JPH034793A - ストレプトミセスからのリゾチーム遺伝子、それを得る方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ストレプトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）からのリゾチーム遺伝子のクローニング、こ
の遺伝子の種々の微生物株への移入および遺伝子産生物
の調製に関する。周囲のシグナル配列の交換による遺伝
子の修飾についても同様に記載されている。

リゾチームと定義される酵素は、１，４−β−Ｎアセチ
ルムラミダーゼのような、Ｎ−アセチルムラミン酸のＣ
１と細菌ペプチドグリカンのＮ−アセチルグルコサミン
のＣ４との間のグリコシド結合な切断するものである［
ｊｏｌｌｅｓ、　Ｐ、およびＪｏｌｌｅｓ、　Ｊ、：　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６３．１（３５−１８９（１９８
４）］。リゾチームは多くの生物に見出され、研究され
てきた。アミノ酸配列は公知であって、反応機構は卵ア
ルブミンからのリゾチームについて提示された（　Ｊｏ
ｌ　ｌｅｓ　ら：　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ　７８．６６８−６６８９．１９６３、Ｐ
ｈ１ｌｌｉｐｓ、　Ｄ、　Ｃ，：　Ｓｃｉ、　Ａｍ、　
２１５．７８−９０．１９６６゜　総説は、前出のＪｏ
ｌｌｅｓおよびＪｏｌｌｅｓを参照されたい。）、リゾ
チームが検出された他の種の例としては、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　Ｉａｂｅｄａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　”ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ”）　［：Ｍｏｒｉｔａ
ら：Ｊ。

１３ｉｏｃｈｅｍ、　　　８３、８９３−９０３、　（
１９７６）コ、　　Ｓｔｅｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉ
ｓｅｕｓ　［ＷａｒｄおよびＰｅｒｋｉｎｓ：　８ｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｊ。

１０６、　６フー７６、　　（１９６８）コ、　　Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ　［Ｋａ
ｗａｔａら：　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ。

４７、　　ｔ５０１−１５０８、　　（１９８３）コ、
　　ＳｔｒｅｐｔＯｍｙＣｅＳｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉ
ｓ　［Ｈａｙａｓｈｉ　ら：　Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、　５９．３１９−３２３　（１９８１
）コおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏ
ｌｏｒ　（Ｍｊｌｌｅｒ）　（ＤＥ３４４０７３５）な
どのいくつかのストレプトミセス株があげられる。

遺伝子操作法の発達に伴って、種々のリゾチーム遺伝子
のクローニングおよび詳細な分析が可能になった。その
例として、卵アルブミンからのリゾチームの遺伝子（Ｊ
ｕｙｅｎ−Ｈｕｕら：　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６．７
６−８０．１９７９）およびファージＴ４からのリゾチ
ーム（Ｑｗｅｎら：Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６５．２２９−２４８．１９
８３）などがあげられる。

さらに、ＤＮＡ化学合成法は、リゾチーム遺伝子の新規
の合成に用いられてきた。参考文献としては、ヒトリゾ
チーム遺伝子の新規合成（ＥＰ０１８１６３４、Ｉｋｅ
ｈａｒａら：　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、
　３４．２２０２−２２０８．１９８６）および微生物
におけるその発現（ＥＰ　０２５５２３３、Ｍｕｒａｋ
ｉ　ら：　Ａｇｒｉｃ、　Ｒｉｏｔ。

Ｃｈｅｍ、４９．２８２９−２８３１．１９８５、Ｙｏ
ｓｈｉｍｕｒａ　　ら二Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ１ｎ、　１５０．７９４−８０
１゜１９８８）についてあげられる。また、新しい遺伝
子操作法は、天然に存在するリゾチーム遺伝子の特異的
（□す飾（Ｐｅｒｒｙ、　Ｌ、　Ｊ、およびＷｅｔｚｅ
ｌ、　Ｒ，ら：５ｃｉｅｎｃｅ　２２６，５５５−５５
７．１９８４、Ｗｅ　ｔｚｅ　ｌ　ら：Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８５．４０１−４０５、１９
８８、Ｍｕｒａｋｉ　ら：　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９１６．６６〜７５．１９８７
）にも用いられてきて、それによって、反応機構につい
ての情報を得るため、また、例えば、温度安定性などの
酵素の性質に影響することに、用いられてきた。

ストレプトミセスにおいてリゾチームをコードする遺伝
子が今見出された。したがって、本発明は、ストレプト
ミセスからのリゾチーム遺伝子に関し、それは、 ａ）　次の配列 ５’−ＴＴＣＧＣ（Ｇ／Ｃ）ＴＡＣＡＴＣＡＡＧ　ＧＣ
（Ｇ／Ｃ）　ＡＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＡＧ　ＧＧ（Ｇ／Ｃ）　
ＡＣ（Ｇ／Ｃ）　ＡＡＣＴＡＣＡＡ−３’のオリゴヌク
レオチドプローブとハイブリダイズする、および／また
は ｂ）　形質転換の後、リゾチーム陰性突然変異体Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　
４９１３を補足（ｃａｍｐ　ｌ　ｅｍｅｎｔ）するもの
である。

本発明による微生物由来のリゾチーム遺伝子は、ストレ
プトミセス、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏ
ｅｌｉｃｏｌｏｒ　（Ｍｕｌｌｅｒ）および　Ｓｔｅｒ
ｐｔｏｍｙｃｅｓＩａｂｅｄａｅ、またはこれら苗株の
突然変異体および変体（ｖａｒｉａｎｔｓ）から得られ
る。ＤＳＭ　３０３０株（Ｓ。

ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ）およびＤＳＭ　４１５１７株
（Ｓ、　１ａｂｅｄａｅ）はとくに好ましい。

全ＤＮＡをこれらの株から従来の方法にて単離して、種
々の大きさのフラグメントに切断する。

次いで、これをコスミドまたはプラスミドベクターと連
結してから宿主株を形質転換させることができる。別の
方法としては、目的の染色体ＤＮＡフラグメントを、消
化した全ＤＮＡを放射性標識したオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズすることによって前もって位置づけする
ことができる。

この場合には、用いるオリゴヌクレオチドの配列は、遺
伝子コードの規則に従って、前もって決定されたリゾチ
ームタンパク質におけるアミノ酸配列に対応しなければ
ならない。

次いで、適当な遺伝子バンクからリゾチーム遺伝子を含
む宿主クローンを同定することが必要である。工程は用
いる宿主株によるが、以下に記述される通りである。

天然シグナル配列を有するストレプトミセス遺伝子の発
現は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）においてはきわめて不
十分であることから、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）にクロ
ーニングされたリゾチーム遺伝子を同定するために活性
分析を用いるのはあまり得策ではない。

したがって、大腸菌におけるリゾチーム活性の顕著な発
現は期待できず、事実、細胞に毒性である可能性もある
。しかし、フラグメントに切断されたリゾチームの部分
的アミノ酸配列を確立した後にオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いることによって、目的のクローンを見出すこ
とができる。次いで、遺伝子コードの規則に従って、特
定のアミノ酸配列から、ＤＮＡレベルで関連ヌクレオチ
ド配列が得られる。決められたアミノ酸は、６個まての
異なるコードンによって決定することができる。

確立されたアミノ酸配列については、最少数のコードン
によってＤＮＡレベルで決定することができるアミノ酸
の配列を有する領域の検索を行う。

対応するオリゴヌクレオチドの配列をこれらアミノ酸配
列領域から推知する。遺伝子コードの縮重のために、可
能なヌクレオチド配列の数が急激に増える。このために
一般に約２０個のヌクレオチドの配列で充分である。

予備試験において、この型のプローブは、場合によって
は、いくつかのかなりに特異的なシグナルを与えたが、
実際には、これらプローブは、遺伝子の検出には不適当
であることが証明された。

予備試験および以下に記載するスクリーニング工程の双
方において用いられて成功した唯一のものは、３８個の
ヌクレオチドデーＴＴＣＧＣ（Ｇ／Ｃ）ＴＡＣＡＴＣＡ
ＡＧ　ＧＣ（Ｇ／Ｃ）　ＡＣ（Ｇ／Ｃ）　ＧＡＧ　ＧＧ
（Ｇ／Ｃ）　ＡＣ（Ｇ／Ｃ）ＡＡＣＴＡＣＡＡ−３’を
有する上記のプローブである。ストレプトミセスＤＮＡ
における７０％以上という高いＧ／Ｃ含量のために、プ
ローブ合成において用いるコドンの第３番目の位置には
、ＧまたはＣのみを用いた。このプローブを用いれば、
特異的にハイブリダイズするＤＮＡバンドをＳ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　（Ｍｕｅｌｌｅｒ）の全ＤＮＡ
においてのみならず他のストレプトミセス株、例えは、
Ｓ、ａｂｅｄａｅ、の全ＤＮＡにおいても同定すること
が可能である。

入手可能なプラスミドまたはコスミド遺伝子バンクのク
ローンを種々の方法で調べる。一方、得られたクローン
を直接にフィルター上て融解し、遊離するＤＮＡについ
て用いた放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションについて試験する。一方、得
られたクローンを各々単一でまたは１０個のクローンを
プールして培養して、含まれるプラスミド／ニスミドＤ
ＮＡを単離する。次いで、このＤＮＡをフィルター上に
滴下するか、または、制限酵素によって消化をしておい
てから順次行うことができるアガロースゲル電気泳動の
後に、サザンブロツティングによってフィルターに移動
させる。フィルター上に固定されたＤＮＡを、放射性標
識したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。オ
ートラジオグラフィーの後、フィルムの黒変によってオ
リゴヌクレオチドがフィルターに結合した点が示される
。対応するコスミドまたはプラスミドＤＮＡが１０個の
クローンブールに由来する場合には、関連するクローン
を一つずつ処理して、コスミドまたはプラスミドＤＮＡ
をオリゴヌクレオチドと一つずつハイブリダイズさせる
。次いて、陽性と判定されたクローンからのコスミドま
たはブラスミｌ”　Ｄ　Ｎ　Ａを、種々の制限酵素によ
る消化によってフラグメントに切断してから、後者をＩ
ＩＩ次オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。こ
のようにして、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズす
るＤＮＡ領域の位置決めをすることが可能である。

このＤＮＡ領域を配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ベ
クター　例えば、配列決定ベクターｐＵＣ８またはそれ
に由来する配列決定ベクター＋）　Ｓ　Ｖ　Ｂ　２６な
どへのサブクローニング、続く配列決定および予め決定
されたアミノ酸配列との比較によって、単能されたＤＮ
Ａが、実際に、目的としていたＤＮＡであることを示す
ことが可能である。コンピュータープログラムを用いて
、構造遺伝子および５′および３′領域を明示すること
が可能である（表１および２）。リゾチームをコードす
る１、２ｋｂのＡ　ｖ　ａ　Ｉフラグメントを配列決定
ベクターｐＵＣ８またはｌ）　Ｓ　Ｖ　Ｂ　２６からス
トレプトミセスベクター　例えば、ｐＥＲ１！５（ブダ
ペスト条約の規約に基づいてＤｅｕｔｓｃｈ　Ｓａｍｍ
ｌｕｎｇ　ｖｏｎＭ＋ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕ
ｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　（独国徽生物および
細胞培養コレクション）に、リゾチーム欠失突然変異体
中のＤＳＭ４９１３として寄託した）にクローニングし
た。リゾチーム産生株、例えは、Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏ
ｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０、に形質転換の後に、収率な
３〜５倍に増加させることができる。

ストレプトミセスにおけるクローニングのために、Ｓ、
　１ｉｖｉｄａｎｓは、比較的簡単に増殖することから
宿主生物として先ず当然に試みられる株であって、目的
の遺伝子の発現はこのストレプトミセスで期待される。

遺伝子バンクを構築するために、単離された全ＤＮＡお
よびアガロースゲルがらの′ａ厚冨化されたフラグメン
トの双方を、大腸菌／ストレプトミセスシャトルベクタ
ーまたはストレプトミセスベクターに連結させた。しか
し、１００　、０００個以上の形質転換体を試験しても
、リゾチーム遺伝子を有するＳ、　ｌ１ｖｉｄａｎｓク
ローンを同定することは不可能であった。

しかし、遺伝子を相同系（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｓｙ
ｓｔｅｍ）にクローニングすることは可能である。本発
明によるリゾチーム遺伝子は、したがって、リゾチーム
欠失突然変異体の補完によって同定することができる。

有意に低下したまたは皆無のリゾチーム産生能を示す、
Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の、安
定な突然変異体は、自然発生的に生じるか、または、胞
子、菌糸体フラグメントまたは単離されたプロトプラス
トの化学的または物理的突然変異によって、得てもよい
、　Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の
胞子を用いて、化学的突然変異誘発物質、例えば、Ｎ−
ヌチルーＮ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮ
ＮＣ）、ニトロソメチルウレア、メチルメタンスルフォ
ン酸塩、エチルメタンスルフォン酸塩、４−ニトロキノ
リン１〜オキシド、ヒドロキシルアミン、５−ブロモウ
ラシル、亜硝酸ナトリウム、マイトマイシンＣ、エチジ
ウムプロミドまたはアクリフラビンで処理するか、また
は８−メトキシルプヲラレンと反応させてからそれに続
く長波長ＵＶ光線（３６５ｎｍ）で照射処理することが
、好ましい。別法としては、胞子を短波長ＵＶ光線（２
５４ｎｍ）で照射することもできる。化学的突然変異誘
発物質、好ましくはＮ　Ｍ　Ｎ　Ｇ、による処理または
ＵＶ光線（２５４ｎｍ）照射は、生存率０．１％から３
０％、好ましくは１％から２％、までになるようにして
行う。安定したリゾチーム欠失突然変異体Ｓ、　ｃｏｅ
ｌｉｃｏｌｏｒは、ブダペスト条約の規約に基づいて、
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎＭｉｋｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕ
ｒｅｎに寄託番号ＤＳＭ４９１３を付与されて寄託され
ている。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｕｃｅｓ　１ｉｖｉｄａｒ＋ｓのため
に開発されたプロトプラスト形成および形質転換の条件
はすべてのストレプトミセスにおいて好結果をもたらす
ものではないことが知られている。野生型Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ｍｕｅｌｌｅｒ　ＤＳＭ　３０
３０の場合には、充分な形質転換体をＳ、　ｌ１ｖｉｄ
ａｎｓのために記載された方法（Ｃ，、Ｊ、　Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎら：　（１９Ｂ２）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ。

＋５１．６６８−６７７）によって単離することができ
る。

これに対して、この方法ではリゾチーム欠失突然変異体
Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ｍｕｅｌｌｅｒ　ＤＳＭ
　４９１３の形質転換体を得ることは不可能である。し
かし、プラスミドＤＮＡの形質転換は、突然変異体ＤＳ
Ｍ４９１３で以下に記載の条件で効率よく行うことがで
きる。

突然変異体ＤＳＭ４９１３を、約１７ｇ／リットルのカ
ゼインからのペプトン、約３ｇ／リットルの大豆ミール
からのペプトン、約２．５ｇ／リットルのグルコース、
約５ｇ／リットルの塩化ナトノウムおよび約２．５ｇ／
リットルの燐酸水素、二カリウムからなるＣａ５ｏ培地
中で前培養して、約５ｇ／リットルのグリシンで濃厚富
化しておいたＣａ５ｏ培地に移し、３０℃で約４５時間
定Ｔ；増殖間に達するまで振盪する。増殖のための最適
時間および温度は、それぞれの場合に得られる形質転換
体の収率を決定することによって各突然変異体について
容易に確立することができる。

プロトプラスト形成は、０．２　！５　ｍｇ／ｍｌ　〜
１　、Ｏｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌの鶏卵リ
ゾチーム、を用いてＰ緩衝液［Ｈｏｐｗｏｏｄ　ＤＡら
：　ｒＧｅｎｉｔｉｃＭａｎｉｐｕ！ａｔｉｏｎ　ｏｆ
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａ　ｌ　Ｊ、Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　１ｎｎｅ
ｓ　ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳＮｏｒｗｉｃｈ。

Ｅｎｇｌａｎｄ、　Ｐ、　２４５　（１９８５）コ中で
３０〜６０分間、好ましくは４０分間室温にて緩やかに
振盪しながら行う。形質転換のてめに、チオストレプト
ン耐性をコードするプラスミドＤＮＡおよびＴ緩衝液（
）１ｏｐｗｏｏｄら：上記、Ｌ２４１３、を参照された
い）をプロトプラストとともに混合して、次いで、低温
融解性アガロースの代わりに寒天を含む修飾Ｒ３軟寒天
（Ｓｈ　ｉ　ｒａｈａｍａら：　１９８１、Ａｇｒｉｃ
、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　４５．１２７１−１２７３）に埋める。埋
め込まれたプロトプラストを、再生（ｒｅｇｅｎｅｒａ
ｔｉｏｎ）培地、好ましくはＲ２ＹＥ寒天プレート（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄら：上記、Ｐ、２３６、を参照されたい）
、上にひとげて、無蓋で滅菌実験台の中心で２〜６時間
、好ましくは４１１寺間、乾燥させる。３０℃で２０〜
２６時間、好ましくは２４時間、インキュベートしてか
ら、２００μ３／ｍｌのチオストレプトンを含むＮＢ軟
寒天（約３ｇ／リットルのバクトビーフエキス、約５ｇ
／リットルのバクトペブトン、約６ｇ／リットルの寒天
）を重層して、さらに３０℃で６日間インキュベートす
る。

遺伝子バンクを作出するために、リゾチーム産生性株、
好ましくはＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０
３０、の全ＤＮＡを単離して、制限エンドヌクレアーゼ
、例えは５ａｕ３Ａなど、て不完全に切断する。

２．８〜１５ｋｂの大きさの５ａｕ３Ａフラグメントを
単離して、これをＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ
　３０３０から単離して、直線化してから脱燐酸化して
おいたベクターｐＥＢ　１５に連結する。ベクターｐＥ
Ｂ１５は、Ｓ、　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ　ＤＳＭ　４０
７５５から単離されるプラスミドｐＳ　Ｖ　Ｈ１（ＥＰ
　００７０５２２）　ニ由来するｐＥＢ　１５の消化は
、例えば、制限酵素Ｂｇｔｎで行うことができる。

代わりに、Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０
３０またはこのストレプトミセスの他の産生株の全ＤＮ
Ａを、例えば、制限酵素ＳｍａＩで完全に切断する。リ
ゾチーム遺伝子に適した上記オリゴヌクレオチドプロー
ブとのＤ　Ｎ　Ａ　−Ｄ　Ｎ　Ａハイブリダイゼーショ
ンによって、Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３
０３０の全ＤＮＡのＳｍａＩフラグメント（約３．３ｋ
ｂの大きざ）を同定することが可能である。次いで、同
定されたフラグメントを、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（
フレノウフラグメント）を用いる埋填によって末端を予
め平滑末端にしておいた直線状にした脱燐酸化したベク
ターＩ）　０Ｍ４　（ＥＰ　０２５７４１？）に連結さ
せる。ｐＧＭ４の切断を、制限酵素ＢａｍＨＩによって
行うことができる。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる処理の後、Ｄ　Ｎ　Ａ　’Ｉ
Ｈ合物でリゾチーム欠失突然変異体ＤＳＭ４９１３のプ
ロトプラストを形質転換させる。得られるクローンを、
約２０ｇ／リットルの大豆ミール、約２０ｇ／リットル
のマンニＩ・−ルおよび約１．８　ｇ／リットルの寒天
からなり、３０７１ｇ’／　ｍｌのチオストレプトンを
添加しておいた５Ｍ培地（ｐＨ７，５）を用いる寒天ブ
ロック上で、３０°Ｃて５〜７日間インキュベートする
。次いで、リゾチーム産生性クローンを、熱不活化した
ミクロコツカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　
１ｕｔｅｕｓ）細胞を用いるリゾチーム試験寒天プレー
ト上の融解の懸濁ゾーンの形成によって同定する。

リゾチーム産生クローンからのプラスミドｐｃｅｌｌお
よびｐｃｅ１２の単離およびリゾチーム欠失突然変異体
ＤＳＭ４９１３での新規な形質変換の結果、リソチーム
産生性形質転換体が試験した全ての場合について得られ
る。これに対して、プラスミドｐｃａｌｌおよびｐｃｅ
１２てＳ、　１ｉｖｉｄａｎｓを形質変換させた後は、
ミクロコツカス・ルテウスを用いる寒天拡散試験または
光度測定によってリゾチーム産生を認めることはできな
い。

これに対して、プラスミドｐｃｅｌｌまたは１）　ＣＥ
　１２によるＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３
０３０またはリゾチーム過剰産生性突然変体またはそれ
らに由来する変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）の形質転換の
結果、リゾチーム収率は出発株と比較して２〜３倍に増
加する。驚いたことに、プラスミドｐｃｅ１２は、Ｓ、
　ｃｏｅｌｉｅｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０中できわめ
て安定であることが証明された。

ＢｇｌＩＩで切断しておいたベクターｐＥＢ　１５への
ｐｃｅ１２の１．２ｋｂのＡｖａＩフラグメントのクロ
ーニングの結果、リゾチーム遺伝子のＪ：？ｇに、加え
て−，Ｓ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ　［Ｂｅｒｎａ
ｎら：　Ｇｅｎｅ３７．１０１−１１０　（１９８５）
］のチロシナーゼ遺伝子のプロモーター領域を有するプ
ラスミドｐｃｅ１３が得られる。ｐＣＥ　１３の場合に
は、Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０のリゾチーム
産生は３〜５倍に増加する。

本発明によって、細菌性リゾチームを経済的に大量に産
生ずることができ、したがって、食品の保存料としての
使用またはその他医薬的用途を確立することが可能にな
る。酵素は、とくに食品での使用において、やや酸性領
域である至適ｐ　Ｈによって、とくに優れている。

例１ 制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断適当な酵素
による単一消化は、全容ｆｌｌＯ〜３０　ノ１１で反応
温度は各々の酵素の至適温度、ふつうは３７℃、通常行
う。用い得る緩衝液は、Ｍａｎａｔｉｓら　（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　　ら：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ＋ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ　ｌ、Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｐ、１０４以降、
１９８２）の記載による低、中、高塩濃度の緩街ｔ６ｆ
または個々の製造者によって特定して推奨される緩衝液
を用いる。混合？夜中ではＤＮＡ１７１ｇ当り約１〜３
Ｕの酵素を用いる。培養時間は、用いる酵素の熱ｂｉｌ
ｉｔｙによって、１時間から数時間が用いればよい。二
つの異なる酵素による二重消化の場合には、通常、両酵
素を混合液中に同時に加えることが可能である。酵素の
塩要求性が大きく異なる場合には、低塩濃度要求性の酵
素で先ず行って、塩濃度を上げた後に第二の酵素を加え
る。

消化の完了は、反応混合液の一部をゲル電気泳動するこ
とによってチエツクすることができる。

例２ フォスファターゼ反応 ＴＥ緩衝？？Ｚ（１０ｍＭ）リス−塩酸、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８，０）に予め溶解しておいた、突出５′末端
を有する、直線状にしたベクターＤＮＡを、５μｍの２
０ＸＲＡＰ緩衝液（８００叶トリス−塩酸、１００ｍＭ
ＭｇＣＩ　２．２ｍＭＺｎＣｌ２、ｐ　Ｈ８，０）およ
び水で容ＩＬ　１００７１Ｉに調整してから、約３０Ｕ
の仔ウシ腸管フォスファターゼＣＣＩ　Ｐ）（ベーリン
ガー・マンハイム社製）を加える。

３７℃で２〜３時間時間インキュートシてから５μｍの
１０％ＳＤＳを加えた後、６８℃で１５分間加熱する。

３回ののフェノール処理の後、エタノール沈澱、７０％
エタノールによる洗浄を行い、新たなＴＥ緩衝液に入れ
る。可能な別の方法は、１μｍのＣＩＰを制限酵素消化
後に直ちに混合液に加えて、３７℃でさらに２０分間イ
ンキユヘートする。次いで、２μｍの０．５Ｍ　ＥＤＴ
Ａを加えて、混合液を６５℃で１時間加熱する。続くフ
ェノール処理および沈澱を、上記のようにして行う。

例３ リガーゼ反応 単離されたＤＮＡフラグメントとプラスミドまたはコス
ミ１−ベクターとの連結をＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら：上記、ｐ、２８６以降およびｐ、４７４
、を参照されたい）の推奨する条件下で行う。反応を、
１０〜２０μｍの容量でＤＮＡ濃度１００〜４００７Ｊ
ｇ／ｍｌで行う。連結されるＤＮＡを一緒に沈澱させて
計算された量のりガーゼ緩衝液に再懸濁させることは、
どくに有利である。プラスミドとの連結の場合には、ベ
クタープラスミドと挿入物との比は、通常、１：１から
ｌ：５の間で、コスミドとの連結の場合には、逆に、５
：　１から１０：】の間である。用いる酵素は、Ｔ　４
．　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム、
ニューイグランドバイオラボズ）で混合液当り１ｏｏ−
４０００の濃度で用いる。インキュベーションは、１４
〜１８°Ｃて少なくとも１２時間行う。反応をチエツク
するために、連結の後に反応混合液の一部、例えば２０
μｍの混合液の場合には３μｍ、を反応容器から取り出
して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加える前に反応混合液から
取り出して４℃で保存した試料と、０．８％アガロース
ゲル上で比較する。

例４ パッケージング抽出物（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒ
ａｃｔｓ）の調製 入ファージの頭部へのＤＮＡのインビトロパッケージン
グに必要なパッケージング抽出物を、Ｈｏｈｎの方法（
Ｈｏｈｎ、　Ｂ：　Ｗｕ、　Ｒ，ＦＪＴ集、Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔＤＮＡ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ’６Ｂ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、２９９−３０９．１
９７９）によって調製する。大腸菌ＢＨ３２６８８株（
凍結融解物（ｆｒｅｅｚｅ　ｔｈａｗ　Ｉｙｓａｔｅ、
　ＦＴＬ）　）およびＢ　ＨＢ２６９０　（超音波処理
抽出物（ｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔ、５Ｅ））を、グ
リセロール培養物から、Ｌブロス培地（１リットル当り
１０ｇのバクトドリブトン、５ｇの酵母抽出液、５ｇの
ＮａＣ１，ｐＨ７，５）中に接種する（５ｍ１の培地に
対して５０μｍのグリセロール培養物）。Ｌブロスプレ
ートに３２℃で増殖させた培養物を画線して、再び３２
℃で培養する。各プレートの増殖物から５個のコロニー
を取り上げて二枚のしブロスプレートに移す。その一つ
を３２℃でインキュベートして、他の一方を４２℃で培
養する。３２℃で増殖して４２℃で増殖しない単一コロ
ニーのみを次の工程に用いる。

それぞれの場合、４２°Ｃで増殖を示さないコロニーの
一つを今度はＬブロスプレートに画線して、３２°Ｃで
一晩培養する。パッケージング抽出物を調製するために
、一つの小コロニーをこれらのプレートからそれぞれ選
択して、１０ｍ１のしグロス培地で培養する。培養物を
３２℃で一晩培養して、次の日に、主培養に接種するた
めに用いる。

ＦＴＬ抽出物を調製するために、８００ｍ１の新鮮なし
ブロス培地に１０％のＢＨ３２６８８の前培養物を接種
して、３２℃で振盪機で２２０　ｒｐｍでＯＤ　６００
が０．４５〜０．５０に達するまで培養する。

次いで、培養物をブンゼンバーナーの炎の上で回転させ
ながら４２〜４３℃に加熱する。温度は、温度計を直接
に懸濁液に差し込んで非滅菌状態で計る。次いで、イン
キュベーションは回転水槽中で、緩やかに振盪しながら
４２〜４４℃で１５分間、次いで、激しく振盪しながら
３７℃で２．５時間行う。懸濁液を１０°Ｃに氷水中で
冷却して、次いで、２００ｍ１を６．ＯＯＯｒｐｍで４
℃で１０分間５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５で遠心分離する
。各ベレットを０．３ｍ１の冷シュークロース溶液（１
０％シュークａ−スを５０ｍＭのトリスに溶解、ｐ）Ｉ
７．４）と、気泡をつくらないように混合して、１０ｍ
１の遠沈管に移して、３０μｌの新鮮なリゾチーム溶液
（２ｍｇ／ｍ１水溶液）と攪拌する６混合液をドライア
イス内で凍結させる。早くとも３０分後に遠沈管を緩や
かに室温にまで融解する。完全に融解した後、２５０μ
ｍの水冷Ｍｌ緩衝液（４１０μｍのＨ２Ｏ，１μｍのβ
−メルカプトエタノール、６μｍの０．５Ｍトリス−塩
酸、ｐＨ７，４，３００）ｔ　ｌの５０ｍＭスペルミジ
ン、９μｍのＩＭＭｇＣｌｚ、７５μｍの０．１Ｍ　Ａ
ＴＰ）を各管の内容物に加えて、丁寧に混合した後、３
５，０ＯＯｒ　ｐ　ｍで２℃で２５分間遠心分雌する（
ベックマンＬ８−Ｍ（３０超遠心１１）。

次いで、上清を合わせて、２５７１１づつをドライアイ
ス中で凍結して、使用時まで一８６℃で貯蔵する。

ＳＥパッケージング抽出物を調製するために、４００ｍ
１のしブロス培地に４ｍｌのＢＨ３２６９０株の一晩培
養物を接種して、次いで、５ｏｒｖａｌｌ遠心分離機で
の遠心分離まではＢＨ８２６８８株について記述された
工程と全く同様に行う。二つの遠沈管に得られるＢＨＢ
２６９０株のペレットをそれぞれ３ｍｌの冷緩衝液Ａ（
２０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、３ｍＭＭｇＣ
１２、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１　ｍＭＥ
　Ｄ　Ｔ　Ａ）中で気ン包をつくらないようにして攪拌
して、懸濁液を透明なくｃｌｅａｒ）プラスチック容器
に合わせて入れる。プラスチック管を塩／氷／水混合物
内にいれて、最大出力で５秒間周期（ＩＩＩｕｌｓｅｓ
）で超音波装置（ブランソン超音波処理機）で超音波処
理する。溶液の粘度を周期の合間にパスツールピペット
でチエツクする。最初の二、三周間の後に溶液粘度の大
きな増加が認められ（高分子量のＤＮへの細胞からの遊
離）、次いで、周期数が増えるにつれて粘度が低下する
（ＤＮＡが低分子量のフラグメントに破砕される）。各
周期の間、懸濁液の温度が２０℃を決して越えないよう
に、懸濁液を繰り返して充分に冷却する。超音波処理し
た懸濁液を低い粘度にするためには、１０周期が必要で
ある。超音波処理の後に、懸濁液を６　、０００ｒｐｍ
で４℃で１０分間遠心分離しく５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−
５冷却遠心機、５Ｓ−３４０−ター）、上清を小ペレッ
トから吸い取る。０．６ｍ１の冷Ｍ１緩衝液（上記参照
）を各２００１１１の上清すべてに加えて、混合した後
、２０　）ｌｌづつを、予めドライアイス上で冷却して
おいた０、５ｍｌエッペンドルフ反応管に移し入れる。

分注された試料を一８６℃で貯蔵する。

代わりの方法としては、種々の製造会社、例えば、ベー
リンガー・マンハイムやＡｍｅｒｓｈａｍＢｕｃｈｌｅ
ｒ、　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇなどから既製のパッケ
ージング抽出物を購入することも可能である。

例５ 人ファージにおけるパッケージング 例３に記載のりガーゼ混合物の３μｍのを９μのＳＥ抽
出物（例４）と氷水槽中で攪拌して、２分間後に１０μ
ｍのＦＴＬｈ１１出物（例４）を加える。その後、室温
で１０分間インキュベートする。

次いで、５００μｍの３Ｍ緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ
、１０ｍＭＭｇ５ＯＩＬ、５０ｍＭ）リスＭＣＩ、ｐＨ
７−５，０，０１％ゼラチン）を加える。この混合液を
、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）反応に用いる
ことができる。

例６ 大腸菌ＥＤ８７６７の形質導入 ０．４％のマルトースおよび１０ｍＭＭｇ５ＯＩＬを加
えた５ｍｌのしブロス培地に、５０μｍの大腸菌ＥＤ８
７６７株のよく増殖した液体培養物を接種する。細菌を
３７℃で約１２時間振盪して、初期定常期に達した後に
卓上遠心分離機で集菌する。

沈澱を０．５ｍｌの緩衝液（１０ｍＭＭｇＳＯＩＬ、０
．４％マルトース）で洗浄して、０．２５　ｍｌの同じ
緩衝液に再懸濁させる。例５で得られたコスミドフ７−
ジの１０μｍをこの濃縮細菌懸濁液の１００　Ｉｔ　Ｉ
に加える。これを３７℃で１５〜３０分間インキュベー
トする。次いで、０．５ｍｌのしブロス培地を加えて、
混合液を３７℃で３０〜６０分間再びインキュベートす
る。次いで、混合液の１００μｍを１５μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むしブロスプレート上に塗布する。よく
増殖したコロニーが得られるまでプレートを３７℃でイ
ンキュベートする。

例７ ＤＮＡの部分消化 ストレプトミセスからの全ＤＮＡの部分消化を雑誌「フ
ォーカス（ｆｏｃｕｓ）　Ｊ　　（ＢｅｔｈｅｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｖｏｌ
、　７、Ｎｏ、　２．１９８５．３頁）に記載の方法に
て行う。ストレプトミセスのＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ
ｒ　ＤＳＭ　３０３０株から単離された全ＤＮＡを制限
酵素５ａｌＩ（：よっＴ３０−４０ｋｂのフラグメント
に切断する。５０μｍのＤＮＡ溶液、４０１１１（７）
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス−ｆ（Ｃ１，１ｍＭＥＤＴ
ＡＳ　ｐＨ８，０）、１０μｍのＩＯＸ高塩高士緩衝液
び１０ＴＪＪの５ａｌＩを含む全容置１００μｍの混合
液がとくに適していることが証明されている。混合液を
３７℃で１ｏ分間インキュベートして、次いで、直ちに
氷に移す。フェノール／クロロボルムで抽出した後、Ｄ
ＮＡをエタノ−ルて沈澱させて、７０％のエタノールで
洗浄して、次いて、５０　）ｔ　ｌのＴＥ緩衝液に再懸
濁する。

この方法では、５ａｉｌ酵素はすべての可能な切断部位
を切断しない。

例８ 大腸菌におけるＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　
３０３０　Ｄ　ＮＡのコスミド遺伝子バンクの作出 全ＤＮＡをストレプトミセスのＳ、　ｃｏｅｌｉｃａｌ
ｏｒＤＳＭ　３０３０株からり、Ａ　Ｈｏｐｗｏｏｄら
（上記、ｐ、７９、を参照）の記載の方法によって単離
して、おもに３０〜４０　ｋｂの大きさのＤＮＡフラグ
メントが形成されるように例７に記載のようにして制限
酵素５ａｌｌで部分消化する。消化したストレプトミセ
スＤＮＡの一部を、例３に記載のように、制限酵ｇｓａ
ｌｌで完全に切断した後に脱燐酸化したコスミドベクタ
ー１）ＨＣ７９（例２を参照されたい）と共に連結させ
る。２０μｍリガーゼ混合液の３１１１をλファージの
頭部にパッケージングさせる（例４〜６）。得られる組
換えコスミドベクージを大腸菌ＥＤ８７６７株の感染に
用いる。組換え細菌コロニーを、５０μｍ／ｍ１のアン
ピシリン（Ａ　ｒｎ　ｐ　）を加えておいたしブロスプ
レート上て遣損する。約２，０００個のコロニーを取り
あげて、個々のクローンを容易に再び見つけることがで
きるように、新鮮なしブロス／　Ａ　ｍ　ｐプレートの
基盤口（ｇｒｉｄ）の中に移す。各プレートの複写（ｄ
ｕｐｌ　１ｃａｔｅ）を作出する。遺伝子バンクが完全
であるかどうかを確認するために、単一コロニーをｍ１
旧１ｙｓｉｓに取り入れて単離されるコスミドＤＮＡを
酵素５ａｌＩで完全に切断する。得られるフラグメント
パターンは、３０〜４０ｋｂの大きさのコスミドＤＮＡ
がすべてのクローンに含まれていることを示す。

遺伝子バンクのリゾチーム遺伝子を検索するために、各
々の場合、基盤目に取り入れた１０個のコロニーを、５
０μｇ’／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのしブロス
培地に一緒に接種して、３７°Ｃで一晩１辰盪する。）
欠いで、関連の懸濁ン夜についてｍ１ｎｉｌｙｓｅｓを
行い、その結果として得られる各々の場合の１０個のコ
スミドＤＮＡの混合物を制限酵素５ａｌＩで完全に切断
する。フラグメントを０．８％アガロースゲル上で分画
して、サザンブロッティングによってナイロンフィルタ
ーに移動させる。ストレプトミセスのＳ、　ｃｏｅｌｉ
ｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ３０３０の５ａｌＩ消化全ＤＮＡも
同じゲルに対照として適用する。ＤＮＡをフィルターに
固定した後、後者を直接に次のハイブリダイゼーション
反応に使用する。

これらのフィルターを、例１３に記載のようにして１．
放飼性標識した以下のオリゴヌクレオチドプローブとハ
イブリダイズさせる。

５’−ＴＴＣＧＣ（Ｇ／Ｃ）ＴＡＣＡＴＣＡＡＧ　ＧＣ
（Ｇ／Ｃ）　ＡＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＡＧ　ＧＧ　（Ｇ／Ｃ）
　ＡＣ（Ｇ／Ｃ）　ＡＡＣＴＡＣＡＡ−３’フイルター
を５５〜６０℃でハイブリダイズさせてから、６０〜６
５℃で洗浄する。得られる約２．０００個のコスミドク
ローンのコスミドＤＮＡを１０個づつプールして、放射
性標識した上記の配列を有するオリゴヌクレオチド混合
物と反応させる。

オートラジオグラフィーの後、フィルター上の位置がＳ
、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の全ＤＮ
Ａからのシグナルと同一であるシグナルを示す、各々１
０個のクローンを有する全１１群のプールを見出すこと
が可能であった。１０個のプールからの関連クローンを
一つずつ接種して、コスミドＤＮＡを単離した。前に用
いたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが
点で示され、これによって１０個のそれぞれのプール中
で陽性のシグナルに対応するクローンが同定される。

例９ コスミドクローンからのＤＮＡフラグメントのサブクロ
ーニング 陽性コスミドベクーンの一つからのコスミドＤＮＡをＣ
ｓ　Ｃｌ　／　Ｅ　ｔ　Ｂ　ｒ勾配で精製して、単離し
たＤＮＡを制限酵素５ａｉｌで完全に消化する。得られ
るＤＮＡフラグメントを、同様に５ａｌｌで消化してｈ
）ら次いてアルカリフォスファターゼ（仔ウシ腸管フォ
スファターゼ、ベーリンガー・マンハイム社製、例２を
参照されたい）処理もしておいたベクターｐＳＶ８２６
とともに連結する。ｐＳＶＢ２６は、既知のベクターｐ
　Ｕ　Ｃ８［ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ：　Ｇ
ｅｎｅ　１９（１９８２）　２５９−６８コとほとんど
同一で、ポリリンカー中の制限酵業切断部位の位置方向
と性質が異なるのみである。以下に記述するクローニン
グにｐＵＣ８を用いろことは、同様に可能である。

大１１ｉ１ｍＨＢ　１０１株のコンピテントにした細胞
の形質転換の後、５０７１ｇ／ｍｌのアンピシリンを含
むしブロス培地上で、プラスミドＤＮＡを含むクローン
の選択を行う。コロニーの増殖の後、コロニーハイブリ
ダイゼーション（例１５）を用いてどのクローンが目的
のフラグメントを含んでいるかを調べる。プラスミドＤ
ＮＡを、陽性反応を示すクローンからｍ１ｎｉｌｙｓｉ
ｓによって単離して、５ａｌＩ消化によって、クローン
が目的の５ａＬＩフラグメントを含んでいるかどうかを
調べる。

５ａｌＩフラグメントは、スクリーニングに用いたオリ
ゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって最
終的に同定される。

また、オリゴヌクレオチドプローブと陽性反応するコス
ミドクローンからの他の制限フラグメン１、をベクター
ｐＳＶ８２６において同様の方法でサブクローニングす
ることも可能である。例えば、コスミドクローンからの
約１．２ｋｂの大きざのＡｖａＩフラグメントを同定し
て、突出末端をクレノウボリメラーゼで埋填して、アガ
ロースゲルから単離した後に、ｐＳＶ８２６のＳｍａＩ
切断部位にクローニングした。二つの異なるＢｓ５Ｈ■
フラグメントを異なるオリゴヌクレオチドを用いて同様
に同定して、末端を埋填して、アガロースゲルから単離
した後に、ｐＳＶＢ２６の単一のＳｍａｌ切断部位にク
ローニングする。このようにして、種々の制限フラグメ
ントをｐＳＶＢ２６にクローニングすることができる。

これらフラグメントの制限酵素地図作出の結果、第１図
に示される制限酵素地図が得られ、これにはリゾチーム
遺伝子および周辺領域が含まれる。

この領域に唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）制限切断部位が含ま
れることから、適当な酵素とｐＳＶＢ２６のポリノンカ
ー領域の制限切断部位の一つを認識する酵素とにの二重
消化によって、特異的な削除を行うことおよび次の配列
決定に後者を用いることが可能になる。ｐｓＶＢ２６は
ポリリンカー配列のみがｐＵＣベクターと異なっている
ことから、サンジャー法による５ａｌＩフラグメントの
配列決定に通常のｐＵＣブライマーを用いる。さらに、
スクリーニングに用いるオリゴヌクレオチドをブライマ
ーとして用いる。配列決定に用いる種々の構築物は、よ
り詳細に第２図に再度示される通りである。第２図に示
される１、２ｋｂの大きさのＳ　ｍ　ａＩ／ＡｖａＩフ
ラグメントの配列は表１に、リゾチーム構造遺伝子の配
列は表２に、それぞれ示される通りである。

入Ｖａ工 表２ 例１０ 全ＤＮＡからのハイブリダイズしているフラグメントの
同定 Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒから単離された全ＤＮＡを
種々の制限酵素、例えば、５ａｌＩ、Ｂｓ５ＨＩ、Ｓｍ
ａＩ、Ａｖａｌ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ
、ＰｖｕＩＩなど、でそれぞれ単一で、完全に消化する
。得られるフラグメント混合物を０．８％アガロースゲ
ル上で分画して、サザンブロッティングによってナイロ
ンフィルターに移動させる。フィルターを例１３に記述
のようにして処理して、放射性標識したオリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせる。至適のハイブリダイゼー
ション温度をハイブリダイゼーションおよび洗浄温度を
３０〜６０℃で変えることによりて決定する。

ハイブリダイゼーションをオートラジオグラフィによっ
て可視化する。最も可能なハイブリダイゼーションおよ
び洗浄の温度で、唯一のフラグメントを分画した全ＤＮ
Ａから同定できる温度を、このようにしてそれぞれのオ
リゴヌクレオチド（混合物）について検索する。とくに
、３８個のヌクレオチドの長さで配列５’−ＴＴＣＧＣ
（Ｇ／Ｃ）ＴＡＣＡＴＣＡＡＧ　ＧＣ（Ｇ／Ｃ）　ＡＣ
（Ｇ／Ｃ）　ＧＡＧ　ＧＧ（Ｇ／Ｃ）　ＡＣ（Ｇ／ｃ）
　ＡＡＣＴＡＣＡＡ−３’を有するオリゴヌクレオチド
混合物によってよい結果が達成される。より短いオリゴ
ヌクレオチド混合物では、満足な結果が得られない。

３８個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド混合
物を用いて１．６０〜６５℃のハイブリダイゼーション
および洗浄温度において、Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０全ＤＮＡから
明瞭なシグナルが得られるや例えば、約３．３ｋｂの大
きさのＳｍａｌフラグメント、約１．３ｋｂの大きさの
５ａｌＩフラグメント、約１．２ｋｂの大きさのＡｖａ
ｌフラグメントおよび約０．８ｋｂの大きさのＢｓ５Ｈ
Ｉ［フラグメントを、このようにしてこのオリゴヌクレ
オチド混合物を用いてＳ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の全ＤＮＡか
ら同定する。

ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂｇｌｌｌ、ＸｈｏＩなどに
よる消化では、きわめて大きいフラグメントのみが認め
られる。

例１】 Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０全ＤＮ
Ａからの５ａｌＩフラグメントのクローニング 例１０に記述の工程によって、リゾチーム遺伝子を検索
するために用いたオリゴヌクレオチド混合物と陽性シグ
ナルを示す１．３ｋｂ付近の大きさの５ａｌＩフラグメ
ントを同定することが可能であった。Ｓ、　ｃｏｅｌｉ
ｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０からの全ＤＮＡを制限酵
素５ａｌＩで完全に消化して、１．１〜１．５ｋｂの大
きさのフラグメントを例２１に記述の工程によってアガ
ロースゲルから単離した。精製されたフラグメントを５
ａｌＩで完全に消化してから次いでアルカリフォスファ
ターゼ（仔ウシ腸管フォスファターゼ、ベーリンガー・
マンハイム社製）処理をしておいたベクターｐＳＶＢ２
６とともに連結させる。大腸菌Ｈ８１０１株のコンピテ
ントにした細胞をリガーゼ混合物で形質転換して、５０
　）ｉ　ｇ／　ｍｌのアンピシリンを含むＬブロス培地
上てプラスミドを含むクローンを選択する。得られる約
１，０００＠のコロニーを基盤目に取り入れて、各プレ
ートについて複写をつくる。それぞれの場合、１０個の
クローンを一緒に５ｍｌのしブロス培地に移して、増殖
の後にプラスミドＤＮＡをｍ１ｎｉｌｙｓｉｓによって
単離して、未消化のままでアガロースゲルに供する。簡
単に電気泳動をした後、ＤＮＡをサザンブロツティング
によってナイロンフィルターに移動させる。次いで、こ
れらフィルターを予め確立された至適条件下で上記のオ
リゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズさせる。陽性
のプールをこのようにして見出した。

プールにおいて代表されるクローンを一つずつ接種して
、上記の工程を行う。これによって、それぞれの場合に
おいて陽性反応を示すクローンを明瞭に同定することが
可能である。これらの単一クローンから単離されろプラ
スミドは、すべて同一の５ａｌＩフラグメントを含んで
いた。この後の工程は例９に記述と同様に行う。

例１２ サザンＤＮＡ移動 フラグメントにしたＤＮＡを、標準となるＤＮＡの存在
下で０．８％アガロースゲル電気泳動て分画する。泳動
終了の後に、ゲルをプラスチック佃に移して、０．２５
Ｍ塩酸で１５〜２０分間、次いで、変性緩衝液（０，５
ＭＮａＯＨ１１，５ＭＮａＣ１）て２×３０分間および
最後に中和緩衝ｊｉ（ＩＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ８，０
）、１．５ＭＮａＣ１）で２×３０分間下垂装置（ｎｕ
ｔａｔｉｎｇｄｅｖｉｃｅ）上で処理する。それぞれの
場合、緩衝溶液はゲルが充分に覆われるように加える。

次いで、ゲルを二層の吸着紙（Ｗｈａｔｍａｎ、３ＭＭ
）の上において、Ｍａｎｉａｔｉｓら（上記を参照され
たい）の３８５頁に記載の方法でプロッティングを行う
。

ただし、ナイロンフィルター（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ　
Ｐｌｕｓ、ＮＥＮ社製）をニトロセルロースフィルター
の代わりに用いる。プロッティングは、吸着紙をおいて
開始して、少なくとも１６時間行う。移動が完了した後
、ゲルスロットに印付けして、ナイロンフィルターを６
５℃のオーブンに入れる。次いで、フィルターをｌ０Ｘ
ＳＳＣ緩衝液をしみ込ませた吸着紙（Ｗｈａｔｍａｎ、
３ＭＭ）上で柔らかくして、短波長のＵＶ光線を２分間
照射する（ＵＶランプ、Ｄｅｓａｇａ　Ｍｉｎｕｖｉｓ
、波長：２５４μｍ、フィルター／ＵＶ光源の距ｉｆ：
　　１０〜１２ｃｍ）。この間、ＤＮＡを載せたフィル
ターの側面はＵＶ光源から離しておく。照射の後、フィ
ルターを風乾する。

例１３ フィルターと結合したＤＮＡの、ハイブリダイゼーショ
ン ハイブリダイゼーションは、実質的には、Ｇｉｂｃｏ　
ＢＲＬ社出版の雑誌（ｒｆｏｃｕｓＪ　、Ｖｏｌ、　９
、ＮＯ６２，１９８７、ｐ、１−２）に記載の方法にて
行った。

フィルターを前ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘｓ
ｓｃ、２０耐１燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、１０　
Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ、７％ＳＤＳ、１５分間の煮沸に
よって変性させた１００μｇ／ｍ１のサケ精子ＤＮＡ）
で６５℃で少なくとも２時間洗浄する。次いで、デキス
トラン５Ｒ酸溶液（５０％）を最終濃度１０％になるよ
うに加えて、照射性標識したオリゴヌクレオチドを１〜
５　ｎｇ／ｍ１の濃度でハイブリダイゼーション溶液に
加える。

次いて、振盪恒温槽で緩やかに振盪させながら少なくと
も１６時間インキュベーションを行う。個々のインキュ
ベーション温度はオリゴヌクレオチドによって異なるが
、予め最適にしておく。フィルターを洗浄用緩衝？＆Ｉ
（３ＸＳＳＣ１１０ｍＭ燐酸ナトリウム、（ｐＨ７，０
）、１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５％５ＤＳ）中
に置く。ハイブリダイゼーション温度で１時間振盪した
後、洗浄用緩衝液Ｉを洗浄用緩衝液ＩＩ　（ＩＸＳＳＣ
５１％５ＤＳ）で置き換えて、後者を３０分後に代える
。３０分後、新鮮な洗浄用緩衝液■中で湿ったフィルタ
ーをカセット中のＸＨｇ光フィルム（例えば、コダック
Ｘ５１）に露出させる。露出時間は、８０℃で４時間か
ら５日の間である。

例１４ オートラジオグラフィー ハイブリダイズしたフィルターをＷｈａｔｍａｎｎａＭ
Ｍ紙に固定させる。露出を、適当なＸ線フィルム（コダ
ックＸ−ＯｍａｔＡＲ、コダックＸＳ　１）を用いて遮
光したカセットの中で増強スクリーンを用いて一８０℃
で行う。次いて、フィルムを現像する。

例１５ コロニーハイブリダイゼーション プラーク／コロニースクリーンフィルター（Ｃｏ１ｏｎ
ｙ／Ｐｌａｑｕｅスクリーン（登録商標）、ＮＥＮＲｅ
ｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、カタログＮｏ、
ＮＥＦ−９７８／９７８Ａ）を、コロニーの生じている
寒天プレート上に置く。フィルターを２〜３分間後に除
去して、表面に付着している細菌コロニーとともに、先
ず、１０％ＳＤＳに浸したＷｈａｔｍａｎｎ３　Ｍ　Ｍ
紙上に５分間置く。次いで、フィルターを、予め０．５
ＭＮ　ａＯＨｌｌ、５ＭＮａＣ１に浸しておいたＷｈａ
ｔｍａｎｎ　ａ　Ｍ　Ｍ紙に５分間移す。予め０．５Ｍ
）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，０）、１．５ＭＮａｃｌ
に浸しておいたワットマン３ＭＭ紙に５分間新たに移し
て、最後に乾いたＷｈａｔｍａｎｎ　ａ　Ｍ　Ｍ紙に移
す。乾燥後、付着したコロニー残滓をフィルターから除
去するためζこフィルターを緩？訂を夜（３ＸＳＳＣ５
０，１％５ＤＳ）で６５℃で数時間振盪する。

例１Ｇ オリゴヌクレオチドの合成 りＮＡ構築ブロックの合成を、例１０からのオリゴヌク
レオチドを例に用いて説明する。固相合成のために、３
′末端に位置するヌクレオシド、すなわちこの場合には
アデニン、を３゛水酸基を介して担体に共有結合させる
。担体材料は、官能基として長鎖アミノアルキル基を有
するＣＰＧ（：ＪＩ整された有孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏ
ｌ　ｌｅｄ　ｐｏｒｅｇｌａｓｓ））である。次の請合
成工程において、塩基構成分は、５−０−ジメトキシト
リチルヌクレオシド−３−燐酸β−シアノエチルジアル
キルアミドとして用いる。ここで、アデニンはＮ６−ベ
ンゾイル化合物として、シトシンはＮ４−ベンゾイル化
合物として、グアニンはＮ２−イソブアチル化合物とし
て、およびチミンは保護基をもたないかたちで存在する
。０．２μｍｏｌの結合された５−０−ジメトキシトノ
チル−Ｎ６−ペンゾイルー２−デオ、キシアデノシンを
含有する２５ｍｇの重合担体な次のような作用物で連続
的に処理する。

Ａ）アセトニトリル Ｂ）　　３％トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液Ｃ）
アセトニトリル Ｄ）　　５μｍｏｌの適当なヌクレオシド−３−０−フ
ォスファイトおよび２５μｎｏｔテトラゾール（０，１
５ｍ１の無水アセトニトリル溶液） Ｅ）アセトニトリル Ｆ）４０％ルチジンおよび１０％ジメチルアミノピリジ
ンを含有するテトラヒドロフランに溶がした２０％無水
酢酸 Ｇ）アセトニトリル ■）容量比で５：４：１のルチジン／水／テトラヒドロ
フラン混液に溶かした３％イオジンここて「フォスファ
イト」とは、２−チオキリボース−３−モノ燐酸モノ−
β−シアノエチルエステルであフて、第三者をジイソプ
ロピルアミノ基で飽ｆ口させたものである。個々の合成
工程の収率は、それぞれ、デトリチレーション（ｄｅｔ
ｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ）反応Ｂ）によって、分光光度計
で４９６ｎｍの波長でジメトキシトリチル陽イオンの吸
収を測定することによって決定することができる。合成
が完了した後、ジメトキシトリチル基をＡ）〜Ｃ）で記
述したようにして除去する。アンモニア処理によってオ
リゴヌクレオチドを担体から切り放し、同時に、β−シ
アノエチル基を除去する。オリゴマーを５０℃で１６時
間濃アンモニアで処理することによって、塩基からアミ
ノ保護基を定量的に除去する。

このようにして得られる粗生産物を、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって精製する。

例１７ タンパク質配列分析 ＨＰＬＣて精製したタンパク質またはタンパク質フラグ
メントの配列分析を、タンパク質シーケンサ−（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、４７７Ａ）を用
いて行う。

例１８ ＤＮＡ配列分析 ＤＮＡ配列分析を、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４
６３−５４６７．１９７７）によって二本鎖プラスミド
ＤＮＡについて開発されたジブすキシヌクレオチドを用
いるＤＮＡ配列配列決定法（ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ）で、Ｈｅ１ｎｒｉｃｈ（
Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｑｕｉｃｋ　ａｎｄ　
ｓｉｍｐｌｅ　ＰｌａｓｍｉｄＳｅｑｕｅｎｃ　！　ｎ
ｇ、ベーリンガーマンハイム社、１９８６）による降飾
法を用いて行った。り　Ｕ　Ｃベクターからの配列決定
のために用いた「正常」または「反対の（ｒｅｖｅｒｓ
ｅｄ）　Ｊブライマーは、また、ｐＳＶＢベクターから
の配列決定にも用いることができる。配列決定に用いる
ＤＮＡをＣｓＣ１／ＥｔＢｒ勾配によって２回精製する
。

配列決定を、キットとして市販されている試薬、例えば
ベーリンガーマンハイム社によるもの（タレノウポリメ
ラーゼ）など、を用いて行う。

例１９ 配列決定ゲル 配列決定された試料を、６％ポリアクリルアミド／尿素
ゲル上で分画する。ゲルのより下の部分において広域に
分かれるバンドを圧縮するために、また、より上部にお
いて最大に可能な分離能を達成するために、陰極容器に
１Ｍ酢酸ナトリウムな含む泳動緩衝液を入れて、塩勾配
を用いる。

例２０ オリゴヌクレオチドの放射性同位体標識精製したオリゴ
ヌクレオチドの放射性標識の工程は、実質的には、Ｇｉ
ｂｅｏ　ＢＲＬ社出版の雑誌「フォーガス」　（＼’ｏ
１．９、Ｎ０９２．１９８７．１頁）に記載の方法であ
る。２（３０ｎｍでの吸光度１を有する精製脱塩された
オリゴヌクレオチドを４０μｍの再蒸留水に入れて、こ
の１μｍを標準標識反応に用いる。

１５〜２０１１＋の用いられる放射能活性（γ−３２ｐ
−ＡＴＰ、６　、０ＯＯＣｉ　／　ｍｍｏ　Ｉ、Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社製）を濃縮して（
Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ　ａ縮機、Ｂａｃｈｈｏｆｅｒ社製
）、７μｍの再蒸留水に再び入れる。１μｍの１０×キ
ナーゼ緩衝液（０，５Ｍ）リス−ｃｉ（ｐＨ７，６）、
０．１ＭＭｇＣ１２，５０ｍＭＤ’ｌ”Ｔ、１ｍＭスペ
ルミジン、１ｍＭＥＤＴＡ）を加えて、さらに、１１１
１の再ｇ４したオリゴヌクレオチドおよび１μｍのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（約７ユニツト）を加える。

混合物を３７℃で約３０分間インキュベートして、未反
応のＡＴＰをセファデックス０１５カラムで除去する。

このとき、放射性標識されたオリゴヌクレオチドが、携
帯用カウンターによって直接に測定できろ最初の両分と
して主要量の未反応ＡＴＰの前に明瞭に現れる。精製さ
れたオリゴヌクレオチドを次のハイブリダイゼーション
実験に直接に使用する。

例２１ アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの単離泳動緩
衝１夜として酢酸ナトリウムを用いる水平装置のゲル電
気泳動によってＤＮＡを分画Ｌ／た後、目的のＤＮＡフ
ラグメントの位置を長波長ＩＪ　Ｖ光線（３６６ｎｍ）
の下でマーカーフラグメントと比較して決定する。バン
ド幅領域のゲルを約１〜２ｍｍの厚さで切り出して、ゲ
ルを再び装置に戻した後、泳動緩衝液で溝たす。通常の
条件でごく短時間（４５〜６０秒）電気泳動を再び行っ
て、切り出しておいたスポットからピペットで緩衝液を
取り出して、この操作を目的のＤＮＡバンドが完全にゲ
ルから消失するまで繰り返す。ゲルスロットから取り出
した緩衝液を合わせて、フェノール／クロロホルムで抽
出して、溶出されるＤＮＡを、ＴＥ緩緩衝漬方エタノー
ル沈澱の後、通常のように再懸濁させる。

例２２ オリゴヌクレオチド配列の選択 次のようなアミノ酸配列が、リゾチームタンパク質のＮ
末端およびＢ　ｒＣＮフラグメントの配列決定によって
得られる。

Ｎ末端配列： Ａｒｇ　　　　　　　　Ｔｒｐ １ｅ −Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ Ｂ　ｒＣＮフラグメント２： ５ｐ Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−に１−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−−ＡｓｒＩ−
Ｌａｙｓ−ＴｉｅＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−１
１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ｒｌａ−Ａｌａにｌｙ−Ｔｙｒ
−Ａｇｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｘ　−Ａｓｐ１ａ Ｓｅｔ　　　　　Ｉｌｅ ＾ｒｇ−Ｐｈｅ−−Ａｌａ−−Ｔｙｒ Ｖａｌ　　　　　Ａｓｎ Ｂ　ｒＣＮフラグメント３： Ａｌｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘ　−！’ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｒｐ−Ｖａｌ−Δ１ａ−Ｆｉｉｓ−τｒｐ−Ｇ１．ｙ−
Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｐ窒潤 ５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ次のようなオ
リゴヌクレオチド混合物を強調文字で示したアミノ酸配
列物から合成する。

Ｎ末端配列：　Ｇ；ＧＧ／ＣＧＴＧ／ＣＣＡＡ／Ｇ　Ｇ
ＧＧ／ＣＡＴＴ／ＣＧＡＴ／ＣＧＴ またはアンダーラインされた配列についてはＣＡＡ／Ｇ
　ＧＧＮ　　ＡＴＴ／ＣＧＡＴ／ＣＧＴＢ　ｒＣＮフラ
グメント３： ＴＴＴ／ＣＴにＧ　ＧＴＧ／ＣにＣＧ／ＣＣＡＴ／ＣＴ
ＧＧ　ＧＧまたは単一のオリゴヌクレオチド ＴＴＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＧＧＴ
ＴＣＴＧＧ　ＧＴＣＧＣＣＣＡＣ１’ＧＧ　ＧＧＴＴＣ
ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣＣＡＣＴＧＧ　ＧＧＴＴＣＴＧ
Ｇ　ＧＴＣＧＣＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＧＧ記載したオリゴ
ヌクレオチドについて、産生株（ｐｒｏｄｕｃｅｒ　５
ｔｒａｉｎ）のゲノムｂｌｏｔｓとのハイブリダイゼー
ションのいくつかの例で、再現できるシグナルを得るこ
とが可能であった。これは、Ｎ末端領域からの１４ｍｅ
ｒおよびＢ　ｒＣＮフラグメント３から２０　ｍｅｒに
とくに適用される。しかし、対応するオリゴヌクレオチ
ドと同定されたクローンは、正しいものとは証明されな
かった。

Ｂ　ｒＣＮフラグメント２から見出されたアミノ酸配列
は、実験によって著しい相違を示した。しかし、上記の
アンダーラインされた配列は公知の真菌Ｃｈａ　ｌ　ａ
　ｒｏｐｓ　ｉ　ｓからの配列と目立ってよりよく一致
することを、コンピューター比較によって示すことがで
きる。この配列からの以下のオリゴヌクレオチドを、関
連コドンの第３番目の位置におけるＧおよびＣ残基のみ
を考慮して合成する。

５−ＴＴＣＧＣ（Ｇ／Ｃ）ＴＡＣＡＴＣＡＡＧ　ＧＣ（
Ｇ／Ｃ）　ＡＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＡＧ　ＧＧ（Ｇ／Ｃ）　Ａ
Ｃ（Ｇ／Ｃ）　ＡＡＣＴＡＣＡＡ−３産生株のゲノムＤ
ＮＡとのハイブリダイゼーションにおいて、再現性シグ
ナルをこの３８ｍｅｒを用いて得る。オリゴヌクレオチ
ドを用いて、大腸菌の遺伝子バンクからのリゾチーム遺
伝子の同定に成功した。クローニングされた遺伝子のＤ
ＮＡ配列決定によって、ＢｒＣＮフラグメント２の位置
１４においてアミノ酸配列決定によって同定されたアス
パラギン残基がリジン残基に代わっていることが示され
た。

しかし、個々のコドンは第３番目の位置のみで異なって
いることから、このエラーは用いるオリゴヌクレオチド
の結合能に悪影響を及ぼさない。

例２３ 化学的突然変異誘発によるＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ
　ＤＳＭ　３０３０リゾチ一ム欠失変異体、の単離 胞子懸濁液を調製するために、リゾチーム産生性Ｓ、　
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０をＳＭ培地（
２０ｇ／リットルの大豆ミール、２０ｇ／リットルのマ
ンニトール、１８ｇ／リットルの寒天、ｐＨ７，５）を
含む寒天スラント管中で３０℃で少なくとも７日間明瞭
な胞子形成が認められるまでインキュベートする。多管
を、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレエー）（Ｔｗｅｅｎ８０）を加えておいた５
ｍｌの０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液で、超音
波水槽で、２０秒間リンスする。孔サイズ５）ｔｍの滅
菌膜フィルターを通す濾過によって細胞残滓を除去する
。ＰＡ液に含まれる胞子を１０．．０ＯＯＸ　ｇで１０
分間遠心分離して集める。次の化学的突然変異のために
、少なくとも１０６個の胞子を２ｍｌの０．９％（讐／
ｖ）塩化ナトリウムに懸濁させて、８ｍｌのＮ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＣ；
、３ｍｇ／ｍりの′ｒＭ緩衝ｉ＆　（５０ｍｍｏｌ／リ
ットルトリス−マレイン酸、ｐＨ９，０）溶液を加えて
、混合液を遮光して室温で６０分間インキュベートする
。このような条件下で、胞子の生存率約１％が得られる
。胞子を１０，０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心分離して沈
澱させて、各回１０ｍ１の０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナト
リウムで３回洗浄し、次いで、５ｍｌの０．９％（ｗ／
ｖ）塩化ナトリウムに懸濁させて、適当に希釈してＳＭ
栄養培地プレート上にひろげて、３０て少なくとも５日
間インキュベーＩ・する。得られるコロニーを５Ｍ寒天
ブロック（０，５ｃｍ直径）に移して、加湿キャビネッ
ト中で３０℃で５日間インキュベートする。次いで、ブ
ロックをミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）試
験寒天を含むプレートに移して、加湿キャビネッ！・中
で３０℃でさらに１６時間インキュベートする。

リゾチーム試験寒天を、Ｏ、ｌ　ｍｏｌａｒ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５，０）に懸濁した凍結乾燥Ｍｉｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ　ＡＴＣＣ４（３９８（
ベーリンガーマンハイム社製）　　（０，４ｍｇ／ｍｌ
）から調製する。これは、Ｕｌ　ｔ＋・ａｔｕ＋・ｒａ
Ｘ処理によって５分間均質化され、使用の前に、６０℃
で３０分間、次いで４２℃で１５分間インキュベートし
て、０．９％寒天を加えておいたものである。

細胞外プロテアーゼの作用は、用いるミクロコツカス試
験寒天において、コロニーに直接に接する清澄なゾーン
の形成によって示させる。リゾチームは、その外側に接
して別の濁ったゾーンを形成する。

調べた１０，０００個のコロニーから、もはや濁った融
解ゾーンを示さないＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳ
Ｍ　３０３０リゾチ一ム陰性突然変異体の一つを単離し
た。後者を適当な３Ｍ栄養培地プレートから５０ｍｍｏ
ｌ／リットルＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０）を加えた栄養
溶液（１００ｍ１）に移して、そのリゾチーム産生性を
、３０℃で３．５．７．１０日間振盪後、ＤＥ３４４０
７３５に記載のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ
を用いる濁度測定法によって決定した。単離された突然
変異体は、ＳＭ栄養溶液中でのプロトプラスト形成後の
反復振盪培養試験およびベクターｐｃＭ４（ＥＰ０２５
７４１？）での形質転換でも示されるように、安定して
いる。

例２４ 物理的突然変異誘発によろＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ
　０５Ｍ４９１３のリゾチーム欠失変異体、の単離例２
３のようにして、少なくとも１０６個のＳ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の胞子を５ｍ
ｌの９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０１％（
Ｗ／Ｖ）ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート （Ｔｗｅｅｎ８０）に懸濁させて、濾過胞子懸濁液を調
製した。次のＵＶ突然変異に用いられる工程を、記載の
方法（Ｈｏｐ讐ｏｏｄ　Ｄ、　Ａ、ら：上記を参昭、３
７〜３８頁）で行う。このためのＵＶ光線（２５４ｎｍ
）による照射時間は、得られる生存率が２％になるよう
に選択した。照射された胞子を、適当な希釈で３Ｍ栄養
培地プレート（例２３を参照されたい）上にひろげて、
３０°Ｃて少なくとも５日間インキュベートする。

得られるコロニーを５Ｍ寒天ブロック（０，５ｃｍ直径
）に移して、加湿キャビネット中で３０℃で５日間イン
キュベートする。フ゛ロックをミクロコツカス試験寒天
（例２３を参照されたい）を含むプレートに移して、加
湿キャビネット中で３０℃でざらに１６時間インキュベ
ートする。調べた７゜０００個のコロニーから、ミクロ
コツカス試験プレート上で濁った融解ゾーンを示さない
リゾチーム突然変異体、Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　
ＤＳＭ　４９１３を単離した。

この変異体は、５０ｍｍｏｌ／リットルＦ（ＥＰＥＳ　
（ｐＨ７，０）を加えた５Ｍ栄養溶液（例２３を参照さ
れたい）中での反復振盪培養試験、ブロトブラスト形成
後およびベクターｐ　ＣＭ　４　（ＥＰ　０２５７１！
＋７）を用いる形質転換後でさえも安定であることが証
明された。

例２５ Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ株のプロトプラストの調製
および形質転換 例２４のようにして単離したリゾチーム陰性突然変異体
Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　４９１３を５０
ｍ１のＣａ５ｏ栄養溶液（１７ｇ／リットルのカゼイン
からのペプトン、３ｇ／リッＩ・ルの大豆ミールからの
ペプトン、２．５ｇ／リットルのグルコース、５ｇ／リ
ットルの塩化ナトリウム、２．５ｇ／リットルの燐酸水
素二カリウム）で３０℃で３日間振盪する。この培養物
の５ｍｌを５０ｍ１の５ｇ／リットルのグリシンを添加
したＣａ５ｏ栄養溶液に移して、３０°Ｃて約４５時間
定常増殖間に達するまで振裏する。

細胞菌糸体を、最後にガラスホモゲナイザーで分別（ｄ
ｉｖｉｄｅ）　シて、５，０ＯＯＸ　ｇて１０分間遠心
分離する。細胞を２５ｍ１のＰ緩衝ｍ　（）Ｉｏｐｗｏ
ｏｄ　Ｏ。

へ、ら：　ｐ、２４５、上記を参照されたい）で洗浄し
て、５、ＯＯＯ’Ｘｇで１０分間遠心分離して、１２．
５ｍｔのＰ緩衝液に入れる。１２．５ｍｌの２ｍｇ／ｍ
ｌの鶏卵リゾチームのＰ緩衝液溶液を加えて、顕微鏡に
よる検鏡によって菌糸体がプロトプラストにまで充分に
崩壊していることが示されるまで室温で約４０分間緩や
かに振盪する。２５ｍ１のＰ緩衝液を加えて、脱脂綿を
通して濾過する。濾液を３，０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠
心分離して、沈澱したプロトプラスＩ・を２ｍｌのＰ緩
衝液に再懸濁させて、２０　ＯＩｔ　ｌずつに分けて一
８０℃で凍結させる。

形質転換において、融解した２　００　）ｔ　ＩのＳ、
　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　４］３プロトプラス
トを、チオスｊ・レブトン耐性をコードする２０μｍの
プラスミドＤＮＡ（ｌｎｇ〜１μｇのＤＮＡと対応する
）と５００　／ｌｌのＴ緩衝？ａ　（Ｈｏｐｗｏｏｄ　
Ｄ、　Ａら：　ｌ）、２４Ｇ、上記を参照されたい）と
共に混合して、直ちに７枚のＲ２ＹＥプレート（Ｈｏｐ
ＸＪｏｏｄ　Ｄ、　Ａ、ら：ｐ。

２３６、上記を参照されたい）にひろげて最初の重量の
７０％になるまで乾燥する。次いて、予め４２°Ｃに暖
めておいた修飾されたＲ３軟寒天４ｍｌを重層して、蓋
無しで滅菌作業台（クラス２）のまん中で４時間乾燥さ
せる。修飾されたＲ３軟寒天［Ｓｌ＋１ｒａｈａ＋ｎａ
　　ら：　　Ａｇ＋’ｉＣ，Ｂｉａｌ、　　ＣＩ＋ｅｍ
、　　４５、１２７１−１２７３　（１９８１）］は、
１７１　ｇ／リットルのスークロース、Ｌｏｇ／リット
ルのグルコース、４ｇ／リットルのバクトベブトン、４
ｇ／リットルの酵母エキス、０．５ｇ／リットルの塩化
カリウム、８．１ｇ／リットルの塩化マグネシウム、２
，２ｇ／リットルの塩化カルシウム、０．２ｇ／リット
ルの燐酸二水素カリウム、４ｇ／リットルの寒天、２５
ｍｍｏｌ／リットルのＴＥＳ緩衝７夜（Ｎ−トリス［ヒ
ドロキシメチルコータチル−２−アミノエタンスルホン
酸、ｐＨ７，２）を含む。接種して乾燥させたプレート
を３０°Ｃで２４時間インキュベートして、ジメチルス
ルホキシドに溶解したチオストレプトン（２００Ｉｚｇ
／ｍｌ）を加えて４２°Ｃに予め加温しておいたＮＢ軟
寒天（３ｇ／リットルのバクトビーフエキス、５ｇ／リ
ットルのバクトベプ１ン、６ｇ／リットルの寒天）の２
．５．ｍｌを重層して、３０°Ｃで少なくともされに６
日間インキユヘートする。

例２Ｇ ヘクターブラスミトの単離 ベクターｐＧＭ４　（第３図）を、ＥＰ　０２５７４１
７に記載の方法て、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｈａ
ｎａｅｎｓｉｓ　ＤＳＭ２９３２からのプラスミドｐｓ
ｃｓから調製して、Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　４９１３を形質転換さ
せて、Ｄ、Ａ。

ＨＯｐｗｏｏｄら：（〕。８５（上記を参照されたい）
に記載の方法で単離する。

ベクターｐＥＢ１！５（第４図）は、Ｓ。

Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ　ＤＳＭ　４０７５５から得られ
るプラスミドｐ　Ｓ　ＶＨ１（ＥＰ　００７０５２２）
に由来する。

ｐｓＶＨｌの２．５ｋｂおよび３．Ｏｋｂの大きさの二
つの８ｇｌｎフラグメントを除去して、１．１ｋｂの大
きさでチオストレプトン耐性をコードする、ベクターｐ
ＳＬＥ４１　（ＤＥ　３４１２０９３）からの、Ｂ＋：
ＩＩフラグメントで置き換える。その結果、８．１５ｋ
ｂの大きさのベクターｐＥＢ２が得られる（　Ｗｏｈｌ
　１ｅｂｅｎ　Ｗ、　ら：　（１９８５）　Ｉｎ：　Ｓ
ｉｘ　Ｉｎｔ、　Ｓｙｍｐ。

ｏｎ　Ａｃｔｕ＋ｏｍｙｃｅｔｅｓ　ＢｉｏｌｏｇｙＳ
Ｓｚａｂｏ　Ｇ、　Ｂｉｒｏ　Ｓ、、にｏｏｄｆｅｌ　
ｌｏｗ　Ｍ、ｆＪＷ集９９−１０１．　Ａｋａｄｅｍｉ
ａｉ　Ｋｉａｄｏ。

Ｂｕｄａｐｅｓｔ）。

ｐＥＢ２の４．（３ｋｂのＳｓ　ｔＩＩフラグメントを
、ネオマイシン耐性（ＡＰ　Ｈ−Ｉ　）をコードする、
プラスミドｐＬ　Ｊ　６８００１ｏｐｗｏｏｄ　Ｄ、Ａ
ら：　１１．２９８、上記を参照されたい）の、１．Ｏ
ｋｂのＳｓ　ｔＩＩフラグメントに連結させる。その結
果、５．７ｋｂのプラスミドｌ）　Ｅ　Ｂ　３が得られ
る。次いで、ｐＥＢ３の部分的５ａｕ３Ａ消化によって
ｌ）　Ｓ　Ｖ　Ｈ１の最小のレプリコンを２．４ｋｂフ
ラグメントに配置することができる。

５　、１　ｋｂのベクタープラスミドｐＥＢ１５（第４
図）はこのフラグメント、さらに、チオストレプトン耐
性をコードする、ｐ　５ＬＥ４１　（ＤＥ　３４１２０
９３）の１．１ｋｂのＢｅ１ｌフラグメント、およびプ
ラスミドｐ　Ｉ　Ｊ　７０２　［Ｈｏｐｗｏｏｄ　Ｄ、
Ａら：ｐ。

２９２、前出、Ｂｅｒｎｏｎら：　Ｇｅｎｅ　３７．１
０１−１１０　（１９８５）］のチヲシナーゼをコード
する１、６ｋｂのＢｃｌｌフラグメントを隣接して含む
。

ベクタープラスミドｐＥＢ１５でＳ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　４９１３を形質転換さ
せると、Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　４９１４が得られろ。

Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＤＳＭ　４９１４は、Ｄｅ
ｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕｒ　Ｍｉｋｒｏ
ｏｒ３ａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ
ｅｎに寄託されている。

ｐＥＢ　１５を、Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ
　４９１４からＨｏｐｗｏｏｄ　Ｄ、Ａら：　ｐ、８５
による記載の方法で同様に単離した。

例２７ Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の５ａ
ｕ３Ａ　ＤＮＡフラグメントの、リゾチーム欠失突然変
異体ＤＳＭ４９１３へのクローニング リゾチーム産生性Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ
　３０３０の全ＤＮＡをり、Ａ、ｔｌｏｐｖｏｏｄら（
ｐ、７９、前出）による記載の方法で単離して、制限エ
ンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａ（例７を参照されたい）で
不完全に切断して、０．７％アガロースゲル上で分画の
後、２．８ｋｂから１５ｋｂのフラグメントを単離した
（例２１を参照されたい）。

例２６のようにして単離されたベクタープラスミｌ；　
Ｉ）　Ｅ　Ｂ　１５を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌｎ
（例１を参照されたい）で完全に切断して、例２のよう
に脱燐酸化する。０．１μｇのＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌ
ｏ＋°の単離されたＳａ　ｕ　３　Ａフラグメントと０
．０５７１３のＢｇｌＩＩで切断されて脱燐酸化された
ｐＥＢ１５ＤＮＡを次のりガーゼ反応（例３を参照され
たい）に用いる。

次いで、例２５に記載の方法によって、例２４のように
して単離されるリゾチーム欠失突然変異体のブａドブラ
ストの形質転換に用いる。

例２８ Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の３．
３ｋｂのＳｍａＩＤＮＡフラグメントの、リゾチーム欠
失突然変異体ＤＳＭ４９１３へのクローニング リゾチーム遺伝子に特異的な３８ｋｂのオリゴヌクレオ
チドプローブ（例１０を参照されたい）によって同定し
ておいた、Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０
３０の全ＤＮＡの、３．３ｋｂのＳｍａｌフラグメント
を例２１に記載の方法で単離した。

ベクターｐ　０Ｍ４　（ＥＰ　Ｏ，２５７，４１７）を
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで完全に切断して、
突出末端をフラグメント（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、ら：
　ｐ、１１３、前出）、アルカリフォスファターゼ（例
２を参照されたい）で処理して、Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏ
ｌｏｒＤ　Ｎ　Ａの、３．３ｋｂの大きさの単離された
ＳｍａＩフラグメントにＴ４ＤＮＡリガーゼによって連
結させる（例３を参照されたい）。次いで、リガーゼ混
合物でＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　４９１３
のプロトプラス！・を形質転換させる（例２５を参照さ
れたい）。

例２９ リゾチーム産生性を補足する突然変異体の検出例２７ま
たは例２８のようにして得られたＳ。

ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒクローンを、３０μｇ／ｍｌの
チオストレプトンを加えておいた９Ｍ栄養培地のブロッ
クに移して、加湿キャビネットで３０℃で５日間インキ
ュベートした後、リゾチーム試験寒天（例２３をり照さ
れたい）上に移す。加湿キャビネットで３０℃で１６時
間インキュベートした後、例２７のようにして得た１、
５００個のクローンの一つおよび例２８のようにして得
た１５０個のクローンの一つで、野生型Ｓ、　ｃｏｅｌ
ｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０のリゾチーム産生に相
当する産生がミクロコツカス試験寒天上の濁った融解ゾ
ーンの形成によって明瞭に示された。

例３０ リゾチーム産生性クローンのプラスミドの単離および特
徴付は プラスミドｐｃｅｌｌおよびｐｃｅ１２を、Ｈｏｐｗｏ
ｏｄ　Ｄ、Ａら（ｐ、８５、前出）に記載の方法で、そ
れぞれ例２８および例２７のようにして得られたリゾチ
ーム産生性Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒクローンから単
離して、制限酵素地図作出（第３図および第４図）によ
って特徴付けをした。プラスミドｐｃｅｌｌ（第３図）
は、ＢａｍＨＩで切断してから突出末端を埋填しておい
たベクターｐＧＭ４に挿入されたＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏ
ｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の全ＤＮＡの、Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０リゾチーム（
ｌｙｓ）をコードする、３．３ｋｂのＳｍａｌフラグメ
ントを含む。

ベクター１）０Ｍ４は、Ｓ、　ａｚｕｒｅｕｓからのチ
オストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）およびＳ、　ｆｒ
ａｄｉａｅからのネオマイシン耐性遺伝子（ａ　ｐ　ｂ
　Ｉ　）を含む。プラスミドｐｃｅ１２（第４図）は、
Ｂｇｌ［Ｉで切断されたベクターｐＥＢ　１５にクロー
ニングされたＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３
０３０の全ＤＮＡの、Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ｄ
ＳＭ　３０３０リゾチーム（ｌｙｓ）をコードする２、
９ｋｂの５ａｕ３Ａフラグメントを含む。ベクターｐＥ
Ｇ１５は、Ｓ。

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓからのチロシナーゼ遺伝子（
ｔｎｅｌ）およびＳ、　ａｚｕｒｅｕｓからのチオスト
レプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）を含む。

例３１ リゾチームをコードするプラスミドの、Ｓ、　１ｉｖｉ
ｄａｎｓおよび種々のＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｆｏｒ株へ
の移入プラスミドｐｃｅｌｌおよびｐｃｅ１２（例３０
を参照されたい）のそれぞれて、例２３及び例２４のよ
うにして得たＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　０５Ｍ　３
０３０リゾチ一ム欠失突然変異体を形質転換させた（例
２５を参照されたい）。５０ｍｍｏｌ／リットルのＨＥ
ＰＥＳ、ｐＨ７，０、および３０Ｍｇ／ｍｌのチオスト
レプトンを添加しておいた３Ｍ栄養溶液中での次の振盪
培養試験（例２３を参照されたい）において、調べた形
質転換体の全てで野生型Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０のリゾチーム
産生に相当するリゾチーム産生性が光度測定試験法（Ｄ
Ｅ　３４４０７３５）によって認められた。

Ｃ，Ｊ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ら［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　１５１．６６８−６７７　（１９８２）］の記
載による方法によって二つのプラスミドをそれぞれＳ、
　ｌ　１ｖｉｄａｎｓＴ　Ｋ　Ｅ３４　（Ｈｏｐｗｏｏ
ｄら：　ｐ、２６６、前出）に移動させることが可能で
あった。しかし、単離された形質転換体は、５０ｍｍｏ
ｌ／リットルのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０）および３０
Ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンをそれぞれ含むＣａ５ｏ
栄養溶液（例２５を参照されたい）またはＳＭ栄養溶液
のいずれにおいても光度測定試験法（ＤＥ　３４４０７
３５）で検出できるリゾチーム産生を示さなかった。

一方、例３０のようにして単離したプラスミドｐｃｅｌ
ｌまたはｐｃｅ１２の一つによってＳ、　ｃｏｅｌｉｃ
ｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０を形質転換させた場合には
、　　５０ｍｍｏｌ／リットルのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７
，０）および３０Ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを加え
ておいた５Ｍ栄養培地を用いる続く振盪培養試験におい
て、出発株よりも２〜３倍の高いリゾチーム収量を得る
ことが可能である。抗生物質チオストレプトンが存在し
ない場合には、同じリゾチーム産生の増加がＳＭ培地で
達成される。

例３２ 安定性・試験 プラスミドｐｃｅ１２（例３０を参照されたい）を含む
Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｆｏｒ　ＤＳＭ　３０３０を、５
０ｍｍｏｌ／リットルのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０）を
含む抗生物質無添加ＳＭ栄養溶液中で３０℃でｌＯ日間
振盪する。サンプル それぞれを適当に希釈して、３０ｔｔｇ／ｍｌのチオス
トレプトン添加または無添加ＳＭ栄養培地を含む５枚の
栄養培地プレートに塗布する。３０℃で７日間のインキ
ュベーションの後、同じ細菌力価（ｔｉｔｅｒ）が二つ
のタイプのプレートでそれぞれ見出される。チオストレ
プトンを含まないＳＭ栄養培地プレートのそれぞれから
の５００個のコロニーを３０７１ｇ／ｍｌのチオストレ
プトンを含むＳ　Ｍ栄養培地プレートに移す。３０で７
日間インキユヘートシた後、同数のコロニーを両タイプ
のプレート上で見出すことが可能であった。

例３３ Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０からの
リゾチーム遺伝子の前への、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓからのチロシナーゼ遺伝子
のプロモーター領域のクローニング 例３０のようにして単離したプラスミドｐｃｅ１２（第
４図）を制限エンドヌクレアーゼＡ　Ｖ　ａ　Ｉで完全
に切断して、突出末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＴ（
フレノウフラグメント）（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、ら：
前出、ｐ、目３）で埋填する。得られる１、２ｋｂＤＮ
Ａフラグメントを例２１？こ３己載の方法で単離する。

ベクタープラスミドｐ　Ｅ　Ｂ１５（例２６を参照され
たい）を酵素ＢｇＩＩＩて完全に切断して、突出末端を
埋填して、脱燐酸化（例２を参照されたい）して、ｐｃ
ｅ１２（例３を参照されたい）からの１．２ｋｂの大き
さの単離されたＤＮＡフラグメントと連結させる。リガ
ーゼ混合物でＳ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　４
９１３　（例２５を参照されたい）を形質転換させて、
得られる形質転換体を３０７１ｇ／ｍｌのチオストレプ
トン添加５Ｍ栄養培地く例２３を参照されたい）を含む
寒天ブロックに移して、加湿キャビネットで３０℃で５
日間インキュベートする。次いで、ブロックをミクロコ
ツカス試験寒天（例２を参照されたい）を含むプレート
上に移して、加湿キャビネットで３０℃でされに１６時
間インキュベートする。ブラスミ１’　Ｄ　Ｎ　Ａを、
Ｄ、Ａ、　Ｈｏｐｗｏｏｄ　ら：前出、ｐ、８５に記載
された方法で、試験寒天上の濁った融解ゾーンの形成に
よフて認められるリゾチーム産生性形質転換体から単離
して、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＵて完全に切断す
る。２．１ｋｂとｑ、２ｋｂのＰｖｕＪＩフラグメント
を有するプラスミドｐＣｅ１３（第４図）を単離する。

リゾチーム遺伝子（ｔｙｓ）の位置方向は、ｐｃｅ１３
の得られるｐＶｕＵフラグメントの大きさによって第４
図のように確立される。チロシナーゼ遺伝子（ｍｅｔ）
のプロモーター領域を、そのプロモーターとシグナル配
列とともにｐｃｅ１３のリゾチーム遺伝子の前に位置さ
せる。プラスミドｐｃｅ１３でＳ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＤＳＭ　３０３０　（Ｃ，Ｊ、
　Ｔｈｏｍｐｓｏｎら：　１９８２、Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、　１５１．６６８−６７７）を形質転換させ
る。

このようにして得られる形質転換体は、５０ｍｍｏｌ／
リットルのＨＥＰＥＳ　（ｒ）Ｂ７．Ｏ）を含む３０μ
ｇ／ｍｌのチオストレプトン添加および無添加のＳＭ培
地を用いる振盪培養試験（例２３を参照されたい）にお
いて、それぞれの場合、出発株Ｓ、　ｃｏｅｌｉｃｏｌ
ｏｒ　ＤＳＭ　３０３０の３〜５倍高いりゝゾチーム産
生性を示す。

区である。

第４図は、ベクターｐＥＢ１５を図示する、説明図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）次の配列 ５′−ＴＴＣＧＣ（Ｇ／Ｃ）ＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣ（
   Ｇ／Ｃ）ＡＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＡＧＧＧ（Ｇ／Ｃ）ＡＣ（Ｇ
   ／Ｃ）ＡＡＣＴＡＣＡＡ−３′のオリゴヌクレオチドプ
   ローブとハイブリダイズする、および／または ｂ）形質転換後、リゾチーム欠失突然変異 体ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＤＳ
   Ｍ４９１３を補足する、ストレプトミセスからのリゾチ
   ーム遺伝子。 ２、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｂｅｄａｅまたはＳ
   ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｍ■ｌ
   ｌｅｒ）からの、請求項１に記載のリゾチーム遺伝子。 ３、Ｓ．ｌａｂｅｄａｅＤＳＭ４１５１７またはＳ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＤＳＭ３０３０からの、請求項２
   に記載のリゾチーム遺伝子。 ４、１．２ｋｂのＡｖａｌフラグメント上に位置してい
   る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリゾチーム遺
   伝子。 ５、表１に示される配列を有する、請求項４に記載のリ
   ゾチーム遺伝子。 ６、表２に示される配列を有するリゾチーム遺伝子。 ７、ヘテロなコントロールまたはシグナル配列を上流ま
   たは下流に位置させた、請求項６に記載のリゾチーム遺
   伝子。 ８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕ
   ｓからのチロシナーゼ遺伝子のプロモーター領域を上流
   に位置させた、請求項７に記載のリゾチーム遺伝子。 ９、請求項１〜８のいずれか１項に記載のリゾチーム遺
   伝子を含む、ハイブリドベクター。 １０、請求項９に記載のハイブリドベクターを含む、微
   生物。 １１、請求項１０に記載の微生物によって発現させたリ
   ゾチーム。 １２、リゾチーム欠失突然変異体Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
   ｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＤＳＭ４９１３。 １３、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ
   。 ５′−ＴＴＣＧＣ（Ｇ／Ｃ）ＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣ（
   Ｇ／Ｃ）ＡＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＡＧＧＧ（Ｇ／Ｃ）ＡＣ（Ｇ
   ／Ｃ）ＡＡＣＴＡＣＡＡ−３′１４、プラスミドｐＥＢ
   １５を含むＳ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＤＳＭ４９１４。