JPH0349698A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌検出法 - Google Patents
細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌検出法Info
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- JPH0349698A JPH0349698A JP18568389A JP18568389A JPH0349698A JP H0349698 A JPH0349698 A JP H0349698A JP 18568389 A JP18568389 A JP 18568389A JP 18568389 A JP18568389 A JP 18568389A JP H0349698 A JPH0349698 A JP H0349698A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔 産業上の利用分野 ］
本発明は、臨床検査５ 殊に食中毒検査，．４たは食品
検査において Ｓａｌａｏｎｅｌｌａ菌（ Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ属に属する菌）を検出する． 〔 従来の技術と問題点 〕 検査材料が患者の嘔吐物、糞便，食品または拭き取り材
料の場合、Ｓａｌｍｏｎｅｌ！ａ菌と同定するまでには
、増菌培簑、確認培養に至る操作を行わなければならな
い．各培養段階に要する時間は，１８〜２４時間であり
総所要時間にすると約２日間と１・人下乍、ｂ なり、長時間を要する．確認培費では、ＴＳＩ寒天、Ｓ
ＩＭ培地、ＶＰ−ＭＲ培地およびリジン脱炭酸テスト用
培地に接種し、３７℃で一晩培養する．したがって、時
間ならびに費用がかかり、操作的にも煩雑である． 一方，最近では，オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプ
ロープ法あるいはパイプリダイゼーション法が試みられ
るようになってきた．しかし，オリゴヌクレオチドを標
識修飾したプローブにより、展上、あるいは他の支持体
上でハイプリダイゼーションを行い、これを検出する場
合、紹菌検査において十分な検出感度と選択性を得るの
が難しい．［ 発明の目的 ］ 本発明は，オリゴヌクレオチドを核酸合成反応の１ライ
マーとして用いた遺伝子増幅技術によりＳａｌｓｏｎｅ
＋１ａ菌由来の核酸を検出するもので、簡痩，迅速かつ
高感度なＳａｌｓｏｎｅｌｌａ田の検査法を提供するこ
とにある． ［ 問題点を解決するための手段および作用 ］本発明
は、オリゴヌクレオチドを１ライマーとして機能させた
遺伝子増幅法によりＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌を選択的に
検出することを特徴としている．遺伝子増幅の方法につ
いては、Ｓａｉｋｉ らが、開発したＰｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法（以下，略して
ＰＣＲ法； Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３０．１）５０ （
１９８５））をもとに行っている．この方法は、ある特
定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合はＳａｌ■ｏ
ｎｅｌｌａ菌のａｒａ Ｃ遺伝子〉を検出する場合、そ
の領域の両端の一方は＋鎖を他方は一饋をそれぞれ認識
してハイブリダイゼーシシンするようなオリゴヌクレオ
チドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした試
料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライ
マーとして機能させ、生成した２本ｍｔｌ．酸を再び１
本鎖に分離し、再び５ 同様な反応を起こさせる．この
一連の操作を繰り返すことにより２つのプライマーには
さまれた頼域は検出できるまでにコピー数が増大してく
る．検体としては，臨床検査材料、例えば、糞便、尿、
血液、組織ホモジェネートなど，また、食品材料でもよ
い．これら材料をＰＣＨの試料として用いるには、材料
中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操作が前処
理として必要となる． しかし、プライマーがパイプリ
ダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在すれば
ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性剤、
アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行させる
に十分な核酸量を持った試料液が調製できる．本発明で
１ライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、選
択性や検出感度および再現性から考えて、１０塩基以上
、望ましくはｉｓｔｘ基以上の長さを持った核酸フラグ
メントで，化学合成あるいは天然のどちらでもよい．ま
た、プライマーは，特に検出用として標識されていなく
てもよい．１ライマーが規定しているＳａｌｓｏｎｅｌ
ｌａ菌のａｒａ Ｃ遺伝子の増幅領域は，５０塩基から
２．０００塩基、望ましくは、 １００塩基から１．０
００塩基となればよい．鋳型依存性ヌクレオチド重合反
応には、ｎ｛熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、
この酵素の起源については９０〜９５℃の温度で活性を
保持していれば，どの生物種由来でもよい．熟変性温度
は，９０〜９５℃，プライマーをハイブリダイズさせる
アニーリング操作の温度は３７〜６５℃，、重合反応は
５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ反応を
２０から４２サイクル行って増幅させる．検出は酵素反
応液をそのまま、アガロースゲル電気泳動にかけること
で増幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長さが
確認できる．その結果から、検体中に、目的とするヌク
レオチドが存在しているかどうが判定することができる
．この判定はそのままＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌の有無を
判定するものとなる．増輻されたヌクレオチド断片の検
出には，その池の電気泳動やクロマトグラフィーも有効
で［ 実施例］ （実施例ｌ） 検」Ｌ曵」Ｌ製 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌は表１の櫂の見出しに示した７
菌種１４株を用いてそれぞれを適当な増田培地に接種し
、３７℃、好気的条件下で終夜培養を行い、その培地．
１．５ｍｌから遠心操作により菌体を回収した．１
０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ Ｐ Ｈ ７．５〉でｌｒ
ｇＪ洗浄後，同護衝液にリゾチームをｌｍｇ ／ ｍ
Ｉとなるように溶かした液、０．５ｍｌで懸濁させ、３
７℃、 １０分で溶菌させた．溶菌液に前記Ｍｆｌｉ液
で飽和させたフェノールを同容量加え，よく攬はんした
．遠心後，上層液を回収し．エタノール沈澱処理を行っ
て核酸成分を沈澱させ，その沈澱物を前記綬街液， ｌ
ｍｌに溶がして，これを検体とした． 一 マー ▲ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｆｆｌのａｒａ Ｃ遺伝子の塩基
配列（ ＣＩ．ｘｒｋｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．；
Ｇｅｎｅ １８，１５７−１６３（１９８２））
から、 特ｚ′ｆ請求範囲第２項に示した配列を選び、
それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し
た．化学合成は島津ＤＮＡ合成１ｆＩＮＳ−１を用い、
トリエステル法により行った．合成したヌクレオチド断
片の精製はＣｌａ逆相カラムを用いて行った．旦コΣ旦 前記検体液を３μ１を用いそれに滅菌蒸留水１６．０５
μ！、１０×反応用バッファ−３μ１、ｄＮＴＰ溶液４
．８μ１、プライマ−（１）１。５μ１，プライマー（
２｝１、 ５μ１そして耐熟性ＤＮＡポリメラーゼ０．
１５μｌを加え、３０μ！の反応液を調製した．
この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ
社製）を５０μｌ加え反応液上に重層する．各添加され
た液の内容を下記に示す． １０×反応用バッ７ｙ ： ５００ｍＭ ＫＣ
Ｉ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８． ３
＞，１ ５ｍＭ ＭｇＣ Ｉ２， ０． １％（
ｗ／ ｖ ）ゼラチン ｄＮＴＰ溶液： ｄＡＴＰ． ｄＣＴＰ， ｄＧ
ＴＰ，ｄＴＴＰを混合させた物で各終濃度が１．２５ｍ
Ｍ プライマ−（１）および（２）： 前述した化学合成精
製品の各水、溶液（ ５ ００（１／ ｍｌ）プライマ
ーの組合せは、特許ｌＩＩ求範囲第２項に示した配列（
（ａ〉〜（ｃ〉）より、次の組合せを用いた． マー ＋ マー （ａ） ＋ （ｂ）（．Ｌ
〉＋（ｃ｝ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ： Ｔａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼ（ ５ ｕｎｉｔ／ ｍｌ； Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌａｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製） 反応条件は、次の通りである． 熱変性： ９４℃ １分 アニーリング＝ ３７℃ １分 重合反応： ６０″Ｃ ｌ分 熱変性からア二一リングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７分）とし、これを４２サイク
ル〈総所要時間約４時ｒｆｆ！）行った．これらの操作
は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社′！ＡＤ
ＮＡＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒに上記反応条件をプ
ログラムすることで行った． 栓エ出 反応液から、増輻されたヌクレオチド断片を検出するた
め，アガロース電気泳動を以下の様に行った． アガロースゲルはゲル濃度２％（ ｗ ／ ｖ ）とし
、臭化エチジウム《０．５μｇ／ｍ Ｉ ）を含むもの
を用いた．泳動の電気的条件は、定電圧１ ０ ０ Ｖ
，＆９間は３０分行った．操作方法ならびに他の条件は
Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（１９８２）に記載されている技法で行った．反応
液の他に分子量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移
動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さを算出した
．直１ 前述したように、ａｒａ Ｃ遺伝子は、すでに塩基配列
が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、すな
わち、プライマーがＰＣＲにより、！！ｌｔａさせてく
るヌクレオチドの大きさは推定できる．それによると，
プライマ− （ａ）と（ｂ）では、３２９塩基、 （ａ
）と（ｃ）では、 ５３９塩基の長さのヌクレオチドが
増幅されてくるはずである．表１に示した数値は，上記
方法で増幅されてきたヌクレオチドの長さを測定した結
果で、単位はキロ塩基対である． 同表からわかるように、 各フ゜ライマーの 組合せとも、 推定されたヌクレオチドの長さと一 致しており、 これらが、 Ｃ遺伝子の標的として いる領域を正しく増幅してきていることを示している． 表 １ （ａ）＋（ｂ） （ａ）＋（ｃ） 旧２２ｌ：農林水産省３２畜衛生試験場（実施例２〉 実施例１で得られた結果が， ． ＳａｌＩｌ＋ｏｎｅ
ｌｌａ菌に対し選択的なものか確かめるため，Ｂ床検査
においてＳａｌ＋ｗｏｎｅｌｌａ菌以外で検査対象とな
り得る菌種について比較検討した． 方法は、実施例１に示したものと同じであるが、（２）
． （６）． （１ｇ）の株については嫌気的条件下、
４０℃で終夜培養を行い、ＰＣＲ法に適用しうる試料を
調製してきた．検体の調製において培養した菌は，表２
の縦の見出しに示した１１菌株である．また，ヒト胎盤
由来ＤＮＡは１μｇ ／ ｍ Ｉの濃度のものをｆＩｉ
ｌＦＪシ、これも同様にＰＣＲを行わせた．結果を表２
に示す．表１と同様、澗内の数値の単位はキロ塩基対で
ある．一部の菌種においてＰＣＨの副次的産物とみられ
る，増幅されたヌクレオチド断片が検出されたが，どれ
もａｒａ Ｃ遺伝子のＦＡ基配列から推定されるヌクレ
オチド断片の長さとは異なっている．Ｓａｌａｏｎｅｌ
ｌユ苗と同じａｒａ Ｃ道伝子をこれらの菌種が持って
いれば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチドがはず
である．従って、これらの菌種由来の増幅されたヌクレ
オチド断片はａｒａ Ｃ遺伝子を２２ 識して生成され
たものではないことが明かであり、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ菌とは容易に区別し、検出できることがわかる．なお
、本発明の実施例にに用いているアガロース電気泳動を
前述の泳動条件で行えば１００塩基対以下の範囲であれ
ば５から１０４基対、１００から５００塩基対の範囲で
あれば１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別することがでる．さらに、アクリルアミドなどを
ゲルに用いることでヌクレオチドの長さの測定の精度を
向上させれば、選択的検出における信頼度はさらに高ま
るものと考えられる． （以下余白） 表 ２ 菌株名 ブライマーの組合せ （ａ）＋（ｂ） （ａ）＋（ｃ） ！；ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｇ＋ｕｒｉｕｍ （ＩＦＯ１２５２９） ０．３３ ０．５４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｃａ＋ａｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅＪｕｎｉＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｖｉｂｒ［ｏ ｐａｒｉｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＳ
ｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓＣｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｓ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＳｈｉｇｅ目
ａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌ
ｅｘｎｅｒｌＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ （１）０．２０ （２） （３）０．５０ （４）０．５０ （５）０．１０ 〈６〉 （７）０．８０ （８）０．５０ （９）０．８０ ０．２０ ０．４０ ０，２０ ０．２０ Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｅｎｔａ （１２） Ｇｏｌｌｅｃｔｌｘｎ，（１２冫Ｈｕｍａｎｐｆａｃｅ
ｎｔａｌ ＤＮＡ Ｏｎｃｏ社製 ［ 発明の効果 ］ 本発明では，ＰＣＲ法を用いたことで，ＳユＩｍｏ−ｎ
ｅｌｌａ菌の検出に３いて，遺伝子増幅作用による高い
検出感度と、２つあるいは、 それ以上のプライマーで
反応が規定されることによる高い選択性を得ることがで
きる． また、高い検出感度のため、多量の検体を必要
とせず、検体の前処理が簡便で済む．しかも、反応時間
が短く、検出も簡単な機材だけで済み，操作も容易なた
め同定までの時間を大幅に短縮できることができる．以
下の実施例に示すが、反応時間が４時間，検出にかかる
操作が３０分である．また．検出にアガロースゲル電気
泳動と奥化エチジウムによる核酸染色法をもちいること
ｒ、プライマー等に標識せずに検出が行え、しかも、核
酸の長さが確２″２できるので結果の信頼性が高いもの
となる， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌のａｒａ Ｃ道伝
子は、Ｓａｌａ＋ｏｎｅ目ａｍに属する全ての閑株に背
遍的に存在していると考えられる． したがって，この
遺伝子を標的とすることでＳ＾ｌｓｏｎｅ ｌ Ｉａｆ
ｆｌ Ｇ ＦＪを一括して検出することができる．一方
、ヌクレオチド配列における他の生物種のｉｒａ Ｃ遺伝子とは相 同性が少ないことからＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌に対する
選択性は維持される．
検査において Ｓａｌａｏｎｅｌｌａ菌（ Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ属に属する菌）を検出する． 〔 従来の技術と問題点 〕 検査材料が患者の嘔吐物、糞便，食品または拭き取り材
料の場合、Ｓａｌｍｏｎｅｌ！ａ菌と同定するまでには
、増菌培簑、確認培養に至る操作を行わなければならな
い．各培養段階に要する時間は，１８〜２４時間であり
総所要時間にすると約２日間と１・人下乍、ｂ なり、長時間を要する．確認培費では、ＴＳＩ寒天、Ｓ
ＩＭ培地、ＶＰ−ＭＲ培地およびリジン脱炭酸テスト用
培地に接種し、３７℃で一晩培養する．したがって、時
間ならびに費用がかかり、操作的にも煩雑である． 一方，最近では，オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプ
ロープ法あるいはパイプリダイゼーション法が試みられ
るようになってきた．しかし，オリゴヌクレオチドを標
識修飾したプローブにより、展上、あるいは他の支持体
上でハイプリダイゼーションを行い、これを検出する場
合、紹菌検査において十分な検出感度と選択性を得るの
が難しい．［ 発明の目的 ］ 本発明は，オリゴヌクレオチドを核酸合成反応の１ライ
マーとして用いた遺伝子増幅技術によりＳａｌｓｏｎｅ
＋１ａ菌由来の核酸を検出するもので、簡痩，迅速かつ
高感度なＳａｌｓｏｎｅｌｌａ田の検査法を提供するこ
とにある． ［ 問題点を解決するための手段および作用 ］本発明
は、オリゴヌクレオチドを１ライマーとして機能させた
遺伝子増幅法によりＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌を選択的に
検出することを特徴としている．遺伝子増幅の方法につ
いては、Ｓａｉｋｉ らが、開発したＰｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法（以下，略して
ＰＣＲ法； Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３０．１）５０ （
１９８５））をもとに行っている．この方法は、ある特
定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合はＳａｌ■ｏ
ｎｅｌｌａ菌のａｒａ Ｃ遺伝子〉を検出する場合、そ
の領域の両端の一方は＋鎖を他方は一饋をそれぞれ認識
してハイブリダイゼーシシンするようなオリゴヌクレオ
チドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした試
料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライ
マーとして機能させ、生成した２本ｍｔｌ．酸を再び１
本鎖に分離し、再び５ 同様な反応を起こさせる．この
一連の操作を繰り返すことにより２つのプライマーには
さまれた頼域は検出できるまでにコピー数が増大してく
る．検体としては，臨床検査材料、例えば、糞便、尿、
血液、組織ホモジェネートなど，また、食品材料でもよ
い．これら材料をＰＣＨの試料として用いるには、材料
中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操作が前処
理として必要となる． しかし、プライマーがパイプリ
ダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在すれば
ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性剤、
アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行させる
に十分な核酸量を持った試料液が調製できる．本発明で
１ライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、選
択性や検出感度および再現性から考えて、１０塩基以上
、望ましくはｉｓｔｘ基以上の長さを持った核酸フラグ
メントで，化学合成あるいは天然のどちらでもよい．ま
た、プライマーは，特に検出用として標識されていなく
てもよい．１ライマーが規定しているＳａｌｓｏｎｅｌ
ｌａ菌のａｒａ Ｃ遺伝子の増幅領域は，５０塩基から
２．０００塩基、望ましくは、 １００塩基から１．０
００塩基となればよい．鋳型依存性ヌクレオチド重合反
応には、ｎ｛熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、
この酵素の起源については９０〜９５℃の温度で活性を
保持していれば，どの生物種由来でもよい．熟変性温度
は，９０〜９５℃，プライマーをハイブリダイズさせる
アニーリング操作の温度は３７〜６５℃，、重合反応は
５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ反応を
２０から４２サイクル行って増幅させる．検出は酵素反
応液をそのまま、アガロースゲル電気泳動にかけること
で増幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長さが
確認できる．その結果から、検体中に、目的とするヌク
レオチドが存在しているかどうが判定することができる
．この判定はそのままＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌の有無を
判定するものとなる．増輻されたヌクレオチド断片の検
出には，その池の電気泳動やクロマトグラフィーも有効
で［ 実施例］ （実施例ｌ） 検」Ｌ曵」Ｌ製 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌は表１の櫂の見出しに示した７
菌種１４株を用いてそれぞれを適当な増田培地に接種し
、３７℃、好気的条件下で終夜培養を行い、その培地．
１．５ｍｌから遠心操作により菌体を回収した．１
０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ Ｐ Ｈ ７．５〉でｌｒ
ｇＪ洗浄後，同護衝液にリゾチームをｌｍｇ ／ ｍ
Ｉとなるように溶かした液、０．５ｍｌで懸濁させ、３
７℃、 １０分で溶菌させた．溶菌液に前記Ｍｆｌｉ液
で飽和させたフェノールを同容量加え，よく攬はんした
．遠心後，上層液を回収し．エタノール沈澱処理を行っ
て核酸成分を沈澱させ，その沈澱物を前記綬街液， ｌ
ｍｌに溶がして，これを検体とした． 一 マー ▲ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｆｆｌのａｒａ Ｃ遺伝子の塩基
配列（ ＣＩ．ｘｒｋｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．；
Ｇｅｎｅ １８，１５７−１６３（１９８２））
から、 特ｚ′ｆ請求範囲第２項に示した配列を選び、
それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し
た．化学合成は島津ＤＮＡ合成１ｆＩＮＳ−１を用い、
トリエステル法により行った．合成したヌクレオチド断
片の精製はＣｌａ逆相カラムを用いて行った．旦コΣ旦 前記検体液を３μ１を用いそれに滅菌蒸留水１６．０５
μ！、１０×反応用バッファ−３μ１、ｄＮＴＰ溶液４
．８μ１、プライマ−（１）１。５μ１，プライマー（
２｝１、 ５μ１そして耐熟性ＤＮＡポリメラーゼ０．
１５μｌを加え、３０μ！の反応液を調製した．
この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ
社製）を５０μｌ加え反応液上に重層する．各添加され
た液の内容を下記に示す． １０×反応用バッ７ｙ ： ５００ｍＭ ＫＣ
Ｉ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８． ３
＞，１ ５ｍＭ ＭｇＣ Ｉ２， ０． １％（
ｗ／ ｖ ）ゼラチン ｄＮＴＰ溶液： ｄＡＴＰ． ｄＣＴＰ， ｄＧ
ＴＰ，ｄＴＴＰを混合させた物で各終濃度が１．２５ｍ
Ｍ プライマ−（１）および（２）： 前述した化学合成精
製品の各水、溶液（ ５ ００（１／ ｍｌ）プライマ
ーの組合せは、特許ｌＩＩ求範囲第２項に示した配列（
（ａ〉〜（ｃ〉）より、次の組合せを用いた． マー ＋ マー （ａ） ＋ （ｂ）（．Ｌ
〉＋（ｃ｝ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ： Ｔａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼ（ ５ ｕｎｉｔ／ ｍｌ； Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌａｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製） 反応条件は、次の通りである． 熱変性： ９４℃ １分 アニーリング＝ ３７℃ １分 重合反応： ６０″Ｃ ｌ分 熱変性からア二一リングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７分）とし、これを４２サイク
ル〈総所要時間約４時ｒｆｆ！）行った．これらの操作
は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社′！ＡＤ
ＮＡＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒに上記反応条件をプ
ログラムすることで行った． 栓エ出 反応液から、増輻されたヌクレオチド断片を検出するた
め，アガロース電気泳動を以下の様に行った． アガロースゲルはゲル濃度２％（ ｗ ／ ｖ ）とし
、臭化エチジウム《０．５μｇ／ｍ Ｉ ）を含むもの
を用いた．泳動の電気的条件は、定電圧１ ０ ０ Ｖ
，＆９間は３０分行った．操作方法ならびに他の条件は
Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（１９８２）に記載されている技法で行った．反応
液の他に分子量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移
動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さを算出した
．直１ 前述したように、ａｒａ Ｃ遺伝子は、すでに塩基配列
が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、すな
わち、プライマーがＰＣＲにより、！！ｌｔａさせてく
るヌクレオチドの大きさは推定できる．それによると，
プライマ− （ａ）と（ｂ）では、３２９塩基、 （ａ
）と（ｃ）では、 ５３９塩基の長さのヌクレオチドが
増幅されてくるはずである．表１に示した数値は，上記
方法で増幅されてきたヌクレオチドの長さを測定した結
果で、単位はキロ塩基対である． 同表からわかるように、 各フ゜ライマーの 組合せとも、 推定されたヌクレオチドの長さと一 致しており、 これらが、 Ｃ遺伝子の標的として いる領域を正しく増幅してきていることを示している． 表 １ （ａ）＋（ｂ） （ａ）＋（ｃ） 旧２２ｌ：農林水産省３２畜衛生試験場（実施例２〉 実施例１で得られた結果が， ． ＳａｌＩｌ＋ｏｎｅ
ｌｌａ菌に対し選択的なものか確かめるため，Ｂ床検査
においてＳａｌ＋ｗｏｎｅｌｌａ菌以外で検査対象とな
り得る菌種について比較検討した． 方法は、実施例１に示したものと同じであるが、（２）
． （６）． （１ｇ）の株については嫌気的条件下、
４０℃で終夜培養を行い、ＰＣＲ法に適用しうる試料を
調製してきた．検体の調製において培養した菌は，表２
の縦の見出しに示した１１菌株である．また，ヒト胎盤
由来ＤＮＡは１μｇ ／ ｍ Ｉの濃度のものをｆＩｉ
ｌＦＪシ、これも同様にＰＣＲを行わせた．結果を表２
に示す．表１と同様、澗内の数値の単位はキロ塩基対で
ある．一部の菌種においてＰＣＨの副次的産物とみられ
る，増幅されたヌクレオチド断片が検出されたが，どれ
もａｒａ Ｃ遺伝子のＦＡ基配列から推定されるヌクレ
オチド断片の長さとは異なっている．Ｓａｌａｏｎｅｌ
ｌユ苗と同じａｒａ Ｃ道伝子をこれらの菌種が持って
いれば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチドがはず
である．従って、これらの菌種由来の増幅されたヌクレ
オチド断片はａｒａ Ｃ遺伝子を２２ 識して生成され
たものではないことが明かであり、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ菌とは容易に区別し、検出できることがわかる．なお
、本発明の実施例にに用いているアガロース電気泳動を
前述の泳動条件で行えば１００塩基対以下の範囲であれ
ば５から１０４基対、１００から５００塩基対の範囲で
あれば１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別することがでる．さらに、アクリルアミドなどを
ゲルに用いることでヌクレオチドの長さの測定の精度を
向上させれば、選択的検出における信頼度はさらに高ま
るものと考えられる． （以下余白） 表 ２ 菌株名 ブライマーの組合せ （ａ）＋（ｂ） （ａ）＋（ｃ） ！；ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｇ＋ｕｒｉｕｍ （ＩＦＯ１２５２９） ０．３３ ０．５４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｃａ＋ａｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅＪｕｎｉＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｖｉｂｒ［ｏ ｐａｒｉｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＳ
ｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓＣｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｓ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＳｈｉｇｅ目
ａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌ
ｅｘｎｅｒｌＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ （１）０．２０ （２） （３）０．５０ （４）０．５０ （５）０．１０ 〈６〉 （７）０．８０ （８）０．５０ （９）０．８０ ０．２０ ０．４０ ０，２０ ０．２０ Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｅｎｔａ （１２） Ｇｏｌｌｅｃｔｌｘｎ，（１２冫Ｈｕｍａｎｐｆａｃｅ
ｎｔａｌ ＤＮＡ Ｏｎｃｏ社製 ［ 発明の効果 ］ 本発明では，ＰＣＲ法を用いたことで，ＳユＩｍｏ−ｎ
ｅｌｌａ菌の検出に３いて，遺伝子増幅作用による高い
検出感度と、２つあるいは、 それ以上のプライマーで
反応が規定されることによる高い選択性を得ることがで
きる． また、高い検出感度のため、多量の検体を必要
とせず、検体の前処理が簡便で済む．しかも、反応時間
が短く、検出も簡単な機材だけで済み，操作も容易なた
め同定までの時間を大幅に短縮できることができる．以
下の実施例に示すが、反応時間が４時間，検出にかかる
操作が３０分である．また．検出にアガロースゲル電気
泳動と奥化エチジウムによる核酸染色法をもちいること
ｒ、プライマー等に標識せずに検出が行え、しかも、核
酸の長さが確２″２できるので結果の信頼性が高いもの
となる， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌のａｒａ Ｃ道伝
子は、Ｓａｌａ＋ｏｎｅ目ａｍに属する全ての閑株に背
遍的に存在していると考えられる． したがって，この
遺伝子を標的とすることでＳ＾ｌｓｏｎｅ ｌ Ｉａｆ
ｆｌ Ｇ ＦＪを一括して検出することができる．一方
、ヌクレオチド配列における他の生物種のｉｒａ Ｃ遺伝子とは相 同性が少ないことからＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌に対する
選択性は維持される．
Claims (7)
- （１）検体中におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属に分類さ
れる菌を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチドま
たは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌のａｒａＣ遺伝子をコー
ドするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド
配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレ
オチドであつて、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＣ
（３’）…（ａ） （５’）ｄ−ＴＡＣＣＧＣＣＡＴＡＣＧＴＣＴＧＡＧＣ
（３’）…（ｂ） （５’）ｄ−ＧＴＴＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＡＣＧ
（３’）…（ｃ） または対応する相補的配列から成ることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - （２）請求項第１項に記載された各オリゴヌクレオチド
の配列のうち、少なくとも連続した１０塩基以上を含む
オリゴヌクレオチド。 - （３）請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオチドの
配列のうちの１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反
応のプライマーとして機能させ標的ヌクレオチド配列を
選択的に増幅させることを特徴とする方法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
した場合その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応
の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマー
によるハイブリダイゼーシヨンを繰り返すことにより特
定のヌクレオチド配列を増幅させ、それを電気泳動、ク
ロマトグラフィーで検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することでＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ菌の検出を行うことを含む方法。 - （４）請求項第３項記載の方法における反応物から電気
泳動、ないしクロマトグラフイーにより増幅されたヌク
レオチド配列を分離し、この分子量を決定することによ
り前記検体中に認識されるべき配列が存在しているか否
かを判定することでＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌の検出を行
うことを含む方法。 - （５）請求項番３項記載の方法における反応物からアガ
ロース電気泳動および臭化エチジウムによる核酸染色を
行うことによる検出方法。 - （６）請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオチドの
配列の１つを有するオリゴヌクレオチドをプローブとし
て機能させ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレ
オチド配列を選択的に検出する方法。 - （７）請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオチドの
配列の１つを有するオリゴヌクレオチドが標識物で修飾
されていることを特徴とする請求項第６項記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568389A JPH0789958B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| DE69032778T DE69032778T2 (de) | 1989-07-18 | 1990-07-17 | Verfahren zur Untersuchung von durch Mikroorganismen verursachten Lebensmittelvergiftungen und Reagens dafür |
| EP90113661A EP0409159B1 (en) | 1989-07-18 | 1990-07-17 | Method for testing causative microorganism of food poisoning and reagents therefor |
| US08/126,754 US5529910A (en) | 1989-07-18 | 1993-09-27 | Method for testing causative microorganisms of food poisioning and reagents therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568389A JPH0789958B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0349698A true JPH0349698A (ja) | 1991-03-04 |
| JPH0789958B2 JPH0789958B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16175040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18568389A Expired - Fee Related JPH0789958B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789958B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7241566B2 (en) | 2001-06-22 | 2007-07-10 | Marshfield Clinic | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella sp., E. coli O157:H7, and Listeria monocytogenes |
-
1989
- 1989-07-18 JP JP18568389A patent/JPH0789958B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7241566B2 (en) | 2001-06-22 | 2007-07-10 | Marshfield Clinic | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella sp., E. coli O157:H7, and Listeria monocytogenes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0789958B2 (ja) | 1995-10-04 |
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