JPH0347080A - トリプトファナーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はプロテウス（Ｉ’ｒｏ　ｔｅｕｓ　）属菌株由
来のトリプトファナーゼをコードするＤＮ八へ列、１亥
ＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込んだ組換えプラスミ
ド、該＆Ｉｌ換えプラスミドを存する形質転換体及び該
形質転換体を用いてトリプトファナーゼを製造する方法
に関する。

トリプトファナーゼはトリプトファンをインドール、ピ
ルビン酸及びアンモニアに分解する反応を触媒する酵素
であり、反応式は以下の通りである。

トリプトファン＋Ｈ！０戸ヨインドール士ピルヒ゛ン酸
十Ｎ１１゜ 上記の反応は可逆的であり、トリプトファナーゼを触媒
として用いることによりインドール、ピルビン酸及びア
ンモニアからトリプトファンを合成することが出来る。

（従来の技術） 従来、トリプトファナーゼは例えばプロテウスレトゲリ
　（ＰｒｏＬｅｕｓ　ｒｅｔｔｏｇｅｒｉ）エシェリヒ
アコリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１
２株等、トリプトファナーゼ生産能を有する微生物をト
リプトファンまたはその誘導体の存在下で培養し、該培
養物がらトリプトファナーゼを採取することにより製造
されている。しかしながら、この方法では培地中にトリ
プトファンまたはその誘導体等の高価な物質を添加する
ことが必要であり、またトリプトファナーゼの収量も充
分ではなく、効率の良いトリプトファナーゼ製造方法の
開発が望まれていた。

一方、プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓ
ｉｎｃｏｎｓ　ｔａｎｓ　）に属する菌株がインドール
化合物又はその誘導体とピルビン酸エステルとアンモニ
ウムイオンとからＬ−トリプトファンまたはその誘導体
を生成する能力を有することが公知であった（特開昭６
２−２０５７９１号）。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の課題は、遺伝子操作技術を用いて培地中にトリ
プトファン又はその誘導体を添加することなく、トリプ
トファナーゼの生産性を向上させる新たな方法を提供す
ることにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の課題を解決するために、トリプト
ファナーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を発
現ベクターに組み込んだ組換えプラスミド、該プラスミ
ドを含有する形質転換体及び該形質転換体を用いてトリ
プトファナーゼを生産する方法について検討した。まず
トリプトファナーゼ生産菌の有するトリプトファナーゼ
遺伝子をクローニングし、該遺伝子のＤＮＡ配列を決定
した。次いで該ＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込んだ
組換えプラスミドを得、更に該プラスミドを含む形質転
換体＠調製し、該形質転換体を用いるトリプトファナー
ゼの製造方法について検討し、本発明を完成するに至っ
た。

すなわち本発明は （１）プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属菌株由来のトリ
プトファナーゼをコードするＤＮＡ配列。

（２）請求項第１項記載のＤＮＡ配列を含む組換えプラ
スミド。

（３）請求項第２項記載の組換えプラスミドにより形質
転換された形質転換体。

（４）請求項１項記載のＤＮＡ配列を組み込んだ組換え
プラスミドにより、生物細胞あるいは微生物を形質転換
し、得られた形質転換体を培養して培養物からトリプト
ファナーゼを採取することを特徴とするトリプトファナ
ーゼの製造方法。

からなるものである。

本発明のプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属菌株由来のト
リプトファナーゼをコードするＤＮＡ配列は第１図に示
されるものである。

本発明のプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属菌株由来のト
リプトファナーゼをコードするＤＮＡ断片は、第１図の
塩基配列の一部を有するものであっても、塩基配列が一
部欠失、置換されたり挿入が加わったものであっても、
トリプトファナーゼをコードする限り、本発明の範囲に
含まれる。以下、本発明を実施するための各段階につい
て詳細に説明する。

（ａ）トリプトファナーゼをコードする・ＤＮＡ配列お
よび＄ＪＩ換えプラスミドの調製 本発明においてトリプトファナーゼをコードするＤＮＡ
配列の採取源となるプロテウス属菌株としては、プロテ
ウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓｉ　ｎｅｏｎ
ｓ　ｔａｎｓ　）が好ましく、上記ＤＮＡ配列はプロテ
ウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　１ｎｃｏｎ
ｓｔａｎｓ）の染色体ＤＮＡより分離できる。好適な例
としては、プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅ
ｕｓ　１ｎｃｏｎｓｔａｎｓｃを栄養培地で培養し、こ
の培養物を５．ＯＯＯｒｐｍ以上、好ましくは８．００
０〜１０．０００ｒｐ…で５分間以上、好ましくは１０
〜１５分間遠心分離して菌体を得る。この菌体より、例
えばＲｏｄｒｉｑｕｅｚ　Ｒ，Ｌ　ｅｔ　ａｌ　Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（＾
ｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　　Ｐｕｂ！ｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙ、　　１９８３）或はＫｏｉｚｕｍｉ　
Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｔｅｃｂ。

Ｂｉｏｅｎｇ、、２７，７２１〜７２８．１９８５記載
の方法等により染色体ＤＮＡを得ることが出来る。

この染色体ＤＮＡに制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ　（東
洋紡製）を３０℃以上、好ましくは３７°Ｃで、３０分
以上、好ましくは、１〜２時間作用させて切断し、種々
の大きさの染色体ＤＮＡ断゛片混合物を得る。このよう
にして得られたＤＮへ断片混合物から、例えばシｇ糖密
度勾配遠心分離等により低分子量（例えばＩＫｂρ以下
）のＩＩＮＡ断片を除き、更にエタノール沈澱法等のｆ
ｉ縮平手段より濃縮し、トリブトファナ−ゼをコードす
る遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物を得る。

本発明の組換えプラスミドはプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕ
ｓ）属菌株由来のトリプトファナーゼをコードするＤＮ
Ａ配列をベクターＤＮＡに組み込んだものである。

本発明に用いるベクターＤＮＡとしては、宿主となる生
物細胞又は微生物においてトリプトファン又はその誘導
体の添加を必要とすることなく、トリプトファンの発現
を行なわせるものである。例えばプラスミドベクターＤ
ＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等があげられ
るが、好適な例として、プラスミドベクターｐＢＲ３２
２、ρｔｌｃ１９　（東洋紡５１）、バクテリオファー
ジベクターλＺＡＰ、　Ｅ門ＢＬ３（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｍｅ製）等があげられる。

本発明では、上記ベクターＤＮＡにトリプトファナーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物を連結
する。連結には例えば大腸菌ＤＮＡＵガーゼ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（東洋紡製）など、好ましくはＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを４〜１７°Ｃ１好ましくは４〜１６゛Ｃにて１
時間以上、好ましくは４〜１６時間作用させ、組換えＩ
ＩＮＡを得る。このＭ換え［ｌＮＡを用いて、宿主微生
物、例えば［！、ｃｏｌｔに−１２、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ
Ｍ１０９株、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＩＩＢＩＯＩ株、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　Ｃ６００株、１４．ｃｏｌｉＸＬＩ−ｂｌｕｅ株
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）などを形質転換あるいは形
質導入しそれぞれの菌体を得る。この形質転換および形
質導入は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、１９８２）記載の方法によ
り行うことが出来る。

そして上記形質転換体あるいは形質導入体からトリプト
ファナーゼ生産能を有する菌株を、酵素免疫テストなど
によりスクリーニングし、トリプトファナーゼをコード
する遺伝子を含有する組換えＤＮＡが得られる。更に上
記組換えＤＮＡ中のトリプトファナーゼをコートする遺
伝子を含有するＤＮＡ断片を常法に従い、小断片化して
上記ベクターＤＮＡと連結し、トリプトファナーゼをコ
ードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミドを得るこ
とが出来る。

該ｇ換えプラスミドに挿入されたＤ）ＪＡ断片の塩基配
列の決定を行ない、トリプトファナーゼをコードするＤ
ＮＡ断片を得る。

（ｂ）形質転換体の調製 （ａ）にて得られたトリプトファナーゼをコードするＤ
ＮＡ配列をベクターに組み込んだＭｉ換えプラスミドを
、生物細胞あるいは微生物に導入することにより、所望
の遺伝形質とベクターＤＮＡの形質を合せ持つ形質転換
体が得られる。宿主微生物としてはＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１
２株、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｈ
８１０１株、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００株、Ｅ、ｃｏｌｉ
　Ｄｌｌ−１株等が挙げられる。このようにして得られ
た好適な例としては、例えばＥ、ｃｏｌｉ　ＩＩＢＩＯ
Ｉ　（ｐＴＥ１９２０）がある。

（Ｃ）トリプトファナーゼの製造 上記（ｂ）で得られた形質転換体を培養するにはトリプ
トファナーゼの生産に適した培地であって、且つ宿主微
生物の生育に適した培地を用いる０通常エシェリヒア属
の生育培地として用いられているＬＢ培地（トリプトン
、酵母エキス、食塩）　、ＢＰＢ培地（Ｄｉｒｃｏ；ポ
リペプトン、酵母エキス、リン酸カリウム）等を基本培
地として用いればよい。その他、必要に応じて他の炭素
源、窒素源及びアミノ酸、ビタミン等の栄養素を添加し
てもよい。培養方法は、通常振とう培養あるいは通気攪
拌培養で行う。培養温度は２０〜４５℃の範囲、好まし
くは３７°Ｃ付近、培養初発ｐＨはｐＨ６，０〜７．５
、好ましくはｐＨ６，２〜６．８付近で行うのがよい。

これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施
できる。

培養期間は１０〜４０時間で生育し、菌体内にトリプト
ファナーゼが生育蓄積される。

本酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよ
い。例えば抽出法には、超音波破砕、ガラスピーズを用
いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤などい
ずれを用いてもよい。更に抽出液については、公知の硫
安やばう硝等の塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシ
ウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミ
ンなどの凝集法さらにはＤＥ八へ（ジエチルアミノエチ
ル）セファロース（ファルマシア製）　、ＣＭ　（カル
ボキシメチル）等のイオン交換クロマトグラフィーおよ
びゲル濾過法等により精製することが出来る。

（発明の効果） 本発明のトリプトファナーゼをコードするＤＮＡ配列を
含む組換えプラスミドを有する形質転換体を培養すると
、トリプトファンを培地に添加することなくトリプトフ
ァナーゼを効率よく生産することが可能となる。

（実施例） 以下、実施例を挙げ本発明の詳細な説明を行う。

プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓｉｎｃ
ｏｎｓｔａｎｓ）　ＩＰ０１２９３１株を栄養培地（ポ
リペプトン１％、酵母ｘ−ｊｒス０．５９Ａ、食塩０．
５％　）　１ｏｏＩＩＪｆｆｉ　ニ接触し、３７℃で１
０時間振とぅ培養し培養液を得た。

この培養液をＩ２．００Ｏｒｐｍ、１ｕ分間遠心分離し
て湿菌体を得た。該菌体からＲｏｄｒｉｑｕｅｚ　Ｒ，
Ｉ、ｅｔ　ａｌ。

Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ（Ａｄｄｉｓｏｎ−ＷｅｓｌｅｙＰｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８３）記載の方法により染色
体ＤＮＡを調製した。

該染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ　（東洋紡製）２
５ユニツトで３７°Ｃ１１時間切断した。切断後５〜２
０％シヨ糖密度勾配遠心分離を行い、２〜２０Ｋｂｐ画
分のＤＮＡ断片を調製した。

バクテリアファージヘクターλ−ＺＡＰ　（ＥｃｏＲＴ
切断済み、Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ製）１μｇと上記
（１）で得たＥｃｏＲＪで切断した染色体ＤＮＡ０．５
μｇをＴ、Ｉ）ＮＡＩＪガーゼ（東洋紡製）１ユニツト
で１６°Ｃ１１２時間反応させＤＮＡを連結した。

連結したＤＮＡはλＤＮＡインビトロパッケージングキ
ットＧｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ製）を用いてパンケージソゲした。パッケージング
により得られた組換えファージはＭａｎｉａｔｉｓ　Ｔ
、ｅｔ　ａｌ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（Ｃ
ｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、１９８２）記載の
方法によりＥ、ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株（Ｓ　Ｌ
ｒａ　ｔａｇｅｎｅ製）に形質導入した。使用（ＩＮＡ
　１ｕｇ当たり約２　ｘｌＯ６個のファージプラークが
得られた。

トリプトファナーゼをコードするＤＮＡ配列を有する組
換えファージの検索は酵素免疫テストにより行った。酵
素免疫テストはＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキット
（ベーリンガーマンハイム製）を用いて行った。本酵素
免疫テストはトリプトファナーゼ約１０ｐｇの検出限界
を示し、上記ファージプラーク１０００個当り１〜３個
の陽性発色が得られた。

酵素免疫テストで陽性のプラーク３個よりＳ　ｔｒａ　
ｔａｇｅｎｅ製λＺＡＰ使用マニュアルの指示に従い組
換えプラスミドを切り出した。得られた３種の組換えプ
ラスミドをＥｃｏＲＩで切断すると３種の組換えプラス
ミド共通に８．３ＫｂＰのＤＮＡ断片が見いだされた。

この８．３ＫｂｐのＤＮＡ断片は種々の制限酵素により
特徴付けされた（第３図）。

この８．３ＫｂｐのＥｃｏＲＩ断片約４７／ｇから旧ｎ
ｄｌ［［（東洋紡製）を用いて切断し、約４　Ｋｂｐの
ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ■断片を得た。生じたＤＮＡ断片
はアガロース電気泳動後、ＤＮＡ精製キット、ＧＥＮＥ
ＣＬＥＡＮＴＭ　（ＢＩｏ　１０１製）を用いてアガロ
ースゲルよりの抽出及び精製を行った。

約４　ＫｂｐのＥｃｏＲＩ−１１ｉｎｄ　ｍ　ＤＮＡ断
片約１ｕｇを、ＥｃｏＲｌｌｌｉｎｄ　［［［にて切断
間環したプラスミドベクターＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ
　（門−１３）　　（ＳｔｒａｔａＢｅｎｅ製）約０．
５μと混合し、Ｔ４リガーゼ１ユニントで１６°Ｃ１１
２時間反応させてＤＮＡを連結させ組換えプラスミドｐ
ＴＥ２０１を得た。

更に取得ＤＮＡ断片の小型化を進めるためにＫｉｌ。

５ｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（宝酒
造製）を用い、そのマニュアルに従いＥｃｏＲＩ切断サ
イト側から約１．７にｂｐ、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩサイト
側から約０．７Ｋｂｐの塩基をデイレ−ジョンさせ、挿
入ＤＮＡ断片が約１．６Ｋｂｐとなった組換えプラスミ
ドｐＴＥ２０２を得た。

ついで、プラスミドｐＴＥ２０２を、その有するマルチ
クローニングサイトを利用しにｐｎｌおよび５ａｃＴで
切断し所望するＤＮＡ断片を切り出した。

得られた約１．６Ｋｂｐのにｐｎｌ−３ａｃｌ断片約１
μｇを、Ｋｐｎｌ−５ａｃｌで切断間環した発現ベクタ
ーｐＵｃ１９約０．５μｇと混合しＴ４リガーゼ１ユニ
ットで１６°（，１２時間反応させてＤＮＡを連結させ
組換えプラスミドｐＴＥ１９２０を得た。

この組換えプラスミドｐＴＥ１９２０は発現ベクターｐ
Ｕｃ１９の有するランクプロモーター（Ｌａｃ　Ｐｒｏ
ｍｏｔｅｒ）の制御下に生物学的活性を有するトリプト
ファナーゼをコードする。

一方、岨換えプラスミドＰＴＥ２０１の挿入ＤＮＡ断片
の小型化をデイレ−シラン法で進めるに当たり生じた種
々の大きさのディレーションミュータントより１本鎖Ｄ
ＮＡを調製し、得られた１本鎖ＤＮＡについて７−Ｄｅ
ａｚａ−３ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　（東洋紡製）
を用いて塩基配列の決定を行った。次いで組換えプラス
ミドｐＴＥ１９２０に挿入されているＤＮＡ断片の塩基
配列の決定を行った。トリプトファナーゼをコードする
塩基配列を第１図に示す。

上記トリプトファナーゼをコードするＤＮＡ配列を有す
る組み換えプラスミドｐＴＥ１９２０を用いＭａｎｉａ
ｔｉｓ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｆｌａｒｂｏｒ、　
１９Ｂ２）記載の方法によりＥ、ｃｏｌｉ　ＩＩＢＩＯ
Ｉを形質転換してＥ、ｃｏｌｉ　）ＩＢＩＯＩ（ｐＴＥ
１９２０）を調整した。

本形質転換体は誘導物質なしに可溶性タンパク質の約６
０％まで目的とするトリプトファナーゼを生産した。

トリプトファナーゼの活性測定法は、０．２χインドー
ル、１．１χピルビン酸ナトリウム、１，１χ塩化アン
モニウム、０．１ｍＭピリドキサールリン酸ン容液中に
て、２０℃、３０分間反応後、トリプトファンの生成量
をＨＰＬＣ（日立製作断裂）にて測定した。酵素活性は
２０°Ｃで１分間に１マイクロモルのトリプトファンを
生成する酵素活性を１ユニントとした。

■供与株プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕ
ｓ　１ｎｃｏｎｓｔａｎｓ）及びＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩ
ＯＩ（ｐＴＥ１９２０）株の酵素生産性を培地（ポリペ
プトン２％、酵母エキス２％、ラクトース０．３％、食
塩０．５％、アンビシシリン５０μｇ／ｍｌ）にて比較
した。

各々の株の培養活性を下記の第１表に示すが、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　ＨＢＬＯＩ（ｐＴＥ１９２０）株では、トリプト
ファン等の誘導なしにトリプトファナーゼが高生産され
ていることがわかる。

第１表 上記の酵素生産性の比較に用いた培地と同様の培地６！
を、１０２−ジャーファーメンタ−に分注し、１２１℃
、１５分間オートクレーブ殺菌を行い放冷後、５０ｍｇ
／ｄアンピシリンを６ｄ添加した。この培地に上記と同
じ培地にて予め３７°Ｃで８時間振とう培養したＥ、ｃ
ｏｌｉ　ＩＩＢＩＯＩ（ｐＴＥ１９２０）　　の’？ｔ
　ａ　ン夜を６０ｔｎｌ接種し、３７℃にて２４時間通
気攪拌培養を行った。培養終了時のトリプトファナーゼ
活性は１．０５０／ｄ−Ｂｒｏｔｈであった。

培養液６Ｉ！、から遠心分離により菌体を集め、５０ｍ
Ｍ　　Ｋ−リン＃ｔ１Ｍ街′ｅｐＨ７，５，５００ｄに
懸濁し、常法によるガラスピーズを用いる機械的な破砕
法により菌体を破砕した。この菌体破砕液からトリプト
ファナーゼの粗酵素液を遠心分離により得た。

このようにして得た粗酵素液にポリエチレンイミンによ
る除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用いた塩
析分画を行った。ここで得られた塩折沈澱物を、５０ｄ
の５０１１ＩＭのに一リン酸緩衝液、ｐＨ７，５に再溶
解し、同緩衝液により平衡化されたＤＥＡＥ−セファロ
ース（ファルマシア製）カラムクロマトグラフィーに供
し、０〜０．針の食塩濃度勾配溶出法により約０．１〜
０．３Ｍの食塩濃度範囲でトリプトファナーゼ活性画分
を得た。このトリプトファナーゼ活性画分を限外濾過機
にて濃縮後、５０ｓ＋Ｍ　　Ｋ−リン酸緩衝液、ｐｌ＋
７．５で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマ
シア！！ｉりカラムクロマトグラフィーにてゲル濾過を
おこなった。このようにして純化されたトリプトファナ
ーゼ３６５゜ユニットを得た。収率は５８％であった。

【図面の簡単な説明】

第１　図ハフ”ロチウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓｆｎｃｏｎｓｔａｎｓ　）株のトリプトファナー
ゼをコードするＤＮ＾配列を示し、第２図は対応するア
ミノ酸配列を示す。 第３図は組換えプラスミドｐＴＥ１９２０の構築経過を
示す。 第１図（ａ） ＡＴＣＧＣＴ　　ＡＡＡ　　ＡＧＡ　　ＡＴＴ　　ＧＴ
Ａ　　ＧＡＡ　ＣＣＡ　　ＴＴＣＣＧＣ０ ＡＴＴ　　ＡＡＡ　　ＡＴＧ　　ＧＴＡ　　ＧＡＡ　　
ＡＡＴ　　ＡＴＣＣＧＴ　　ＡＴＴ　　ＣＣＡ０

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属菌株由来のトリ
   プトファナーゼをコードするＤＮＡ配列。
2. （２）請求項第１項記載のＤＮＡ配列を含む組換えプラ
   スミド。
3. （３）請求項第２項記載の組換えプラスミドにより形質
   転換された形質転換体。
4. （４）請求項１項記載のＤＮＡ配列を組み込んだ組換え
   プラスミドにより、生物細胞あるいは微生物を形質転換
   し、得られた形質転換体を培養して培養物からトリプト
   ファナーゼを採取することを特徴とするトリプトファナ
   ーゼの製造方法。