JPH03500004A - アシル‐ペプチド ヒドロラーゼならびにその製造法および用途 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 アシル−ペプチドヒドロラーゼならびにその製造法および用途発明の背景 発明の分野 本発明は組換えＤ　Ｎ　Ａ法によるアシル−ペプチドヒドロラーゼの製造に関す る。また、この酵素を用いてアシル化ペプチドまたはタンパク質の加水分解を、 および誘導体化Ｎａ−アセチルアミノ酸供与体と遊離のα−ＮＨ１基を有する受 容タンパク質の間の反応を触媒することにも関する。

技術的背景の簡単な説明 タバコモザイクウィルス　コートタンパク質のアミノ末端にアセチル基が発見さ れて以来、多数のＮ“−アセチル化タンパク質が動物、植物、゛およびそれらの ウィルスにおいて、さらに細菌および菌類においても発見された。従って、Ｎ” −アセチル化は生物における代表的なタンパク質修飾の１つと考えられている。

さらに、一部の真核細胞では、細胞内可溶性タンパク質の８０％以上がＮ＃−ア セチル化されていることが示唆されていた［Ｂｒｏｖｎ、　Ｊ、　Ｌ、　＋　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　２５４　：１４４７−１４４９（１９７９ル 。

タンパク質のＮ′−アセチル化の生物学的な意義については今なお未解決の問題 である［Ｔｓｕｎａｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｓｏｌ、 　１０６　：　１６５ｌ６５−１７０（１９を参照コ。この翻訳後修飾は細胞内 タンパク質をタンパク質加水分解から保護するもので市ると提案されていた。し かし、このことはすべてのタンパク質には当てはまらない。枯菌からのアクチン の場合、タンパク質がＮ“−アセチル化されるとタンパク質加水分解は遅くなる 。対照的に、ネコのヘモグロビンはＮ＃−アセチル化とは関係なく同じ速度で分 解される［Ｔｓｕｎａｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４コ。

最近のＤＮＡ配列決定の結果から、Ｎ＃−アセチル化される分泌タンパク質の構 造遺伝子においては、アセチル化されるアミノ末端残基のコドンは付加的なアミ ノ酸のコドンが挿入されることなく、直接、開始コドンが前に存在していること がわかった［Ｔｓｕｎａｓａｖａ　ｅｔａｌ、　、　１９８４］。Ｎ“−アセチ ル化と生物学的膜を通過する分泌タンパク質の運搬の間の関係を理解するための 努力はわずかしか行われていない。Ｎ“−アセチル化の機能を完全に理解するた めには、タンパク質およびペプチド中のＮ　’−アセチル化アミノ酸を微量分析 尺度で同定することが重要となろう。このためには、Ｎａ−アセチル基またはＮ “−アセチルアミノ酸の除去が効率的に行われなければならない。

アシル−ペプチド　ヒドロラーゼ（ＡＰＩ）はＮ″〜アシル化ペジペプチド水分 解に成功裏に用いられていた。動物の肝臓から精製されたそのような酵素の１つ は、Ｎａ−アセチル化されたタンパク質由来のやや短いペプチドからＮａ−アセ チルアミノ酸を放出させることができる［Ｔｓｕｎａｓａｔａ　ｅｔ　ｓｌ、　 ＋　１９８４］。基質特異性はアミノ末端残基に対して広い。ＡＰＲは、ブロッ クされたペプチドからＮ’−末端のアセチルアミノ酸あるいはホルミル化アミノ 酸を切断する［Ｊｏｎｅｓ　ｅｔａｌ、　、　ＢＢＲＣ１２６：　９３３（１９ ８５）］。この酵素は多種多様のペプチドの加水分解を触媒し、それを行う際に ある種の基質に対しては異なる最適ｐＨを示す。また、この酵素は生合成中のポ リペプチド鎖のプロセッシングにおいて重要な役割を演じることもある。アセチ ル化された基の存在は多くのタンパク質で検出されないが、これはほとんどの場 合、第１アミノ酸とともに形成期ポリペプチド鎖のブロック基が生合成中のどこ かで除去されるためである。ＡＰＨは、ラット肝臓から［Ｔｓｕｎａｓａｖａ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ、　７７　：　８９−１０２（１９７ ５）コ、ウシ肝臓から［Ｇａｄｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｂｉｏｅｈｉｍ、　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　６６２　：　８６−９３（１９８１）コ、ブタ肝臓か ら［Ｔｓｕｎａｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９３　：　 １２１７−１２２０（１９８３）コ、ラット脳から［Ｍａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅ＋ｎ、　４１　：　２０１−２０８（１９８３）］ 、およびヒト赤血球から［Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａ ｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、　１２Ｂ　：　９３３−９４０（１９８５）］、精製されている。

本発明は、第１図のアミノ酸配列からなるアシル−ペプチドヒドロラーゼ（ＡＰ Ｒ）タンパク質に関する。また、本発明は、組換えＤＮＡ法によるＡＰＨの製造 、およびペプチドまたはタンパク質のアミノ−アシル化または加水分解において ＡＰＲを利用することに関する。

本発明のＡＰＲをコードしている組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を用いて多数のあらゆる 宿主を形質転換し、ＡＰＨの新規な供給源およびその無制限の供給を得ることが できる。本発明の目的は、無制限の供給が可能な実質的に純粋なＡＰ）（の新規 供給源を提供することである。

さらに、本発明は、Ｎ＃−アシル化タンパク質の加水分解、またはＮ“−アセチ ルアミノ酸供与体と遊離のα−ＮＨ，Ｉを有する受容タンパク質の間の反応を触 媒させるためにこの酵素の利用することをも包含するものである。

従って、本発明の別の目的はＡＰＨを用いることによって、Ｎ−アシル化タンパ ク質を加水分解する方法、および遊離のα−Ｎ　Ｈを基を有する受容体とＮ’− アセチルアミノ酸供与体からあらゆるポリペプチドまたはタンパク質をアミノ− アシル化する方法を提供するこ第１図はＡＰＨのアミノ酸配列を示すものである 。下線部分および斜線部分は、ＡＰＨのトリプシンおよび臭化シアンフラグメン トのエドマン分解法、およびクローンＡＰＨ３６、ｌ　ｃＤＮＡのジデオキシ鎖 終止配列決定法によって決定した領域である。星印はグリコジル化の可能性のあ る部位を示す。斜線部分はセリンとヒスチジンの両方を含む活性部位を示す。

第２図は、縮重プローブＹＳ１７．２およびＹＳ２０．１の配列を得たＡＰＩペ プチドを示すものである。

第３図は、ＡＰＨをコードしている遺伝子を同定および単離するために、プロー ブでｃＤＮＡライブ、ラリ−をスクリーニ・ングする際の工程図を示すものであ る。

第４図は、ＡＰＩ３６．１クローンのファージＤ　Ｎ　Ａ挿入体のＤＮＡ配列を 示すものであり、ラット肝臓クローンＡＰＨ３６，１由来の付加的な３°非翻訳 化配列を加え、ラット血清アルブミン配列を除くものである。

第１図および第４図において、アミノ酸は次の１文字のアルファベットで示され ている：Ａ＝アラニン、Ｂ＝アスパラギン酸またはアスパラギン、Ｃ＝システィ ン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝ニブ リシンＨ＝ヒスチジン、１＝インロイシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メ チオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝ニブロリンＱ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン 、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、■＝バリン、Ｗ＝ニトリブトファンＹ＝チロシ ン、Ｚ＝グルタミンまたはグルタミン酸。

用語の意味する範囲を示し、明細書および請求の範囲の理解を助けるために以下 に定義を挙げる。

れは転写と翻訳の組合せである。

プラスミド：特定の抗生物質に対する耐性を伝達する遺伝子を含有している生物 の主染色体の一部ではない環状の２本鎖ＤＮＡ分子。

プラスミドが単細胞生物中に入れられると、プラスミドＤＮＡのために生物の性 質が変化、即ち形質転換される。例えば、テトラサイクリン耐性の遺伝子（Ｔ　 ｅｔ”）を担持しているプラスミドは、それまでテトラサイクリンに感受性であ った細胞を耐性の細胞に形質転換する。プラスミドによって形質転換された細胞 は「形質転換体Ｊとド、ファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列。クローニン グ媒体は、そのＤＮＡの必須の生物学的機能を失うことなくＤＮＡ配列を決定可 能な方法で切断することができる１または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を 特徴とし、形質転換された細胞を同定する際に用いるのに適したマーカーを含ん でいることもある。マーカーは、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリ ン耐性である。クローニング媒体はベクターと呼ばれることが多い。

組換えＤＮＡ分子またはハイブリッドＤＮＡ　：生細胞の外で末端−末端結合さ れた異なるゲノム由来のＤ　Ｎ　Ａセグメントで構成される分子であり、ある種 の宿主細胞に感染する能力を有し、その中で維持される分子。

それによって隣接遺伝子（群）の転写をコントロールすることができるＤＮＡ配 列。

プロモーター：　ＲＮＡポリメラーゼが結合し、隣接遺伝子（群）の転写を開始 させるＤ　Ｎ　Ａ配列。

アシル−ペプチドヒドロラーゼ（、ＡＰＨ）：この用語は、インビボまたはイン ビトロの系においてあらゆるタンパク質またはペプチドからＮ’−末端アシル化 アミノ酸を放出させる活性を有する、あらゆる種由来のアシル−ペプチドヒドロ ラーゼ（群）を含むことを意味する。また、本発明においては、アシル−ペプチ ドヒドロラーゼなる用語は、ペプチドまたはタンパク質のＮａ−末端部分からＮ ”−アセチル化アミノ酸を切断する、天然のアシル−ペプチドヒドロラーゼのあ らゆる類似体、同族体、突然変異体または誘導体を含むように用いる。また、こ の用語は、タンパク質またはペプチドのＮ−末端からアシル化アミノ酸を切断す る活性を保持している天然アシル−ペプチドヒドロラーゼの部分フラグメントな どの、天然のアミノ酸数よりも少ないアミノ酸を有するフラグメントをも含むこ とを意味する。さらに、この用語は、天然のアシル−ペプチドヒドロラーゼまた はその類似体の配列を１またはそれ以上の周辺のアミノ酸とともに含有し、そし てアシル−ペプチドヒドロラーゼ活性を示すあらゆる産物を含むように用いる。

また、アシル−ペプチドヒドロラーゼなる用語は、アシル−アミノ酸放出因子、 アシル−アミノ酸放出酵素、アシルーアミノベブチドヒド屯ラーゼおよびアセチ ルアミノアシル−ｐ−ニトロアニリダーゼなどの同義体をも包含する。

実質的に純粋な形態二本明細書で用いる「実質的に純粋」または「実質的に純化 された」なる用語は、天然の状態でこの因子に通常伴われるあらゆる化合物を実 質的に含まないタンパク質を説明するものである。さらに、この用語は、当分野 で通常の技術を有する者が用いるｌまたはそれ以上の純度または均質性の性質か ら均質である因子を記述するものである。例えば、実質的に純粋な因子は、分子 量、クロマトグラフィー法およびそのような他のパラメーターに対して標準実験 偏差内の一定かつ再現性ある性質を示すであろう。

しかし、この用語はこの因子と他の化合物との人工あるいは合成の混合物を除外 することを意味するものではない。また、この用語は、この因子の生物学的活性 を妨げず、かつ例えば不完全な精製のゆえに存在することもある少量の不純物の 存在を排除することを意味するものではない。

創りすμ秒羞 本発明は、第１図に示したアミノ酸配列を有する酵素、この酵素をコードしてい る遺伝子配列、この遺伝子配列を含有している媒体、これによって形質転換した 宿主、形質転換宿主発現による酵素の製造、およびペプチドまたはタンパク質の アミノ−アシル化または加水分解におけるこの酵素の利用を包含するものである 。

ゲル濾過で測定するとラット肝臓ＡＰＨの分子量は２９０．０００−３２０．０ ００である。サブユニットあたりに１つの活性セリンを有する４つの同じサブユ ニットが存在するようである。ＡＰＲのＮ１−末端はアシル化されている。ＡＰ ）Ｉは、セリン、ヒスチジンおよびカルボキシル基が関与する電荷リレー系を有 するセリンプロテアーゼのようである。活性部位の周辺は、ヒスチジンの存在に より他のトリプシン族のプロテアーゼとは異なっている。ＡＰＨは基質に対して 広い特異性を示すが、Ａｃ−Ａｌａ−１Ａ　ｃ−３ｅｒ−１およびＡｃ−Ｍｅｔ −含有のペプチド（最も普通のＮ−末端残基）を他のアシル化ジペプチドよりも 一層効率的に切断する。ＡＰＨは、Ａ　ｃ−Ｔ　ｒｐ−１Ａｃ−Ａｓｐ−１Ａ　 ｃ−Ｇ　１ｕ−１Ａ　ｃ−Ａ　ｒｇ−１Ａ　ｃ−Ｐ　ｈｅ−１およびＡｃ−Ｐｒ ｏ−含有のペプチドに対しては活性を有していないか、または極めて低い活性し か有していない。

アシル−ペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）は、タンパク質がアセチル−ＣｏＡか らアセチル基を受け取る反応を触媒するＮ’−アセチルトランスフェラーゼとは 区別されるべきである［Ｔｓｕｎａｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｂｒｙｏｌｏｇｙ　１０６　：　１６５−１７０（１９８４）コ。ま た、アシル−ペプチド　ヒドロラーゼは、α−Ｎ−アシルアミノ酸ヒドロラーゼ ｊＧａｄｅ　ｅｔａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ 　６６２　：　８６−９３（１９８１）］としても知られているアミノアシラー ゼＣ５ｚａｊａｎｉ、Ａｃｔａ　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｈｕｎｇ、１５　：　２２３−２２８（１９８０）］とも区別される べきである。

ＡＰＨはいくつかの供給源から単離および精製されているが、ＡＰＨの配列は決 定されていなかった。本発明はこの配列を開示するものである（第１図）。

ＡＰＲをコードしているＤＮＡ配列は種々の供給源から得ることができる。例え ば、ノーザン・プロ。２ト法［Ａ１５ｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、ＭｅｔｈｏｄＥｎ ｚｙｍｏｌ、　６８　：　２２０−２４２（１９７９）］、およびラベルしたオ リゴヌクレオチドプローブを用いて、ＡＰＨを産生じているあらゆる種の組織か らＡＰＨをコードしているｍＲＮＡを単離することができる。次いで、このｍＲ ＮＡを当業者には既知の方法によってｃＤＮＡに変換することができる。プロー ブはＡＰＲペプチドの既知のアミノ酸配列に基づいて合成することができる。

別法では、縮重ＤＮＡプローブを用いてＡＰＩを産生じている種のＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングし、それによってＡＰＩをコードしているＤＮＡ配列を 含有しているクローンを単離することができる。このＤＮＡライブラリーは、１ またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いるゲノムＤＮＡのフラグメント 化、それに続くベクターへの導入、およびそれを用いることによる宿主細胞の形 質転換によって得られ、次いで宿主細胞を培養およびスクリーニングする。

ＤＮＡプローブは検出可能な一団によってラベルすることができる。そのような 検出可能な一団は、検出しうる物理的または化学的性質を有するあらゆる物質で あってよい。そのような物質は免疫検定法の分野で広く開発されており１、通常 、そのような方法でを用なほとんどすべてのラベルを本発明に適用することがで きる。特に有用なものは、酵素的に活性な群、例えば酵素［ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈ ｅｗ、μ：　１２４３（１９７６）を参照］、酵素基質［英国特許明細書１．５ ４８．７４１を参照コ、補酵素［米国特許Ｎ　ｏ、　４．２３０．７９７および ４．２３８．５６５を参照］および酵素阻害物質口米国特許Ｎｏ、　４．１３４ ．７９２を参照コなど：蛍光物質［ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｅｗ。

２５　：　３５３（１９７９）を参照］：発色物質；ルミネッセンス物質、例え ば化学ルミネッセンス物質および生物ルミネッセンス物質［ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈ ｅｗ。

２５　：　５１２（１９７９）を参照］：特異的に結合しうる配位子；近接の相 互作用する対：ならびに放射性同位体、例えばｓＨ，＠ＳＳ、＠ｔｐ、ｔｔＪお よびＩ４Ｃなどである。このようなラベルおよびラベルする対は、それら自身の 物理的な性質（例えば、蛍光物質、発色物質および放射性同位体）またはそれら の反応もしくは結合の性質（例えば、酵素、基質、補酵素および阻害物質）に基 づいて検出される。例えば、補助因子ラベルされたプローブは、酵素（ラベルは この酵素のための補助因子である）と酵素のための基質を加えることによって検 出することができる。例えば、基質に作用して測定可能な物理的性質を有する産 物を生成する酵素を用いることができる。後者の例には、β−ガラクトシダーゼ 、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが含まれるがこれらに限定は されない。

連結（ライゲート）のための平滑末端化または付着末端化、適切な末端を得るた めの制限酵素消化、適当なところでの付着末端の充填、望ましくない結合を避け るためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なりガーゼによる連結を包含 する常法に従い、ベクターＤＡＰＨを発現させるためには、適当な宿主要素によ って認識される転写および翻訳シグナルが必要である。真核宿主は、インビトｃ で培養することができる哺乳動物細胞、特に白血球、とりわけ骨髄腫細胞または 他の形質転虜されたかもしくは腫瘍性のリンパ球、例えばＥＢＶ形質転換された 細胞であってよい。別法によれば、非哺乳動物細胞も用いることができ、細菌、 菌類、例えば酵母、糸状菌などを用いることができる。

ＡＰＲ製造のための可能性ある宿主は、インビトロの組織培養で、または動物中 インビボで増殖させた哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、正しい折り畳みあ るいは正しい部位のグリコジル化を含むＡＰＨ分子に対する翻訳後修飾を付与す ることができる。宿主として有用な哺乳動物細胞には、ＢＥＲＯもしくはＣＨＯ −Ｋｌなどの線維芽細胞起源の細胞、またはハイブリドーマＳ　Ｐ　２１０−Ａ Ｇ　１４もしくは骨髄腫Ｐ３ｘ６３Ｓｇｈなどのリンパ様細胞起源の細胞、およ びそれらの誘導体が含まれる。通常、ＡＰＨ構築物は、宿主細胞によって認識さ れる複製系を有するベクターの一部であろう。

好ましい態様では、ＡＰＨをコードしている遺伝子を担持しているプラスミドに よって原核細胞を形質転換する。特に重要な細菌性宿主には、大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）Ｋ　１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−１λ−、プロトトロピー性：ＡＴＣＣ２ ７３２５）、およびその他の腸内細菌科の細菌、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　 ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍあるいはＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、およ び種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ種が含まれる。このような条件下ではＡＰＨはグ リコジル化されないであろう。原核性宿主は、発現プラスミド中のレプリコンお よびコントロール配列に適合するものでなければならない。ＡＰＨをコードして いるｃＤＮＡを含有するプラスミドを保持している原核性宿主は、１９８７年８ 月２１日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシラン［Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｌ　Ｉｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、　ＭＩＬ　Ｌ：ＳＡコに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６７５０４を得ている。

通常、宿主細胞に適合しうる種から導かれるレプリコンおよびコントロール配列 を含有しているそのようなベクターは、宿主との関係で用いられる。このベクタ ーは、通常、レプリコン部位ならびに形質転換細胞において表現型選択を与える ことができる特定の遺伝子を担持している。また、ＡＰＲをコードしているＤＮ Ａの発現を、他の調節配列（形質転換されていない状態の生物にとってホモロー ガスであってよい）の支配下に置くこともできる。例えば、ラクトース依存性の 大腸菌染色体ＤＮＡは、酵素β−ガラクトシダーゼを同化してラクトース利用を 仲介するラクトースまたはｌａｃオペロンを含有している。ｌａｃコントロール 要素は、大腸菌に感染性であるバクテリオファージλｐｌａｃ５から得ることが できる。ｌａｃプロモーター−オペレーター系はＩ　ＰＴＧによって誘導するこ とができる。

他のプロモーター／オペレーター系またはその一部も同様に用いることができる 。例えば、コリシンＥ１、ガラクトース、アルカリホスファターゼ、トリプトフ ァン、キシロース、ｔａｘなどを用いることができる。

哺乳動物宿主のために、いくつかの可能性あるベクター系を発現用に利用するこ とができる。ある群のベクターは、ウシ乳頭楯ウィルス、ポリオーマウィルス、 アデノウィルス、または５Ｂ４０ウイルスなどの動物ウィルスから得られる、自 律的に複製する染色体外プラスミドを与えるＤＮＡ要素を利用している。第２の 群のベクターは、所望の遺伝子配列の宿主染色体への組込みに依存している。

導入ＤＮＡを染色体中に安定に組込んでいる細胞は、発現ベクターを含有してい る宿主細胞の選択を可能にするマーカーをも導入することによって選択すること ができる。このマーカーは、栄養要求変異宿主にプロトトロピーを、生物致死剤 （例えば、抗生物質、または銅などの重金属）耐性を付与するものであってよい 。選択マーカー遺伝子は発現させようとするＤＮＡ配列に直接結合させてもよい し、また同時形質転換によって同−細胞中に導入してもよい。また、別の要素が ｍＲＮＡの合成を最適にするために必要となることもある。これらの要素には、 スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサ−１および終止シ グナルが含まれる。このような要素を導入したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ発現ベクターには 、Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，＋　Ｍｏ１．　Ｃｅｌ。

Ｂｉｏｌ、　３　：　２８０（１９８３）が記載しているベクターなどが含まれ る。

宿主の性質に依存して多種多様の転写および翻訳調節配列を用いることができる 。この転写および翻訳シグナルは、調節シグナルが発現レベルの高い特定の遺伝 子に結合しているアゾ／ウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サルウィルスなどのウ ィルス供給源から得ることができる。別の方法によれば、アクチン、コラーゲン 、ミオシンなどの哺乳動物発現産物由来のプロモーターを用いることができる。

また、抑制または活性化を与える転写開始シグナルを選択して遺伝子の発現を調 節することもできる。重要なのは、温度感受性であって温度が変わると発現を抑 制するかまたは開始させることができる調節シグナル、または化学的な調節（例 えば、中間代謝物）を受ける調節シグナルである。

構築物を含有しているＤＮＡ配列またはベクターが発現用に調製されたなら、こ のＤＮＡ構築物を適当な宿主に導入することができる。プロトプラスト融合法、 リン酸カルシウム沈澱法、電気穿孔法あるいはその他の通常の方法など、種々の 方法を用いることができる。融合の後、細胞を培地中で増殖させ、適当な活性に ついてスクリーニングする。遺伝子（群）が発現されるとＡＰＨが産生される結 果になる。

ＡＰＨ産生のための宿主細胞は、永久細胞、主に骨髄腫あるいはリンパ腫細胞で あってよい。これらの細胞を、培養フラスコ中の適切な栄養培地で増殖させるか 、または相乗的宿主（例えば、マウスまたはラット）もしくは免疫欠損宿主もし くは宿主部位（例えば、ヌードマウスまたはハムスター嚢）に注射することがで きる。

本発明のＡＰＲは、例えば抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフィニティーク ロマトグラフィー、電気泳動などの通常の方法に従って単離および精製すること ができる。

里養 製造および精製されたＡＰＨを例えば医薬製造の分野で用いて、Ｎ−アシル化さ れたペプチドを加水分解するか、あるいはペプチドのＮ’−末端をアミノアシル 化することができる。前者は水溶液中で行われ、無反応性のタンパク質をエドマ ン配列決定に対して感受性にする。後者は無水に近い環境下で行われ、治療に用 いるタンパク質の分解を減少させるのに有用である。有機合成のための２相系で 酵素を使用することについては、Ａ、　Ｋ１１ｂｉｎｏｖの記載ｒ　Ｌ！ｎｅｏ ｎｖｅｎｔ　１ｏｎｅｎｄｅｒ編、１９７３）を参照。

無水に近い環境はＡＰＩの基質特異性を変え、ペプチドのアミノアシル化が起こ るであろう。有機溶媒中での酵素の基質特異性は、水中での特異性とは根本的に 異なっていることがあり、時には逆であることもある［Ｚａｋｓ　ｅｔ　ａｌ、 　、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、旦８　：　２７６７−２７６８（１ ９１１１６）を参照コ。水と混和するかまたは混和しない溶媒中、トリプシンお よびα−キモトリプシンによってペプチドを合成することができカビのリパーゼ が、多数のほぼ無水の溶媒中で触媒として強力に作用することがわかった。有機 媒体中でのリパーゼの活性は、リパーゼを回収した水溶液のｐＨに依存している 。有機溶媒中での最大のリパーゼ活性は、水中での酵素活性のｐＨ最適条件に一 致する［Ｚａｋｓｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　：　３１９２−３１９６（１９８５）を参照コ。

さらに、酵母から得られるカルボキシペプチダーゼＹなどのセリンカルボキシペ プチダーゼが、アミノ酸エステルまたはアミドまたは他の基質とアミノ酸または 他のアミン成分との反応によってペプチドを合成することができることが示され た（米国特許Ｎ　ｏ、　４．３３９．５３４）。

ＡＰＨなどの酵素は、いくつかの基本的な規則に従うという条件のもと、有機溶 媒中で触媒として強力に機能することができる。これらの規則には次のものが含 まれる＝（１）溶媒の適切な選択（酵素分子から必須の水層を取り除くものでな いときには疎水性の溶媒が最も良い）　；　（２）酵素活性にとって最適ｐＨの 水溶液から回収された酵素の使用；および（３）有機溶媒中での酵素粉末の微細 な分散および激しい撹拌による拡散の制限の排除［Ｚａｋｓ　ｅｔ　ａｌ−＋　 １９８６を参照］。

ＡＰＲ触媒の縮合反応の反応物質は、受容ポリペプチド、例えば遊離のＮ“−末 端基を有するタンパク質、および基質、例えばアシル化されたアミノ酸のベンジ ルアルコール誘導体である。基質の濃度はアミノ−アシル化反応を起こさせるに 十分なものであることが必要である。選択される溶媒は、酵素を囲んでいる必須 の水分子の層を除去しない疎水性の溶媒である。溶媒に入れる前のＡＰＲは、酵 素活性にとって最適のｐＨの水溶液から回収される。溶媒中の微細なＡＰＩ粉末 の分散、および激しい撹拌を行って拡散が制限されることを抑制する［Ｚａｋｓ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１０８：　２７６７−２７６ ８（１９８６）コ。さらに、有機の条件は、酵素が有機媒体に不溶性であること からＡＰＨの抽出を容易にするであろう［Ｚａｋｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔ’　１゜ＡＰＲはその微細な水和粉末形態で懸濁させてもよいし、 また担体上に固定してもよい。−価アルコールなどの不活化試薬に対する酵素の 安定性は固定化によって高められることが多い。トリプシンおよびα−キモトリ プシンは、不溶性のアルミナーホスホコラミノコンプレックス上に固定化される と、水混和性のｍ個アルコールを含む有機溶媒に対して顕著な耐性を示すことが わかった［Ｐｕｇｎｉｅｒｅｅｔ　ａｌ、　、　１９８６］。ＡＰＨを当業者に は既知の方法によってビーズおよびその他の担体に固定化し、次いでこれをバッ チで、またはカラムで用いることができる。

ここまで本発明を一般的に説明したが、本発明は以下の具体的な実施例を参照す ることによってさらによく理解されるであろう。これらの実施例は説明のために だけ本明細書中に挙げたものであって、特に記載がなければ本発明はこれらに限 定されるものではない。

実施例 実施例Ｉ　ＡＰＨの抽出および精製 應扶科：　ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６８％ＦＰＬＣカラム（モノＱＨＲ５１ ５、およびモノ５ＨＲ５１５）、セファクリル５−ｓｏ。

スーパーファイン、オクチル−セファロース、およびポリバッファー７４はＰ　 ｈａｒｍａｃｉａから、スフェロゲルＣＡＡ−ＨＩＣカラム（０゜４６ｘｌＯｃ ｘ）はＢ　ｅｃｌｖａｎから、ヒドロキシルアパタイト（バイオゲルＨＴ）はＢ 　１ｏ−Ｒａｄから、グリセロールはＢＲＬから、リアクチゲル６ＸはＰ　１ｅ ｒｃｅから、そしてアミノ酸（Ａ　ｅ−Ｌ　−Ａ　ｌａ）はＳ　ｉｇｍａから入 手した。他のすべての化学物質は試薬級またはそれ以上であっ酵素の精製：ＤＥ ＡＥセルロースおよびセファロース６Ｂの代わりにＤＥＡＥセファロースＣＬ− ６ＢおよびセファクリルＳ−３００をそれぞれ用いたことを除き、Ｔｓｕｎａｓ ａｗａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（Ｔｏｋｙｏ）７７　： 　８９−１０２（１９７５）ノ記載のようにしｒ３００ｙの５ット肝１ｍ（雄、 ＣＤ株）からＡＰＲを精製した。力・ラムの大きさおよび勾配も変えた。ヒドロ キシルアパタイト　クロマトグラフィーに対しては、出発の勾配は２０ｓ＋ｌｌ リン酸緩衝液ではなく５ｍＭリン酸緩衝液であり、１０％のグリセロールを勾配 に用いた。４１１９の精製酵素を得た。ＤＥＡＥセファロースＣＬ−５Ｂクロマ トグラフイーの間に全活性の増加が観察された。セファクリルＳ−３００からの タンパク質の均質性を確認するために追加のクロマトグラフィーを行った：即ち 、（ｉ）ｐＨ５〜８の種々の緩衝液を用いるモノＱおよびモノＳによるＰｈａｒ ｍａｃｉａ　ＦＰＬＣシステムでのイオン交換クロマトグラフィー：０）オクチ ル−セファロースおよびスフェロゲルＣＡＡ−ＨＩＣによる疎水性相互作用クロ マトグラフィー；（ｉ）ポリバッファー７４を用いるモノＰによるクロマトフオ ーカシング：および（ｍ）リアクチゲル６Ｘ（Ｐｉｅｒｃｅ）およびアセチル− Ｌ−アラニンから調製したＡｃ−Ｌ　−Ａ　ｌａ−セファロースを用いるアフィ ニティークロマトグラフィーである。いずれの場合にも、なお一層の分離あるい は活性の増加は観察されなかった。

工程　活性　タンパク質　比活性　収率　精製度（単位）　（ｉ９）　（単位／ １１９）（％）１　本モジトド　１９４　４４２００　Ｇ、００４３９　１００ 　１．００２１２０００ｘｇ上清　１９４　３９４０Ｇ　０．００４９２　１０ ０　１．１２４熱処理　１３９　２５２０　０．（１５５２６５１１，５５ＤＥ ＡＥ−セフＴＯ−ス　２０ｇ　２９．３　７．１０　１０８　１６３０６　ヒＦ ｏ４ジルアパタイト　１４８　５゜９０　２５．１　７６　５７１１１０実施例 ２　ＡＰＩのトリプシンおよび臭化シアンフラグメントのアミノ酸配列決定およ びプローブの作成本実施例の方法は第３図の左側に示されているものである。

原材料：ＡＰＨは実施例１のようにして精製した。純度はＬａｅｍｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８０−６８５（１９７０）の方法によりＳＤＳポ リアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。

臭化シアン、グアニジン−ＨＣＱ、２−メルカプトエタノール、上りフルオロ酢 酸（ＴＦＡ）はＰ　１ｅｒｃｅから、アセトニトリル（ＨＰＬＣグレードＵＶ遮 断１８８　ｎｍ）はＪ−Ｔ−Ｂａｋｅｒから入手した。Ｎ−トシル−ＰｈｅＣｈ ＊Ｃｇで処理したトリプシンはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎから購入した。Ｂ　ｒａ ｄｆｏｒｍタンパク質検定試薬および電気泳動試薬はＢ　１ｏ−Ｒａｄから入手 した。ただし、分子量マーカーおよびトリスはＳｉｇｍａから購入した。Ｚ　ｗ ｉ　ｔｔｅｒｇｅｎｔ　３−１４はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから、［１４Ｃ］ヨー ド酢酸（９，８＋ｌＩＣ１／ｍモル）はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ ｒから入手した。

他のすべての試薬は、入手可能な市販品のなかで最高純度のものを用いた。

ジスルフィド結合の還元およびヨード酢酸によるアルキル化７Ｍグア＝シフＨＣ （！／２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する０、５Ｍ　）リス−ＨＣｌ２（ｐＨ８，５） 中でＡＰＨ（３ｎモル）を変性し、アルゴン下、室温で１２時間または３７°Ｃ で３時間、８〜１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを用いて還元した。この混合 物（０，１９ｍのにｉ’　ｌ　Ａ　Ｃコヨード酢酸［３０μＱの０，５晃　トリ ス−ＨＣＱ（ｐＨ８，５）／７聞グアニジンＨＣｌ２／２ｍＭ’ＥＤＴＡ中に２ ．６μモル］を加え、この反応を暗所中、３７°Ｃで１時間行った。次いで、２ −メルカプトエタノールを最終濃度Ｑ、２Ｍ１ｍなるまで加えた。このタンパク 質を、４容量のアセトン／メタノール（３：１、ｖ／ｖ）による沈澱またはＯ， ＬＭの酢酸に対する透析によって脱塩し、５ａｖａｎｔコンセントレータ−／エ バポレーターで凍結乾燥した。

カルボキシメチル化したタンパク質を７０％ギ酸（０，１〜０．２１１２）に溶 解し、これにＣＮＢｒ溶液（７０％ギ酸中１００ｏ／ｘの（１０〜１５μｅ）を 加えた。この混合物を室温で２４時間インキュベートし、水で希釈した後に真空 乾燥した。このＣＮ　Ｂ　ｒ切断したペプチドフラグメントを逆相ＨＰＬＣ（Ｒ ＰＬＣ）で精製するか、またはトリプシン消化によってさらにフラグメント化し た。

トリプシンによる消化 ０．２％Ｚ　ｗｉｔｔｅｒｇｎｔ　３−１４を含有する（）、２Ｍ炭酸水素アン モニウム（０，２１１２）にＣＮＢｒペプチドを溶解し、Ｎ−）シル−ＰｈｅＣ Ｈ，。

ＣＱで処理したトリプシン（５０ｐモル）を用いて３７℃で２０時間消化した。

この消化物を真空乾燥し、ＲＰＬＣ精製用に０．１％ＴＦＡ中の６Ｍグアニジン ＨＣｉ２に溶解した。

逆相ＨＰＬＣによるペプチドフラグメントの精製ＣＮＢｒフラグメントについて は０４カラム（Ｖｙｄａｃｌｏ、　４６　ｘ　２５ｃｍ、３００人の孔を有する １０ミクロンの粒子）、またトリプシンフラグメントについてはＰｈｅｎｙｌカ ラム（Ｖｙｄａｃ、　Ｏ−４６ｘ２０　”５３００人の孔を有する５ミクロンの 粒子）を用い、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＨＰ　ＬＣシステム３４４によるＲＰＬＣによ ってペプチドを精製した。

粗製のペプチド混合物を、０．１％ＴＦＡで平衡化したカラムにかけ、０．１％ ＴＦＡ中の０〜８０％アセトニトリルの直線勾配液を用い、１　ｗ（１／分の流 速で１６０分で溶離した。溶出液は２１４ｎＩｍと２８０ｎｍの両成敗でモニタ ーした。それぞれのピークを集め、必要なら、乾燥して６ＭグアニジンＨＣｅ− ０，１％Ｔ　Ｆ　Ａ（０，：）＋Ｑ’）に再溶解した後に同じカラムを用いてイ ンクラティックＲＰＬＣによりさらに精製した。それぞれの分画のペプチドを分 離するためのアセトニトリルの最適濃度は最初のＨＰＬＣの溶出ノくターンから めた［Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｆｉａｔ’　１．　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　：　７７１１−７７１５（１９８T）の式 ］ アミノ酸分析 アシル−ペプチドヒドロラーゼを０．１Ｍ酢酸に対して徹底的に透析し、凍結乾 燥し、そして０．１％フェノールを含有する５ＮＨＣＱ中、４８時間および２４ 時間、１１０℃で加水分解した。アミノ酸組成をＢｅｃｋｍａｎ　６３００アミ ノ酸分析機によって測定した［１１１ｒｓ。

ペプチドの配列決定 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａタンパク質配列決定機および Ａｌ）Ｉ）ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　１２０Ａ　Ｐｔｈ分析機を用いてペ プチド配列の分析を行った［［１ｅｓｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、　２５６：　７９００−７９９７（１９８１）を参照コ。

プローブの作成 ２種類のオリゴヌクレオチドプローブＹＳ２０．１およびＹＳ１７．２を２種類 のペプチドのアミノ酸配列から作成した（第２図を参照〉。これらのプローブは 、シリカを基剤とする固相法［Ｍａｔｔｅｕｃｃｉｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ａ ｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　１０３　：　３１’８５−３１９１（１９８１） Ｅおよびプロトン活性化ヌクレオシドホスホルアミダイト法ｒＢｅａｕｃａｇｅ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２２　：　１８５９− １９６２（１９８１）Ｕを用い１．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３ ｇ０ＡＤＮＡ合成機によって合成した。精製したオリ゛ゴヌクレオチドをＰＡＧ Ｅによって粗製の合成混合物から単離し、［−”Ｐ］ＡＴＰで９ｘｌｏ’の比活 性ニラヘルした。ＹＳ１７．２およびＹＳ２０゜１は１２８−倍の縮重オリゴヌ クレオチドのプールである。このＹＳ１７．２およびＹＳ２０．１プールは長さ がそれぞれ１７および２０ヌクレオチドであった。２つのプローブは１２ヌクレ オチドが重なっており、これらのプローブを連続して用いてＤ　Ｎ　Ａライブラ リーをスクリーニングすると２５ヌクレオチド片のＡＰＨをコードしているＤ　 Ｎ　Ａが効率的にスクリーニングされる。

衷旌ｆ’ＡＩ３　ｃＤＮＡライブラリーの作成およびスクリーニングならびにＡ ＰＲをコードしているｃＤＮＡの配列決定本実施例の方法は第３図の右側と下の 部分に示されているものである。

ラットの肝臓を液体Ｎ、中で急速冷凍し、グアニジンインチオシアネート中で解 凍し、ＲＮＡをＣ５（Ｊ！を用いる遠心によって精製しプローブｐＡＣＴ−１へ のハイブリダイゼーションによって無傷であることが示された［Ｓｐｉｅｇｅｌ ｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２５８　：　１００８３−１ ００８９０９８３）］。

Ｇｕｂｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　２５　：　２６３−２６９（１９８３ ）が修飾を加えたＯｋａｙａｍａｅｔ　ａｌ。、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 　２：　１６１ｌ６１−１７０（１９の方法によって１０μｉＦのポリ（Ａ）’ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡの末端をＴ４　ＤＮＡポリメラー ゼで平滑にし、内部のＥｃｏＲ１部位をメチル化した後、このｃＤＮＡをＥｃｏ ＲＩリンカ−に連結した。次いで、このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを過剰のＥｃｏＲＩで消 化し、セファロースＣＬ−４Ｂのクロマトグラフィーにかけた。５００ｂｐ以上 のｃＤＮＡを集め、トリスホウ酸緩衝液中、０．８％アガロースゲルでさらに分 画した。

ｌｋｂ以上で移動するｃ　Ｄ　Ｎ　ＡをＮＡ−４５紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　 ＆　５ｃｈｕｅｌｌ）を用いて集めた。２０μＱ中、大きさの選択を行ったｃＤ ＮＡ（１００μ９）に脱ホスホリル化したｇｔｌ　ＩＥＹｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｌ」謀奪堕：　１１９４−１１９８（ １９８３）を参照］ＤＮＡ（１０μｇ）を連結し、インビトロでパッケージング を行った［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　（１９８２）（Ｃｏｌ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）を参照コ。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株Ｙ１ ０８８を組換えファージで感染させ、ライブラリーをスクリーニング用に培養し た。

始めに４５０，０００のクローンを培養し、ＹＳ２０．１を用いてスクリーニン グした。４５０．０００のうち２７の複製するポジティブなプラークが観察され た。これら２７のうち１２を単離し、精製し、次いでＹＳ１７．２を用いて再ス クリーニングした。１２のうちの１つのプラークだけが真のポジティブであるこ とが観察された。

このクローンをＡＰＨ５，２と命名した。ＡＰＨ５，２中のｃＤＮＡ挿入体が正 しくＡＰＲをコードしていることを確認するため、オリゴハイブリダイゼーショ ン部位の領域をジデオキシヌクレオチド鎖終止法ＩＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９４　：　４４１−４４８（１９７５）を 参照］によって配列決定した。この配列を翻訳させると、オリゴヌクレオチドプ ローブの設計に用いたペプチド配列と同一のペプチド配列が産生された。

クローンＡＰ８５．２中のｃＤＮＡ挿入体は制限酵素分析によって〜１．３ｋｂ であることがわかった。ＡＰＨ遺伝子の長さの概算値を得るため、「染色体歩行 ｊ法を用いてもつと大きいプローブを得、次いでこれを用いてノーザンプロット 上のＡＰＨをコードしている１ＲＮＡをハイブリダイズさせた。ＡＰＨ５，２の 部分制限地図に基づいて６６０ｂＰのＫｐｎ−ＸｍｎＩフラグメントを選択した 。放射ラベルしたプローブをニック−トランスレーションによって作成し、これ を用いて、ノーサンプロット法に従って調製したラット組織ｍＲＮＡをスクリー ニングした［Ａｌｗｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９７９）］。６６０ｂｐの プローブは、大きさが〜２．９ｋｂの１個のｍＲＮＡとハイブリダイズした。

クローンＡＰ８５．２の１．３ｋｂのフラグメントは２．９ｋｂのｍＲＮＡに比 べてかなり短いので、６６０ｂｐのフラグメントを用いてラット肝臓ｃＤＮＡラ イブラリーを再スクリーニングした。培養した１１０万のクローンのなかで、１ ５の複製するポジティブなプラークが観察された。これらクローンのうちの１３ を単離し、ファージＤＮＡを単離した。最も長い鎖は２．５ｋｂのｃＤＮＡ挿入 体を含有しており、これをＡＰＨ３６，１と命名した。

ファージＤＮＡ　ＡＰＨ３６，１を精製し、配列決定した。この配列決定法は、 ｃＤＮＡの特異的配列領域にハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチド配列決定 プライマー、またはエキソヌクレアーゼ■によって生成させた欠失突然変異体、 Ｍ１３へのＡＰＨ３６，１ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　挿入体のエンドヌクレアーゼフラグ メントのサブクローニングを包含する。

ＡＰＨ３６，１ｃＤＮＡの５°末端の翻訳された配列、即ち最初の４０アミノ酸 は、ラット血清アルブミンのアミノ酸配列と同一であることがわかった。従って 、ＡＰＨ３６，１は２．５ｋｂのＡＰＨをコードしているｃＤＮＡだけを含有し ているスクランブル・クローンであった。

第１図は、ラット血清アルブミン配列を含まないＡＰＨ３６，１ｃＤＮＡ翻訳配 列翻訳室ものである。下線を引いた配列および斜線で示した配列はＡＰＨのトリ プシンおよび臭化シアンフラグメントの配列決定によって得た配列である。活性 部位は斜線領域で示し、それぞれの星印は可能性あるグリコシド修飾の部位を示 す。

それぞれのＡＰＨサブユニットは分子量ｇｏ、ｏｏｏまたはおよそ７００〜７５ ５のアミノ酸残基を有するので、またクローンＡＰ８３６．１のＡＰＨコード化 配列配列１８４塩基対（即ち、７２８アミノ酸）であることがわかったので、別 の「染色体歩行」がＡＰＩをコードしている遺伝子の５′末端を見つけるために 必要であった。

この末端に、平均の挿入体の大きさ１．１ｋｂおよび６．８ｘｌＯ’の独立クロ ーンを含むＣ１ｏｎｅｔｅｃｈから市販のλ−ｇｔｌｌラット肝臓ｃＤＮＡライ ブラリー（ＨＲＬｌｏｏＩ）を、クローンＡＰＩ３６．１の先端５’ＡＰＲ暗号 配列由来のＢａｎ２−Ｐｓｔｌフラグメントから作成した放射ラベルプローブで スクリーニングした。延長した５°配列を含有しているクローンを単離し、その ファージＤＮＡを精製した。ファージＤＮＡの配列決定はジデオキシ鎖終止法に よって行う［Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ６．１９７５］。翻訳配列の最端の３° 末端は停止コドンの配置によって同定した［星印で示した］。

アシル−ペプチドヒドロラーゼの暗号配列の失われた５°末端の配列は、アシル −ペプチドヒドロラーゼｍＲＮＡのプライマー延長分析によって決定する。ＡＰ Ｈ３６−１の暗号領域の５°−最末端に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用い てｃＤＮＡ鎖の合成をプライムする。この反応の鋳型は、前もって行うハイブリ ッド選択によってアシル−ペプチドヒドロラーゼのメツセージを豊富化した全細 胞性ポリＡ’ＲＮＡまたはｍＲＮＡである。このように合成したｃＤＮ以上の記 載は特に好ましい態様に関するものであるが、本発明がこれらに限定されないこ とは理解されよう。当業者なら、開示した態様に種々の修飾を加えることもあろ うが、このような修飾は本発明の範囲内に含まれる。

微生物 （寄託機関の名称） アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（寄託機関の住所） １２３０１　パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド２０８５２、アメリカ合衆国（寄託臼）　（受は入れ 番号） １９８７年８月２１日　６７５０４ （追加の表示） 大腸菌ＤＫＩ中の、部分ラット肝臓アシルペプチドヒドロラーゼｃＤＮＡを含む ｐＢＲ３２２、ｐＡＰＨ３６，１１ＶＬＬＳＥＰＱＥＡＡ ６０？　ＦＡＶＥＱＶＬＱＥＥ　ＨＦＤＡＲＦｉＶＡＬＭ　ＧＧＳＨＧＧＦＬＳ ＣＨＬＩＧＱＹＰＥＴＹ　５ＡＣＩＡＲ？ＪＰＶＩご＝＝：二：ニコ ＦＩＧ、１ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　３ Ｔｃｖｃｃ’ｒｃｃｒｃＡｃＴｃＡｃｃｃｃｃＡｃ　ｃＡｃｃｃ　ｃｃｃＡｃｃ 　ｃｃｖｃｖ＾ｃｃｃｃｃ　ＣＣ（ＴＴＡＣＣＣＣＣＣＡＧ@ＣＣ ＣＡＣＴＣＴＣＣＡＡＡ　ＣＣＣＯＣＣＧＣＧＡＣＣＴ（ｉ（ＴＣＡＣＣＡＣＡ 　ＣＡＣ；Ｔ（Ｔ（ＣＴｒＣＡ　ＣＣＣＡ（ＣＡＴ　ＣＡＡ`Ｇ　Ｃ ＴＣＴＣ（ＴＴＣ（２ＣＡＡＣＣＣＣ（ｉｃＡｃｃｃＡｃＡｃＴｃＴＣＡＣＧＡ ＣＡＣＣＡＡＡＡＡ　ＣＡＣＴｒＣＴｒＧ　ＣＡ（：　ＣＴ@ＣＴＯ ＦＩＧ、　４Ｃ ＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＴＣＣＣＣＡＣＡＣＣ＾ＣＴＡＡＣＡＡＣ Ｔ＾ＴＯ’口’ＡＴＣＡＴＡＡＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣ＾ｃＡｃ　ｃ 国際調査報告 ＰＣ？１０５８８１０２８４１ １ＰＣＩ　Ｃｌ２Ｎ　９７８０：　Ｃｌ２ｈｌ　１５１００１　Ｃ０７Ｆｆ　１ ５／１２；　Ｃｌ２Ｐ　２１１０６υＪ＋！　４３５／６９．　４３５／ｌフ２ ．３．　４３５／３２０；　５３６／２６

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．第１図に示すアミノ酸配列からなる実質的に純粋な形態のアシル−ペプチド ヒドロラーゼ（ＡＰＨ）。
2. ２．天然のグリコシル化を伴わないアシル−ペプチドヒドロラーゼ。
3. ３．アシル−ペプチドヒドロラーゼをコードしている遺伝子配列を含有する組換 えＤＮＡ分子。
4. ４．遺伝子配列が哺乳動物ＡＰＨをコードしている請求項３記載の組換えＤＮＡ 分子。
5. ５．哺乳動物がラットである請求項４記載の組換えＤＮＡ分子。
6. ６．遺伝子配列がｃＤＮＡの形態にある請求項３または４記載の組換えＤＮＡ分 子。
7. ７．分子がベクターである請求項３〜５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。
8. ８．ベクターがプラスミドである請求項７記載の組換えＤＮＡ分子。
9. ９．請求項３〜５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主。
10. １０．細菌である請求項９記載の宿主。
11. １１．酵母である請求項９記載の宿主。
12. １２．哺乳動物細胞である請求項９記載の宿主。
13. １３．（ａ）請求項３〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子を得；（ｂ）該ＤＮＡ 分子をベクター中に挿入し；（ｃ）該ベクターで宿主系を形質転換し；（ｄ）該 宿主中で組換えＤＮＡ分子のＡＰＨのＤＮＡ配列を発現させ；そして （ｅ）該発現によって生成したＡＰＨを回収すること；を特徴とするアシル−ペ プチドヒドロラーゼの製造方法。
14. １４．請求項１３記載の方法によって製造したＡＰＨ。
15. １５．アシル化されたポリペプチドを請求項１または２記載のＡＰＨと接触させ ることを特徴とする、該アシル化されたポリペプチドのＮ−末端アシルアミノ酸 を加水分解する方法。
16. １６．請求項１または２記載のＡＰＨの存在下で誘導体化Ｎ■−アセチルアミノ 酸供与体と遊離のα−ＮＨ２を有する受容体とを接触させることを特徴とする、 該供与体と該受容体の間の反応を触媒する方法。
17. １７．触媒反応を無水に近い媒体中で行う請求項１６記載の方法。
18. １８．固定化された形態にある請求項１、２、または１４のいずれかに記載の酵 素。