JPH034782A - 明確なエピトープ特異性を有するヒト組織プラスミノーゲン活性化因子に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
明確なエピトープ特異性を有するヒト組織プラスミノーゲン活性化因子に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH034782A JPH034782A JP9490790A JP9490790A JPH034782A JP H034782 A JPH034782 A JP H034782A JP 9490790 A JP9490790 A JP 9490790A JP 9490790 A JP9490790 A JP 9490790A JP H034782 A JPH034782 A JP H034782A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
種々の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）に
対するモノクローナル抗体はすでに文献に記述されてお
り、その中ではｔ−ＰＡ分子全体が該文献で知られるモ
ノクローナル抗体の調製のための免疫原として使用され
ている。それゆえこれらの抗体は、異物またはその一部
が問題とする宿主生物の免疫原である場合、記述されて
いる免疫化により該宿主の免疫系が理論的に該異物上に
存在する全ての認識部位に関する幅広い抗体を産生じ得
ることからその免疫特異性が分らないという欠点を有す
る。
対するモノクローナル抗体はすでに文献に記述されてお
り、その中ではｔ−ＰＡ分子全体が該文献で知られるモ
ノクローナル抗体の調製のための免疫原として使用され
ている。それゆえこれらの抗体は、異物またはその一部
が問題とする宿主生物の免疫原である場合、記述されて
いる免疫化により該宿主の免疫系が理論的に該異物上に
存在する全ての認識部位に関する幅広い抗体を産生じ得
ることからその免疫特異性が分らないという欠点を有す
る。
ｔ−ＰＡは種々の種内に存在する実質的に相同的なアミ
ノ酸配列を有するいわゆる保存的分子である。
ノ酸配列を有するいわゆる保存的分子である。
それゆえ免疫化およびそれに続く融合後に期待でき、か
つそのエピドープ特異性が互いに異なるモノクローナル
抗体が限定される。このことはｔ−ＰＡ分子全体が問題
の生物自体のｔ−ＰＡと事実上同一か、または非常に関
係が近いものであるため、抗体の産生者として働く該生
物が大部分のｈｕ ｒｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡを異物と
して認識し得ないことを意味する。結果的にこの生物は
エピドープ特異性が異なる非常にわずかな抗体しか生成
し得ない。
つそのエピドープ特異性が互いに異なるモノクローナル
抗体が限定される。このことはｔ−ＰＡ分子全体が問題
の生物自体のｔ−ＰＡと事実上同一か、または非常に関
係が近いものであるため、抗体の産生者として働く該生
物が大部分のｈｕ ｒｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡを異物と
して認識し得ないことを意味する。結果的にこの生物は
エピドープ特異性が異なる非常にわずかな抗体しか生成
し得ない。
分子全体による免疫化の際、免疫原的に優勢な部位がそ
の免疫応答に影響し、かつ結果的に融合を行う時これら
の免疫原的に優勢な部位に対するモノクローナル抗体の
みが得られることから、これらの異なる抗体の数はさら
に定性的に制限される。したがってｔ−ＰＡ分子の免疫
原的に劣るエピドープはどの融合にも含まれなくなる。
の免疫応答に影響し、かつ結果的に融合を行う時これら
の免疫原的に優勢な部位に対するモノクローナル抗体の
みが得られることから、これらの異なる抗体の数はさら
に定性的に制限される。したがってｔ−ＰＡ分子の免疫
原的に劣るエピドープはどの融合にも含まれなくなる。
このことはすでに知られているｈｕ ｒｔ−ＰＡに対す
るモノクローナル抗体が存在する全てのエピドープを認
識するのではなくその一部を認識し、方、エピドープが
どの抗体によって認識されるかも全く分らないことを意
味している。さらにエピドープが配列エピドープかまた
は構造エピドープかに関する区別もある。それが配列エ
ピドープまたは連続的エピドープである場合、そのモノ
クローナル抗体は多かれ少なかれ所定の線形のアミノ酸
配列を認識する。構造エピドープまたは不連続エピドー
プの場合、このモノクローナル抗体は１個以上の部分的
ペプチドの空間的配置を認識する。
るモノクローナル抗体が存在する全てのエピドープを認
識するのではなくその一部を認識し、方、エピドープが
どの抗体によって認識されるかも全く分らないことを意
味している。さらにエピドープが配列エピドープかまた
は構造エピドープかに関する区別もある。それが配列エ
ピドープまたは連続的エピドープである場合、そのモノ
クローナル抗体は多かれ少なかれ所定の線形のアミノ酸
配列を認識する。構造エピドープまたは不連続エピドー
プの場合、このモノクローナル抗体は１個以上の部分的
ペプチドの空間的配置を認識する。
それゆえエピドープのアミノ酸配列はかならずしもたん
白質の線形アミノ酸配列（−次または二次構造）を構成
する必要はなく、その代りにエピドープはアミノ酸配列
の秩序ある空間的構造によっても形成し得る。
白質の線形アミノ酸配列（−次または二次構造）を構成
する必要はなく、その代りにエピドープはアミノ酸配列
の秩序ある空間的構造によっても形成し得る。
文献によって知られているｈｕ ｒｔ−ＰＡのモノク
ローナル抗体のエピドープ特異性は合成的または酵素的
に生成したペプチドフラグメントを用いることにより、
またはエピドープスキャニングにより、かなりの犠牲の
もとに測定される（Ｇｅｙｓｅｎ。
ローナル抗体のエピドープ特異性は合成的または酵素的
に生成したペプチドフラグメントを用いることにより、
またはエピドープスキャニングにより、かなりの犠牲の
もとに測定される（Ｇｅｙｓｅｎ。
Ｈ，Ｍ、 、 Ｍｅｌｏｅｎ、 Ｒ，Ｈ，およびＢａｒ
ｔｅｌｉｎｇ、 Ｓ、 Ｊ。
ｔｅｌｉｎｇ、 Ｓ、 Ｊ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ８２、１７８（１９８５） ；“
ペプチド−分析、合成および生物学”Ｕｄｅｎｆｒｉｅ
ｎｄおよびＭｅｉｅｎｈｏｔｅｒ 編、９巻、アカデミ
ツクブレス社版（１９８７） 、； Ｇｅｙｓｅｎ、
Ｈ，Ｍ、 。
ＵＳＡ ８２、１７８（１９８５） ；“
ペプチド−分析、合成および生物学”Ｕｄｅｎｆｒｉｅ
ｎｄおよびＭｅｉｅｎｈｏｔｅｒ 編、９巻、アカデミ
ツクブレス社版（１９８７） 、； Ｇｅｙｓｅｎ、
Ｈ，Ｍ、 。
Ｒｏｄｄａ、 Ｓ、 Ｊ、、 Ｍａｓｏｎ、 Ｔ、 Ｊ
、、 Ｔｒｉｂｂｉｃｋ、 Ｇ、および５ｃｈｏｏｆｓ
、 Ｐ、 Ｇ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏ １ｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ１０２ 、２５９（１９８７） ；
Ｇｅｙｓｅｎ、 Ｈ，Ｍ、、 Ｒｏｄｄａ、 Ｓ。
、、 Ｔｒｉｂｂｉｃｋ、 Ｇ、および５ｃｈｏｏｆｓ
、 Ｐ、 Ｇ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏ １ｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ１０２ 、２５９（１９８７） ；
Ｇｅｙｓｅｎ、 Ｈ，Ｍ、、 Ｒｏｄｄａ、 Ｓ。
Ｊ、およびＭａｓｏｎ、 Ｔ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、 ２３．７０９（１９８６）参照）。
ｍｕｎｏｌ、 ２３．７０９（１９８６）参照）。
それゆえ本発明の目的は限定された配列エピドープ特異
性を有する組織プラスミノーゲン活性化因子、特に組換
えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｈｕ ｒｔ−
ＰＡ ）に対する新規なモノクローナル抗体を提供する
ことであり、この抗体は各々理論的に可能なエピドープ
、すなわち免疫原的に弱いエピドープを含むエピドープ
の中の特定の１つを認識する。これらの抗体を用いるこ
とにより、１、 ｈｕ ｒｔ−ＰＡの一次、二次およ
び三次構造を予測すること、 ２、例えば血清中および細胞培養上清中でｔ−ＰＡを他
のプラスミノーゲン活性化因子から区別すること、 ３、例えば−本積形と二本鎖形、ｒ型と■型など種々の
ｔ−ＰＡ形を互いに区別すること、および４、 フィブ
ロネクチンフィンガードメイン、成長因子ドメイン、第
一および第二クリンゲルドメインのようなｔ−ＰＡの種
々の領域の構造と機能の関係を確立および研究すること
、 およびこれらの知見によりたとえばインヒビター結合部
位のブロッキング、炭水化物フラクションのマスキング
またはｒｔ−ＰＡ排除のためのレセプター結合部位のマ
スキングによりｔ −Ｐ Ａの生理学的性質の修正、特
にこれらの性質の強化または改良を可能にすることから
これらの抗体は非常に重要である。
性を有する組織プラスミノーゲン活性化因子、特に組換
えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｈｕ ｒｔ−
ＰＡ ）に対する新規なモノクローナル抗体を提供する
ことであり、この抗体は各々理論的に可能なエピドープ
、すなわち免疫原的に弱いエピドープを含むエピドープ
の中の特定の１つを認識する。これらの抗体を用いるこ
とにより、１、 ｈｕ ｒｔ−ＰＡの一次、二次およ
び三次構造を予測すること、 ２、例えば血清中および細胞培養上清中でｔ−ＰＡを他
のプラスミノーゲン活性化因子から区別すること、 ３、例えば−本積形と二本鎖形、ｒ型と■型など種々の
ｔ−ＰＡ形を互いに区別すること、および４、 フィブ
ロネクチンフィンガードメイン、成長因子ドメイン、第
一および第二クリンゲルドメインのようなｔ−ＰＡの種
々の領域の構造と機能の関係を確立および研究すること
、 およびこれらの知見によりたとえばインヒビター結合部
位のブロッキング、炭水化物フラクションのマスキング
またはｒｔ−ＰＡ排除のためのレセプター結合部位のマ
スキングによりｔ −Ｐ Ａの生理学的性質の修正、特
にこれらの性質の強化または改良を可能にすることから
これらの抗体は非常に重要である。
本発明に従かいこの目的は以下のようにして達成された
。ｔ−ＰＡの一次構造を用い（Ｐｅｎｎｉｃａ、 Ｄ。
。ｔ−ＰＡの一次構造を用い（Ｐｅｎｎｉｃａ、 Ｄ。
等、Ｎａｔｕｒｅ ３０１．２１４−２２１）、コン
ピュータープログラムの助けを借りてｈｕ ｒｔ−ＰＡ
のペプチド配列は３６個のエピドープを有していると推
定した。
ピュータープログラムの助けを借りてｈｕ ｒｔ−ＰＡ
のペプチド配列は３６個のエピドープを有していると推
定した。
コンピュータ分析はハイドロフイリア（Ｈｏｐｐ、 Ｔ
。
。
Ｐ、およびＷｏｏｄｓ、 Ｋ、 Ｒ，）、Ｉｏｌｅｃ、
１ｍｍｕｎ、 ２０．４３３−４８９ （１９８３）
）、バイトロバシー（Ｋｙｔｅ、 Ｊ、およ乙）Ｄｏ
ｏ−１ｉｔｔｌｅ、 Ｆ、 Ｒ，Ｊ、 ！Ｊｏｔ、 Ｂ
ｉｏｌ、 １５７．１（１；−１３２（１９８２）
’）、アクロフィリア（Ｈｏｐｐ、 Ｔ、 Ｐ。
１ｍｍｕｎ、 ２０．４３３−４８９ （１９８３）
）、バイトロバシー（Ｋｙｔｅ、 Ｊ、およ乙）Ｄｏ
ｏ−１ｉｔｔｌｅ、 Ｆ、 Ｒ，Ｊ、 ！Ｊｏｔ、 Ｂ
ｉｏｌ、 １５７．１（１；−１３２（１９８２）
’）、アクロフィリア（Ｈｏｐｐ、 Ｔ、 Ｐ。
＾ｎｎａｌｉ ５ｃｌａｖｏ、 ２．４７−６０（１
９８４））、抗原性および柔軟性（Ｋａｒｐｌｕｓ、
Ｐ、 Ａ、および５ｃｈｕｌｚ、 Ｇ、Ｅ。
９８４））、抗原性および柔軟性（Ｋａｒｐｌｕｓ、
Ｐ、 Ａ、および５ｃｈｕｌｚ、 Ｇ、Ｅ。
Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓ ｃｈａｆｔｅｎ ７２．
２１２−２１３ （１９８５） ）によって構成される
パラメーターの予測と基本的アミノ酸配列の構造の特徴
（アルファーへリックス、ベータ・ターン、ランダムコ
イル） （Ｇｒａｎｉｅｒ、 Ｊ。
２１２−２１３ （１９８５） ）によって構成される
パラメーターの予測と基本的アミノ酸配列の構造の特徴
（アルファーへリックス、ベータ・ターン、ランダムコ
イル） （Ｇｒａｎｉｅｒ、 Ｊ。
等、ＪｏＭｏｌ、 Ｂｉｏｌ、 １２０．９７−１２０
（１９７８）に関する予測を連結した。推定されるエ
ピドープの核領域はＰｅｎｎ１ｃａ、 ［１，等（Ｎａ
ｔｕｒｅ ３０１ 、２１４−２２１）によって報告
されたｔ−ＰＡのアミノ酸配列の以下の部分配列； １−２ （１）、 ７−９ （２）、 ２０−２２ （
３）、 ２４−３０ （４）、 ）７−４０（６）、
５８−６１ （７）、 ８４−８５ （８）、 ８９−
１００ （９）、 １０３ （１０（１１）、 １２５
−１：１０ （１２）、 １４２−１５１ （１３）、
１６０−１６４ （１４）（１５、１８３−ＩＢＢ
（１６）、 １９４−１９６ （１７）、 ２１７−２
１９ （１Ｂ）（１９）、 ２４１−２４２ （２０）
、 ２４５−２５０ （２１）、 ２６８−２７１（２
２）（２３、３２６−３２９（２４）、 ３４４−：
１５０ （２５）、 コロ２−３６９ （２６）
（２７）、 ４１１−４１７ （２Ｂ）、 ４２６−４
２７ （２９）、 ４３６−４４２ （３０）（３１）
、 ４６０−４６６ （３２）、 ４７５−４７９ （
３３）、 ５０２−５０６ （：１４）および５２２−
５２７ （３６）。
（１９７８）に関する予測を連結した。推定されるエ
ピドープの核領域はＰｅｎｎ１ｃａ、 ［１，等（Ｎａ
ｔｕｒｅ ３０１ 、２１４−２２１）によって報告
されたｔ−ＰＡのアミノ酸配列の以下の部分配列； １−２ （１）、 ７−９ （２）、 ２０−２２ （
３）、 ２４−３０ （４）、 ）７−４０（６）、
５８−６１ （７）、 ８４−８５ （８）、 ８９−
１００ （９）、 １０３ （１０（１１）、 １２５
−１：１０ （１２）、 １４２−１５１ （１３）、
１６０−１６４ （１４）（１５、１８３−ＩＢＢ
（１６）、 １９４−１９６ （１７）、 ２１７−２
１９ （１Ｂ）（１９）、 ２４１−２４２ （２０）
、 ２４５−２５０ （２１）、 ２６８−２７１（２
２）（２３、３２６−３２９（２４）、 ３４４−：
１５０ （２５）、 コロ２−３６９ （２６）
（２７）、 ４１１−４１７ （２Ｂ）、 ４２６−４
２７ （２９）、 ４３６−４４２ （３０）（３１）
、 ４６０−４６６ （３２）、 ４７５−４７９ （
３３）、 ５０２−５０６ （：１４）および５２２−
５２７ （３６）。
５）、 ４９−５３
．１０７−１１０
１７１−４７７
２２６−２３９
２９７−３０２
３７８−３８７
４４５−４４７
５１５ （３５）
により形成される。
それゆえ各エピドープ領域は免疫原性を有し、かつモノ
クローナル抗体を生成するための抗原として適している
。核領域は完全に抗原決定基を構成するものでなければ
ならない。この目的のため該核領域はｈｕ ｒｔ−Ｐ
Ａの天然のアミノ酸配列に類似する１０から１５個のア
ミノ酸を含むペプチドで成り立っている。
クローナル抗体を生成するための抗原として適している
。核領域は完全に抗原決定基を構成するものでなければ
ならない。この目的のため該核領域はｈｕ ｒｔ−Ｐ
Ａの天然のアミノ酸配列に類似する１０から１５個のア
ミノ酸を含むペプチドで成り立っている。
本発明に従かい新規モノクローナル抗体はに６ｈｈｅｒ
およびＭｉｌｓｔｅｉｎ （Ｎａｔｕｒｅ ２５６
３４９５−４９７ （１９７５） ）によって始めて報
告された従来法によって得られる。
およびＭｉｌｓｔｅｉｎ （Ｎａｔｕｒｅ ２５６
３４９５−４９７ （１９７５） ）によって始めて報
告された従来法によって得られる。
基本的に本方法は適当な免疫原をマウスまたはその他の
適当な宿主に注入することを含む。免疫化後その肺細胞
を取り出し、個々の細胞に分離してからミエローマ細胞
と融合した。ハイブリッド細胞が得られ、これをハイブ
リドーマと呼ぶ。これらのハイブリドーマ細胞はインビ
トロで増殖する。選択条件の選択およびクローニング（
制限希釈）により個々のクローンを単離し、その各々の
クローンは該抗原に対する単一のエピドープ特異的抗体
を産生ずる。この方法で得られる個々の抗体は、免疫原
基質の抗原決定基に対する反応として生成される、相当
する免疫化生物由来の単一融合Ｂ細胞の生産物である（
Ｋｅａｒｎｅｙ、 Ｊ、 等、Ｊ。
適当な宿主に注入することを含む。免疫化後その肺細胞
を取り出し、個々の細胞に分離してからミエローマ細胞
と融合した。ハイブリッド細胞が得られ、これをハイブ
リドーマと呼ぶ。これらのハイブリドーマ細胞はインビ
トロで増殖する。選択条件の選択およびクローニング（
制限希釈）により個々のクローンを単離し、その各々の
クローンは該抗原に対する単一のエピドープ特異的抗体
を産生ずる。この方法で得られる個々の抗体は、免疫原
基質の抗原決定基に対する反応として生成される、相当
する免疫化生物由来の単一融合Ｂ細胞の生産物である（
Ｋｅａｒｎｅｙ、 Ｊ、 等、Ｊ。
参照）。
それゆえ本発明に従かい本明細書に述べられている方法
によりエピドープとして分類され、かつ５モジアニン、
カタラーゼまたは脂質たん白質、好ましくはカタラーゼ
またはその誘導体のようなアジュバントキャリヤーに結
合された上述のペプチドフラグメント（１）ないしく３
６）の少なくとも１つをエピドープとして使用し、一方
所定の配列領域を都合のよいように伸長し、少なくとも
１０ないし１５個のアミノ酸を含むペプチド合成を可能
にするセグメントを得る。
によりエピドープとして分類され、かつ５モジアニン、
カタラーゼまたは脂質たん白質、好ましくはカタラーゼ
またはその誘導体のようなアジュバントキャリヤーに結
合された上述のペプチドフラグメント（１）ないしく３
６）の少なくとも１つをエピドープとして使用し、一方
所定の配列領域を都合のよいように伸長し、少なくとも
１０ないし１５個のアミノ酸を含むペプチド合成を可能
にするセグメントを得る。
また免疫化は組換えにより生成するｈｕ ｒｔ−ＰＡの
酵素的切断フラグメントを用いて行なう。これらのフラ
グメントは天然のアミノ酸配列に類似するように対応的
に決定された化学合成ペプチドによりまたはｈｕ ｒｔ
−ＰＡの変位体によりその長さが様々である。１つ以上
の別種のエピドープが同じキャリヤーに結合され得る。
酵素的切断フラグメントを用いて行なう。これらのフラ
グメントは天然のアミノ酸配列に類似するように対応的
に決定された化学合成ペプチドによりまたはｈｕ ｒｔ
−ＰＡの変位体によりその長さが様々である。１つ以上
の別種のエピドープが同じキャリヤーに結合され得る。
それゆえ、使用するｈｕ ｒｔ−ＰＡ由来の免疫原は
互いにもしくは配列的に異なることが望ましく、たとえ
ば−人免疫化はカタラーゼに結合するかまたは未結合の
（ＸＹＺ）。
互いにもしくは配列的に異なることが望ましく、たとえ
ば−人免疫化はカタラーゼに結合するかまたは未結合の
（ＸＹＺ）。
（ｒｔ−ＰＡ）を用いて行ない二次免疫化はＰａｍ ３
Ｃｙｓに結合するかまたは未結合などの（ＸＹＺ）、
ｒｔ−ＰＡを用いて行なう。（ＸＹＺ） 、ｒｔ−Ｐ
Ａはｈｕ ｒｔ−ＰＡ分子またはその変異体の所望され
るアミノ酸配列を示し、かつトリペプチドまたはその多
量体に制限されるものではない。しかし、免疫化はイン
ビトロでも行なわれる。
Ｃｙｓに結合するかまたは未結合などの（ＸＹＺ）、
ｒｔ−ＰＡを用いて行なう。（ＸＹＺ） 、ｒｔ−Ｐ
Ａはｈｕ ｒｔ−ＰＡ分子またはその変異体の所望され
るアミノ酸配列を示し、かつトリペプチドまたはその多
量体に制限されるものではない。しかし、免疫化はイン
ビトロでも行なわれる。
上述の推定に基づき３４４−３５０ （２５）フラグメ
ントを含むｈｕ ｒｔ−ＰＡ ３４３−３５３（２５
）フラグメントを例で示した従来法で合成した。例とし
てのフラグメントを用いて本発明の方法を以下のように
行うのが望ましい。
ントを含むｈｕ ｒｔ−ＰＡ ３４３−３５３（２５
）フラグメントを例で示した従来法で合成した。例とし
てのフラグメントを用いて本発明の方法を以下のように
行うのが望ましい。
１．免疫化についてはマウスＢａｌｂ／ｃを２週間サイ
クルで以下のように免疫化した。
クルで以下のように免疫化した。
好ましいカタラーゼに結合するｈｕ ｒｔ−ＰＡ ３４
３３５３ （２５）フラグメントは２５０μＩ ＰＢＳ
および２５０、ｚＪ完全フロインドアジュバントに溶か
して投与することが好ましく、一方必要ならばひきつづ
く免疫化、好ましくは二次ないし水成免疫化に対しては
完全フロインドアジュバントよりもむしろ不完全フロイ
ンドアジュバントを使用する。
３３５３ （２５）フラグメントは２５０μＩ ＰＢＳ
および２５０、ｚＪ完全フロインドアジュバントに溶か
して投与することが好ましく、一方必要ならばひきつづ
く免疫化、好ましくは二次ないし水成免疫化に対しては
完全フロインドアジュバントよりもむしろ不完全フロイ
ンドアジュバントを使用する。
２、 モノクローナル抗体の融合、選択、産生なども従
来法を用いて行う （Ｋ６ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｊｎＮａｔｕｒｅ ２５６−１４９５−４９７（１９
７５） ； Ｋｅａｒｎｅｙ、 Ｊ、等、Ｊ、 ［ｍ
ｍｕｎｏｌ、 １２３−１１５４８−１５５８（１９７
９）−； Ｇａ１ｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、
Ｍｅｔｈ Ｅｎｚ ｍ、 ７３．３−４６（１９８
１）およびＹｅｌｔｅｒ、 Ｓｏｍａｔｆｃ Ｃｅ１
ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ ３．２３１−２４２ （１９７
７）参照）。
来法を用いて行う （Ｋ６ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｊｎＮａｔｕｒｅ ２５６−１４９５−４９７（１９
７５） ； Ｋｅａｒｎｅｙ、 Ｊ、等、Ｊ、 ［ｍ
ｍｕｎｏｌ、 １２３−１１５４８−１５５８（１９７
９）−； Ｇａ１ｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、
Ｍｅｔｈ Ｅｎｚ ｍ、 ７３．３−４６（１９８
１）およびＹｅｌｔｅｒ、 Ｓｏｍａｔｆｃ Ｃｅ１
ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ ３．２３１−２４２ （１９７
７）参照）。
この免疫原およびｈｕ ｒｔ−ＰＡに対して正の反応を
示す全てのクローンを４週間の安定な抗体産生に関して
テストした。さらに、それらのウロキナーゼ、トリプシ
ン、キモトリプシン、エラスターゼ、ストレプトキナー
ゼ、プロウロキナーゼ、カタラーゼ、血清アルブミン、
上皮成長因子およびフィフロネクチンのような他のタン
パク質との交叉反応をテストした（第１表参照）。リス
トしたたん白質と交叉反応を示さないクローンのみを産
生に用いた。
示す全てのクローンを４週間の安定な抗体産生に関して
テストした。さらに、それらのウロキナーゼ、トリプシ
ン、キモトリプシン、エラスターゼ、ストレプトキナー
ゼ、プロウロキナーゼ、カタラーゼ、血清アルブミン、
上皮成長因子およびフィフロネクチンのような他のタン
パク質との交叉反応をテストした（第１表参照）。リス
トしたたん白質と交叉反応を示さないクローンのみを産
生に用いた。
モノクローナル抗体は、たとえば組織培養皿、組織培養
フラスコ、振盪容器または醗酵槽中など種々の容積で産
生じ得る。特定の必要条件に依存し、（ＲＰＭ Ｉ ＋
−≦−１０％ＦＣＳ）または適当な無血清培地などの種
々の産生培地が使用される。
フラスコ、振盪容器または醗酵槽中など種々の容積で産
生じ得る。特定の必要条件に依存し、（ＲＰＭ Ｉ ＋
−≦−１０％ＦＣＳ）または適当な無血清培地などの種
々の産生培地が使用される。
モノクローナル抗体（ＭＡＢ）のエピドープ特異性をペ
プチドスキャニングにより測定する（Ｇｅｙｓｅｎ、
Ｈ，？１．ｌ Ｍｅｌｅｏｎ、 Ｒ，’Ｈ，およびＢａ
ｒｔｅｌｉｎｇ。
プチドスキャニングにより測定する（Ｇｅｙｓｅｎ、
Ｈ，？１．ｌ Ｍｅｌｅｏｎ、 Ｒ，’Ｈ，およびＢａ
ｒｔｅｌｉｎｇ。
Ｓ、 Ｊ、 Ｐｒｏｃ、ＮａｔＩ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ ８１．３９９８（１９８４） １Ｇｅ
ｙｓｅｎ＋ Ｈ，ｌ’１．Ｉ Ｂａｒｔｅｌｉｎｇ、
Ｓ、 Ｊ、および Ｍｅｌｏｅｎ、 Ｒ，Ｉｔ、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ
、 ＵＳＡ且、１７８ （１９８５） ；ペプチド
−分析、合成および生物学、Ｕｄｅｎ ｆ ｒ １ｅｎ
ｄおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ ［，９巻、アカデミツ
クブレス社版（１９８７） ； Ｇｅｙｓｅｎ、 Ｈ，
Ｍ、。
ｉ、 ＵＳＡ ８１．３９９８（１９８４） １Ｇｅ
ｙｓｅｎ＋ Ｈ，ｌ’１．Ｉ Ｂａｒｔｅｌｉｎｇ、
Ｓ、 Ｊ、および Ｍｅｌｏｅｎ、 Ｒ，Ｉｔ、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ
、 ＵＳＡ且、１７８ （１９８５） ；ペプチド
−分析、合成および生物学、Ｕｄｅｎ ｆ ｒ １ｅｎ
ｄおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ ［，９巻、アカデミツ
クブレス社版（１９８７） ； Ｇｅｙｓｅｎ、 Ｈ，
Ｍ、。
Ｒａｄｄａ、 Ｓ、 Ｊ、ｌ Ｍａｓｏｎ、 Ｔ、 Ｊ
、、 Ｔｒｉｂｂｉｃｋ、 ｃ、ｌおよび５ｃｈｏｏｆ
ｓ、 Ｐ、 Ｇ、 Ｊ、ｆｍｕｎｏｌｏ １ｃａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ１０２ 、２５９（１９８７） ； Ｇｅ
ｙｓｅｎ、 Ｈ，Ｍ、、 Ｒｏｄｄａ、 Ｓ、 Ｊ。
、、 Ｔｒｉｂｂｉｃｋ、 ｃ、ｌおよび５ｃｈｏｏｆ
ｓ、 Ｐ、 Ｇ、 Ｊ、ｆｍｕｎｏｌｏ １ｃａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ１０２ 、２５９（１９８７） ； Ｇｅ
ｙｓｅｎ、 Ｈ，Ｍ、、 Ｒｏｄｄａ、 Ｓ、 Ｊ。
およびＭａｓｏｎ、 Ｔ、 Ｊ、 ｉｏｌ、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、 ２３．７０９（１９８６）参照）。抗体ペプ
チドスキャニング（ベブスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）
）はたとえば次のように行った。
ｎｏｌ、 ２３．７０９（１９８６）参照）。抗体ペプ
チドスキャニング（ベブスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）
）はたとえば次のように行った。
アミノ成長８のｔ−ＰＡの重複ペプチドを上述のように
合成した。この方法は５２７個のアミノ酸からなるｔ−
ＰＡのうちの５２０個の重複ペプチドの合成を必要とす
る。ペプチド１はアミノ酸１−８を含み、ペプチド２は
アミノ酸２−９を含み、以下同様である。合成後ペプチ
ドは固体キャリヤーに結合したままである。ハイブリド
ーマ細胞培養上清またはその精製モノクローナル抗体を
適当に希釈したＥＬＩＳＡプレート中のペプチドに対す
る反応性に関しテストした。
合成した。この方法は５２７個のアミノ酸からなるｔ−
ＰＡのうちの５２０個の重複ペプチドの合成を必要とす
る。ペプチド１はアミノ酸１−８を含み、ペプチド２は
アミノ酸２−９を含み、以下同様である。合成後ペプチ
ドは固体キャリヤーに結合したままである。ハイブリド
ーマ細胞培養上清またはその精製モノクローナル抗体を
適当に希釈したＥＬＩＳＡプレート中のペプチドに対す
る反応性に関しテストした。
さらに、該モノクローナル抗体のエピドープを合成また
は酵素的作成した他のペプチドを用いて分析した。さら
に天然形のｔ−ＰＡまたは還元カルボキシメチル化形ｔ
−ＰＡに対する反応性を分析することにより、モノクロ
ーナル抗体が配列エピドープ（連続的エピドープ）、構
造エピドープ（不連続エピドープ）または両タイプのエ
ピドープのうちのどのエピドープを認識し得るかを云う
ことが可能となる。もし線形の配列エピドープがその分
子上に空間的に露出する構造エピドープを同時に形成す
る場合、連続的エピドープが存在する。
は酵素的作成した他のペプチドを用いて分析した。さら
に天然形のｔ−ＰＡまたは還元カルボキシメチル化形ｔ
−ＰＡに対する反応性を分析することにより、モノクロ
ーナル抗体が配列エピドープ（連続的エピドープ）、構
造エピドープ（不連続エピドープ）または両タイプのエ
ピドープのうちのどのエピドープを認識し得るかを云う
ことが可能となる。もし線形の配列エピドープがその分
子上に空間的に露出する構造エピドープを同時に形成す
る場合、連続的エピドープが存在する。
それゆえこのモノクローナル抗体は天然形のｈｕｒｔ−
ＰＡおよびその還元カルボキシメチル化形に反応する。
ＰＡおよびその還元カルボキシメチル化形に反応する。
しかし、もしこのモノクローナル抗体がその分子の天然
の三次元構造のみと反応し、その線形エピドープ、すな
わち還元カルボキシメチル花形エピドープと反応しない
場合、不連続エピドープが存在する。もしこのモノクロ
ーナル抗体が還元カルボキシメチル化形とのみ反応し、
かつ天然形とは反応しない場合、再び不連続エピドープ
が存在するか、または連続的エピドープが表面に存在し
ないか、または立体的理由から抗体に接近し得ない。も
しこのモノクローナル抗体が天然形と反応し、かつ還元
カルボキシメチル化形ｈｕ ｒｔ−ＰＡのい（つかの異
なる配列領域と反応するなら、不連続エピドープが存在
し得る。線形配列領域は空間的折りたたみの結果非常に
近接したまま移動する。
の三次元構造のみと反応し、その線形エピドープ、すな
わち還元カルボキシメチル花形エピドープと反応しない
場合、不連続エピドープが存在する。もしこのモノクロ
ーナル抗体が還元カルボキシメチル化形とのみ反応し、
かつ天然形とは反応しない場合、再び不連続エピドープ
が存在するか、または連続的エピドープが表面に存在し
ないか、または立体的理由から抗体に接近し得ない。も
しこのモノクローナル抗体が天然形と反応し、かつ還元
カルボキシメチル化形ｈｕ ｒｔ−ＰＡのい（つかの異
なる配列領域と反応するなら、不連続エピドープが存在
し得る。線形配列領域は空間的折りたたみの結果非常に
近接したまま移動する。
モノクローナル抗体１７−１３４／１１および１７−１
２４／２０は天然形および還元カルボキシメチル化形の
ｈｕｒｔ−ＦＡを認識することから（第１表参照）、そ
のエピドープは天然形 ｒｔ−Ｐへの表面上に露出して
おり、かつ三次構造においてさえ基本的アミノ酸配列Ｅ
ＥＥＱＫを有する連続的エピドープを構成する（第２表
および第３表参照）。このペンタペプチドは抗体の結合
に必要な最小のアミノ酸配列である。Ｎ−末端部分の配
列ＶＰＧおよびＣ−末端部分の配列ＦＥＶは抗体のエピ
ドープへの結合を促進する（第２表および第３表参照）
。これらの知見を合せるとモノクローナル抗体１７−１
３４／１１または１７−１３４／２０ はそのアミノ酸
配列；を有するフラグメンｌ−（２５）を含む配列ＴＪ
ｂｌＶＰＧＥＥＥＱＫＦＥＶ中のエピドープと結合す
る。
２４／２０は天然形および還元カルボキシメチル化形の
ｈｕｒｔ−ＦＡを認識することから（第１表参照）、そ
のエピドープは天然形 ｒｔ−Ｐへの表面上に露出して
おり、かつ三次構造においてさえ基本的アミノ酸配列Ｅ
ＥＥＱＫを有する連続的エピドープを構成する（第２表
および第３表参照）。このペンタペプチドは抗体の結合
に必要な最小のアミノ酸配列である。Ｎ−末端部分の配
列ＶＰＧおよびＣ−末端部分の配列ＦＥＶは抗体のエピ
ドープへの結合を促進する（第２表および第３表参照）
。これらの知見を合せるとモノクローナル抗体１７−１
３４／１１または１７−１３４／２０ はそのアミノ酸
配列；を有するフラグメンｌ−（２５）を含む配列ＴＪ
ｂｌＶＰＧＥＥＥＱＫＦＥＶ中のエピドープと結合す
る。
表−１
種々のたん白質およびペプチドに対するモノクローナル
抗体１７−１３４／１１および１７−１３４／２０の反
応性ｔ−ＰＡ 還元カルボキシメチル化 ｒｔ−ＰＡ ｒｔ−ＰＡペプチド（３４３−３５３）カタラーゼ Ｐａｍ、Ｃｙｓ ｒｔ−ＰＡペプチド （３４３−３５３） Ｐａｍ３Ｃｙｓ ストレプトキナーゼ ウロキナーゼ プロつロキナーゼ ３ ａ 、 Ｖａ １−Ｐｒｏ−Ｇ １ｙ−Ｇ １ｕ−
Ｇ １ｕ−Ｇ １ｕ−Ｇ １ｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ
１ｕ−Ｖａ １ 、 ｓ。
抗体１７−１３４／１１および１７−１３４／２０の反
応性ｔ−ＰＡ 還元カルボキシメチル化 ｒｔ−ＰＡ ｒｔ−ＰＡペプチド（３４３−３５３）カタラーゼ Ｐａｍ、Ｃｙｓ ｒｔ−ＰＡペプチド （３４３−３５３） Ｐａｍ３Ｃｙｓ ストレプトキナーゼ ウロキナーゼ プロつロキナーゼ ３ ａ 、 Ｖａ １−Ｐｒｏ−Ｇ １ｙ−Ｇ １ｕ−
Ｇ １ｕ−Ｇ １ｕ−Ｇ １ｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ
１ｕ−Ｖａ １ 、 ｓ。
表−２
（続き）
表−３
モノクローナル抗体
１７−１３４／１１および
１７−１３４／２０の
エピドープ配
第２表、第３表、第１ａ図および第１ｂ図は本発明に従
がいｈｕ ｒｔ−ＰＡの予測されたエピドープ配列を用
いる限定された免疫化によって得られるＭＡＢ １７−
１３４／２０または１７−１３４／１１のペプチドスキ
ャニング分析を示している。
がいｈｕ ｒｔ−ＰＡの予測されたエピドープ配列を用
いる限定された免疫化によって得られるＭＡＢ １７−
１３４／２０または１７−１３４／１１のペプチドスキ
ャニング分析を示している。
本方法で産生したクローン１７−１３４／２０および１
７−１３４／１１の抗体は免疫グロブリンサブクラスＩ
ｇＭに属する。主にＩｇＧ抗体サブクラス産生クローン
が期待される長期免疫化とは異なり、この融合体はＩｇ
Ｍ抗体分子を生ずる。この事実はｈｕ ｒｔ−ＰＡのよ
うな保存的分子による免疫化の場合、免疫化計画にかか
わりなく生成するのは主にＩｇＭ−抗体であるという観
察と一致している。しかし、通常このモノクローナルＩ
ｇＭ抗体と同一のエピドープ特異性を有するＩｇＧ−抗
体またはその他のｒｇ−サブタイプの抗体をスクリーニ
ングすることは可能である。
７−１３４／１１の抗体は免疫グロブリンサブクラスＩ
ｇＭに属する。主にＩｇＧ抗体サブクラス産生クローン
が期待される長期免疫化とは異なり、この融合体はＩｇ
Ｍ抗体分子を生ずる。この事実はｈｕ ｒｔ−ＰＡのよ
うな保存的分子による免疫化の場合、免疫化計画にかか
わりなく生成するのは主にＩｇＭ−抗体であるという観
察と一致している。しかし、通常このモノクローナルＩ
ｇＭ抗体と同一のエピドープ特異性を有するＩｇＧ−抗
体またはその他のｒｇ−サブタイプの抗体をスクリーニ
ングすることは可能である。
したがって得られたエピドープが明確なＭＡＢは診断薬
剤として、定性および定量用に（たとえばＥＬＩＳＡな
ど） 、ｈｕ ｒｔ−ＰＡの精製用に（たとえばアフイ
ニテイクロマトグラフィー）、薬剤標的用に（ｒｔ−Ｐ
Ａへの結合）、治療薬として（ｔ−ＰＡの中和）または
医薬として（たとえばレセプター結合部位のマスキング
）使用できる。該抗体は天然形としても、またそのフラ
グメントとしても使用し得る。さらに該抗体またはその
フラグメントは標識化または修正し得る。
剤として、定性および定量用に（たとえばＥＬＩＳＡな
ど） 、ｈｕ ｒｔ−ＰＡの精製用に（たとえばアフイ
ニテイクロマトグラフィー）、薬剤標的用に（ｒｔ−Ｐ
Ａへの結合）、治療薬として（ｔ−ＰＡの中和）または
医薬として（たとえばレセプター結合部位のマスキング
）使用できる。該抗体は天然形としても、またそのフラ
グメントとしても使用し得る。さらに該抗体またはその
フラグメントは標識化または修正し得る。
もし、この新規なモノクローナル抗体を、たとえば血清
または体液中のｈｕ ｒｔ−ＰＡの検出に使用する場合
、イムノアッセイ技術が特に通しているようである。こ
れらの技術は、測定すべき抗原基質と、抗体との複合体
の形成に基づいており、その複合体は標識されている。
または体液中のｈｕ ｒｔ−ＰＡの検出に使用する場合
、イムノアッセイ技術が特に通しているようである。こ
れらの技術は、測定すべき抗原基質と、抗体との複合体
の形成に基づいており、その複合体は標識されている。
もしこの操作をたとえばＩｔｓヨウ素のような放射性同
位元素で標識した抗原を用いるならラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）などの競合置換アッセイを採用するのが望
ましい。
位元素で標識した抗原を用いるならラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）などの競合置換アッセイを採用するのが望
ましい。
もし抗体を、たとえば放射能、蛍光、マーカー酵素ある
いは金属キレートなどにより標識する場合は、イムノラ
ジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）または酵素結合免
疫吸着アッセイ （ＥＬＩＳＡ）を採用するのが望まし
い。
いは金属キレートなどにより標識する場合は、イムノラ
ジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）または酵素結合免
疫吸着アッセイ （ＥＬＩＳＡ）を採用するのが望まし
い。
またより大きい検出感度をもたらす抗体の低分子パブテ
ンへの結合も別の可能性としてあげられる。たとえばビ
オチン（アビジンと反応する）またはジニトロフェニル
、ビリドキサノペフルオレサミン（特異的抗ハブテン抗
体と反応する）が従来使用されている。
ンへの結合も別の可能性としてあげられる。たとえばビ
オチン（アビジンと反応する）またはジニトロフェニル
、ビリドキサノペフルオレサミン（特異的抗ハブテン抗
体と反応する）が従来使用されている。
モノクローナル抗体の絶妙な特異性は高感度のアッセイ
、すなわち抗体の標識の選択を可能にする。放射性同位
元素の使用はオペレーターや環境を守る点でかなりの経
費がかかるので標識シグナルとしては特に酵素が適して
いる。さらに酵素の触媒活性はシグナルの増幅をもたら
す。ホースラディッシバーオキシダーゼは多くの有効な
基質があることから特に適している。さらに小さな酵素
は単一でしかも特異的方法（過ヨウ素酸法）で抗体に結
合し得る。
、すなわち抗体の標識の選択を可能にする。放射性同位
元素の使用はオペレーターや環境を守る点でかなりの経
費がかかるので標識シグナルとしては特に酵素が適して
いる。さらに酵素の触媒活性はシグナルの増幅をもたら
す。ホースラディッシバーオキシダーゼは多くの有効な
基質があることから特に適している。さらに小さな酵素
は単一でしかも特異的方法（過ヨウ素酸法）で抗体に結
合し得る。
すでに述べたように、ｈｕ ｒｔ−ＰＡのプロテアーゼ
部分に対する新規なモノクローナル抗体はｈｕｒｔ−Ｐ
Ａの医薬活性を中和し得るし、またｈｕ ｒｔ−ＰＡの
炭水化物部分に対する新規なモノクローナル抗体は肝臓
におけるｈｕ ｒｔ−ＰＡの分解を遅らせ、ｈｕｒｔ−
ＰＡの生理学的寿命を伸ばし、またインヒビターの結合
と競合する新規なモノクローナル抗体はｈｕ ｒｔ−Ｐ
への寿命を延ばす。
部分に対する新規なモノクローナル抗体はｈｕｒｔ−Ｐ
Ａの医薬活性を中和し得るし、またｈｕ ｒｔ−ＰＡの
炭水化物部分に対する新規なモノクローナル抗体は肝臓
におけるｈｕ ｒｔ−ＰＡの分解を遅らせ、ｈｕｒｔ−
ＰＡの生理学的寿命を伸ばし、またインヒビターの結合
と競合する新規なモノクローナル抗体はｈｕ ｒｔ−Ｐ
への寿命を延ばす。
さらに血清および他の液体中のｈｕ ｒｔ−ＰＡまたは
その処理物（タイプＩ、タイプ■、−末鎖、二本鎖など
）は他のプロテアーゼ活性化因子と区別し得、したがっ
て定性および定量的測定が可能である。
その処理物（タイプＩ、タイプ■、−末鎖、二本鎖など
）は他のプロテアーゼ活性化因子と区別し得、したがっ
て定性および定量的測定が可能である。
モノクローナル抗体とｈｕ ｒｔ−ＰＡの天然型および
その還元カルボキシメチル化型との反応性を比較するこ
とにより、その二次および三次構造に関する説明を可能
にする。
その還元カルボキシメチル化型との反応性を比較するこ
とにより、その二次および三次構造に関する説明を可能
にする。
さらに合成ペプチドのアミノ酸置換により非免疫原性ま
たは免疫原性が弱い配列の免疫原性を変化させ、それに
より産生し得るｈｕ ｒｔ−ＰＡに対するモノクローナ
ル抗体の幅を広げることができる。
たは免疫原性が弱い配列の免疫原性を変化させ、それに
より産生し得るｈｕ ｒｔ−ＰＡに対するモノクローナ
ル抗体の幅を広げることができる。
結果として、コンピュータ解析によって予測されるｈｕ
ｒｔ−ＰＡの露出する線形配列の三次元構造に関する
結論を誘導し得る。結果的にｈｕ ｒｔ−ＰＡを天然の
ｈｕ ｒｔ−ＰＡの変異体にもかかわらずたとえば、長
寿命や若いフィブリン構造に対する非結合性など秀れた
活性を有し、また免疫原性を持たないか、または小さい
ｈｕ ｒｔ−ＰＡを第二世代に達成し得るようにひきつ
づき構造を変化し得る。逆に、コンピュータ予測および
特異的合成ペプチドにより、既存もしくは推定上の（第
２世代） ｈｕ ｒｔ−ＰＡ変異体の免疫原性をテスト
することができる。
ｒｔ−ＰＡの露出する線形配列の三次元構造に関する
結論を誘導し得る。結果的にｈｕ ｒｔ−ＰＡを天然の
ｈｕ ｒｔ−ＰＡの変異体にもかかわらずたとえば、長
寿命や若いフィブリン構造に対する非結合性など秀れた
活性を有し、また免疫原性を持たないか、または小さい
ｈｕ ｒｔ−ＰＡを第二世代に達成し得るようにひきつ
づき構造を変化し得る。逆に、コンピュータ予測および
特異的合成ペプチドにより、既存もしくは推定上の（第
２世代） ｈｕ ｒｔ−ＰＡ変異体の免疫原性をテスト
することができる。
以下の例は本発明の説明を意図するものであり、次の略
号を使用する。
号を使用する。
ＡＡ ニアミノ酸
ＡＢＴＳ：２，２’−アジノービス（３−エチルベンズ
チアゾリン−６−スルホン酸 Ａｃ、Ｏ：酢酸無水物 アミノｇ 、 Ａ 、アラニン（Ａｌａ）、Ｃニジステ
ィン（Ｃｙｓ） 、Ｄ ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、
Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ） 、Ｆ ：フェニルアラニ
ン（Ｐｈｅ） 、Ｇ ニゲリシン（Ｇｌｙ）、Ｈ：ヒス
チジン（Ｈｉｓ） 、Ｉ ：イソロイシン（Ｉｌｅ）
、Ｋ ：リジン（Ｌｙｓ） 、Ｌ ：ロイシン（Ｌｅｕ
） 、Ｍ ：メチオニ ７ Ｑ、１ｅｔ）、Ｎ：アスパ
ラギン（Ａｓｎ） 、Ｐ ニブロリン（ｐｒｏ）
、Ｑ ：グルタミン（Ｇｌｎ）Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ
） 、Ｓ ：セリン（Ｓｅｔ） 、Ｔ ：スレオニン
クＴｈｒ）、Ｖ：バリン（Ｖａｔ） 、”ｖＶ ：
）リブトファン（Ｔｒｐ） 、Ｙ ：チロシン（Ｔｙｒ
）ＡＳＡ ＋アミノ酸分析 ＢＯＣ：ｔｅ＋ｔ−ブチルオキシカルボニル基ＢＯＰ
：ベンゾトリアゾールー１−イルーオキシ−トリス−
（ジメチル−アミノ）− ホスホニウムへキサフルオロホスフェ ート ：ウシ血清アルブミン ：ダルトン ：ジシクロへキシル力ルポジイミド ：ジクロロメタン ：ジイソプロピルカルボジイミド ：Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンＳＡ ＣＣ ＣＭ ＩＣ ＩＰＥＡ ニジメチルホルムアミド ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル
−カルボジイミド ：酵素結合免疫吸着検定 ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル基 Ｆｍｏｃ−ＡＳ ：フルオレニルメトキシカルボニル
ーアミノ酸 ＨＯＢｔ ：ヒドロキシベンゾトリアゾールｈｕ：ヒ
ト ＭＡＢ ：モノクローナル抗体 ＭｅＯＨ：メタノール ＭｒＴ ：マイクロプレート ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン Ｑ ｔ Ｆ３ ｕ ： ｔｅｒｔ−ブチルエステルＯＶ
Ａ ：オバルブミン ＰＢＳ ニリン酸緩衝液 Ｐａｍ、Ｃｙｓ ： Ｎ−バルミトイル−Ｓ−Ｃ（２
Ｒ３）−２，３−ビス（バルミトイル）−プ ロピルツーシスティン ＭＦ ＬＩＳＡ ＤＣ ｍｏｃ ＰａｍｓＣ−ＯＨ： ）リパルミトイルー８−グリセリ
ル−し一システィン ｒｔ−ＰＡ ：組換えＭ織プラスミノーゲン活性化
因子 ＲＴ ：室温 ｔ Ｂ Ｕ ： ｔｅｒｔ−ブチル基ＴＦＡ ：）
リフルオロ酢酸 Ｖ ：容積 例１ （カタラーゼ結合体の合成） ペプチドｔ−ＰＡ（３４３−３５４） ＮＨｚ−ＶＶＰ
ＧＥＥＥＱＫＦＥＶ−ＯＨの固相ペプチド合成は全自動
ペプチド合成機４３０Ａ（Ａｉｒ 、ウェイチルスタン
ド（Ｗｅｉ ｔｅｒｓ ｔａｄ ｔ）、ＦＲＧ）を用い
て行った。Ｆｍｏｃアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｖ−ＯＨｌＦｍ
ｏｃ−Ｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇ−ＯＨＳＦｍｏｃ−Ｅ（
ＯｔＢｕ）−０Ｈ。
チアゾリン−６−スルホン酸 Ａｃ、Ｏ：酢酸無水物 アミノｇ 、 Ａ 、アラニン（Ａｌａ）、Ｃニジステ
ィン（Ｃｙｓ） 、Ｄ ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、
Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ） 、Ｆ ：フェニルアラニ
ン（Ｐｈｅ） 、Ｇ ニゲリシン（Ｇｌｙ）、Ｈ：ヒス
チジン（Ｈｉｓ） 、Ｉ ：イソロイシン（Ｉｌｅ）
、Ｋ ：リジン（Ｌｙｓ） 、Ｌ ：ロイシン（Ｌｅｕ
） 、Ｍ ：メチオニ ７ Ｑ、１ｅｔ）、Ｎ：アスパ
ラギン（Ａｓｎ） 、Ｐ ニブロリン（ｐｒｏ）
、Ｑ ：グルタミン（Ｇｌｎ）Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ
） 、Ｓ ：セリン（Ｓｅｔ） 、Ｔ ：スレオニン
クＴｈｒ）、Ｖ：バリン（Ｖａｔ） 、”ｖＶ ：
）リブトファン（Ｔｒｐ） 、Ｙ ：チロシン（Ｔｙｒ
）ＡＳＡ ＋アミノ酸分析 ＢＯＣ：ｔｅ＋ｔ−ブチルオキシカルボニル基ＢＯＰ
：ベンゾトリアゾールー１−イルーオキシ−トリス−
（ジメチル−アミノ）− ホスホニウムへキサフルオロホスフェ ート ：ウシ血清アルブミン ：ダルトン ：ジシクロへキシル力ルポジイミド ：ジクロロメタン ：ジイソプロピルカルボジイミド ：Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンＳＡ ＣＣ ＣＭ ＩＣ ＩＰＥＡ ニジメチルホルムアミド ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル
−カルボジイミド ：酵素結合免疫吸着検定 ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル基 Ｆｍｏｃ−ＡＳ ：フルオレニルメトキシカルボニル
ーアミノ酸 ＨＯＢｔ ：ヒドロキシベンゾトリアゾールｈｕ：ヒ
ト ＭＡＢ ：モノクローナル抗体 ＭｅＯＨ：メタノール ＭｒＴ ：マイクロプレート ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン Ｑ ｔ Ｆ３ ｕ ： ｔｅｒｔ−ブチルエステルＯＶ
Ａ ：オバルブミン ＰＢＳ ニリン酸緩衝液 Ｐａｍ、Ｃｙｓ ： Ｎ−バルミトイル−Ｓ−Ｃ（２
Ｒ３）−２，３−ビス（バルミトイル）−プ ロピルツーシスティン ＭＦ ＬＩＳＡ ＤＣ ｍｏｃ ＰａｍｓＣ−ＯＨ： ）リパルミトイルー８−グリセリ
ル−し一システィン ｒｔ−ＰＡ ：組換えＭ織プラスミノーゲン活性化
因子 ＲＴ ：室温 ｔ Ｂ Ｕ ： ｔｅｒｔ−ブチル基ＴＦＡ ：）
リフルオロ酢酸 Ｖ ：容積 例１ （カタラーゼ結合体の合成） ペプチドｔ−ＰＡ（３４３−３５４） ＮＨｚ−ＶＶＰ
ＧＥＥＥＱＫＦＥＶ−ＯＨの固相ペプチド合成は全自動
ペプチド合成機４３０Ａ（Ａｉｒ 、ウェイチルスタン
ド（Ｗｅｉ ｔｅｒｓ ｔａｄ ｔ）、ＦＲＧ）を用い
て行った。Ｆｍｏｃアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｖ−ＯＨｌＦｍ
ｏｃ−Ｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇ−ＯＨＳＦｍｏｃ−Ｅ（
ＯｔＢｕ）−０Ｈ。
Ｆｍｏｃ−Ｑ−ＯＨＳＦｍｏｃ−Ｋ（Ｂｏｃ）−０ＨＸ
Ｐｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓ（ＯｔＢｕ）および
Ｆｍｏｃ−Ｖ−バラ−アルコキシベンジルアルコール１
％架橋ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（チャージ
：樹脂１ｇ当り０．４３ ｍｍｏβＰｍｏｅ−Ｖ）はス
イス、ローフエルフインゲン（ＬＭｕｆｅｌｆｉｎｇｅ
ｎ）のノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ） Ａ
Ｇから入手した。ピペリジンを用いてＦｍｏｃ保護基を
脱離した後各アミノ酸を最初はＤＭＦ中、ＤＩＣ／ＨＯ
Ｂｔを用いて活性化エステルとして、二回目はＮＭＰ中
ＤＩＣを用いて対称型無水物として２度結合させた。Ｆ
ｍｏｃ−Ｑ−ＯＨは短縮化した予備活性化の後、対称型
無水物としてＮＭＰ中で２度結合させた。
Ｐｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓ（ＯｔＢｕ）および
Ｆｍｏｃ−Ｖ−バラ−アルコキシベンジルアルコール１
％架橋ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（チャージ
：樹脂１ｇ当り０．４３ ｍｍｏβＰｍｏｅ−Ｖ）はス
イス、ローフエルフインゲン（ＬＭｕｆｅｌｆｉｎｇｅ
ｎ）のノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ） Ａ
Ｇから入手した。ピペリジンを用いてＦｍｏｃ保護基を
脱離した後各アミノ酸を最初はＤＭＦ中、ＤＩＣ／ＨＯ
Ｂｔを用いて活性化エステルとして、二回目はＮＭＰ中
ＤＩＣを用いて対称型無水物として２度結合させた。Ｆ
ｍｏｃ−Ｑ−ＯＨは短縮化した予備活性化の後、対称型
無水物としてＮＭＰ中で２度結合させた。
合成はＦｍｏｃ−Ｖ樹脂５００ｍｇ （０，２１５ｍｍ
ｏｆ）を用いて行った。Ｎ−末端アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｖ
−ＯＨを該ペプチドに付加後樹脂を分割した。その半分
はカタラーゼペプチド結合体の合成に用い、別の半分は
Ｆｍｏｃ−Ｓ（ｔＢｕ）−０）１を結合してＢａｍｘ
Ｃｙｓ−３ｅｒ結合体の合成に用いた。ペプチド樹脂を
振盪フラスコ中２０％ピペリジン／ＤＭＦと１５〜２０
分間攪拌することによりＮ−末端Ｆｍｏｃ保護基を脱離
した。その後樹脂をＤＭＦで２度、ＤＭＣで２度、Ｍｅ
ＯＨで２度およびＤＣＭで２度洗浄し、アスピレータ−
を用いて乾燥した。
ｏｆ）を用いて行った。Ｎ−末端アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｖ
−ＯＨを該ペプチドに付加後樹脂を分割した。その半分
はカタラーゼペプチド結合体の合成に用い、別の半分は
Ｆｍｏｃ−Ｓ（ｔＢｕ）−０）１を結合してＢａｍｘ
Ｃｙｓ−３ｅｒ結合体の合成に用いた。ペプチド樹脂を
振盪フラスコ中２０％ピペリジン／ＤＭＦと１５〜２０
分間攪拌することによりＮ−末端Ｆｍｏｃ保護基を脱離
した。その後樹脂をＤＭＦで２度、ＤＭＣで２度、Ｍｅ
ＯＨで２度およびＤＣＭで２度洗浄し、アスピレータ−
を用いて乾燥した。
ＴＦＡ／レゾルシノール／チオアニソール（９５／ ２
．５ ／ ２．５ ； ｖ／ｖ／ｖ）を用いＲＴで２時
間攪拌することによりペプチドを樹脂から切り離した。
．５ ／ ２．５ ； ｖ／ｖ／ｖ）を用いＲＴで２時
間攪拌することによりペプチドを樹脂から切り離した。
この樹脂サスペンションをガラスフィルター（Ｇ２）を
用いてコニカルフラスコ中に濾過し、さらに該樹脂をＴ
ＦＡで２度洗浄した。ペプチドを含むＴＦＡ溶液を減圧
下で濃縮し後、最小量の酢酸を加えてから冷ジエチルエ
ーテル中での沈澱化、混合および沈澱化ペプチドの遠心
を反復することにより精製して含有する捕捉剤（レゾル
シノールおよびチオアニソール）および脱離した保護基
を除いた。
用いてコニカルフラスコ中に濾過し、さらに該樹脂をＴ
ＦＡで２度洗浄した。ペプチドを含むＴＦＡ溶液を減圧
下で濃縮し後、最小量の酢酸を加えてから冷ジエチルエ
ーテル中での沈澱化、混合および沈澱化ペプチドの遠心
を反復することにより精製して含有する捕捉剤（レゾル
シノールおよびチオアニソール）および脱離した保護基
を除いた。
エーテルをエバボレートしその残渣をｔｅｒｔ−ブタノ
ール／ＨｚＯ（４／ １ ； ｖ／ｖ）から２回凍結乾
燥した。
ール／ＨｚＯ（４／ １ ； ｖ／ｖ）から２回凍結乾
燥した。
収量：粗ペプチド １６０．３ｎｖ
加水分解条件＝１８時間、６Ｎ ＨＣβ ０．０１％フ
ェノール、１００℃ Ａ Ｓ Ａ ： Ｅ ５．８（５） 、Ｐ １．０（
１）、Ｇ １．０（１）、Ｖ ２．Ｈ３）、Ｆ １．２
（１）、Ｋ １．１（１） （、カッコ内の数字は理論
的計算値である）、 Ｄの割合： Ｅ ２．０％、ＰＯ％、ＶＯ％、ＦＯ％、
Ｋ３％、 加水分解条件：３０分間、ＴＦＡ／）ＩＣＩ！ （２／
１； ｖ／ｖ）、１６５℃ ＡＳＡ ： Ｅ ５．６（５） 、Ｐ測定せず、Ｇ
１．０（１）、Ｖ ２．５（３）、Ｆ １．１（１）、
Ｋ １．０（１）言亥ペプチドのカタラーゼ（アスベル
ギラス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
） ；サーバ社、ハイデルベルグ、ＦＲＧ）は水溶液中
３０倍量の水溶性カルボジイミドおよびペプチドを用い
て行った（反応時間１８時間）、生成した尿素および未
反応のカルボジイミドおよびペプチドを水に対する透析
（１５時間、３回水交換、排除限界３０００Ｄ）により
除去した。反応産物は最初は水、２回目はｔｅｒ ｔ−
ブタノール／水（４／１、ｖ／ｖ）から凍結乾燥した。
ェノール、１００℃ Ａ Ｓ Ａ ： Ｅ ５．８（５） 、Ｐ １．０（
１）、Ｇ １．０（１）、Ｖ ２．Ｈ３）、Ｆ １．２
（１）、Ｋ １．１（１） （、カッコ内の数字は理論
的計算値である）、 Ｄの割合： Ｅ ２．０％、ＰＯ％、ＶＯ％、ＦＯ％、
Ｋ３％、 加水分解条件：３０分間、ＴＦＡ／）ＩＣＩ！ （２／
１； ｖ／ｖ）、１６５℃ ＡＳＡ ： Ｅ ５．６（５） 、Ｐ測定せず、Ｇ
１．０（１）、Ｖ ２．５（３）、Ｆ １．１（１）、
Ｋ １．０（１）言亥ペプチドのカタラーゼ（アスベル
ギラス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
） ；サーバ社、ハイデルベルグ、ＦＲＧ）は水溶液中
３０倍量の水溶性カルボジイミドおよびペプチドを用い
て行った（反応時間１８時間）、生成した尿素および未
反応のカルボジイミドおよびペプチドを水に対する透析
（１５時間、３回水交換、排除限界３０００Ｄ）により
除去した。反応産物は最初は水、２回目はｔｅｒ ｔ−
ブタノール／水（４／１、ｖ／ｖ）から凍結乾燥した。
該ペプチドのカタラーゼへの結合はカタラーゼおよびカ
タラーゼ分子当り２０〜２５個のペプチドを含むカタラ
ーゼ結合体の加水分解（６Ｎ塩酸、１１０°Ｃ／１８時
間）後のアミノ酸分析により測定した。
タラーゼ分子当り２０〜２５個のペプチドを含むカタラ
ーゼ結合体の加水分解（６Ｎ塩酸、１１０°Ｃ／１８時
間）後のアミノ酸分析により測定した。
例２
（細胞融合）
免疫化マウスの膵臓を無菌条件下で取り出し、その、ｌ
１１１！細胞をシリンジを用いてＲＰ！Ｊ［１６４０（
ギブコ社、カールスルへ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）で該器
官から洗い出した。該単離脾細胞をペレット化しく１ｌ
１００ｒｐ、１０分間）、３度洗浄した後（ＲＰ！、１
１） ＲＰ！、ｌＩ中に分散した。その後該脾細胞をＰ
３Ｘ６３Ａｇ８、６３５３ （ＡＴＣＣＣＰＬ １５
８０）ミエローマ細胞と融合した。対数期の培！−ミエ
ローマ細胞をペレット化し、３度洗浄化した。２ＸｌＯ
’個の胛細胞および２Ｘ１０’個のミエローマ細胞をフ
ァルコンチューブにピペットで移し、遠心後その細胞ペ
レットに４０％ポリエチレングリコール４０００ （
メルク社、ダルムスタット （Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）
） ０．６ ｍｌを滴下した（１分間かけて）。５分間
以内に該融合混合物を約Ｉ Ｑ ｍＮ ＰＲＭＩおよび
１０ｍＩ！ＨＡＴ培地（ベーリンガーマンハイム社）で
希釈した後細胞を再ペレット化し、さらに２５ｍｊｌ！
ＨＡＴ培地に再懸濁した。該細胞懸濁液の２５０μβ画
分を２４穴クラスタープレート （テクノマラ （Ｔｅ
ｃｎｏｍａｒａ）、ファーンワルド（Ｆｅｒｎ ｗａｌ
ｄ））の各ウェルに分取し、ＣＯ２インキュベーク−中
でインキュベートした。使用した支持細胞は１日培養し
た腹腔マクロファージ（ウェル当りＨＡＴ培地中約４Ｘ
１０’細胞）である。新鮮なＨＡＴ培地を３〜５日毎に
添加した。融合細胞の生育に応じ約２週間後に細胞培養
上清を取り出しＥＬＩＳＡ法でその反応性をテストした
。
１１１！細胞をシリンジを用いてＲＰ！Ｊ［１６４０（
ギブコ社、カールスルへ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）で該器
官から洗い出した。該単離脾細胞をペレット化しく１ｌ
１００ｒｐ、１０分間）、３度洗浄した後（ＲＰ！、１
１） ＲＰ！、ｌＩ中に分散した。その後該脾細胞をＰ
３Ｘ６３Ａｇ８、６３５３ （ＡＴＣＣＣＰＬ １５
８０）ミエローマ細胞と融合した。対数期の培！−ミエ
ローマ細胞をペレット化し、３度洗浄化した。２ＸｌＯ
’個の胛細胞および２Ｘ１０’個のミエローマ細胞をフ
ァルコンチューブにピペットで移し、遠心後その細胞ペ
レットに４０％ポリエチレングリコール４０００ （
メルク社、ダルムスタット （Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）
） ０．６ ｍｌを滴下した（１分間かけて）。５分間
以内に該融合混合物を約Ｉ Ｑ ｍＮ ＰＲＭＩおよび
１０ｍＩ！ＨＡＴ培地（ベーリンガーマンハイム社）で
希釈した後細胞を再ペレット化し、さらに２５ｍｊｌ！
ＨＡＴ培地に再懸濁した。該細胞懸濁液の２５０μβ画
分を２４穴クラスタープレート （テクノマラ （Ｔｅ
ｃｎｏｍａｒａ）、ファーンワルド（Ｆｅｒｎ ｗａｌ
ｄ））の各ウェルに分取し、ＣＯ２インキュベーク−中
でインキュベートした。使用した支持細胞は１日培養し
た腹腔マクロファージ（ウェル当りＨＡＴ培地中約４Ｘ
１０’細胞）である。新鮮なＨＡＴ培地を３〜５日毎に
添加した。融合細胞の生育に応じ約２週間後に細胞培養
上清を取り出しＥＬＩＳＡ法でその反応性をテストした
。
例３
（ハイブリドーマ細胞のスクリーニング）全部で５６個
のクローンをＥＬＩＳＡ （酵素結合免疫吸着検定）で
その反応性をテストした。使用した免疫吸着体は免疫原
（ペプチド３４３〜３５４）、ｒｔＰＡ 、還元カルボ
キシメチル化ｒｔ−ＰＡおよびカタラーゼである（各々
２μｇ／ｍｌ）。１７−１３４／１１および１７−１３
４／２０と命名したクローンは免疫原（ペプチド３４３
−３５４） 、ｒｔ−ＰＡおよび還元カルボキシメチル
化ｒｔ−ＰＡの存在下で明らかな反応性を示した。カタ
ラーゼに対しては測定可能な反応性はなかった。
のクローンをＥＬＩＳＡ （酵素結合免疫吸着検定）で
その反応性をテストした。使用した免疫吸着体は免疫原
（ペプチド３４３〜３５４）、ｒｔＰＡ 、還元カルボ
キシメチル化ｒｔ−ＰＡおよびカタラーゼである（各々
２μｇ／ｍｌ）。１７−１３４／１１および１７−１３
４／２０と命名したクローンは免疫原（ペプチド３４３
−３５４） 、ｒｔ−ＰＡおよび還元カルボキシメチル
化ｒｔ−ＰＡの存在下で明らかな反応性を示した。カタ
ラーゼに対しては測定可能な反応性はなかった。
ＥＬＩＳＡテスト操作手順
１、 マイクロプレート （ＭＴＴ）のウェル当り１０
０μｌの抗原溶液を用いた４°Ｃ１−晩でのコーティン
グ； ２、 前記マイクロプレートのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２
０（０，１５％）による３〜４回の洗浄； ３、 ウェル当り２００．ｃｒｆｆの１〜１．５％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳ溶液（ｐＨ７，４）を用いた室温２時間のマ
イクロプレートのプロ、キング； ４、マイクロプレートの洗浄（上述）；５、 ウェル当
り１００μｌの抗体サンプル（０，５％ＢＳＡ／ＰＢＳ
溶液中）の反応（室温２時間放置）；６、マイクロプレ
ートの洗浄（５回、上述）；７、 ウェル当り１００μ
ｌのパーオキシダーゼに結合した抗Ｉｇ抗体溶液（０，
５％ＢＳＡ溶液、１：２０．０００）の反応（室温２時
間放置）；８、マイクロプレートの洗浄（５回、上述）
；９、 ウェル当り１００μｌのＡＢＴＳ ？容液（１
０〇−の０．１ Ｍクエン酸バフファ（ｐＨ４，２）中
１００■ＡＢＴＳ 、５０■過ホウ酸ナトリウム）の反
応：１０．３０分間の反応時間後（室温）のマイクロプ
レートリーダー（ダイナチク （Ｄｙｎａｔｅｃｈ）
ＭＲ６００）を用いた４０５ｎｍでの測定。
０μｌの抗原溶液を用いた４°Ｃ１−晩でのコーティン
グ； ２、 前記マイクロプレートのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２
０（０，１５％）による３〜４回の洗浄； ３、 ウェル当り２００．ｃｒｆｆの１〜１．５％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳ溶液（ｐＨ７，４）を用いた室温２時間のマ
イクロプレートのプロ、キング； ４、マイクロプレートの洗浄（上述）；５、 ウェル当
り１００μｌの抗体サンプル（０，５％ＢＳＡ／ＰＢＳ
溶液中）の反応（室温２時間放置）；６、マイクロプレ
ートの洗浄（５回、上述）；７、 ウェル当り１００μ
ｌのパーオキシダーゼに結合した抗Ｉｇ抗体溶液（０，
５％ＢＳＡ溶液、１：２０．０００）の反応（室温２時
間放置）；８、マイクロプレートの洗浄（５回、上述）
；９、 ウェル当り１００μｌのＡＢＴＳ ？容液（１
０〇−の０．１ Ｍクエン酸バフファ（ｐＨ４，２）中
１００■ＡＢＴＳ 、５０■過ホウ酸ナトリウム）の反
応：１０．３０分間の反応時間後（室温）のマイクロプ
レートリーダー（ダイナチク （Ｄｙｎａｔｅｃｈ）
ＭＲ６００）を用いた４０５ｎｍでの測定。
例４
（ペプチドスキャンにおけるモノクローナル抗体１７−
１３４／１１および１７−１３４／２０のエピドープの
特徴）ｒｔ−ＰＡに対するモノクローナル抗体の結合部
位はペプチドスキャニング法を用いて同定した。
１３４／１１および１７−１３４／２０のエピドープの
特徴）ｒｔ−ＰＡに対するモノクローナル抗体の結合部
位はペプチドスキャニング法を用いて同定した。
ｒｔ−ＰＡ分子の全アミノ酸配列を８アミノ酸残基長の
重複フラグメント（１−８，２−９，３−１０など）に
分割し、これらのオクタペプチドをポリエチレンピン先
端でのＦｍｏｃ固相合成により合成した。このピンを９
６穴マイクロプレートに対して以下のような構成および
空間配置となるようホルダーに固定した。
重複フラグメント（１−８，２−９，３−１０など）に
分割し、これらのオクタペプチドをポリエチレンピン先
端でのＦｍｏｃ固相合成により合成した。このピンを９
６穴マイクロプレートに対して以下のような構成および
空間配置となるようホルダーに固定した。
１ ２ ３ ４
Ａ １−８ ２−９ ３−１０ ４−１１
８ １３−２０ １４−２１ さらに、エピドープを詳細に決定するためテトラ−、ペ
ンタ−、ヘキサ−、ヘプタ−、オクタ−ノナ−ペプチド
を合成した。
８ １３−２０ １４−２１ さらに、エピドープを詳細に決定するためテトラ−、ペ
ンタ−、ヘキサ−、ヘプタ−、オクタ−ノナ−ペプチド
を合成した。
ペプチドはポリエチレンビン（ＣＲＢ、ケンブリッジ、
英国）（直径：４ｕ、長さ４０１ｍ）上で合成し、マイ
クロプレートの構成に従かいホルダー上に８×１２の行
列となるよう同定した。
英国）（直径：４ｕ、長さ４０１ｍ）上で合成し、マイ
クロプレートの構成に従かいホルダー上に８×１２の行
列となるよう同定した。
ポリエチレンポリマーおよびペプチドの間にはアクリル
酸、ヘキサメチレンジアミンおよびＦｍｏｃ−ベーター
アラニンを含む以下に示す酸−および塩基−耐性アンカ
ーおよびス”ペーサ−が存在する；Ｐｏ１ｙｅｔｈｙｌ
ｅｎｅ−ＣＨｚＣＨｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２） ａ−
ＮＨ−Ｃｏ−ＣＨｚ−Ｃｔｌｚ−ＮＨ−Ｆｍｏｃアミノ
酸の結合はポリエチレン製マイクロプレート中で行ない
、また全ての洗浄操作はポリエチレン容器中で行なった
。
酸、ヘキサメチレンジアミンおよびＦｍｏｃ−ベーター
アラニンを含む以下に示す酸−および塩基−耐性アンカ
ーおよびス”ペーサ−が存在する；Ｐｏ１ｙｅｔｈｙｌ
ｅｎｅ−ＣＨｚＣＨｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２） ａ−
ＮＨ−Ｃｏ−ＣＨｚ−Ｃｔｌｚ−ＮＨ−Ｆｍｏｃアミノ
酸の結合はポリエチレン製マイクロプレート中で行ない
、また全ての洗浄操作はポリエチレン容器中で行なった
。
８または９個のアミノ酸を以下の計画に従がい結合させ
た。
た。
最終的なペプチドを含むホルダーをシリカゲルを入れた
デシケータ中減圧下で保存し、Ｐｅｐｓｃａｎ−ＥＬＩ
ＳＡにはこれを直接使用し得る。
デシケータ中減圧下で保存し、Ｐｅｐｓｃａｎ−ＥＬＩ
ＳＡにはこれを直接使用し得る。
モノクローナル抗体に関するテストは実質的には従来の
ＥＬＩＳＡと同様に行った。ブロッキングバッファ、サ
ンプルその他のＥＬＩＳＡ Ｐｅｐｓｃａｎに必要な溶
液をマイクロプレート（コートしていないもの）にピペ
ットで移し、そのホルダーに取り付けた９６本のピンを
ＭＩＴのウェルに挿入した。
ＥＬＩＳＡと同様に行った。ブロッキングバッファ、サ
ンプルその他のＥＬＩＳＡ Ｐｅｐｓｃａｎに必要な溶
液をマイクロプレート（コートしていないもの）にピペ
ットで移し、そのホルダーに取り付けた９６本のピンを
ＭＩＴのウェルに挿入した。
操作
１、ＭＩＴウェル当り２００ ＩＩ ｌ （７） １
％ Ｂ５Ａ１０ＶＡ１０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０溶液に
よるピンのブロッキング（振盪しながら６０分間）； ２、 ウェル当り１７５μｌの抗体サンプルを含むマイ
クロプレートへのピンの移行（室温６０分間又は４℃−
晩）； ３、 ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０溶液中でのピンの洗
浄（１０分間、４回）； ４．１％Ｂ５Ａ１０ＶＡ ／ ０．１％Ｔｗｅｅｎ ２
０溶液で希釈したウェル当り１７５μｌの抗−Ｉｇ抗体
ウサギ抗マウスパーオキシダーゼ（ダイアツバ（Ｄｉａ
ｎｏｖａ）、ハンブルグ、１：１００００希釈物）を含
むマイクロプレートへのピンの移行（振盪しながら室温
で６０分間）； ５、 ピンの洗浄（上述）； ６、 ウェル当り１５０μβの、へＢＴＳ溶液（２０〇
−１０，１Ｍクエン酸バッファ （ｐＨ４，０）中１０
０１１１００１１Ｉ１．６０μＡ３５％Ｈ２Ｏ２）を含
むマイクロプレートへのピンの移行（３０分間）；７．
４０５ｎｍにおけるマイクロプレートの測定。
％ Ｂ５Ａ１０ＶＡ１０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０溶液に
よるピンのブロッキング（振盪しながら６０分間）； ２、 ウェル当り１７５μｌの抗体サンプルを含むマイ
クロプレートへのピンの移行（室温６０分間又は４℃−
晩）； ３、 ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０溶液中でのピンの洗
浄（１０分間、４回）； ４．１％Ｂ５Ａ１０ＶＡ ／ ０．１％Ｔｗｅｅｎ ２
０溶液で希釈したウェル当り１７５μｌの抗−Ｉｇ抗体
ウサギ抗マウスパーオキシダーゼ（ダイアツバ（Ｄｉａ
ｎｏｖａ）、ハンブルグ、１：１００００希釈物）を含
むマイクロプレートへのピンの移行（振盪しながら室温
で６０分間）； ５、 ピンの洗浄（上述）； ６、 ウェル当り１５０μβの、へＢＴＳ溶液（２０〇
−１０，１Ｍクエン酸バッファ （ｐＨ４，０）中１０
０１１１００１１Ｉ１．６０μＡ３５％Ｈ２Ｏ２）を含
むマイクロプレートへのピンの移行（３０分間）；７．
４０５ｎｍにおけるマイクロプレートの測定。
第１ａ図および第１ｂ図はモノクローナル抗体１７−１
３４／１１およびｌ ７／１４３／２０のペプチドスキ
アンの結果を示したものである。 Ｄ工びニュ 月央↓二互 残 基 番 号
３４／１１およびｌ ７／１４３／２０のペプチドスキ
アンの結果を示したものである。 Ｄ工びニュ 月央↓二互 残 基 番 号
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の所定のエピ
ドープを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞系列で、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列（ペニカ
（Ｐｅｎｎｉｃａ）Ｄ．等（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）￥３０１￥、２１４−２２１）により定義されている
）：１−２（１）、７−９（２）、２０−２２（３）、
２４−３０（４）、３７−４０（５）、４９−５３（６
）、５８−６１（７）、８４−８５（８）、８９−１０
０（９）、１０３（１０）、１０７−１１０（１１）、
１２５−１３０（１２）、１４２−１５１（１３）、１
６０−１６４（１４）、１７１−１７７（１５）、１８
３−１８８（１６）、１９４−１９６（１７）、２１７
−２１９（１８）、２２６−２３９（１９）、２４１−
２４２（２０）、２４５−２５０（２１）、２６８−２
７１（２２）、２９７−３０２（２３）、３２６−３２
９（２４）、３４４−３５０（２５）、３６２−３６９
（２６）、３７８−３８７（２７）、４１１−４１７（
２８）、４２６−４２７（２９）、４３６−４４２（３
０）、４４５−４４７（３１）、４６０−４６６（３２
）、４７５−４７９（３３）、５０２−５０６（３４）
、５１５（３５）および５２２−５２７（３６） から選ばれた配列を含むエピドープを有するペプチドで
免疫化した脾細胞とミエローマ細胞との細胞融合によっ
て得られることを特徴とする細胞系列。 ２、前記脾細胞がマウスＢａｌｂ／Ｃ由来のものであり
、かつ前記ミエローマ細胞が細胞系列Ｐ３Ｘ＿６＿３Ａ
ｇ８．６５３またはそのサブクローンであることを特徴
とする請求項１記載のハイブリドーマ細胞系列。 ３、ｈｕｒｔ−ＰＡのエピドープ領域３４４−３５４を
認識するモノクローナル抗体を産生することを特徴とす
る請求項１または２のいずれか１項記載のハイブリドー
マ細胞系列。 ４、１７−１３４／１１と命名され、かつ第１表ないし
第３表および第１ａ図および第１ｂ図記載の特徴を有す
るモノクローナル抗体の生成を特徴とする請求項３記載
のハイブリドーマ細胞系列。 ５、１７−１３４／２０と命名され、かつ第１表ないし
第３表および第１ａ図および第１ｂ図記載の特徴を有す
るモノクローナル抗体の生成を特徴とする請求項３記載
のハイブリドーマ細胞系列。 ６、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型およびこれらのサブタイプのモ
ノクローナル抗体で、ｔ−ＰＡのアミノ酸領域：１−２
（１）、７−８（２）、 ２０−２２（３）、２４−３０（４）、３７−４０（５
）、４９−５３（６）、５８−６１（７）、８４−８５
（８）、８９−１００（９）、１０３（１０）、１０７
−１１０（１１）、１２５−１３０（１２）、１４２−
１５１（１３）、１６０−１６４（１４）、１７１−１
７７（１５）、１８３−１８８（１６）、１９４−１９
６（１７）、２１７−２１９（１８）、２２６−２３９
（１９）、２４１−２４２（２０）、２４５−２５０（
２１）、２６８−２７１（２２）、２９７−３０２（２
３）、３２６−３２９（２４）、３４４−３５０（２５
）、３６２−３６９（２６）、３７８−３８７（２７）
、４１１−４１７（２８）、４２６−４２７（２９）、
４３６−４４２（３０）、４４５−４４７（３１）、４
６０−４６６（３２）、４７５−４７９（３３）、５０
２−５０６（３４）、５１５（３５）および５２２−５
２７（３６） に存在する１つ以上のエピドープを認識すること特徴と
する抗体。 ７、請求項１ないし４の少なくとも１項記載のハイブリ
ドーマ細胞系列により産生されることを特徴とする請求
項６記載のモノクローナル抗体。 ８、請求項１ないし５の少なくとも１項記載のハイブリ
ドーマ細胞系列の産生法で、アミノ酸領域：１−２（１
）、７−９（２）、２０−２２（３）、２４−３０（４
）、３７−４０（５）、４９−５３（６）、５８−６１
（７）、８４−８５（８）、８９−１００（９）、１０
３（１０）、１０７−１１０（１１）、１２５−１３０
（１２）、１４２−１５１（１３）、１６０−１６４（
１４）、１７１−１７７（１５）、１８３−１８８（１
６）、１９４−１９６（１７）、２１７−２１９（１８
）、２２６−２３９（１９）、２４１−２４２（２０）
、２４５−２５０（２１）、２６８−２７１（２２）、
２９７−３０２（２３）、３２６−３２９（２４）、３
４４−３５０（２５）、３６２−３６９（２６）、３７
８−３８７（２７）、４１１−４１７（２８）、４２６
−４２７（２９）、４３６−４４２（３０）、４４５−
４４７（３１）、４６０−４６６（３２）、４７５−４
７９（３３）、５０２−５０６（３４）、５１５（３５
）および５２２−５２７（３６）に存在するエピドープ
で免疫化した実験動物由来の脾細胞またはインビトロ免
疫化による脾細胞をミエローマ細胞と融合することを特
徴とする方法。 ９、請求項６または７記載のモノクローナル抗体の産生
方法で、請求項１ないし５の少なくとも１項記載のハイ
ブリドーマを培養し、ついで生成した抗体を単離するこ
とを特徴とする方法。 １０、分析用、診断薬として、ｈｕｒｔ−ＰＡ精製用、
薬剤標的用または治療薬としての請求項６または７記載
の新規な抗体の使用。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE3911794.4 | 1989-04-11 | ||
| DE19893911794 DE3911794A1 (de) | 1989-04-11 | 1989-04-11 | Monoklonale antikoerper gegen rekombinaten humanen gewebeplasminogenaktivator mit definierter epitopspezifitaet, deren herstellung und deren verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH034782A true JPH034782A (ja) | 1991-01-10 |
Family
ID=6378387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9490790A Pending JPH034782A (ja) | 1989-04-11 | 1990-04-10 | 明確なエピトープ特異性を有するヒト組織プラスミノーゲン活性化因子に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH034782A (ja) |
| DE (1) | DE3911794A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015030134A1 (ja) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | 三ツ星ベルト株式会社 | 歯付ベルト |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2709492B1 (fr) * | 1993-09-03 | 1995-11-24 | Bioxytech | Méthode d'immunodosage spécifique de la glutathion peroxydase plasmatique humaine, kit pour sa mise en Óoeuvre, oligopeptides et anticorps spécifiques de la méthode . |
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-
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- 1990-04-10 JP JP9490790A patent/JPH034782A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015030134A1 (ja) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | 三ツ星ベルト株式会社 | 歯付ベルト |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| DE3911794A1 (de) | 1990-10-18 |
| EP0392369A1 (de) | 1990-10-17 |
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