可能なボタンをもたらすことを予
備含浸している。

ゲル材は、試料の沈積の前にエンクロージャ中に沈積さ
せられ得るが、本発明の好適な実施例では、ゲル材及び
試料は、共沈積（ｃｏｄｅｐｏｓｉｔｅ）させられる。

少なくとも試料の沈積は、遠心作用によって好適に行な
われる。

従って、好適な実施例においては、ゲル材及び試料は、
試料中の望ましくない流体（例えば上澄み）を吸収し得
る多孔質の支持ウェブによって画成されているエンクロ
ージャ内へ、遠心操作（例えば遠心機を用いて）によっ
て共沈積させられる。

好適に、アルギン・ゲル材が用いられ、その硬化は、塩
化カルシウムのような硬化剤との接触によって達成され
る。好適な実施例においては、硬化剤が、支持ウェブに
適用されており、もって、エンクロージャ内での沈積に
よってアルギン・ゲルが支持ウェブと接触すると、アル
ギン・ゲルの硬化が直ちに開始する。

また、本発明は、上記方法を実施する装置をも提供する
。

［実　施　例］以下、添付図面を参照して本発明について説明する。

本発明に係る方法を好適に実施するにおいて、エンクロ
ージャ／キャリヤ組立体１（第２図）が、キャリヤ３内
の濾紙からなる裏打ち層（図示せず）上に１枚以上の濾
過カード２を積み重ねることによって組み立てられ、上
記キャリヤ３は、積み重ねられた濾過カードを収容ため
の凹部４と、細胞遠心機のスライドホルダ６（第３図）
と係合するための、ラグ５のような適切な位置決め手段
とを備えている。濾過カード・濾紙積層体は、１８×１
８ｍｍの正方形であり、濾過カード２は、エンクロージ
ャを画成する円形のアパーチャアを有している。組立体
１の構成部品が第１図に示されており、組み立てられた
構成部品が第２図に示されている。この組立体の使用に
先立ち、積み重ねられた濾過カード２及び濾紙からなる
裏打ち層によって構成されている支持ウェブに、硬化剤
（例えば、塩化カルシウムの５％溶液）が、図示されて
いる満場８のような適切な手段によって掛けられる。

組立体１は、ゲル材及び試料をエンクロージャ内に共沈
積させる手段と共に、スライドホルダ６に嵌装される。

第３図に示されているように、これらの手段は、ＥＰ−
Ａ−０，０４７，８４０号に開示されているような試料
室ユニット１０を備えており、このユニットは、組立体
１を覆うようにしてスライドホルダ６内に受容されるフ
ランジ１１と、濾過カード２のアパーチャアと整合する
試料チューブ１２とを有している。試料チューブは、フ
ランジ１１とは反対側の密閉端部の近傍で漏斗チューブ
１３と連通している。第３図は、上　９− 記構成部品のそれぞれの配置を理解しやすくするため、
互いに分離させられている構成部品を示している。それ
らが組み立てられると、組立体１のラグ５は、スライド
ホルダ６の四部９内に位置すると共に、ユニット１０の
フランジ１１は、組立体１と係合してそれをスライドホ
ルダ６内に閉じ込め、アパーチャアの周囲に試料チュー
ブ１２と濾過カード２との間の密封接続を形成する。組
立体１及びユニット１０を装着したスライドホルダ６が
、細胞遠心機のヘッド・キャリヤ（図示せず）内に嵌装
されると、スライドホルダ６は、試料チューブ１２の密
閉端部がその開口端部よりも低くなるような姿勢をとり
、この結果、漏斗チューブ１３を介して試料チューブ１
２内に置かれた材料は、試料チューブ１２の密閉端部の
近傍に留る。

第３図に示されているように、ゲル材及び試料は、概略
的に図示されているそれぞれのアプリケータ１４及び１
５から漏斗チューブ１３内に導入される。好適な実施例
においては、ゲル材は、アルギン酸のナトリウム塩の１
％溶液であり、この　１０− 溶液及び試料の各々２滴が、それぞれのアプリケータ１
４及び１５により、漏斗チューブ１３内に滴下される。

ＥＰ−Ａ−０，０４７，８４０号に説明されているよう
に、細胞遠心機が回転すると、スライドホルダ６は、第
３図に示されている垂直の姿勢をとり、試料チューブ１
２の軸は水平になって人工の重力ベクトルと整合し、こ
の結果、ゲル材及び試料は、アパーチャアによって画成
されているエンクロージャ内に共沈積させられる。ゲル
材が支持ウェブ構造体に吸収されている硬化剤と接触す
ると、ゲル材の硬化が開始する。必要な沈積が得られ、
ゲル材が十分に硬化して沈積した試料を閉じ込めるまで
、遠心操作は続けられる。通常、細胞遠心機は、最高で
１５００ｒｐｍの低い速度で回転させられ、その回転速
度で５分間保持され、停止させられる。

今やゲル・ボタン２０（第４図）を収容している組立体
１は、ここで、スライドホルダ６から取り出される。も
し必要ならば、ゲル材の完全な硬化が、支持ウェブ及び
ゲル・ボタンを硬化剤中に浸漬することにより、促進さ
れる。これは、その基部が第４図に参照符号２１で示さ
れているところの在来の処理カセット内に、又は、以下
に第６図〜第８図を参照して説明するところの、キャリ
ヤ３及び適切なカバーによって構成されている処理カセ
ット内に、支持ウェブ及びゲル・ボタンを移すことによ
り、達成される。ゲルが完全に硬化すると、未だ支持ウ
ェブ内にあるゲル・ボタンは、在来の組織処理操作又は
同様の操作を受ける。封埋段階において、支持ウェブは
好適に除去され、もって、後続の、結果として生じた細
胞組織塊の薄片化において、ミクロトームの刃への損傷
が避けられる。封埋は、第５図に示されている構成によ
り、封埋用の型（１０ｘ１０ｍｍ）内で好適に達成され
、もって、支持部２３に取着された細胞組織塊２４が作
製される。

好適な実施例においては、封埋の準備ができている地点
に移されるまでの、ゲル・ボタンへの手による接触及び
その損傷を最小にするため、キャリヤは、処理カセット
の一部を形成している。第６図及び第８図は、アセター
ル樹脂成形によって形成されているキャリヤ／処理カセ
ットの好適な形状を示している。

これらの図に示されているように、キャリヤ／処理カセ
ット１００は、ヒンジ１０３によって合体させられてい
る２つの部分１０１，１０２を具備しておりおり、部分
１０２は、部分１０１上に折り重ねられ得る。部分１０
２は、スナップキャッチ・ペグ１０４を有しており、該
ペグ１０４は、部分１０１における穴１０５と係合して
部分１０１上の決った位置に部分１０２を固定し、もっ
て処理カセットを形成する。

部分１０１は、本発明に係る上述した方法におけるキャ
リヤとして機能し、この目的のため、その前面に、１８
Ｘ１８ｍｍの正方形の凹部１０６であって、上述した支
持ウェブの濾過カード・濾紙積層体を受容するためのも
のを有している。部分１０２は、部分１０１上に折り重
ねられた際にカバーを形成すると共に、カセットが閉じ
られた際１３に支持ウェブ及びゲル・ボタン上にクリアランスをもた
らすための凹部１０７をその前面に有している。また、
凹部１０７は、支持ウェブ内のエンクロージャの底部を
画成する濾紙の延長部を収容する。

キャリヤ／処理カセット１００の、カセットを形成して
いる形態において、部分１０１上の決った位置に部分１
０２を固定するのを補助するため、部分１０２の端部は
、部分１０１の対応する端部に係合する、前方に突出し
ているフランジ１０８を有している。これは、もし処理
が完了する前にヒンジ１０３が壊れた場合、整合を維持
すべく機能する・。

部分１０１の後面は、突出しているラグ１０９であって
、第３図を参照して説明した態様で、細胞遠心機のスラ
イドホルダ６にキャリヤ／処理カセットを位置させるた
めのものを有している。処理が完了した後にカセットを
開くのを容易にするため、部分１０１，１０２は、指の
爪が入るところの縁凹部１１０を有している。キャリヤ
／処理４− カセット１００は、処理カセットとして使用されている
際に処理流体の自由な流れを提供すべく、図示のように
、自由に穴を開けられている。

本発明に係る方法に戻ると、５μｍの厚さのほぼ６０個
の切片が、上述した方法で作製された細胞組織塊２４か
ら、検鏡組織標本切片法によって切断され得、そして、
６個までの切片が、例えばヘマトキシリン及びエオシン
で染色するための標準的な顕微鏡用スライドガラス上に
供給される。

シャントン・ヘマトキシリン（活性度２）によるゲルの
染色、及び水性アルシアン・ブルー染料溶液によるゲル
の染色は、中位である。他方、マイヤーズ・ヘマトキシ
リンは、ゲルを殆ど染めなかった。ゲルの染色が望まし
くない所にある材料は、染色の前に燐酸塩の緩衝塩でほ
ぼ５分間スライドガラスを処理することにより、除去さ
れ得る。細胞の僅かな部分が、この処理の間に不可避的
に失われ得るが、これは、１枚のスライドガラスに多数
の切片を取ることにより、補償され得る。

エンクロージャの濾紙裏打ち層は、図示されていない。

それは、濾過カード２と同じ大きさであるか、あるいは
、第６図〜第８図に関連して説明したように、それは、
濾過カード２よりも大きく、取扱いの目的で、便利な“
端子”をもたらすべく、少なくとも一方の側部に、組立
体１から突出するように構成されていてもよい。裏打ち
層が濾過カード２よりも大きい場合、キャリヤ３から取
外す際、過剰の部分が濾過カード上に折り重ねられ、も
って、後続の取扱い及び処理において部分的に硬化した
ゲル・ボタンは、損傷又は障害から保護される。

日常の実験室での実施においては、数バッチ分のゲル・
ボタンが、自動組織処理装置により、夜通し処理される
。硬化後であって処理前のカセット化されたゲル・ボタ
ンの貯蔵は、１０％ホルマール生理的食塩水（４％ホル
ムアルデヒド）のポット内に保持することにより、達成
される。

ある試料は、上述した操作が実行される前に、前処理を
必要とするかもしれない。例えば、新鮮な状態で受は入
れられた、あるいは等張生理的食塩水内の細胞学的な材
料は、遠心操作（３０００ｒｐｍで５分間）して固形分
を沈積させ、次いで、上澄みをデカンタし、その後、固
形分を例えば１０〜１５ｍ１の１０％中性緩衝ホルマリ
ン（ＮＢＦ）（４％ホルムアルデヒド）中で再懸濁させ
るような前処理を必要としよう。（重い沈降物又は目に
見える軟層を含む沈降物に対しては、１０〜１５ｍ１の
ＮＢＦに移された３〜４滴の試料からなる限定された試
料が推奨される。）固定化に１５分間の余裕をみた後、
更に、遠心操作（３０００ｒｐｍで５分間）、デカンタ
、及びほぼ３〜４滴の１０％ＮＢＦ中での再懸濁が、図
面を参照して説明した操作を実行するに適した試料を提
供するであろう。

アルコール性流体（例えば、サッコマノ流体）内に受容
された細胞学的材料は、細胞収縮及び沈殿したクロマチ
ンのような、アルコール固定図を見せるであろう。その
ような材料は、それ以上の固定を必要とせず、その前処
理は、単に、遠心操作、上澄みのデカンタ、及び１０％
ＮＢＦ中での７再懸濁からなっており、上述した操作に対して少ない量
の試料を提供する。同様な前処理が、ホルムアルデヒド
溶液内で固定させられる材料に適用され得る。

殆どの有機溶剤に対して、そして熱いワックスに対して
さえ非常に安定であるが、好適なアルギン・ゲルは、中
性緩衝ホルマリン中で、燐酸イオンの存在の下に、ＥＤ
ＴＡのようなキレート剤により、非常にゆっくりと解重
合される。それにもかかわらず、細胞組織塊は、中性緩
衝ホルマリン中で受容された検体から調製され得る。何
故ならば、過剰なカルシウム・イオンが、濾過カード及
び濾紙中に存在し、数滴の試料中に存在する比較的少量
の燐酸イオンを効果的に追い出すからである。試料片が
、細胞組織塊が作製される前に適切に固定されるという
ことは、重要である。もし固定が処理サイクルの一部と
して用いられるならば、不緩衝ホルマール生理的食塩水
が使用されるべきであるということ、あるいは、細胞ボ
タンが、固定工程後に、アルコールに直接加えられるべ
きで　１８− あるということが、示唆される。硬化した細胞ボタンは
、不利な効果を及ぼすことなく、室温の中性緩衝ホルマ
リン中に短時間なら耐えることができる。現在のところ
、中性緩衝ホルマリン中での安定性に関する最良の見積
りは、３０分間である。

微細針吸引が、１８〜２２ゲージの針によって到達され
得る多くの組織部位から行なわれ得る。

最も典型的に、これらは、胸腺、甲状腺及びリンパ腺を
含んでおり、これらの組織の膨潤は、容易に見られ得又
は感じられ得る。この“非侵入”技術は、組織の外科的
な生検即ち測探になり得る。

ＦＮＡ試料が輸送材料（固定液又は通常の生理的食塩水
）内で収集される限り、細胞組織塊は調製され得る。気
管支洗液、胸膜滲出液及び尿のような他の細胞学的検体
から細胞組織塊を調製することも可能であろう。そのよ
うな場合、試料は、細胞組織塊の調製に先立ち、予め遠
心操作され且つ固定されなければならない。

電子顕微鏡用のペレットは、バクテリア、Ｊ１１細胞及
び原生動物のような固定された粒状検体の遠心操作によ
って形成される。従って、１つの応用が、ゲルとＥＭ処
理流体との共存性及びカルシウム・イオンと電子ビーム
との相互作用に依存して、ＥＭ実験室内で見出され得る
。

［発明の効果］細胞組織塊を調製する、本発明に係る方法は、ユーザに
、従来技術を凌ぐ、多くの利点を提供する。第１に、好
適な技術において使用される細胞。

遠心操作は、オペレータの干渉を著しく減少させること
により、且つ、試料の量を限定することにより、再現性
のある標準的な細胞組織塊が作製されることを可能にす
る。

第２に、好適なアルギン・ゲル材は、塩化カルシウムに
よって非常に効率的に、化学的に硬化させられるので、
寒天の不便さが避けられ得る。原料は、トロンビンより
もかなり安価であり、より容易に使用され得、しかも冷
蔵庫内に貯蔵される必要がない。長くなった保存寿命の
ために、アルギン溶液は、ホルムアルデヒド含有溶液内
で作製されることさえ可能になる。

第３に、従来の方法と異なり、好適なアルギン・ゲルは
、スライドガラス１枚当りに利用される細胞の数を著し
く減少させることなく、染色に先立ち、切片から容易に
除去され得る。しかしながら、ヘマトキシリン及びエオ
シンでの染色後のゲルのモーブ染色は、不完全な細胞標
本の位置を捜し出すのを助ける。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る方法を実施するための、好適な
実施例におけるエンクロージャ及びキャリヤの構成部品
の断面図、第２図は、第１図に示されている部品が組み立てられて
たところを示す断面図、第３図は、ＥＰ−Ａ−０，０４７，８４０号に開示され
ている遠心機を使用する、上記方法における好適な沈積
操作を概略的に説明するための説明図、第４図は、ゲル／試料ボタンを有するエンクロージャの
、処理カセットへの移動を説明するための説明図、１第５図は、処理されたゲル／試料ボタンを封埋すること
から生ずる細胞組織塊を示す説明図、及び第６図〜第８図は、本発明に係る方法を実施するための
キャリヤ／処理カセットの好適な形状を示す、それぞれ
、背面図、側面図及び正面図である。１・・・エンクロージヤ／キヤ２・・・濾過カード３・・・キャリヤ４・・・凹部５・・・ラグ６・・・スライドホルダ７・・・アパーチャ８・・・満場９・・・凹部０・・・試料室ユニットト・・フランジ２・・・試料チューブ３・・・漏斗チューブリヤ組立体　２２　− １４．１５・・・アプリケータ２０・・・ゲル・ボタン１００・・・キャリヤ／処理カセット１０１．１０２・・・部分１０３・・・ヒンジ１０４・・・スナップキャッチ・ペグ１０５・・・穴１０６・・・凹部１０７・・・凹部１０８・・・フランジ１０９・・・ラグ１１０・・・縁間部３

Claims

【特許請求の範囲】

（１）細胞組織塊を調製する方法であって、支持ウェブ
によって画成されているエンクロージャ内に、試料と硬
化可能なゲル材とを沈積させ、上記ゲル材を硬化させて
上記試料を閉じ込め、その後、上記ゲル材と閉じ込めら
れた上記試料とを組織標本風に処理して封埋可能なボタ
ンをもたらす、方法。
（２）前記ゲル材及び前記試料を、前記エンクロージャ
内に共沈積させる請求項１記載の方法。
（３）少なくとも前記試料を、前記エンクロージャ内に
遠心作用によって沈積させる請求項１又は２記載の方法
。
（４）前記ゲル材及び前記試料を、多孔質の支持ウェブ
によって画成されているエンクロージャ内へ遠心操作に
よって共沈積させる請求項２又は３記載の方法。
（５）前記多孔質の支持ウェブに、前記ゲル材用の硬化
剤を予備含浸する請求項４記載の方法。
（６）前記ゲル材がアルギンである請求項１〜５のいず
れか一項に記載の方法。
（７）前記硬化剤が塩化カルシウムである請求項５又は
６記載の方法。
（８）請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実施
するのに使用される装置であって、キャリヤと、エンクロージャを画成している支持ウェブであって、上
記キャリヤ内に受容され得且つ硬化可能なゲル材及び試
料の沈積物を受容すべくなされているものと、を具備する装置。
（９）前記支持ウェブが、その中にアパーチャを有する
多孔質の濾過カードと該アパーチャの一方の側を閉塞す
る裏打ち層とを備えている請求項８記載の装置。
（１０）前記裏打ち層が濾紙である請求項９記載の装置
。
（１１）前記キャリヤが処理カセットの一部を構成して
いる請求項８、９又は１０記載の装置。
（１２）前記キャリヤが、ヒンジによって合体させられ
ている第１の部分及び第２の部分からなっており、該ヒ
ンジは、該第２の部分が該第１の部分の上に折り重ねら
れて閉じた処理カセットを形成するのを可能にし、該第
１の部分は、前記支持ウェブを受容する凹部を有してい
る請求項８〜１１のいずれか一項に記載の装置。