JPH0348800B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はモノクローナル抗体に関する。更に詳
しくいえば、本発明はラツト免疫グロブリンに対
するモノクローナル抗体、その製造方法およびそ
の利用法に関するものである。

従来の技術 近年、主としてマウスの免疫系細胞を使い、そ
の各種表面抗原に対する抗体を利用して免疫系の
働きや免疫疾患発症の機序を解明する研究が大き
く進歩した。

即ち、免疫系細胞はその表面に各種の抗原を持
つており、それらの表面抗原は免疫系細胞の種
類、機能、分化の程度等により変化するので、そ
れらの表面抗原の各々に対するモノクローナル抗
体を用いて各種表面抗原の有無を調べることによ
り、免疫系細胞の同定（タイピング）を簡単に行
なえる様になつたことが、免疫学の基礎研究に大
きく貢献している。

マウスの免疫系細胞表面抗原に対する抗体の大
部分はマウスの免疫系細胞をラツトに免疫して得
られたもので、現在も同様な方法で新しい免疫系
細胞表面抗原に対する抗体の開発が盛んに行なわ
れている。

これらの抗体を用いて、マウスの免疫系細胞表
面抗原を調べる方法として、従来、これらの抗体
にFITC（フルオレセイン・イソチオシアネート）
やPE（フイコエリスリン）等の螢光色素、HRPO
（西洋ワサビペルオキシダーゼ）やAP（アルカリ
性フオスフアターゼ）等の酵素、もしくは¹²⁵I、
¹⁴C、³H等の放射性同位元素のいずれかを標識し、
表面抗原に反応した抗体を検出する免疫測定法が
用いられている（「免疫学実験入門」、標識抗
体法；学会出版センター，1981年）。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、上記ように抗体に螢光色素、酵
素あるいは放射性同位元素を標識する場合には、
検出値を最適とする様に、抗体と標識物質との結
合比率を前もつて決定するための試験を行なう必
要があり、これは極めて手間のかかる作業であ
る。また、免疫系細胞のタイピングを行なう際に
は複数の抗体を用いることが多いが、それらの抗
体のすべてを標識し、しかも夫々に対して同程度
の検出感度を達成し得る様にすることは極めて煩
雑であると共に困難であるという問題があつた。

更に、標識物質を結合することにより抗体の反
応性が低下することもあり、このような場合は、
高い検出感度で精度の良いデータを出すことは困
難であつた。

前記の様にマウスの免疫系細胞表面抗原に対す
る抗体の大部分はラツト由来のものである。従つ
て、ラツトの抗体（免疫グロブリン）のすべてに
反応し、しかもマウスの免疫系細胞および免疫グ
ロブリンと交差反応しない抗ラツト免疫グロブリ
ン・モノクローナル抗体があれば、マウスの免疫
系細胞表面抗原の検出は容易かつ正確なものとな
る。

即ち、上記のような特性のモノクローナル抗体
にFITC、PE等の螢光色素、HRPO、AP等の酵
素もしくは¹²⁵I、¹⁴C、³H等の放射性同位元素のい
ずれかを、適当な比率で結合させた標識抗体を用
意しておけば、ラツト由来の表面抗原に対する抗
体は標識を行なわずに検体にそのまま反応させ、
その後に上記の標識モノクローナル抗体を二次抗
体として反応させることにより、容易に免疫系細
胞の表面抗原を検出できる。この方法を用いれ
ば、従来の様にすべてのラツト由来の抗体の各々
に標識を行なう必要が無くなり、極めて便利にな
る。しかもどの抗体を用いても、同じ感度で正確
な反応結果が得られるという利点がある。

これ迄にも同様の目的でラツト免疫グロブリン
に特異的に反応するモノクローナル抗体を作り出
す試みはなされているが、ラツトとマウスは近縁
種であるため、マウス以外のラビツト等を免疫感
作動物として用いた場合はラツト免疫グロブリン
とマウスの免疫系細胞表面にあるマウス免疫グロ
ブリンのいずれに対しても交差反応する抗体しか
得られず、上記のような目的には使えなかつた。
更に、マウス免疫系細胞への交差反応を無くする
ために、マウスを免疫感作動物として用いた例も
あるが、その場合はラツト免疫グロブリンに反応
するモノクローナル抗体が出来にくく、うまくラ
ツト免疫グロブリンに反応するモノクローナル抗
体が取れても、一部のラツト免疫グロブリンにし
か反応しなかつたり、反応性が弱く従来の方法と
比べて検出感度が劣るために、あるいはやはりマ
ウス免疫グロブリンへの交差反応が見られるため
に、実用的なものでなかつた。

このような状況の下で、上記の如きラツトの抗
体（免疫グロブリン）のすべてと反応し、かつマ
ウスの免疫系細胞および免疫グロブリンと交差反
応しない抗ラツト免疫グロブリン・モノクローナ
ル抗体を得、またこれを工業的に生産し得る方法
を開発することは意義深いことであるが、このよ
うなものは今のところ知られていない。

そこで、本発明の目的は上記のようなラツト免
疫グロブリンに対するモノクローナル抗体を提供
することにあり、更に、該モノクローナル抗体を
工業的に生産する方法を提供すること、並びに該
モノクローナル抗体を利用した免疫測定法（イム
ノアツセイ法）を提供することも本発明の重要な
目的を構成する。

問題点を解決するための手段 このような状況の下で、本発明者等は上記の如
き目的とする特性のラツト免疫グロブリンに対す
るモノクローナル抗体を得るべく種々検討、研究
した結果、ラツトの抗体で感作した特定のマウス
の脾細胞と骨髄腫（ミエローマ）細胞との融合細
胞、即ちハイブリドーマを使用することが有利で
あることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明のモノクローナル抗体は、ラツト
免疫グロブリンのアイソタイプIgG₁、IgG_2a、
IgG_2b、IgG_2cおよびIgMのすべてに反応するもの
であり、特にアイソタイプIgG₁に属するもので
ある。

このようなモノクローナル抗体は本発明によれ
ば以下のようにして製造することができる。即
ち、ラツト免疫グロブリンで免疫感作されたマウ
スの脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合して、
ラツト免疫グロブリンに対して特異的なモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを得、該ハイブリ
ドーマを培養することにより目的のモノクローナ
ル抗体を量産し得る。

上記本発明の方法においてハイブリドーマの形
成は、融合に用いる細胞の調製、ポリエチレング
リコールによる細胞融合、クローニング（例えば
限界希釈法）等の一連の工程からなる従来公知の
技術に従つて得ることができる。

上記ハイブリドーマを得るために用いる脾細胞
としては特にラツトとはアロタイプの異なる
C57BL／６マウスが好ましい。これによつてラ
ツト免疫グロブリンのすべてに対して反応し、し
かもマウスの免疫系細胞とは交差反応しないモノ
クローナル抗体を得ることができる。一方、脾細
胞と融合すべきミエローマ細胞としては従来公知
の各種のものが利用できる。

得られたハイブリドーマの培養はin vitro、in
vivoのいずれも可能であり、例えばマウスの腹腔
内あるいはRPMI1640、イーグルMEM、などの
各種培地中で行うことができ、生成モノクローナ
ル抗体の精製は塩析法、カラムクロマトグラフイ
ー法、電気泳動法等の各種方法を適当に組合せる
ことにより行う。

かくして得られる本発明のモノクローナル抗体
は既に述べたようにラツト免疫グロブリンのアイ
ソタイプのすべてと反応し、しかもマウスの免疫
系細胞並びに免疫グロブリンと交差反応しないも
のであることから、特にマウス免疫系細胞の表面
抗原を調べるのに適している。

作 用 以上述べてきたように、免疫系細胞の同定を行
う上で、各種表面抗原に対する抗体を使用するこ
とが有利であり、従来からこのような各種方法が
提案されてきた。しかしながら、従来使用されて
いるこの種の抗体の大部分はマウスの免疫系細胞
をラツトに免疫して得られたラツト由来のもので
あることから、ラツト抗体全てに反応し、かつマ
ウスの免疫系細胞および免疫グロブリンと交差反
応しない抗ラツト免疫グロブリン・モノクローナ
ル抗体の開発が望まれていた。

そこで、このようなモノクローナル抗体を作製
する試みがなされたが、ラツトとマウスとが近縁
種であることから目的とする抗体は得られなかつ
た。更に、マウスを免疫感作動物として使用して
も、実用的なモノクローナル抗体は得られなかつ
た。

このような状況の下で、本発明者らは上記の失
敗例における原因がマウスへのラツト免疫グロブ
リンの免疫感作の方法にあると判断し、ラツト
（アロタイプａ）とは、アロタイプの全く異なる
マウスC57BL／６（アロタイプｂ）をラツト免疫
グロブリンの免疫感作動物として用いることによ
り、即ちマウスの免疫系がラツト免疫グロブリン
を異物（抗原）として認識しやすい形で免疫感作
を行なうことにより、ラツト免疫グロブリンのア
イソタイプIgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG_2cおよび
IgMのすべてに極めて高い特異的反応を示し、ラ
ツトとは近縁種であるマウスの免疫系細胞表面抗
原およびマウス免疫グロブリンには反応しないモ
ノクローナル抗体を作り出すことに成功したもの
である。

かくして得られた本発明のモノクローナル抗体
はラツト免疫グロブリンのアイソタイプのすべて
に特異的に反応し、しかもマウスの免疫系細胞お
よび免疫グロブリンと交差反応しないものである
ので、マウスの免疫系細胞表面抗原を調べる免疫
測定法（イムノアツセイ法）において有利に使用
でき、その第１の方法は、既に述べたように、本
発明のモノクローナル抗体を螢光色素、酵素もし
くは放射性同位元素で標識し、ラツト由来の抗体
もしくは抗血清に対する二次抗体として用いる免
疫測定法において使用できる。

本発明のモノクローナル抗体を用いた別の測定
法としては、上記モノクローナル抗体にビオチン
を結合させたものを用意しておけば、これを同様
に二次抗体として用い、さらに上記の各種標識物
質のいずれかとアビジンもしくはストレプトアビ
ジンの結合物質を加えてビオチンと反応させるこ
とにより、容易に免疫系細胞の表面抗原を検出で
きる。この方法を用いれば、上記モノクローナル
抗体にビオチンを結合させておくだけで、免疫測
定法が変わつてもそれに適した標識物質とアビジ
ンもしくはストレプトアビジンの結合物質を選ぶ
ことにより対応することができ、さらに便利であ
る。

かくして、本発明のモノクローナル抗体は、表
面抗原に反応するラツト由来の複数の抗体に標識
物質を結合する手間を省き、安定かつ高検出感度
の免疫測定法を実現することを可能とする。

実施例 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明
するが、本発明の範囲は以下の例により何等限定
されるものではない。

本発明のラツト免疫グロブリンに対するモノク
ローナル抗体の製造手順は次の通りである。

(a) 動物への免疫感作および抗体産生細胞の調製 C57BL／６マウスに正常ラツト血清から精製
したラツト免疫グロブリンを免疫感作し、感作マ
ウスの脾細胞を調製して細胞融合に用いた。

ラツト免疫グロブリンの精製方法：45％硫安塩
析法およびゲル濾過法を用いてラツト血清中のア
ルブミン等の免疫グロブリン以外の成分を取り除
き、さらにプロテインＡアフイニテイーカラムを
用いて免疫グロブリンを精製濃縮した。

免疫方法：PBS（リン酸緩衝食塩水）に溶かし
たラツト免疫グロブリンにコンプリート・フロイ
ンド・アジユバンドを加えたものを４週令の
C57BL／６マウスに、ラツト免疫グロブリンの
量で50〜100μg／匹ずつ皮下注射した。さらに１
〜２週間の間隔で同一のマウスに少なくとも２
回、同様にして追加免疫を行なつた。この追加免
疫はコンプリート・フロインド・アジユバントを
加えず静脈注射で行なつても良い。最終免疫の３
〜４日後に免疫感作マウスから部分採血を行な
い、オクタローニ法でマウス血清中にラツト免疫
グロブリンに対する抗体ができていることを確認
し、抗体濃度の高いマウスの脾細胞を細胞融合に
用いた。

脾細胞の調製方法：マウスから摘出した脾臓を
FCS（牛胎児血清）を含まないRPMI1640倍地中
で細断し５分間遠心分離を行ない上清を取り除い
た後、0.17Mの塩化アンモニウム溶液を加えて赤
血球を溶解させ、さらにFCSを含まない
RPMI1640倍地で２回、遠心分離（1200rpm、５
分間）により脾細胞の洗浄を行なつた。

(b) 骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製 ミエローマとしてマウス由来の８−アザグアニ
ン耐性株（ヒポキサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフエラーゼ欠損株）であるP3−X63−
Ag8−U1（P3U1）〔カレント トピツクス イン
マイクロバイオロジー アンド イム ノロジ
ー（Current Topics in Microbiology and
Immunology），81，１−７（1978）〕を用いた。
他にP3−NS1−１−Ag4−１（NS−１）〔ユーロ
ピアン ジヤーナル オブ イムノロジー
（European J.Immunology），６，511−519
（1976）〕、P3−X63−Ag8−６，５，３（X63、
653）〔ジヤーナル オブ イムノロジー（J.
Immunology）123，1548−1550（1979）〕、SP2／
０−Ag14（SP−２）〔ネイチヤー（Nature），
276，269−270（1978）〕等のミエローマを用いて
も良い。

あらかじめ８−アザグアニンを含む10％FCS−
RPMI1640培地で耐性を確認したミエローマを75
cm²カルチヤーフラスコで10％FCS−RPMI−1640
培地を用いて培養し、対数増殖期のものをFCSを
含まないRPMI1640培地で２回、遠心分離
（1200rpm、５分間）により洗浄して、細胞融合
に用いた。

(c) 細胞融合 ポリエチレングリコール（分子量1500）1gに
対しジメチルスルフオキシド（DMSO）0.35ml
を加え加熱融解させたものに、等量のFCSを含ま
ないRPMI1640培地を加え37℃に保温したポリエ
チレングリコール溶液（PEG溶液）を用いて細
胞融合を行つた。

上記の如くして調製した骨髄腫細胞と脾細胞を
１：５−１：10の割合でFCSを含まない
RPMI1640培地中で混合し、1900rpmで５分間遠
心分離にかけ、上清を取り除いた。遠心管の底に
残つた細胞のペレツトに、0.5ml／マウス１匹脾
細胞のPEG溶液をピペツトで少量ずつ、１〜２
分かけて加えながら、同時にピペツトの先端でペ
レツトをくずした。さらに、37℃に保温したFCS
を含まないRPMI1640培地10〜20mlを少量ずつ
ピペツトで加えながら、PEG溶液を撹拌し、稀
釈した。

以上の操作で得られた細胞懸濁液を900rpmで
５分間遠心分離にかけ、上清を取り除いた後、10
〜20％FCS−RPMI1640培地に10⁷個／mlの細胞
濃度となる様に懸濁し、この懸濁液を96穴マイク
ロプレートに100μ／穴ずつ分注した。

融合後の細胞は、温度を37℃、炭酸ガス濃度を
５％に設定したCO₂インキユベーター内で培養を
行い、翌日、ヒポキサンチン（100μM）、アミノ
プテリン（0.4μM）、チミジン（16μM）を含む10
％FCS−RPMI1640培地（HAT培地）を100μ
／穴ずつ加えた。

さらに、37℃にて、５％炭酸ガス雰囲気下で培
養を続け、１〜２日毎に培地の色を調べ、培地の
pHが低下して培地の色が黄色味がかつて来たら、
その都度、100μ／穴の培養液を抜き取り新鮮
なHAT培地を100μ／穴ずつ加えた。

培養開始後７〜10日目項から脾細胞とミエロー
マの融合細胞だけが増殖を始め、コロニーを形成
するのが観察された。10日目には融合していない
ミエローマはすべて死滅しており、交換用の培養
液を、HAT倍地からアミノプテリンを除いた
HT培地に代えた。

(d) クローニング 融合細胞のコロニーが透過光により肉眼で観察
できる程度まで大きくなつた穴について、培養液
交換時の採取上清を用いて、酵素免疫測定法
（ELISA）によりラツト免疫グロブリンに対する
抗体産生の有無を調べ、抗ラツト免疫グロブリン
抗体の産生が認められた穴の融合細胞のみ、限界
稀釈法によりクローニングを行つた。

酵素免疫測定法：ELISA用の96穴マイクロプ
レート（ダイナテツク社）に、免疫感作に用いた
ラツト免疫グロブリンを濃度5μg／mlに稀釈した
溶液を50μ／穴ずつ分注し、１時間静置してコ
ーテイングを行つた。次に、0.05％ツイーン
（Tween）20−0.01M燐酸ナトリウム緩衝食塩水
（PBS；pH7.2）で穴内をよく洗浄した後、１％
牛血清アルブミン（BSA）−0.01MPBSを200μ
／穴ずつ分注し、30分間静置してブロツキング
を行つた。さらに、上記の洗浄液で穴内をよく洗
浄し、培養液の採取上清を50μ／穴ずつ入れて
１時間静置反応させた後、再度上記の洗浄液で穴
内をよく洗浄し、二次抗体としてHRPO（西洋ワ
サビペルオキシターゼ）標識ラビツト抗マウス免
疫グロブリン抗体（ダコパツツ社）を500倍稀釈
した溶液を50μ／穴ずつ分注し、１時間静置反
応させた。なお、HRPO標識ラビツト抗マウス
免疫グロブリン抗体はラツト免疫グロブリンへの
交差反応が見られたので、ラツト免疫グロブリン
を結合させたアフイニテイーカラムを通して、交
差反応のある抗体部分を吸収してから用いた。

最後に、上記の洗浄液で穴内をよく洗浄してか
ら、オルトフエニレンジアミン（OPD）基質液
（4mg OPD＋4μ 30％過酸化水素水／10ml
pH5.0クエン酸緩衝液）を50μ／穴ずつ分注し、
室温下、暗所で30分間反応させ、2N硫酸溶液50μ
／穴を加えて反応を停止させた。

基質液の発色はエライザーアナライザー（東洋
測器(株)）を用いて、490nmの吸光度により測定し
た。

限界稀釈法：フイーダー細胞としてBALB／
Ｃマウスの胸腺細胞を10⁷個／mlの濃度で懸濁さ
せた10％FCS−RPMI1640培地に融合細胞を加
え、96穴マイクロプレートに、融合細胞の数が平
均５、１および0.5個／穴となる様に３つの区に
分けて撤いた。37℃、５％炭酸ガス濃度雰囲気下
で培養を行い、時々各穴のコロニー数をカウント
し、pHが低下した穴は培養液（10％FCS−
RPMI1640培地）の交換を行つた。

コロニーがある程度の大きさになつてから、各
穴の培養液上清を採取し、上述と全く同じ酵素免
疫測定を用いて、各穴の融合細胞の抗ラツト免疫
グロブリン抗体の産生の有無と、同抗体が産生さ
れている場合はそのラツト免疫グロブリンに対す
る反応性の強さを調べた。

ラツト免疫グロブリンに対し強い反応を示した
穴で、しかも１つのコロニーだけが観察された穴
の融合細胞を用いて、上述と同じ要領で、再度限
界稀釈法によりクローニングを行つた。

(e) 反応特性検査 この様にして得られたモノクローナル抗体の培
養液上清を用いて、モノクローナル抗体の反応特
性を調べた。

即ち、“(d)クローニング”のところで述べた酵
素免疫測定法と類似の方法で、コーテイングする
試薬をラツト免疫グロブリンの代わりにラツト免
疫グロブリンの各アイソタイプIgG₁、IgG_2a、
IgG_2b、IgG_2cおよびIgMの各々を5μg／mlに稀釈
した溶液を異なる穴にコーテイングし、後は上述
と同じ操作を行い、モノクローナル抗体の各アイ
ソタイプに対する反応を調べた。

その結果、ラツト免疫グロブリンのすべてのア
イソタイプに強い反応を示すモノクローナル抗体
を産生する融合細胞株（ハイブリドーマ）が１つ
あり、本発明のハイブリドーマ（M21）を得た。

このモノクローナル抗体のアイソタイプは
IgG₁（κ鎖）であつた。

(f) 抗体の製作 ハイブリドーマ（M21）をヌードマウスの腹腔
に注射し、20日間該腹腔内で培養した後に腹水を
採取し、この腹水から本発明のモノクローナル抗
体を精製した。

モノクローナル抗体の精製法：40％硫安塩析法
およびイオン交換クロマトグラフイーを用いて精
製を行い、SDS−PAGE（SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法）により精製されたモノクロ
ーナル抗体の純度が高いことを確かめた。

勿論、ハイブリドーマ（M21）をin vitroで培
養し、その培養液からモノクローナル抗体を精製
してもよい。

以上の結果得られたモノクローナル抗体にビオ
チンおよびFITC（フルオレセイン・イソチオシ
アネート）を各々標識し、ラツト免疫グロブリ
ン、マウス免疫グロブリンおよびマウス免疫系細
胞への反応の特異性を調べた。

第１図に酵素免疫測定法（ELISA）で調べた、
本発明のモノクローナル抗体のラツト免疫グロブ
リンの各アイソタイプに対する反応性を、又、第
２図に酵素免疫測定法で調べた、本発明のモノク
ローナル抗体のマウス免疫グロブリンに対する反
応性を示す。

ELISAの詳細については“(d)クローニング”
のところで述べた方法に準ずるものであるので省
略する。但し、一次抗体としてビオチン化した本
発明のモノクローナル抗体を用い、二次抗体とし
てHRPO（西洋ワサビペルオキシダーゼ）−アビ
ジンを用いた。

第１図及び第２図より明らかな様に、本発明の
モノクローナル抗体はラツト免疫グロブリンには
高い反応性を示す（第１図参照）が、ラツトと近
縁種であるマウスの免疫グロブリンには全く反応
せず（第２図参照）、ラツト由来の抗体を用いて
マウスの免疫系細胞表面抗原を調べる際に、本発
明のモノクローナル抗体に各種標識物質を結合さ
せ二次抗体として用いることが可能であることが
分かる。

FITC標識モノクローナル抗体を二次抗体とし
て用いて、BALB／ｃマウスのリンパ節細胞お
よび脾細胞の表面抗原を調べた結果を、第３図な
いし第７図に示す。螢光測定はFACS（ベクト
ンデイツキンソン社）で行つた。これらの図にお
いて、螢光測定結果は横軸に明るさを、また縦軸
に細胞数をとつた光ヒストグラムとして示した。
また、図中の番号は夫々陽性細胞のピーク１、陰
性細胞のピーク２および一次抗体を反応させてい
ない細胞のピーク３を示すものである。

第３図および第４図は各々、BALB／ｃ正常
マウスのリンパ節細胞表面のThy1.2抗原および
GK1.5抗原を、抗Thy1.2抗体（ラツトIgM）およ
び抗GK1.5抗体（ラツトIgG_2b）を用いて測定し
た結果である。

第５図、第６図および第７図は各々、
BALB／ｃ正常マウスの脾細胞表面のLy−１抗
原、Ly−２抗原及びGK1.5抗原を、抗Ly−１抗
体（ラツトIgG_2a）、抗Ly−２抗体（ラツト
IgG_2a）および抗GK1.5抗体（ラツトIgG_2b）を用
いて測定した結果である。

いずれもバツクグラウンドの無い綺麗な反応特
性が見られ、ラツト由来の抗体を用いてマウスの
免疫系細胞表面抗原を調べる際に、二次抗体とし
て極めて有効であることが確かめられた。第８図
に、念のためにBALB／ｃマウスの脾細胞に直
接FITC標識モノクローナル抗体を反応させた場
合と何も反応させなかつた場合とを比較した螢光
測定の結果を示すが、本発明のモノクローナル抗
体はマウスの脾細胞と全く反応していないことが
分かる。

勿論、螢光色素としてPE（フイコエリスリン）、
TRITC（テトラローダミンイソチオシアネート）
等の他の物質を利用してもよいし、螢光色素以外
にもHRPO（西洋ワサビペルオキシターゼ）、AP
（アルカリ性フオスフアターゼ）、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチル
コリンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グ
リコアミラーゼおよびチロシナーゼ等の酵素を標
識して酵素免疫測定法の二次抗体として用いた
り、あるいは¹²⁵I、¹⁴C、³H、¹³¹I、³²P、³⁵S、⁴⁵Ca、
⁵¹Cr、等の放射性同位元素を標識して放射性免疫
測定法の二次抗体として用いることも可能であ
る。

あるいは、本発明のモノクローナル抗体にビオ
チンを結合させたものを二次抗体として用い、さ
らに検出用試薬として上記の標識物質のいずれか
にアビジンあるいはストレプトアビジンを結合さ
せたものを反応させる測定法に用いることも可能
である。

発明の効果 以上説明した様に、本発明のモノクローナル抗
体はラツト免疫グロブリンのアイソタイプのすべ
てに対して特異的に反応し、かつマウスの免疫系
細胞および免疫グロブリンと交差反応しないの
で、マウス免疫系細胞の表面抗原を調べるのに有
用である。このようなモノクローナル抗体を用い
た場合には、表面抗原に反応するラツト由来の複
数の抗体に標識物質を結合する手間がいらず、し
かも安定して高い検出感度を達成し得る免疫測定
法が提供できることになる。

さらに、マウスの免疫系細胞以外に、例えばマ
ウスの細胞中の特定物質をラツト由来の抗体や抗
血清で調べる場合にも、本発明のモノクローナル
抗体を同様にして使うことができる。従つて、本
発明はマウスを用いた多くの実験系に対して有効
な手段を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のモノクローナル抗体のラツト
免疫グロブリンに対する反応をELISA法で調べ
た結果を示すグラフである。第２図は本発明のモ
ノクローナル抗体のマウス免疫グロブリンに対す
る反応をELISA法で調べた結果を示すグラフで
ある。第３図および第４図は、FITCを標識した
本発明のモノクローナル抗体を用いてBALB／
ｃマウスのリンパ節細胞への抗Thy1.2抗体およ
び抗GK1.5抗体の反応性をFACSで調べた結果
を示すグラフである。第５図、第６図および第７
図は、同様にFITCを標識した本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いて、BALB／ｃマウスの脾細
胞への抗Ly−１抗体、抗Ly−２抗体および抗
GK1.5抗体の反応性をFACSで調べた結果を示
すグラフである。第８図はFITCを標識した本発
明のモノクローナル抗体のBALB／ｃマウスの
脾細胞に対する反応性をFACSで調べた結果を
示すグラフである。 主な参照番号、１……陽性細胞のピーク、２…
…陰性細胞のピーク、３……一次抗体を反応させ
ていない細胞のピーク。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ラツト免疫グロブリンのアイソタイプIgG₁、
   IgG_2a、IgG_2b、IgG_2cおよびIgMのすべてに反応
   し、かつマウスの免疫グロブリンのクラスIgGお
   よびIgMと交差反応しないモノクローナル抗体。 ２ アイソタイプIgG₁に属する特許請求の範囲
   第１項記載のモノクローナル抗体。 ３ ラツト免疫グロブリンで免疫感作されたマウ
   スの脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合して得
   られたラツト免疫グロブリンのアイソタイプ
   IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG_2cおよびIgMのすべて
   に反応し且つマウスの免疫グロブリンのクラス
   IgGおよびIgMと交差反応しないモノクローナル
   抗体を産生するハイブリドーマを、培養液中もし
   くはマウスの腹腔内で培養することにより、培養
   液中もしくは腹水中にモノクローナル抗体を生成
   蓄積せしめ、これを採取精製することを特徴とす
   る、ラツト免疫グロブリンのアイソタイプIgG₁、
   IgG_2a、IgG_2b、IgG_2cおよびIgMのすべてに反応
   し且つマウスの免疫グロブリンのクラスIgGおよ
   びIgMと交差反応しないモノクローナル抗体の製
   造法。 ４ 上記モノクローナル抗体がアイソタイプ
   IgG₁に属するものであることを特徴とする特許
   請求の範囲第３項記載のモノクローナル抗体の製
   造法。 ５ 上記ラツト免疫グロブリンで感作されるマウ
   スがC57BL／６であることを特徴とする特許請
   求の範囲第３項または第４項記載のモノクローナ
   ル抗体の製造法。 ６ ラツト免疫グロブリンのアイソタイプIgG₁、
   IgG_2a、IgG_2b、IgG_2cおよびIgMのすべてに反応
   し、かつマウスの免疫グロブリンのクラスIgGお
   よびIgMと交差反応しないモノクローナル抗体を
   螢光色素、酵素または放射性同位元素で標識し、
   これをラツト由来の抗体もしくは抗血清に対する
   二次抗体として使用することを特徴とする免疫測
   定法。 ７ 上記螢光色素がフルオレセイン・イソチオシ
   アネート、フイコエリスリンおよびテトラローダ
   ミンイソチオシアネートからなる群から選ばれる
   １種であることを特徴とする特許請求の範囲第６
   項記載の免疫測定法。 ８ 上記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ、ア
   ルカリ性フオスフアターゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
   ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリ
   ンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコ
   アミラーゼおよびチロシナーゼからなる群から選
   ばれる１種であることを特徴とする特許請求の範
   囲第６項記載の免疫測定法。 ９ 上記放射性同位元素が¹²⁵I、¹⁴C、³H、³²P、³⁵S、
   ⁴⁵Ca、⁵¹Crおよび¹³¹Iからなる群から選ばれる１種
   であることを特徴とする特許請求の範囲第６項記
   載の免疫測定法。 １０ ラツト免疫グロブリンのアイソタイプ
   IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG_2cおよびIgMのすべて
   に反応し、かつマウスの免疫グロブリンのクラス
   IgGおよびIgMと交差反応しないモノクローナル
   抗体にまずビオチンを結合させ、得られる結合体
   をラツト由来の抗体もしくは抗血清に反応させた
   後、螢光色素、酵素または放射性同位元素とアビ
   ジンまたはストレプトアビジンとの結合体と反応
   させることを特徴とする免疫測定法。 １１ 上記螢光色素がフルオレセイン・イソチオ
   シアネート、フイコエリスリンおよびテトラロー
   ダミンイソチオシアネートからなる群から選ばれ
   る１種であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １０項記載の免疫測定法。 １２ 上記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ、
   アルカリ性フオスフアターゼ、β−Ｄ−ガラクト
   シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコ
   リンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グル
   コアミラーゼおよびチロシナーゼからなる群から
   選ばれる１種であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１０項記載の免疫測定法。 １３ 上記放射性同位元素が¹²⁵I、¹⁴C、³H、³²P、
   ³⁵S、⁴⁵Ca、⁵¹Crおよび¹³¹Iからなる群から選ばれる
   １種であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   ０項記載の免疫測定法。