JPH03500087A - 抗体結合性血小板の免疫検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体結合性血小板の免疫検定 本発明は、血小板に対する抗体の存在を同定する方法に関する。

本方法は、ヒ）ＩｇＧと非免疫特異的に結合する物質を含まない可溶化された血 小板抗原の調製、およびその用途を包含する。

血小板の輸血（輸注）は、特に、血液疾患に対処するため骨髄移植または細胞減 少療法を施されている患者にとっての重要な血液療法の補助手段である。輸血細 胞上に提示される抗原に対する同種異系免疫（同種免疫）は、７０％もの多くの 患者で問題を内在しており、無作為の供血者（ドナー）の血小板輸血に対して反 応させなくする。

このような患者は、ただ１人の供血者のＨＬＡ−適合性血小板に対して最初は応 答することができるが、最近の研究により、ＨＬ　Ａの適合性はこのような輸血 の結果を信頼できるほどには予知し得ないことが示唆された。これは、免疫学的 ターゲットとなり得る、未だ確定されていないものも含む血小板の種々の膜成分 に少なくとも１部分由来する。確定されている血小板の表面抗原には、他の細胞 （血液型、組織適合性、Ｔ１およびＴｎ抗原）上にも見いだされるものと、血小 板に独特なものと、２つのクラスが存在する。

ＡＢＯ血液型抗原（ＢＧＡ）は、３０年以上前に血小板において検出された。そ の後、これらの抗原は、血小板の膜構造に内在する部分でな（、血小板表面に吸 着していることが示された。血小板上のＢＧＡ物質の量は、血漿中のその星と比 例している。さらに、これら血小板−ＢＧＡ物質は、赤血球上に存在するＢＧＡ 物質とは異なった生化学的特性を有している。このように、ＡＢＯ不適合の血小 板を輸血しても、初期に血小板回復を減少させるのみであり、残りの血小板は正 常に生存する。ＢＧＡは、２人の白血病患者においてＡＢＯ−不適合のＨＬＡ− 適合性血小板の輸血の失敗の原因となるターゲット抗原として関連づけられた。

おそらく、血小板は他のＢＧＡを担っていない。

潜在性Ｔｎ抗原は、免疫優性基としてα−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残 基を有しており、抗体による特定の赤血球の多凝集反応に関与し、そしてこれは 血小板にも存在している。Ｔｎ抗原の異常暴露は、特定のガラクトシル・トラン スフェラーゼ活性（Ｔ−トランスフェラーゼ）の欠損により惹起し得、血小板減 少症に関連していることが多い。

Ｔ　（Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原は、ノイラミニダーゼ で処置することにより暴露することができる、同様に潜在性のβ−Ｄ−ガラクト シル残基である。

主要組織適合性複合体のクラスエ抗原は、血小板の表面で吸収されるとも考えら れている。実際、血小板は血液の全ＨＬＡ−Ａおよび−Ｂ成分の約７３％を担っ ている。研究により、これらの抗原は、血小板表面で発現する種々の抗原のうち で最も免疫原性があることが明確に示唆された。同時に、種々の細胞型のみなら ず、同一の個体由来の血小板においても定量的な発現で、ＨＬＡ抗原の発現は異 なっているかもしれないことが十分に認識されている。

独特の血小板−特異的抗原の存在は、３０年以上前に最初に認識された。１１個 の異なる抗原を含有する７つの抗原システムが現在開示されており、これらはす べて、常染色体の主要遺伝子の産物である。ＰＬＡ（Ｚｗ）、ＰＬ’、およびＫ Ｏシステムは二対立遺伝子（ｄｉａｌｌｅｌｉｃ）であり、ＢＡＫ”、ＬＥＫ” 、およびＤＵＺＯは、これまでに検出されている単一の対立遺伝子のみである。

上記の抗原は実際上、規定されている腋糖タンパク質（ＣＰ）上のエピトープで あり、これらは、特異的な血小板の生化学的機能を担うレセプターとしての特性 を有している。これらの生化学的機能には、ＧＰＩｂによるトロンビン結合、Ｇ ＰＩＩｂ／Ｉ［ｌａ複合体によるフィブリノーゲンの結合、およびＧＰＶによる トロンビン基質として役立っている。

放射線分析トレーサー、免疫蛍光物質、抗グロブリンまたは補体消費、血小板活 性化、および酵素連結免疫検定法など種々のインビトロ実験法により、血小板に 対する同種免疫を証明することができる。このような検定法は、特に交差適合性 試験法と関連して開発され、種々の成功を収めている。

補体活性検定法は、理論的には懸力的な操作法である。しかし、実際には、これ は感度が高くない。抗体で被覆された血小板はマクロファージにより循環系から 除去されるので、血小板粘着と食作用は補体結合試験に代わる妥当な代替法であ るが、これまでに設計されている操作法は厄介であり、再現性が低い。抗グロブ リンの原理を利用する方法は比較的単純かつ感受的であり、そして定量的である が、本質的に復雑な問題をはらんでいる。血小板がＩｇＧなどの血漿成分を吸着 することができることにより「ＰＩａｔｅｌｅｔ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎのトリブレ ｙ　）　（Ｔｒｉｐｌｅｔｔ）、　（１９７ｇ）−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｅｖ ａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｄ 、　）リブレット１ｌｉ）、　１−３４頁、　ＡＳＣＰブレス、シカゴ］、これ ろ検定法のほとんどは、免疫結合化および非特異的結合化１ｇＧの両者を測定す ることによって得られる高いバンクグランドの値を示す。これら高バックグラン ド値は、血小板−関連１ｇＧ（ＰＡＩｇＧ）の測定値を、正常値より実質的に高 い測定値ではないと疑いを持たせることになる。その値の範囲は、１個の血小板 に対して１．７ｆｇから１５．５ｎｇのＩｇＧ（７Ｘ１０’から１．６Ｘ１０’ 分子のＩｇＧ）と報告されている［ジキソン（Ｄｉｘｏｎ）ろのＮ、　Ｅｎｇｌ 、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　、　２９２：２３０−２３６（１９７５）、ネル（Ｎｅｌ ）らのＢｒ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　、　４４　：２８１−２９０（１９ ８０）、イーサス（Ｙｅｓｕｓ）らのＡｔｎｅｒ、　Ｊ、　Ｃ１ｉｎ、　Ｐａｔ ｈｏｌ、　、　８１　：　１（２９８４）コ。ロブグリオ（ＬｏＢｕｇｌｉｏ） らは、１！５■−標識化抗−１ｇＧ法を採用し、これらの値を血小板１個に対し て約１６９±７９個の１ｇ０分子にまで減少させた［ロブグリオらのＮ、　Ｅｎ ｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　、　３０９：４５９−４６３（１９８３）コ。

本発明の目的は、インビトロで有効な血小板抗体検出法、または適合性血小板供 血者を確定するための、特に血小板輸血に反応しない（治療不応性）頻回輸血患 者のための交差適合性試験法を開発することにある。このような操作法は、好ま しくは、保存供血者血小板試料のバンクの調製を包含し、それに対して患者の血 清を抗体の存在とその量につきスクリーニングすればよいことになる。このよう な血小板試料を研究室での検定用として長期間保存するための方法は報告されて いる。

キクター（Ｋｉｋｌｅｒ）らは、フェレーシス・バッグからセグメントを取り出 して供血者血小板を単離し、放射線標識化抗グロブリン試験に使用した［キクタ ーらのＢｌｏｏｄ、６１：２３８−２４２（１９８３）：、　Ｌかし、フェレー シスした（ｐｈｅｒｅｓｅｄ）血小板は１２０時間以上は保存できないので、こ の試験はこのような時間内で集まる供血者に制限されている。

フォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）らはＥＤＴＡ−抗凝集化血液試料から血小板を 単離し、それらをマイクロＥＬＩＳＡ検定に使用する前に１％パラホルムアルデ ヒドで固定させた［フォースターらのＨｉｎ、　Ｙｏｃｈｅｎｓｃｈｅｒ、　６ １：１６５−１６７（１９８３）コ。これとは対照的に、完全に乾燥させ（３０ 日まで保存した）、または０．０１％アジ化ナトリウムを含有する通常の生理食 塩水（４１７日まで保存した）中の、いずれかで保存した血小板では、新鮮な血 小板を使用して得られた結果と良好に相関する再現性ある結果が得られた。

したがって、本発明の重要な局面は、長期の保存でも安定であり、信頼でき、か つ効率的な検定に適合し、そして非特異的な反応性が最小限である、適当な供血 者−特異的な血小板「試剤Ｊを調製することにある。このような血小板試剤は、 本明細書で記載するように、血小板の膜を特定の洗浄剤（ブタ−ジャント）によ り可溶化し、次いで得られた可溶化膜成分を免疫検定用の不活性マトリ、クコに 結合させることによって調製することができる。しかし、このような可溶化成分 本来の生物学的活性は保持され、洗浄剤は以後の生化学的または免疫学的検定を 妨害しないことが重要である。

生物学的な膜を可溶化し、その成分本来の活性を維持させる、という点では個々 の非イオン性洗浄剤の有効性は多様である。これろ洗浄剤は低い臨界ミセル濃度 てあり、ミセルの大きさが巨大てあり、そして膜タンパク質に対して高い親和性 を有しているので、反応培地から完全に除去することができず、したがって種々 の試験システムに適用するには限界がある［ヘレニウス（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ）ら のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ、Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒおよ び１．　ＰａｒｃｅｒｌｉＨ）ＬＶＩ巻、　７３４−７４９頁（１９７９）、ア カテミック・プレス、ロンドンおよびニューヨークコ。

血小板の免疫機能における膜糖タンパク質の特定の役割を研究するため、血小板 −特異的な糖タンパク質（ＧＰ）およびＨＬＡ抗原は共に、種々の非イオン性洗 浄剤により可溶化されている。クコッキ−（Ｋｕｎｉｃｋｉ）　、−）は、ノニ デントＰ　４０　（Ｎｏｎｉｄｅｎｔ　Ｐ２Ｏ）を使用してＰｌ　Ａｌ同種抗原 をＧＰｍａＰｍ−局在させた：クコ・ツキ−らのＭ。１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 　１６：３５３−３６０（１９７９）コ。トリトンＸ−１００は、血小板の表面 １１ｉｆｆｉ分の構造と組成を特性化するため［トノチャー（Ｄｕｔｃｈｅｒ） らのＢ　］　ｏｏｄ５７：３９５−３９８（１９１１１）ｒ、血小板膜タンパク 質に対するモノクローナル抗体（ｍｏＡｂ）を検出するため二二二一マン（Ｎｅ ｗｍａｎ）らのＪ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、。

９０：２４９−２５３（１９８２）コ、そして同種免疫した患者の血小板関連１ ｇＧを研究するためニョハンネス（Ｙｏｈａｎｎｅｓ）　；）のＡｍｅｒ、　Ｊ 、　Ｃ１ｉｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、　、　８１　：８ｌ−８４（１９８３）コにと 、広範に使用されている。トリトンｘ−ｘ１４：ニューマンらのＴｈｒｏｍｂ　 Ｒｅｓ、　、　２７：２２１−２２４（１９８２）］は、完全な膜タンパク質の 選択的な抽出に適用され、一方ブリｌジー９９　（Ｂｒｉｊｊ−９９）［ストロ ミンガ−（Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　７３：２４８１−２４８５（１９７６ ）コ、およびノニデントＰ４０ニパーム（Ｐａｒｍ）のＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　、　２５４：８７０９−８７１２（１９７９）、タック（Ｃｏｏｋ）ら のＨｕｍ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１４：２３４−２４４（１９１！５）ｌは 、血小板表面におけるＨＬＡ抗原の構造を厳密に調べる（ｐｒｏｂｅ）ために使 用された。

バロン（Ｂａｒｏｎ）とトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ニバロンらのＢｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　、　３ｇ２−２７６−２８５（１９ ７５）コの研究により、非イオン性のアルキル−β−Ｄ−グルコシド洗浄剤が紹 介されたが、これは、成分を可溶化し、それ自身の機能を保持させ、そして溶解 物から完全に除去される点で、陽イオン性の、両イオン性の、および他の非イオ ン性の洗浄剤よりも優っているとその後見いだされている［スタツブス（Ｓｔｕ ｂｂｓ）らのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　、　４２６− ４６−５６（１９７６）、リン（Ｌｉｎ）らのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ａｃｔａ、　、　５５７−１７９−１８７（１９７９）、ロセベア（Ｒｏ ｓすｖｅａｒ）らのＢｉｏｃｈｅ＋＋＋、　、　１９：４１０ｇ−４１１５（１ ９８０）コ。ヒルドレス（Ｈｉｌｄｒｅｔｈ）は、これらアルキル・グルコシド 類の幾つかを、形質転換されたセルラインを可溶化する能力について比較し、そ れらが、抗原性的に活性な組織適合性抗原クラス！を放出させる上で他の通常使 用されている洗浄剤と同等、またはそれを上回る程に有効であることを見いだし た［ヒルドレスらのＢｉｏｃｈｅｍ、　、　Ｊ、　、　２０７：３６３−３６６ （１９８２）］。

さらに、可溶化膜の免疫反応性は、上記化学物質が臭化シアン−活性化濾紙ディ スク、ニトロセルロース紙、およびポリスチレン・マイクワタイタ−平板などの 種々の固体マトリ９．クコと結合した後も保持され得ることが示されている。

既述のように、現在使用されている殆どの血小板抗体検定は、マーカー標識化抗 −１ｇＧを使用してＰＡＩｇＧを検出するよう設計したものであるが、それでは 、血小板表面に結合している非免疫型の免疫グロブリンと免疫型のそれとを区別 することは不可能である。

従来の研究者は、種々の洗浄剤、アルブミン溶液、または血小板前処理によって 、非特異的に結合したＩｇＧを阻害（ブロック）または解離させることを目的と していた。しかし、これらの普通に使用さＩｇＧを阻害するとは限らないことは 明白である。このことは、少なくとも幾つかの非免疫のＩｇＧの血小板嘆に対す る親和性が、一般的に非特異的であるタンパク質−タンパク質結合を説明する親 和性よりも大きいことを示唆するのかもしれない。非免疫特異的であるが、強固 な結合であるという現象は、血小板の表面上におけるＩｇｃに対するレセプター 様タンパク質に起因するのかもしれない。

チェンジ（Ｃｈｅｎｇ）らは、ＩｇＧのＦｃフラグメントと相互作用する特異的 な血小板膜糖タンパク質を単離し、特性化したニチェンジらのＪ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、　、　２５４：２１６５−２１６７（１９７９）コ。ベアートスレ イ（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ）らは、洗浄剤で可溶化した血小板から５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより分１１ｉした２００キロダルトンの糖タンパク質との非特異的なＩｇＧ の結合を報告した［ベアートスレイらのＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　 ７４：１７０１−１７０７（１９８４）Ｅ。正常の非免疫１ｇＧに対して高い親 和性を有する単離し得る血小板膜成分が存在することは一般に認められている。

本発明は、無作為の供血者血小板を非イオン性洗浄剤であるデカノイル−Ｎ−メ チルグルカミド（Ｍｅｇａ　１０）により可溶化し、透析して過剰の洗浄剤を除 去し、アガロース結合化１ｇＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーによ って部分的に精製することに基づく方法を詳細に説明するものである。得られた 洗浄剤溶解物をニトロセルロースディスクに固定化し、次いて酵素一連結免疫検 定に供し、血小板の頻回受血者の血清中の免疫学的に活性な血小板膜成分および 臨床的に意義のある抗体の存在を検出した。

第１図は、種々の量のニトロセルロース−結合化血小板の洗浄剤溶解物を検出で きる抗体の検出能を示すものである。血小板のａｅ剤溶解物（Ｐ　Ｌ）・）を本 明細書に記載しているようにして調製し、その（ａ）２０μｇ、（ｂ）１０μｇ 、（ｃ　）５ｕ　ｇ、または（ｄ　）　１　、　Ｏｕｇをニトロセルロース・デ ィスクに適用した。これらのディスクを−ＴＢＳでｌ：１０に希釈した正常血清 （Ｎｓ）、抗−ＨＬＡ−ＡＩ（Ａ１）もしくは同種免疫血清（ＡＦ）、またはＧ ＰＩｔ＋、ＧＰＩｌｂもしくはＧＰＩｌｂ／ｌｌ１ａに対するｍｏＡｂ（５００ ｎｇ）と−緒にインキュベートし、次いで結合化抗体をアルカリホスファターゼ 結合化抗−１ｇＧで検出した。

第２図は、ニトロセルロース結合化ＰＬｙの検出および安定性を示スモのである 。ニトロセルロース・ディスクに本明細書に記載のようにしてＰ　Ｌｙ（２０ｕ 　ｇ）を点在（ｄｏｔｔｅｄ）させ、次いで正常血清（ＮＳ）、抗−Ｐ　１”（ Ｐ　１　”）、同種免疫血清（ＡＦ）、抗−ＨＬＡ−Ａｌ（Ａ１）もしくは抗− ＨＬ、Ａ−８８（Ｂ　８）のｌ：１０希釈物、または血小板糖タンパク質のＧＰ Ｔｂ、ＧＰｎｂもしくはＧＰＩＩｂ／ｌｌ１ａに対するモノクローナル抗体（５ ００ｎｇ）と共にインキユベートした。

１％ウシ血清アルブミン溶液（Ｂ　Ｓ　Ａ）を対照として使用した。すべての希 釈物は、１０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，４）で調製した。調製したばかりのディス ク（白柱）および１００日間保存したディスク（斜線柱）を使用し、アルカリホ スファターゼ−コンジュゲート化抗−ＩｇＧにより、結合化抗体を検出した。

第３図は、ニトロセルロース結合化ＰＡｂの検出および安定性を示すものである 。本明細書に記載しているようにニトロセルロース・ディスクにＰＡｂ（２０μ ｇ）を点在させ、次いで正常血清（ＮＳ）、抗−Ｐ　１　”（Ｐ　１　”）、同 種免疫血清（ＡＦ）、抗−ＨＬＡ−ＡＩ（ＡＩ）もしくは抗−ＨＬＡ−Ｂ８（Ｂ ８）の１：１０希釈物、または血小板糖タンパク質ＧＰＩｂ、ＧＰｎｂもしくは ＧＰＵｂ／Ｉ［［ａに対するモノクローナル抗体（５００ｎｇ）と共にインキユ ベートした。１％ウシ血清アルブミン溶液（Ｂ　Ｓ　Ａ）を対照として使用した 。すべての希釈物は、１０ｅＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，４）で調製した。調製したば かりのディスク（白柱）および１００日間保存したディスク（斜線柱）を使用し 、アルカリホスファターゼ−コンジュゲート化抗−１ｇＧにより、結合化抗体を 検出した。

第４図は、免疫した患者の同種抗体を検出するニトロセルロース結合化ｐＬｙお よびＰＡｂの検出能を示すものである。ニトロセルロース結合化ＰＬｙまたはＰ Ａｂ（２０μｇ／ｘ（りを本明細書に記載のようにして調製し、それぞれＴＢＳ で１＝１０に希釈したａ）正常血清、ｂ）ＡＦ、またはｃ）ＤＰと共にインキユ ベートした。アルカリホスファターゼ結合化抗−１ｇＧを使用して結合化抗体を 検出した。

第５図は、ＰＡｂ中におけるクラスＩ組織適合性抗原の活性の保持を示すもので ある。本明細書に記載のようにして、血小板の洗浄剤溶解物を２人のＨＬＡ型個 体から調製し、ＡｇｌｇＧに吸収させ、ニトロセルロース・ディスクに適用した （２０μｇ／ディスク）。正常血清（ａ）、ＰＩ”に対する抗血清（ｂ）、抗− ＨＬＡ−Ａ３（Ｃ）、抗−ＨＬＡ−Ｂ８（ｄ）、および抗−ＨＬＡ−ＡＩ（ｅ） のＴＢＳによる１：１０希釈物を使用し、これらの抗原の活性の保持についてア ルカリホスファターゼ−結合化抗−１ｇＧ免疫検定法で調査した。

本発明は、血小板抗原に対する抗体を検出するためのシステムとして有用である 基質を調製する方法を包含する。この方法は、幾つかの工程からなる。血小板試 料をまず最初に、透析可能な非イオン性洗浄剤を含有する水溶液で処置する。こ の最初の処置は、血小板成分を可溶化（溶解化）できる条件下で行い、血小板溶 解物を調製する。血小板に対する抗体の存在を検出するための検定法では、“血 小板試料」は、血小板豊富な血漿３０−４０単泣由来の試料プールから調製され るＰａｂとすることができる。交差適合性検定では、「血小板試料コは、フーレ ーシスした、ｉ者の１個体単位から調製されるＰａｂとすることができる。この ような条件は、血小板試料を、非イオン性洗浄剤を漠度約０．２％から約０．５ ％で含有する水溶液で処置することを包含し得る。血小板抗原は、血小板タンパ ク質１ｒｇ当たり約１ｚｇの透析可能な非イオン性洗浄剤を含有する水溶液中、 約Ｏ′Ｃで約３０分間可溶化するのが最も好ましい。

次いで、不溶性の粒子、および過剰の洗浄剤を溶解物から分離し、可溶化した血 小板抗原を含有する溶液を調製するのが好ましい。不溶性の粒子は、得られた溶 解物を遠心して除去するのが好マシく、洗浄剤は透析によって除去するのが好ま しい。

次いて、その得られた溶液からヒ）ＩｇＧと非免疫特異的に結合する物質を除去 し、部分的に精製した血小板抗原を調製する。このヒトＴｇＧと非免疫特異的に 結合する物質を除去するには、その溶液を、個体マトリ、クスに結合したヒトＩ ｇＧと接触させることが好ましい。たとえば、不溶性粒子と過剰の洗浄剤を含ま ない血小板溶液物を、ＩｇＧ−アガロースのカラムに通すクロマトグラフィーに かければよい。

次いて、これらの操作により部分的に精製した血小板抗原を固体マトリックスに 固定化するのが好ましい。この固体マトリックスは、好ましくはニトロセルロー ス紙、ポリスチレン、またはラテックスからなるものであるが、生物学的試料か らの抽出および／または固定化された精製血小板抗原に結合した抗体を検定する のに適している固体マトリックスならどれでもよい。

本発明は生物学的試料中の血小板に対する抗体を検出するための方法に関するも のであるか、本発明方法は、既述した基質の調製に加えて、該固体マトリックス を生物学的試料からなる溶液と接触させ、その固体マトリックスと結合する抗体 の童を測定する工程をも包含するものである。

目的とする生物学的試料が血小板供給源であり、血小板の受血者と予定される者 （血小板の受面予定者）と免疫学的に適合する血小板供給源を同定することを本 発明の目的とする場合、本発明方法は、既述したような血小板供給源由来の血小 板試料から基質を調製することに加え、さらなる工程を包含する。ネガティブ対 照として、以前に輸血を受けてないＡＢ陽性血液型の男性の血液プールから試料 を得る。このように以前に輸血を受けていない男性は、血小板抗原に対する抗体 を持っていないはずである。抗体を含有する試料を、血小板輸血が必要とされる 、またはそれを必要とする可能性のある、予定される血小板の受血者から入手す る。

固定化された部分的に精製した血小板抗原の第１の試料（基質）を、血小板抗原 に特異的な抗体がその固定化された部分的に精製した血小板抗原と結合できる条 件下で、血小板受面予定者由来の抗体含有試料と混合する。該固定化部分的精製 血小板抗原の第２の試料を、第１と同一の条件下で、以前に輸血を受けていない ＡＢ陽性の血液型の男性由来の抗体含有試料と混合する。次いで、第１の固定化 部分的精製血小板抗原と結合した第１の抗体レベル、および第２の固定化部分的 精製血小板抗原と結合した第２の抗体レベルを測定する。

この測定は、当業界周知の多くの方法のいずれによっても行うことができ、それ には酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、および濁度の測定があり、後者の 場合は特に固体マトリックスはビーズ形態のラテックスとする。

次いで、結合化抗体の第１のレベルを第２のレベルと比較する。

第１のレベルが第２のレベルよりも実質的に大きくない場合には、血小板受面予 定者と免疫学的に適合する血小板供給源［この血小板供給源の血小板抗原に対す る抗体を実質的なレベルで含有していないコが同定される。本発明の方法は、免 疫学的に適合する血小板供給源を、血小板輸血後の循環血小板の増加に従来反応 しなかった（治療不応性）患者と交差適合させるのに特に有用である。

本発明を実施する上で使用できる好ましい洗浄剤はアルキル−Ｎ−メチルグルカ ミド類、またはアルキルグリコシド類であるが、比較すれば前者が好ましい。ア ルキル−Ｘ−メチルグルカミドの中でより好ましいものは、デカノイル−Ｎ−メ チルグルカミド、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、オクタ／イル−Ｎ−メチ ルグルカミド、およびヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミドである。最も好まし い本発明の洗浄剤は、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドである。

使用可能なアルキルグリコシド類には、ｎ−デシル・β−Ｄ−グルコピラノシド 、ｎ−ドデシル・β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル・β−Ｄ−マルトシ ド、ｎ−へブチル・β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘキシル・β−Ｄ−グルコ ピラノシド、ｎ−オクチル・β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル・β−Ｄ− グルコピラノシド、およびｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシドがある。

本発明の好ましい態様および利用性を説明するために上記の特定の物質を挙げた が、請求の範囲中で特に明記しない限りは、これらは本発明の限定を意図するも のでない。

下記ノ試剤ハシグ７−ケミカルカンバ＝−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、。

セントルイス、　Ｍ−０）かみ入手した。デカノイル−Ｘ−メチルクルカミド（ Ｍｅｇａ−１０）、ポリビニルピロッドン、γ−グロブリンネ含のウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）、貯蔵（プール）ヒト男性、Ａ　Ｂ血清、ポリ−ルーリジン、 アガロース−結合化ヒトＩ’、ｃ、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ヒツ ジ抗−マウスＩｇＧおよびヤギ抗−ヒトＩｇＧのアルカリホスファターゼフンシ ュゲート化Ｆ　（ａｂ’　）’ｔフラクメント、ｐ−ニトロフェニル−ホスフェ ート基質、およびジェタノールアミン。パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）色素− 試薬タンパク質検定は、バイオラド・ラボラトリーズ、［リッチセント、ＣＡ］ かろ入手した。

ニトロセルロース紙＜０．４５ｕｍ）は、シュレイチャー・アンド・シ二−ル（ Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）、　Ｉｎｃ、、　：ニーン、 ＸＨコから入手した。アビジン−ビオチン試験試薬は、ベクタスティン・ラプス （Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　Ｌａｂｓ）、Ｉｎｃ、、　：バーリンガム、ＣＡＥか ら入手した。組織類別トレイは、ワン・ラムダ（Ｏｎｅ　ＬａｍｂｃｌａＸロス アンゼルス、Ｃ紀およびジェオメトリック・データ（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ　Ｄａ ｔａ）ニワイン、ＰＡＥ。

抗−ＰＩ”同種抗血清は、アスター（Ｒ，Ａｓｔｅｒ）博士［ＢＩｏｏｄ　Ｃｅ ｎｔｅｒ　。

ｒ　５ｏｕｔｈｅａｓｔ　Ｙｉｓｃｏｎｓｉｎ、ミルウォーキー、ＷＸ：；から 譲り受けた。腹水由来のマウスモノクローナル抗体（ｍｏＡ　ｂ）は、マノクエ バー（Ｒ，Ｐ。

ＭｃＥｖｅｒ）博士［テキサス大学、ヘルス・サイエンス・センター、サンアン トニオ、ＴＸコから寛大にも供与を受けた。同種免疫した個体由来の血清（ＡＦ ＳＤＰ）は、ｔＪ、Ｔ、Ｍ、Ｄ、アンダーフン・ホスピタル・ブラッド・バンク から採取した。他のすべての化学物質は分析用の等級を有している。

クエン酸リン酸デキストロースアデニンで凝集阻害したＯ型のＲｈ＋の血液を分 画遠心し、血小板豊富な血漿を調製した。シファー（ＳｃｈｉｆＴｅｒ）および ヤング（Ｙｏｕｎｇ）によって記載されている操作法（１９８３）に従い、血小 板を単離した。純度は、光学顕微鏡によって評価し、調製物を、血小板１０００ 個に対して赤血球細胞または白血球１個はどしか認められないようにした。血小 板の計数は、コールタ−（Ｃｏｕｎｔｅｒ）　Ｓ−プラス（Ｓ−Ｐｌｕｓ）を使 用して電子工学的に行った。

ボウム（Ｂｏｙｕｍ）に記載（１９６ｇ）されているフィコルー／％イパーク密 度勾配法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓ）により、単核球を単離した。

血小板調製物を遠心し、得みれた上清を捨て、ボタン状の血小板の重量を測定し た。１０％の洗浄剤保存溶液をメタノール中で誠製し、０．１５Ｍ’　ＮａＣＱ （Ｔ　Ｂ　Ｓ）および１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニルを含有する５０ｍ Ｍ　トリス−ＨＣ（−ｐＨ８，０で希釈し、０．５％操作用溶液（ｗｏｒｋｉｎ ｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）を調製した。時折撹拌しながら、比率１：１２の洗浄剤 ／タンパク質の割合で、３０分間氷上で血小板を可溶化した。この溶解物（ＰＬ ｙ）を４℃において５０，０００ＸＧで１時間遠心し、得られた上清を、ｌｏｍ Ｍ　ＴＢＳ　（ｐＨ８，０）、０．０２％アジ化ナトリウムに対して４℃で一晩 透析した。

タンパク質濃度を分光学的に測定した。ウシ血清アルブミンを標品として使用し た。ｐＬｙの一部を一７０℃で凍結させた。

アガロース−結合化１ｇＧ（ＡｇｌｇＧ）５００μＱを３０００ｘＧで２分間遠 心し、得られた上清を除去した。ＰＬｙをＴＢＳで１．５１１ｇ／Ｋ（Ｉニ希釈 し、そ（７）ｌ、ＱｘｊをＡｇｌｇＧに加え、室温で３０分間、回転ブラットホ ーム上に置いた。この混合物を既述のように遠心し、上清を除去し、パッキング した新鮮なＡｇ１ｇＧ５００μＣに加えた。インキニベーションを繰り返し、遠 心して吸収上清（ＰＡｂ）を取り出した。吸収が各々終わった後に、上清のタン パク質測定を行った。ＰＡｂを一７０°Ｃで保存した。

ＴＢＳ中、１．Ｏｚｇ／ｙ（のウシ血清フルブミ７（ＢＳ、Ａ）を上記の条件下 で吸収させ、ＡｇｌｇＧへのタンパク質粘着性の特異性を測定した。

ニトロセルロースディスク（ＮＣ）を標準的な６ｕ孔パンチを使用して調製した 。使用する前に、ディスクを蒸留水で５分間水和させ、次いで風乾した。容量１ ０−１５μＱの種々の濃度のＰＬｙ／ＰＡｂをＮＣ上に点在させ、風乾した。使 用するまで、ＸＣディスクを機密容器中、４℃で保存した。以後のすべての工程 は、特に明記しない限り、室温で行った。

ＥＬＩＳＡ検定用に、１つのＮＣを１２Ｘ７５ｉｚガラス管に入れ、１％ポリビ ニルピロリドン−１％ウシ血清アルブミン溶液１００　ｕＣ（マイクロリットル ）を加え、過剰の結合部位を阻害した。３０分間インキュベートした後、その阻 害溶液を吸引二対照てゐる正常血清、１％Ｂ　Ｓ　Ａ、または適当な試験血清（ １００ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，５）、１ｍ＼４　ＣａＣＱｔて希釈）１００μＣ を２つの試験管に加えた。

これらのディスクを３７°Ｃの水浴中で１時間インキュベートし、次いで３−１ ０分間、１０ｍＭ　ＴＢＳ、０．０１％ヤギ血清で洗った。

酵素−コンジュゲート化抗−１ｇＧ（ＴＢＳで１ニア５０に希釈）２００ｇｇを 加え、得られた反応混合物を連続して撹拌しながら１時間インキュベートした。

酵素フンシュゲート体を吸引し、ディスクをＴＢＳで３回洗った。シソファーと ヤング［ジノファーらのＢｌｏｏｄ。

６１：３１１−３１７（１９８３）二に従って、ジェタノールアミン緩衝液（ｐ ）（９゜８）中、１．Ｏｘｇ／πＱのｐ−ニトロフェニルホスフェート基質２０ ０μｇを加え、アルカリホスファターゼ活性を３７°Ｃで検出した。グイナテノ ク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　ｖイタ０−ＥＬＩＳＡ解読機を使用し、４０５開にお ける光学密度を読み取った。

Ｐ　Ｌｙ（１０＋ｎＭ　Ｔ　Ｂ　Ｓ中、１．○ｘｇ／Ｍ１２）１ｇｇを市販され ている６０−ウェルのマイクロタイタートレイ（ＨＬＡ−Ａ、ＢまたはＣ座位特 異的抗血清１．０ｇｇを含有）の各ウェルに加え、それら内容物を室温で３０分 間インキュベートした。既述のように単離したオートロガスな、または無作為の リンパ球を各ウェルに加え、標準的なマイクロ細胞毒性検定を行った［ミツタル （Ｍｉｔｔａｌ）らのＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６：９１３−９１６（ １９６８）コ。

４０単位の血小板豊富血漿の予備的な（パイロット）セグメントから血小板を単 離し、プールした。このプールの一部を、トリニダッド（Ｔｒｉｎｉｄａｄ）ら の改変方法［トリニダソドらのＡｍｅｒ、　Ａｓ５ｏｃ、　ＣＩ　ｉｎ、の組織 適合性試験の第９回定例会の要旨（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎ１ｎ ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ）、シカゴ、　１１．５０頁〕により、ポ リーＬ−リジンを使用してスライドガラスに結合させた。このすべての工程は室 温で行った。

前もってＰ　Ｌｙ（’１　、　Ｏｉｇ／ｙｇ）またはＴＢＳのいずれかで３０分 間吸収させておいた抗血清（ＴＢＳで１：１１０に希釈用０μｇを結合化血小板 に加えた。ＴＢＳで洗浄した後、ビオチン化抗−ＩｇＧ１０μＱを３０分間で加 えた。得られたスライドガラスを洗浄し、アビジン−ピオチン化うクトペルオキ シダーゼ溶ｉ＆１０１０μＣを４５分かけて加えた。３−アミノ−９−エチルカ ルバゾール（１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，２中、０．５ｍＭ）と共 に５分間インキュベートした後、酵素活性を顕微鏡下で検出した。

血小板１．０ｇ（約２．３Ｘ１０”）の可溶化操作で、通常、タンパク質２６． ０立３ｉｇが得られた。洗浄剤／タンパク質の比率を２倍に低下させた場合にも 、同一の収量を得た。限外濾過した後では、不溶性物質が認められたが、透析後 には何ら観察されなかった。冷凍した標本を解凍して遠心しても、試験抽出物の タンパク質濃度は全く減少しなかった。

以下の第１表は、２つの別々のＰＬｙ調製物とＢＳＡ対照溶液の多重吸収の結果 を示すものである。ＡｇｌｇＧによるｐＬｙの２回の吸収について、タンパク質 の一定の損失が見いださた。しかし、３回目に新鮮なＡｇＩｇＧにより処置して も、タンパク質濃度はそれ以上減少しなかった。２つのＰＬｙ５１１製物につい てのこの操作におけるタンパク質の全損失は、３２％と２５％であった。したが って、以後のＰＬＹのすべての吸収は、ＰＬｙｌ、５ｍｇ／Ａｇ１ｇＧ　１．０ πＣの比率で行った。８つの別々のＰＬ＞−調製物を使用したタンパク質の平均 損失は、２９．４±４％であった。この吸収は、ＡｇｌｇＧで同じく処理したＢ ＳＡの回収率（１０７％）により証明されるように、特徴的な現象であった。

血小板溶解物をアガロース−１，０により吸収させた後のタンパク質の回収率 アガロース−１πＣ吸収後に回収された実施例　に加えるＰ　Ｌｙ（ｚｇ）　Ｐ 　Ａｂ（ｒ、ｇ　（％ｘ））＝１　′：２　＝３ １　１、５０　１．１６（７８）　１．０３（６９）　１．０２（６ｇ）■１． ５０　１．２６（８４）　１．１０（７３）　１．１３（７５）Ｂ　Ｓ　Ａ　１ ．００　１．０７（＋０７）寡：出発物質に対する％ 特異的な補体−介在性リンパ球細り汲置性抗体を阻害するＦＬＹの阻害能を以下 の第２表に表す。

第２表 ＰＬｙおよびＰＡｂによる抗体−介在性クラス１９２８球細胞毒性の阻害 Ａ　Ｎ 十：＞９５％阻害率 Ｎ：く５％阻害率 抗−Ａ３（供血者■）および抗−Ｂ４４（１２）（供血者ｍ）の場合を除き、供 血者の血小板の洗浄剤抽出物は、オートロガスな（同種の）リンパ球におけるＨ ＬＡ抗原、およびアロジェネイノクな（異種の）リンパ球における同一の抗原に 対する抗血清の細胞毒性を完全に阻害した。ＦＬＹは、既知の交差反応性抗原に 対する抗血清の反応を若干（〈２ｏ％）減少させる場合があることが見いだされ たが、非自己の抗原に対する抗血清の細胞毒性反応はまったく阻害しなかった。

供血者２由来の全血小板は、同一の検定法で試験した場合、抗−ＨＬＡ−Ａを除 き、すべての特異的抗血清の細胞毒性活性を阻害することに留意することが重要 である。

ＰＬｙおよびＰＡｂは、感受性アビジン−ビオチン免疫ペルオキシダーゼ検定に より測定すると、抗−ＰＩＡ＋活性を完全に吸収する能力を有していた。ＰＬｙ またはＰＡｂで吸収させた抗−２１月からは、免疫ペルオキシダーゼ活性が結合 するという結果は何ら得られなかった。血小板に対して同種免疫した、頻回輸血 の結果たる個体から血清を採取した場合、またはＨＬＡ−特異的な同種抗血清を 吸収させた場合に、同じくペルオキシダーゼ活性が喪失された。

そのＰＬｙによる吸収後における酵素活性は完全に損失する。しかし、対照と比 較した場合、血小板の染色パターンまたはその強度はほとんど減少されていない ことが見いだされた。これは、ＰＡｂがアガロース−結合化１ｇに事前に吸収さ れた非免疫１ｇＧの結合に関与しているそのＰＡｂの膜成分（群）を有していた からである。

ＥＬＩＳＡに関してＮＣＣティスフ結合させる上で最適な可溶化物質量を決定す るため、ＰＬｙの漸次減少量をそのディスクに適用し、第１図に示すように、種 々の抗原に対する抗体または正常血清と共にインキュベートした。血小板の主要 な糖タンパク質ＧＰＩａ。

ＧＰＩｂＳＧＰＵｂ／ｌｌ１ａ複合体、ＨＬＡ−ＡＩ、および血清ＡＦにより規 定される同種決定基（群）はすべて、ＮＣディスク１つに対して１．０ｇｇ程に わずかなＰＬｙで検出可能であった。しかし、後者は反応性の平均が６％の増加 しか示さなかったので、この量のＰＬｙでは、正常血清の対照とＡＦとを区別す ることは不可能であった。

２０ｇｇ／ディスクにより一般に最も高い反応性が得られたので、以後の実験は すべてこの量を使用した。

ＰＬｙのＡｇｌｇＧによる吸収の、正常血清の結合性に対する効果を以下の第３ 表に示す。

第３表 正常血清の結合性に対するアガロース−ＩｇＧによるＰＬｙの吸収の効果 平均ＯＤ　ａｓｓ（’：　ｓ、　ｄ、　）試”　ＰＬ　ＰＡｂ　’／Ｊ　％ Ｎ５−１　０．２２（０，０２）　０．０３（０，０２）　８７ＮＳ−２０，２ ５（０，０３）　０．０９（０，０２）　６４ＮＳ−３０，２９（０，０１）　 ０．１０（０，０１）　６４ＮＳ−４０，１４（０，０２）　０．０３（０，０ １）　８ＯＮＳ−５０，２６（０，０１）　０．０４（０゜０１）　８７ＰＨ３ Ｏ，３４（０，０２）　０．０７（０，０１）　８０１′；、−・ 値は、ディスクに対する酵素基質の結合性について補正した（ＯＤ、５ｓ＝０． ２０＝：０．０２）。

５人から得た血清、および市販されているヒト血清のプールから得た血清を、Ｐ ＬｙまたはＰＡｂのいずれかを点在させたディスクと共にインキユベートし、酵 素コンジコゲート化抗−ヒトＩｇＧを用いテ調査した。ニトロセルロースへのこ の第２の試剤の非特異的な結合性のレベルを、最初の抗体の代わりにＴＢＳを使 用して測定した。

ＰＡｂ値をＰＬｙと比較すると、平均７７％（範囲コロ３−９０）の検出可能な ＩｇＧの減少が見いだされた。第２の試剤の結合性は、各反応に対して０．２０ ：０．０２の光学密［（ＯＤ）単位を与え、したがって以後のすへての読値かろ 差し引いた。

調製したばかりのディスクおよび４°Ｃで保存したディスクを使用してＥＬ　Ｉ 　ＳＡを行った。これは、ＮＣ−結合化ＰＬｙの安定性を確立するために行った 。ＰＬｙディスクを使用し、１００日間保存してもＨＬＡ−ＡＩ、−８８、ＰＬ ”、またはＧＰ　Ｉｂ活性の損失は何ら認められなかった。ＧＰｎｂ、およびＧ ＰＩｂ／ｌｌ１ａの場合にそれぞれ約３５％から１５％の保存−依存性の減少が 確認されたく第２図）。しかし、これら後者の値は正常血清の対照よりも２．５ 倍大きく、ＢＳＡ対照よりも５倍近く高かった。

１００日間の保存後、この同一抗原は、ＮＣ−結合化Ｐ−Ａｂと同等に安定であ ったが（第３図）、）（ＬＡ−ＡＩおよび−Ｂ８の活性ではそれぞれ１８％およ び１５４％減少したことが見いだされた。これらの値は、正常血清の対照よりも 顕著に高かった。

漸次減少量の抗体を、一定量の固定化Ｐ　Ｌｙ／　Ｐ　Ａｂ（２０μｇ／ディス ク）と共にインキユベートすることにより、このＥＬＩＳＡ系の感度も試験した 。ＰＬｙ−結合化ディスクを使用した以下の第４表に示されるように、特異的抗 体は、１　：　１００の希釈度でさえも検出でき、そのＯＤ値は抗−ＰＬ”およ び血清ＡＦについて正常血清対照よりもそれぞれ１．７および１．５倍高かった 。

第４表 同種抗体の漸次減少量を検出できる ニトロセルロース−結合化ＰＬｙおよびＰＡｂの検出能ＮＳ　１０　０．２２（ ０，０４）　０．０２（０，０１）５０　０．４０（０，０６）　０．１７（０ ，０１）１００　０．３８（０，０７）　０．１０（０，０３）ＰＬ”　１０　 ０．４５（０，０１）　０．４０（０，０１）５０　０．６４（０，０４）　０ ．５９（０，０２）２００　０．６２（０，０２）　０．４０（０，０２）ＨＬ Ａ−Ａｌ　１０．　０．６２（０，０１）　０．７５（０，０２）５０　０．４ ６（０，０７）　０．４３（０，０５）１００　０．３１（０，０１）　０．４ ３（０，０１）ＡＦ　１０　０．５３（０，０３）　０．２７（０，０２）５０ 　０．６５（０，０６）　０．４７（０，０３）ｉｏｏ　ｏ。５８（０，０５） 　０．４５（０，０６）値は、ディスクに対する酵素基質の結合性について補正 した（ＯＤ−ｓｓ＝０　、２０±０．０２）。

しかし、抗−ＨＬＡ−ＡＩは、ｌ：５０および１：１００の両希釈度で、対照よ りも高い増加を示していなかった。１：１０希釈度の３つの抗血清はすべて、２ 倍から３倍の増加が認められた。

これらの結果は、ＮＣ−結合化ＰＡｂを使用した同一の検定法により得られた結 果（これも第４図に示している）と対比することができる。希釈度１：１００に おけるすべての抗血清で、酵素活性はＰＬｙ値よりも４倍高く、最も顕著なのは 、１：１０希釈度て得られた値であった。これらは対照の血清の値よりも２ｏ倍 がら３５５倍高った。正常血清の希釈度ｌ：１０における結合性は、ＰＬｙの吸 収後、非常に減少し、ＰＬｙ結合化ディスクで観察される値（０，２２）の１／ １０てあった（０．０２）。

以下の第５表に示している値は、漸次減少量のモノクローナル抗体（ｍｏＡ　ｂ ）に対して試験した場合の検定の感度を表すものである。

第５表 モノクローナル抗体の漸次減少量を検出できるニトロセルロース−結合化ＰＬｙ およびＰ　’Ａ　ｂの検出能ＧＰＩｌｂ／Ｉｌａ　５００　１．４０（０，０２ ）　１．０２（０，０１）２００　１．０５（０，０２）　１．１１（０，０５ ）１００　０．７８（０，０８）　０．８８（０，０３）５０　０．４０（０， ０２）　０．３６（０，０５）２０　０．３５（０，０１）　０．４０（０，０ １）ＧＰＩａ　２０　０．４５（０，０２）　０．４１（０，０１）ｃ、ｐｕｂ 　２０　０．３３（０，０２）　０．３８（０，０１）”　ＢＳＡ対照＝０．２ ２−：０．０５抗−マウスＩｇＧ＝Ｏ，ｌ　６＝Ｏ１０１Ｂ　Ｓ　Ａまたは抗− マウスＩｇＧ対照の値であるそれぞれ０．２２０および０．１６０と比較すれば 、ＧＰＩｂ、ＧＰｎｂ、またはＧＰＩｌｂ／ｍａに対するモノクローナル抗体の 若干２０ｎｇを検出するのは容易であろう。これろモノクローナル抗体のこの’ ｔａＷにおける光学密度値は対照群よりも少なくとも３０％大きく、またＧＰＩ Ｉｂ／ｍａ抗体５００ｎｇでは５−７倍高い。ＰＡｂディスクを１１用した場合 、Ｐｌ、＞−と比較すれば、いずれのモノクローナル抗体の活性も８％以下の損 失しか認められず、このことはこれら免疫学的に重要な表面抗原が吸収時には喪 失されないことを示している。

頻回血小板輸血により同種免疫を受けている、血小板減少症の２人の患者の血清 （血清ＡＦおよびＤＰ）中における血小板抗体の検出能について、ＥＬＩＳＡ系 を試験した。これらの血清は、Ｍ、Ｄ、Ａ。

Ｈｌの組織適合性試験研究所（Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅ５ ｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で通常行われている血小板抗体スクリーニングにお いて強い陽性を示し１両者共に１：９０以上の血清希釈度で反応し、リンパ球細 胞毒性抗体スクリーニングでは５６−細胞パネルの細胞の６０％以上に対して細 胞毒性を示した。

第４図では、ＡＦおよびＤＰにおける固定化ＰＬｙとの強い反応性は、それぞれ 対照群よりも２．３−２．５倍増加した酵素活性を反映するものであった。しか し、この同じ血清をＮＣ−結合化ＰＡｂと共に使用した場合、ＡＦ反応性は、Ｐ Ｌｙで得られた値の１０倍まで増大し、対照群の値よりも２３．７倍高った。同 様に、ＰＡｂとのＤＰ反応性は対照群のそれよりも１６．７倍高いことが示され た。

ｐＬｙについての０．５４からＰＡｂについての０．７１まてのＡＦ反応性の増 加はおそらく、ＡｇｌｇＧでＰＬｙを吸収させた後のディスクに結合した特異的 なタンパク質の増加量を示すものであろう。

同種抗血清を使用してＨＬＡ−特異的な抗原の存在を測定した、２つの異なるＰ ＡｂについてのＥＬＩＳＡ結果を第５図に示す。供血者Ｈは、リンパ球にＨＬＡ −Ａ３を提示するが（第２表参照）、ＰＡｂ中のその発現は最小であり、正常血 清対照群と比較した場合、検出することができないであろう。供血者Ｒ’（ＨＬ Ａ−ＡＩ、３；Ｂ７．８）は、Ａ１およびＢ８の両者に対する抗血清と強く反応 し、それぞれ反応性が１７０％および１４６％増大したが、抗−Ａ３の反応性に ついては対照群よりも６％しか増大しないことが示された。

血小板関連免疫グロブリン（Ｉ　ｇ）を測定するための種々の定量的検定法は開 発を重ね、免疫媒介性の血小板破壊の病態生理学の研究に役立っている。しかし 、これらの殆どは、特異的および非特異的な抗体の結合性を区別できないことか ら、困難性を内在する。実際、検出され得る抗体すべてに対する後者の抗体の影 響は、上記試験結果を無駄にすることが多い程に高いものである。正常の、およ び抗体感受性血小板の両者におけるｒｇ濃度の違いは非常に小さい場合があるの で、特に問題である。本発明は、これろの問題の幾つかを克服するための方法を 包含する。本発明の使用上の有益性の１つは、血小板輸血の結果を子側するため に使用することのできるインビトロ交差適合性試験である。

本発明は、ヒト血小板を可溶化してその膜成分の機能試験を行うために、アルキ ル−Ｎ−メチルグルカミドまたはアルキルグリコシドなどの、透析され得る非イ オン性の洗浄剤を使用することを包含する。この本発明の方法においては、透析 により過剰の洗浄剤が除去され得ることが重要であり、これにより、再構成とタ ンパク質濃度の測定に関連する問題などが未然に回避される。さるに、洗浄剤は 、モノクローナル抗体による抗原の結合を妨害することがあり、そして洗浄剤溶 液由来の抗原の免疫沈降を含む検定を阻害することがあることが知られている。

Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａおよびバイブリド−７，スクリーニング操作法などで使用さ れるプラスチック製の微小ウェルは、洗浄剤の存在下ではタンパク質の結合に非 効率的であることか従来から示されている。他の方法を使用して洗浄剤を膜溶解 物かろ除去されてきたが、それらは透析はどには単純でなく、また可溶化膜成分 に対する多くの有害な作用が排除されない。

本発明の最も好ましい洗浄剤は、デカノイル−Ｎ−メチル・グルカミド（Ｍｅｇ ａ−１０）である。血小板を既述のようにしてＭｅｇａ−１０で可溶化したが、 これは４μｇの血小板約１０＠個の乾燥重量を基準として約２７％の効率であっ た。これは、０．５％ＮＰ４０可溶化放射線標識化血小板を使用するクコノキ（ Ｋ　ｕｎｉｃｋｉ）らに提示されたデータに匹敵するものである。その際、各デ ィスクに結合された物質２０μｇは、約１．８Ｘ１０’血小板由来の溶解物であ り、これは、特異的抗体のレベルが低い粗調製物における血小板膜の少ない成分 でさえも、検出することができるはずである。

本発明の要旨の１つは、非免疫１ｇＧが血小板表面の成分と僅かなレベルででも 結合することを排除または減少させることである。

洗浄剤、ゼラチン、カゼイン、低イオン強度の緩衝液など種々の標準的な阻害試 剤を使って、または高いインキ−ベート温度を使用して、上記の「非特異的な」 、すなわち非免疫特異的な結合を阻害するという、先に行った本発明者らの試み は不成功に終わった。これにより、この結合は、血小板の膜成分（群）の親和性 −１ｇＧ吸収を減少させるために用いられる通常の方法による脱離を妨害する程 に強い親和性、に特異的である（この結合は免疫特異的ではないが）、という仮 説を立てた。洗浄剤で可溶化した血小板をアガロース−結合化ＩｇＧに吸収させ て得られた結果は、このような膜成分がまさに存在し、それらを除去しても免疫 学的に関連する膜抗原のＰＡｂ中における存在性は変化させないことを示してい る。

特異的な補体媒介性リンパ球細胞毒性を阻害するという、透析したＭｅｇａ−１ ０可溶化ＰＬｙ／ＰＡｂの阻害能は、調製物中に存在するＮＰ４Ｑが非特異的に 細胞毒性を阻害したというクックらの従来の試み［クックらのＨｔ＋ｎ＋、　１ ｍｍｕｎｏ１．　、１４：２３４−２４４（１９１！５）：ｌ、およびトリトン Ｘ−１００を使用した、細り包が非特異的に存在するという本発明者らによる研 究とは対照的である。ＨＬＡＡ−３またはＲ−４４（１２）を有すると知られて いる供血者［それぞれ供血者■、供血者■］由来のＰＬｙは、これら抗原を発現 するリンパ球の集落の細胞溶解を阻害しなかったという事実が見いだされた。同 一の対象から得た血小板および白血球は、幾つかのＨＬＡ抗原について矛盾なく 類別できると長く認識されてきた。興味深いことに、リンパ球がＢ−４４の個人 工ピトープを含有するものである供血者■由来のＰＬｙは、抗−Ｂ−１２（公共 エピトープ）または抗−Ｂ−４４活性のいずれも阻害せず、これに対し、Ｂ−１ ２およびＢ−４５サブタイプに対する抗血清は、リンパ球がこれらの抗原を共に 発現するものである供血者■由来のＦＬＹによって完全に阻害された。この阻害 作用の喪失は、抗原の発現レベルが低いことに一部分由来しているのであろう。

実際、このことは、これら組織適合性抗原を血小板の表面に吸収させた場合に起 こり得る。本明細書に記載しているＥＬ　Ｉ　ＳＡ結果は、低レベルのＨＬＡ　 Ａ−３は検出されるが、その抗原の！、またはおそらくは洗浄剤溶解物中におけ るその分子配座により、Ｐ　Ｌ　ｙ／　ＰＡｂは既述した条件下で抗−Ａ３活性 を吸収できなくなり、それによりリンパ球細胞毒性を阻害できないこと、をむし ろ示している。

前者の現象を支持する証拠が最近、セットマン（Ｓａｉｄｍａｎ）らにより教示 され、彼らは蛍光細胞選別分析、ならびに種々の公共および個人）（ＬＡエピト ープに対するモノクローナル抗体を使用し、血小板上の抗原の変動する発現レベ ルを証明した：セットマンらのＡｍｅｒ、　Ｓ。

ｃ、ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｇｅ ｎｅｔｉｃｓ、ニューオーリンズ。

ＬＡ、　、　９１頁の第１２回定例会の要旨（１９８６）Ｅ。この阻害検定は、 ＨＬＡ抗原が、免疫応答を惹起させる、または抗体に認識されて補体を結合する 程に充分な量で血小板上に存在しているか否かを決定するのに有用であることが 分かるであろう。これらの結果は、血小板輸血療法における価値ある情報を与え るものであり得る。

保存ＮＣ−固定化ＰＬｙ−ＰＡｂが長期にわたり安定であるという事実は、開発 および臨床研究において価値がある。ニニーマンろに示唆されているように、数 百のディスクは同時に調製することがてきるので、迅速さと再現性を伴って、ハ イブリドーマまたＩｔ免疫血清スクリーニングを行うことができる。さろに、こ のようにして、精製した固定化膜の糖タンパク質の免疫学的機能を容易に研究す ることができる。少量の固定化抗原またはモノクローナル抗体を使用する場合の 検定の感度は、特に明白である。

広い特異性の抗体を有する２つの同種血清をこのＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａでの試験用 に見いだしたことは幸運であった。、Ａ　ＦおよびＤＰの両血清の反応性は、Ｐ Ｌｙに対する正常血清のそれよりも明らかに大きいが、ＰＡｂをこのような検定 に使用することは、低い陽性と正常血清対照群との値の相違を際立たせるのに当 然に有益である。

血ＩＪＩ板減少症、たとえばパーナート−ソーラー症候群（Ｂｅｒｎａｒｄ−９ ｏｕｌｉｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ冗ＧＰ１ｂ発現の激しい低下二、またはグラン ツマンズ（Ｇｌａｎｚｍａｎ’　ｓ）血小板減少症］＠関連ＧＰＩｌｂおよびＧ Ｐｍａの量の減少子に罹患した患者から調製したＰＡｂを使用し、特異的な血小 板の糖タンパク質の発現レベルを検知するために、モノクローナル抗体プローブ を使用できることは、臨床研究にも適している。これらの、および他の依然とし て規定されていない抗原は、突発性の、疾患関連性の、同種免疫血小板減少症に おける血小板指向性抗体に対する標的と考えられる。この免疫療法を通常の血小 板交差適合法に適用することは容易に考え及ぶ。

血清試料は、血小板輸血に対して臨床的に明らかに反応しない患者から採取する 。血小板豊富な血漿の一部は輸血のために選ぶ単位から取り出せる。得られた血 小板を可溶化し、アガロース−結合化ＩｇＧで吸収させ、得られたＰＡｂをＮＣ ディスクに固定化し、そしてそれを既述したＥＬ　Ｉ　ＳＡに使用する。次いで 、輸血後の血小板の増加をモニターし、それをＥＬＩＳＡで得られた結果と比較 することにより、交差適合性操作としてのこの検定の予想される価値を遡及的に 判断する。

パン・デル・ベルデン（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｅｌｄｅｎ）らは、外観上適合させ 得る「Ｚ−スコア」計算法を使用し、”’Ｃｒ−血小板細胞溶解検定の結果に基 づいて輸血結果を予想した。このＺ−スコアは、対照群の値の標準偏差と相関す る、輸血した非反応性の対照と、試験値との相違として表される。この試験では 、スコア３またはそれ以下は、交差適合が陰性を表す。当然ながら、このような 値は、輸血が成功する予測性を数量化したものである。

循環している血小板指向性抗体の測定は、臨床医にとっての補助的な、かつ確か な情報として重要であることが十分開示されている。

このことは、長年にわたって試みられてきた多くの、かつ種々の血小板抗体検定 に基づき文献により証明される。しかし、血小板をインビトロで取り扱うことが 本質的に困難であることから特に、簡単かつ好感度であり、そして迅速な検定法 は現在までのところ開発されていない。受動ラテックス凝集試験（ＬＡＴ）は、 医学研究施設の病理学者ばかりでなく、個人病院または療養所の臨床医にとって 、上記のような検定法を提供するであろう。抗原（すなわち、ラテックス・ビー ズに結合する訃）を検出するための多くのＬＡＴは広範な用途を有するが、殆ど の産物は、ビーズに固定化されたヘテロローガスな臥厚調製物を提示せず、これ は生化学的により複雑な問題である。

ラテックス凝集法のラテックス抗体試験に対する予備的な適用操作では、貯蔵血 小板から調製したＰＡｂを含有する血小板抗体検出Ｍ剤（ＰＡＤＲ）を、幾つか の大きさのラテックス（ポリスチレン）ビーズに結合させた。タンパク質がラテ ックス・ビーズと結合する機序は完全に特性化されていないが、疎水性の相互作 用が関連し、要はこれさえあれば十分のようである（特定の化学結合には、タン パク質とラテックスとの接触は必要でない）。

１マイクロン直径のビーズを使用し、（ａ）ある量のビーズと結合可能な最大量 のＰＡＤＲは約１．３Ｘ１０−”／μｇ／粒子であることが見いだされ、（ｂ） １つのラテックス・ビーズ当たりに結合する可溶化血小板物質の分子の理論的な 数（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離した可溶化血小板膜成分１ ００ｋｂの平均分子量に基づく）は、約６２００分子／粒子であることが見いだ された。

しかし、これらビーズにおける種々の抗原濃度、および試験抗血清の希釈物を使 用し、既知の陽性抗血清を添加した後におけるこれらビーズの顕微鏡下凝集の定 量化は、まだ行われていない。

ＬＡＹなどのあらゆる凝集検定において重要である因子は、抗体の血清中濃度、 およびマトリックス（ラテックス・ビーズ、赤血球など）と結合する抗原の量で ある。最適な数の抗原分子が、抗体によって架橋連結できるビーズと結合される にちがいなく、これにより凝集が視覚化される。抗原のラテックス・ビーズへの 固定化についての文献が非常に僅かではあるが存在する。これらは、抗原−ラテ ックス・ビーズの最適の比率を決定するための定量的な方法を提示していないこ とが見いだされている。

最少量の密度の濃い研究調査により、この問題が解決され、臨床研究用の価値あ る試剤が得みれることになろう。

本発明は、半定量的な免疫検定法に使用することのできる血小板交差適合性試剤 を容易に調製する操作法を提供する。これら試剤は長期間保存できるので、大量 の供血プールをスクリーニングし、患者と適合する供血者を選択し、次いてその 選択した個体から血小板を採取することが可能になる。

本発明は、以下の請求の範囲に記載している思想および範囲から逸脱しないなら ば、本明細書に記載している種々の部分、要素、工程および操作法における構築 、操作、および配列上の変更は可能である。

ｃ５　リ　シ　〜 田藻霞査報告 ＩＮＩ４ＩＭ＋１１１１１ＪＩム１ｍ１１ｃＩＩｌ。ｓ　ｈｅ　；Ｃ’：：Ｓ　 Ｅε、こ二９；３

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．血小板抗原に対する抗体を検出するのに有用である基質の調製方法であって 、 血小板試料を、透析可能な非イオン性洗浄剤を含有する水溶液で処置し、その血 小板成分を可溶化して溶解物を調製し、不溶性の粒子および過剰の洗浄剤を該溶 解物から分離し、可溶化した血小板抗原を含有する溶液を調製し、ヒトＩｇＧに 非免疫特異的に結合する物質を該溶液から除去し、部分的に精製された血小板抗 原を調製し、該部分的に精製された血小板抗原を固体マトリックスに固定化させ る工程、 からなることを特徴とする方法。
2. ２．血小板に対する抗体を検出するのに有用である基質の調製方法であって、 血小板抗原を、血小板タンパク質１ｍｇ当たり透析可能な非イオン性洗浄剤約１ ｍｇを含有する水溶液中、約０℃で約３０分間可溶化し、 該可溶化血小板抗原から不溶性の粒子および過剰の洗浄剤を分離し、 核可溶化血小板抗原からヒトＩｇＧと非免疫特異的に結合する物質を除去して部 分的に精製された血小板抗原を調製し、そして該部分的に精製された血小板抗原 を固体マトリックスに固定化させる工程、 からなることを特徴とする方法。
3. ３．生物学的試料中の血小板に対する抗体を検出するするための方法であって、 血小板を、透析可能な非イオン性洗浄剤を含有する水溶液で処置し、その血小板 成分を可溶化して溶解物を調製し、該溶解物から不溶性の粒子および過剰の洗浄 剤を分離し、ヒトＩｇＧと非免疫特異的に結合する物質を該溶解物から除去し、 部分的に精製された血小板抗原を調製し、該部分的に精製された血小板抗原を固 体マトリックスに固定化させ、 該固体マトリックスを生物学的試料と接触させ、そして固体マトリックスに結合 した抗体のレベルを測定する工程、からなることを特徴とする方法。
4. ４．血小板の受血予定者と免疫学的に適合する血小板供給源を同定する方法、お よび血小板減少症の患者の血小板に対する血清抗体を検出する方法であって、 血小板供給源由来の血小板試料を、透析可能な非イオン性洗浄剤を含有する水溶 液で処置し、血小板成分を可溶化して溶解物を調製し、 該溶解物から不溶性の粒子および過剰の洗浄剤を分離し、ヒトＩｇＧと非免疫特 異的に結合する物質を該溶解物から除去して部分的に精製された血小板抗原を調 製し、該部分的に精製された血小板抗原を固体マトリックスと接触させて固定化 部分的精製血小板抗原を調製し、以前に輸血を受けていないＡＢ陽性血液型の男 性の血液プールから抗体含有試料を得、 血小板の受血予定者、または血小板に対する血清抗体を有している可能性のある 者を同定し、 該固定化部分的精製血小板抗原の第１の試料を、血小板抗原に特異的な抗体が該 固定化部分的精製抗原と結合できる条件下で、血小板受血予定者または抗一血小 板抗体を有すると疑われる者由来の抗体含有試料と接触させ、 該固定化部分的精製血小板抗原の第２の試料を、血小板抗原に特異的な抗体が該 固定化部分的精製抗原と結合できる条件下で、以前に輸血を受けていないＡＢ陽 性の血液型の男性由来の抗体含有試料と接触させ、 第１の固定化部分的精製血小板抗原と結合した第１の抗体レベル、および第２の 固定化部分的精製血小板抗原と結合した第２の抗体レベルを測定し、そして、 結合化抗体の第１のレベルをその第２のレベルと比較し、該第１のレベルが該第 ２のレベルよりも実質的に大きくない場合には、該血小板受血予定者と免疫学的 に適合する血小板供給源と同定するか、または該第１のレベルが該第２のレベル よりも実質的に大きい場合には、抗一血小板の血小板受血予定者と、または血小 板減少症の患者の抗体が存在すると同定する工程 からなることを特徴とする方法。
5. ５．洗浄剤がアルキル−Ｎ−メチルグルカミド、またはアルキルグリコシドであ る請求項１、２、３または４に記載の方法。
6. ６．洗浄剤がアルキル−Ｎ−メチルグルカミドである請求項１、２、３または４ に記載の方法。
7. ７．洗浄剤がデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ノナノイル−Ｎ−メチルグル カミド、オタクノイル−Ｎ−メチルグルカミド、またはヘプクノイル−Ｎ−メチ ルグルカミドである請求項１、２、３または４に記載の方法。
8. ８．洗浄剤がデカノイル−Ｎ−メチルグルカミドである請求項１、２、３または ４に記載の方法。
9. ９．洗浄剤がｎ−デシル・β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル・β−Ｄ− グルコピラノシド、ｎ−ドデシル・β−Ｄ−マルトシド、ｎ−へブチル・β−Ｄ −グルコピラノシド、ｎ−ヘキシル・β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル ・β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル・β−Ｄ−グルコピラノシド、または ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシドである請求項１、２、３または４に記 載の方法。
10. １０．水溶液が約０．２％から約０．５％の透析可能な非イオン性洗浄剤を含有 する請求項１、２、３または４に記載の方法。
11. １１．不溶性の粒子を、遠心を包含する工程により分離する請求項１、２、３ま たは４に記載の方法。
12. １２．過剰の洗浄剤を、透析を包含する工程により分離する請求項１、２、３ま たは４に記載の方法。
13. １３．ヒトＩｇＧと非免疫特異的に結合する物質の除去を、固体マトリックスと 結合させたヒトＩｇＧに該溶液を接触させて行う請求項１、２、３または４に記 載の方法。
14. １４．固体マトリックスがニトロセルロース紙、ポリスチレン、またはラテック スからなる請求項１、２、３または４に記載の方法。
15. １５．血小板の受血予定者が、血小板の輸血時における循環性血小板の量の増加 に反応しない請求項４に記載の方法。