JPH03500169A - 標識オリゴヌクレオチドの化学的製造方法及び生物学的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 標識オリゴヌクレオチドの化学的製造方法及び生物学的使用 本発明は、標識オリゴヌクレオチドの化学的合成方法とこれらオリゴヌクレオチ ドの低温プローブ（ｓｏｎｄｅ　ｆｒｏｉｄｅ）としての生物学的使用とに係わ る。

本発明はより特定的には、既知のＤＮＡフラグメント又はＲＮ＾フラグメントに 対して相補的でありハイブリダイゼーションプローブとして使用できるＤＮＡフ ラグメントの合成に係わる。

遺伝子配列の検出には、放射性同位体で標識された高温プローブ（ｓｏｎｄｅ　 ｃｈａｕｄｅ）と称するプローブが長い間使用されてきた。しかるに、オートラ ジオグラフィーという方法は、感度はかなり高いが時間及び費用がかかり、危険 な放射性物質を取扱うという欠点がある。

そこで、ここ５年の間に、放射性元素を使用しない低温プローブと称するプロー ブを用いる核酸配列検出法の研究が次第に大きな関心を気めるようになった。

例えば、オリゴヌクレオチドプローブをビオチニル化ヌクレオチド三リン酸（ｎ ｕｃｌ！ｏｔｉｄｅ　ｔｒｉｐｈｏｐｈａｔｅ　ｂｉｏｔｉｎｙ１６）で酵素標 識するためのキットが既に何種類も市販されている。これらのビオチニル化プロ ーブの検出は、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼもしくはガラクト シダーゼのような酵素システム、又は蛍光もしくは化学ルミネセンスによる比色 システムを、ビオチンに対して極めて大きな親和性を有するタンパク質であるス トレブタビジンに結合することによって実施される。

精度の極めて高い検出には、所定位置で調節的に標識される所定組成のプローブ の使用が有効であると思料される。

本発明者等はこれについて研究を重ね、低温プローブの合成を改善する方法を開 発した。この方法の骨子は、オリゴヌクレオチド配列を構成する時に、その配列 中に通常存在する塩基に代えて修飾ヌクレオチドを組込むことにある。

これらの修飾塩基を介して、通常の塩基と同様の水素結合の可能性を保持しなが ら、置換鎖を導入し、この鎖に標識を固定するのである。

そこで本発明は、化学的合成によりオリゴヌクレオチドを製造する方法であって 、１つ以上の部位に標識単位を一定の方法で組込むことができる方法を提供する 。

本明細書の本文及びクレームでは、本発明の合成方法の対象となる配列の諸単位 （ｍｏｔｉｆ）を、これらの単位の塩基の名称によって識別する。

これらの単位はヌクレオシド及びヌクレオチドであり得、リボース及び／又は２ −デオキシリボースを糖として含み得る。

本発明の方法は一般的にはオリゴデオキシヌクレオチドの合成に使用されるが、 対応するオリゴリボヌクレオチドの合成にも勿論使用できる。

本発明の化学的手法による合成方法は下記のステップを含むことを特徴とするニ ー　構成すべきオリゴヌクレオチド配列を固相法で化学的に合成する時に、その 配列に存在する筈の１つ又は複数のシトシンの代わりに、４位が活性化作用基で 置換された１つ又は複数のチミンを夫々組込み、 −構成されたオリゴヌクレオチド配列を式Ｒ−＾−Ｒ。

［式中、 Ｒ及びＲｏは互いに同じであって−ＮＨ２基、−ＳＨ基もしくは一〇ＦＩ基を表 し、又はＲ及びＲｏが互いに異なり、一方が−ＮＦ１．基、ＳＯ基もしくは一〇 Ｈ基を表し、他方が−Ｎｕ−Ｘ基、Ｓ−Ｘ基もしくは一〇−Ｘ基を表し、但しＸ は当該分子の標識として機能できる基であり、 Ａは炭素原子数的４〜２０のアルキル鎖であって、必要であればＯ，Ｎ又はＳの ようなヘテロ原子を含む］で示される化合物と反応させて、１つ又は複数の活性 化チミンの代わりに４位に置換鎖をもつ５−メチル−シトシンを形成し、化合物 Ｒ−＾−Ｒ゛が標識用の基を含まない場合には、−メチル−シトシンの置換鎖に 標識用の基を導入する。

シチジンを活性化チミジンで置換すると、標識すべき単位を構成中の配列の定位 置に配置することができるようになる。従って、完全に決定された構造及び置換 を有する家酸物が形成される。これに対し、従来の酵素合成による標識オリゴヌ クレオチドの製造では、ヌクレオチドがプライマーから非調節的に組込まれる。

本発明の方法ではまた、組込んだ単位を様々な構造の鎖で極めて柔軟に置換する ことができるなめ、様々な標識の固定が可能であり、従って単一の活性化配列か ら夫々に異なる鎖又は異なる標識を有する複数のプローブを得ることができる。

本発明の合成方法は更に、５°末端ＯＨ及び３°末端ＯＢが遊離したままのオリ ゴヌクレオチドが得られるという利点も有する。このようなオリゴヌクレオチド は、例えば生物学的ベクターの中に挿入することがきる。

本発明の方法の別の利点は、多数のＤＮ＾フラグメントを迅速に且つ低コストで 製造せしめる自動化が可能であるという点にある。

４位を活性化されたチミン単位を組込むステップは、オリゴヌクレオチド配列を 構成する間に行う、この配列は、所期の配列の単位を固体支持体に固定された最 初のヌクレオチド又はヌクレオシドから順に結合してゆき、シトシン単位を４位 で活性化されたチ゛ミン単位により所望通りに置換することによって構成する。

「固体支持体」という用語は、核酸を溶解状態で含み得る少なくとも１種類の特 定媒質中で不溶性を維持できる総ての支持体を指す、使用し得る支持体は多数あ る。具体的には、シリカの有機ポリマー又はガラスピーズ等が挙げられる。これ らの支持体は、別個の分子を直接に又はリンクを介して固定させる反応で使用さ れる官能基を付与すべく、予め（官能化）処理しておくと有利である。この種の 支持体には市販のものもある。その具体例としては、ポリアクリルモルホリドタ イプのゲル、例えばＥＮＺＡＣＲＹＬ　Ｋ−２”という商品名で市販されている ものが挙げられる。ポリアクリルアミド、ポリスチレン又はセルロースもこの種 の支持体として使用できる６ ヌクレオシド又はヌクレオチドの結合は単位毎に、又はヌクレオチド基毎に行う 、配列の構成には、ヌクレオチド値を伸長してゆく公知の固相法、特にホスホト リエステル法又はホスホルアミダイト（ｐｈｏｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）法と 称する方法を使用すると有利である。この種の方法は例えば、本明細書に添付し た参考文献一覧表中の文献（１）〜（６）に記載されている。

縮合は結合剤の存在下で行う、結合剤は過剰量で使用するのが好ましい、結合率 を調べると、活性化チミジン単位を縮合してもこれらの単位は余り減少しないこ とがわかる。

チミンの４位を活性化する方法としては、この頂点にトリアゾール、ニトロ−ト リアゾール又はテトラゾール、イミダゾールのタイプの複素環誘導体を固定する 方法がある。

所望通りに活性化したチミンを容易に形成せしめる好ましい活性化作用基の１つ は、１，２．４−）リアジイル基からなる。

この基をチミンに固定する操作は、例えば参考文献（７）、（８）又は（９）に 記載の方法によって行う。

チミンの頂点４の活性化には別の方法も使用し得、例えば文献（１０）及び（１ １）に記載の方法に従い酸塩化物を用いて実施することもできる。

本発明の方法の第２ステツプでは、合成したオリゴヌクレオチド配列、即ち１つ 以上の所望の部位に活性化チミン単位を含む配列を、式Ｒ−＾−Ｒ゛の化合物と 反応させる。

有利には、ジアミノアルカン、グリコールスはα、ω−アミノアルコールのよう な二官能化合物を使用する。

適当なジアミノアルカンには、エチレン−ジアミン、１−６−ジアミツヘキサン 、１−１０−ジアミノデカン又はスペルミンがある。

ジアミノアルカンによる活性化チミンの置換は、ピリジンのような有機溶媒中で 、好ましくは過剰量のアミンを用いて行う。

形成されたオリゴヌクレオチド配列、即ちメチル−シトシン置換単位を有する配 列を、構成の間中これらの配列を固定的に支持していた支持体がち切り離し、ブ ロック解除する。有利には、固相法による合成で使用した塩基及びホスフェート から保護基を除去する一般的方法を使用する。

ホスフェート基は、より特定的には、例えばＴＨＣＰ＾０と濃縮アンモニア水と を順次使用してブロック解除する。

室温で操作して、ＴＭにＰ＾０を約１４時間反応させる。濃縮アンモニア水は室 温より高い温度、好ましくは約５０℃で約２〜７時間、特に５時間作用させると 有利である。

次いでＤＮＡフラグメントを１つ以上のイオン交換カラムに通して精製し、その 後、例えば酢酸を用いて脱保護処理し、好ましくは再び精製する。

置換鋼が標識用の基を含まない場合は、４位で鎖によって置換された１つ又は複 数のメチル−シトシン単位を含むオリゴヌクレオチド配列を、その分子の標識と して機能し得る基と反応させる。

一般に使用される基としては、ペプチド、ハブテン、着色基もしくは蛍光性基、 例えばローダミン、フルオレセインもしくはダンシル、又はホスファターゼもし くはペルオキシダーゼのような酵素が挙げられる。

好ましい標識はペプチドからなり、アミノ末端基に置換鋼を含むオリゴヌクレオ チドと結合する。

より特定的にはビオチンを活性化した形態、例えばビオチニル−Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステルの形態で使用する。

アミノ化オリゴヌクレオチドのビオチニル化は、ＤＭＦタイプの有機溶媒中で、 塩基性媒質中のこれらオリゴヌクレオチドに活性化形態のビオチンを作用させる ことによって実施するのが好ましい。

従って、オリゴヌクレオチドはより特定的にはｐＨ約８〜１０、好ましくは９の バッファに溶解する。

この反応は過剰量の活性化ビオチンを用いて行うと有利である。

オリゴヌクレオチド濃度対活性化ビオチン濃度の比は約１０−’／１にする０反 応温度は室温以下であり、約０℃〜２５℃の範囲で変化させ得る。反応混合物を ３〜８時間、好ましくは約６時間にわたってほぼ室温に維持し、次いで８〜２０ 時間、好ましくは約１２〜１４時間にわたって約０℃に維持すると、良好な結果 が得られる。

本発明の方法で製造した標識ＤＮＡフラグメントは、生物学的用途で使用できる ように精製する。

合成時に形成された塩の除去は、１つ又は複数のイオン交換樹脂カラム、ＳＩ！ ｐｈａｄｅｘＩＩム又はＢｉｏｇｅｌカラムを用いて行うと有利である。

本発明の他の特徴及び利点は、アンチトロンビンＩＩＩのクローン化遺伝子の検 出に使用されるビオチニル化ＤＮＡプローブの製造に係わる以下の非限定的実施 例で明らかにされよう。

これらの実施例で使用されている略号は下記の意味を表す： ｔＴ：４位が１．２．４−）リアゾールで置換された２°−デオキシチミジン、 ＤＭＴｒ　ニジメトキシトリチル、 が下記の式 で示される基ｐで置換されたチミジン、ＴＰＳＮＴ　：　２，４．６−　）リイ ソプロピルーベンゼンスルホニル−３−二トロー１．２．４−）リアゾール、 ＴＭＣＰ＾０：ピリジン−アルドキシメート−テトラメチルグアニジン、 ＤＣＣＩ　ニジシクロへキシルカルボジイミド、ＤＣｌｌ　ニジシクロヘキシル 尿素、 ＢＮＨＳ　：ビオチニルートヒドロキシスクシンイミド、ＴＥＡＢ　：重炭酸ト リエチルアンモニウム。

実施例１：ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（又はＡＴ　ＩＩりのｃＤＮ＾ＤＮＡフ ラグメントて相補的なビオチニル化プローブの合成。

本発明者等が先に行った実験では、５°位を３２ｐで酵素標識したプローブを用 いて、プラスミド中に挿入したＡＴ　ＩＩＩからｃＤＮ＾を単離することができ た。

これらのｃＤＮ＾を配列し、対応するｍＲＮ＾配列を記述した。

この既知の配列に基づいて、下記の３つのビオチニル化プローブをホスホトリエ ステル固相法により手動で合成した： Ｃ★＝５−メチル、２°−デオキシシチジン；Ｂｉｏｔ＝ビオチニル； Ｂ＝Ｃ★の４位の（Ｎト（ＣＨ２）＋。−ＮＲ−Ｂｉｏｔ）。

この合成は下記の３つのステップを含む：１）トリアゾール化ＤＮＡ配列の化学 的合成、２）ｔＴの１．２．４−）リアゾリル基のデカンジアミンによる置換、 ３）アミノ化ＤＮ＾配列のビオチニル化。

プローブ１の合成ではこれらのステップを下記のように支持体としては、例えば 商標Ｅｎｚａｃｒｙｌ　Ｋｍで市販されている樹脂のようなポリアクリルアミド タイプの樹脂を使用する。チミジン置換率は支持体１ｇ当たり１３０１ｍｏｌで ある。

この支持体の置換率、即ち支持体に固定された最初のヌクレオシドの量を、酸処 理（２％ベンゼンスルホン酸）によって遊離したＣ）１２ｃ１２／ＣＨ，０１１ ：　７０−３０混合物中のＤＭＴ　”カチオンの５０７ｎｍ　ＵＶでの定量によ って評価する。

−下記の式Ｉ で示される単位を丁の合成： 完全に保護したチミジンＤ　Ｍ　Ｔ　ｒ　Ｔ［Ｆ］４ｇ（５，０７ｍｍｏｌ）を ピリジン中で１．２．４−）リアゾール１．４ｇ（２０，３ｍｍｏりと共に蒸発 処理する。

残留物を蒸留ピリジン２５−１中に溶解し、フラスコを水浴中に配置する。

２．５ｇ（１０，１４ｎｍｏｌ）の０−クロロフェニルホスホジクロリゾートを 加え、この反応媒質を０℃で１０分間撹拌し、次いで４８時間室温に維持する。

蒸発乾固後に残留物をＣＨ２Ｃｌ、中にとり、濃縮ＮａＦＩＣＯ２で洗浄し、中 性ｐ）ＩになるまでＨ，０で濯ぎ、Ｎａ１ＳＯ，で乾燥し、濾過し、次いで蒸発 処理する。

得られた生成物を最少銀の量のＣＨ，ＣＬに溶解し、石油エーテル中で繰返し３ 回沈澱させる。

シリカカラム及びＳ！ｐｈａｄｅｘ　ＬＥＩ２０ｅカラムで何回か精製ＤＭＴｒ （ｔ） すると、　１．７ｇの　℃が得られる（収率４０％）。

薄層クロマトグラフ４　（ＣＨｚＣｌｚ、Ｎｅｏｎ：９５−５）　Ｒｆ＝０．４ ８゜−トリアゾール化ＤＮＡ配列の合成 りＭＴｒ １２０ｍｇ、即ち１５．５ｐｍｏｌの支持体　Ｔのを２％ベンゼンスルホン酸（ ＾ＢＳ）で脱トリチル化する。

ＭＴｒ ヌクレオシド　Ｃへ〇（６ｅｑ、）をトリエチルアミン−ピリジン−〇、０：１ −３−１混合物（ＴＰＥ）によって２０分間脱シアノエチル化処理し、次いで１ ８ｅｑ　、のＴＰＳＮＴで活性化し、支持体に固定されたチミジンの官能基５′ ＯＢに結合する。

結合率を、ベンゼンスルホン酸での処理によって遊離されたカチオンＤＭＴ”の ５０７ｎｍ　ＵＶでの定量によって評価した。

この最初の結合の結合率は１００％である。

ヌクレオシドの結合率は、ＤＭＴｒＣＡＴが５９％、ＤＨＴｒＣＴ＾が６５％、 ＤＭＴｒＣＴＣが８６％、ＤＨＴｒＴＴＣが９３％である。

２）　に　るｔＴの１２４−）１　ゾ１ル　！の２に　い−　ンジアミンで　る ６１ｇ（７，９１１＋１ｏｌ）の樹脂を１２０ｆｆｉＭデカンジアミンのピリジ ン溶液６１０ｕｌ（１０ｅｑ、）中に懸濁させる。

この反応媒質を２日以上室温に維持する。樹脂を脱水した後、ピリジンで濯いで 残留ジアミンを完全に除去する。

このアミノ化配列を支持体から切り取り、固相合成で一般に使用されている方法 により脱ブロツク処理する。

水−ジオキサン：１７１混合物に１８７ＨにＰ＾０を溶解した溶液を１．１ｍ１ （１，１ｍｍｏｌ）加えて、オリゴヌクレオチドの脱ブロックを行う、脱ブロッ クすべきホスフェート毎に１０ｅｑ、のＴＭＣＰ＾０を使用する。即ち、前記Ｄ ＮＡ配列の場合には１５０ｅｑ、のＩＭＴＮＩＩ；Ｐｈ３を使用する。

室温で一晩おいた後、前記反応媒質を蒸発乾固させる。

濃縮アンモニア水（２０％）を３１加え、５時間５０℃に加熱する。

樹脂を濾過によって分離し、濯ぎ、Ｖ液を濃縮し、次いでＨ２Ｏを溶離液とする Ｄｏｗｅｘ　ＮＦＩ４”樹脂カラムに通す、得られた生成物を凍結乾燥し、分離 用Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌｅカラムを用いて、酢酸トリエチルアンモニウム１０−２ Ｍバッファ中のアセトニトリルを２０分間で５から２５％又は５から５０％に変 える勾配溶離で、ＨＰＬＣによりＤＭＴｒ段階で精製する。

Ｈ２０中８０％の酢酸で２０分間室温で配列の脱トリチル化を行う、酸を蒸発さ せ、次いでトルエンとの２回又は３回の同時蒸発によって除去する。

残留物をｌ’＋２０中に溶解し、エチルエーテルで洗浄し、濃縮する。

完全に脱保護された生成物を分離用Ｎｕｃ１Ｍｏｓｉｌ’カラムでＨＰＣＬによ り再精製し、その後分析用Ｎｕｅ　ｌ６ｏｓ　ｉ　Ｉ　’カラムで検査する。

３）アミノ　ＤＮＡ　のビ　ニル −ビオチニル、トヒドロキシースクシンイミド（Ｂ、Ｎ、Ｈ，Ｓ）エステルの合 成 使用したプロトコールはＢＡＹＥＲ及びＷＩＬＣ）ＩＥＫによりＭｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、（１９７４）、３４，２６５−７に記載されているも のである。アルミナに通したＤＭＦ３ｍｌ中にビオチン２５０＋ｅｇ（１ｍｓ＋ ｏｌ）を溶解し、この溶液に１５０＋ｅｇ（１，３ｅｑ、）のＮ−ヒドロキシス クシンイミドと４１２ｗ１ｇ（２ｅＱ、）のＤＣＣＩとを加える。

この反応媒質は白色懸濁液の形態を有する。これを３０分間５０℃に加熱し、次 いで室温で２０時間撹拌する６形成されたジシクロヘキシル尿素沈澱物を濾過し 、炉液を０℃で約１４時間保存する。形成されたＤＣＵの不溶性部分を濾過によ って除去し、Ｐ液を濃縮する。　ＢＮ）Ｉｓを大量のイソプロパツールで再結晶 化する。

生成物が２フ１ｗ１１！得られる。これは、７７．６％のエステル化率に等しい 。

−下記の式３に従うアミノ化プローブのビオチニル化ＩＤＯのアミノ化プローブ を、２０ｈｌのｎ２ｏと１０ｈｌのＮａＨＣＯｓバッフｙ　（ｐＨ９）との混合 物中に溶解する。　１ｍｇ（２，９３ｕｍｏｌ）のビオチニル、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステルを４０μｍのＤＭＦに加える。室温で６時間おき且つ０ ℃で一晩おいた後、ＤＮＦを蒸発させ、得られた生成物を０．０５Ｍ　ＴＥＡＢ バッファで溶離されるＳＬ’ｐｈａｄｅｘ　Ｇ１０６カラムに通す。

次いでプローブを分析用又は分離用ＮｕｃｌＩ！ｏｉｓｌ’！’カラムでｉｔ、 Ｃにより精製する。

精製が終わったらオリゴヌクレオチドをＤｏｗｅｘ　５０　ｗＮ）１４”ｅカラ ムでアンモニウム形態で交換し、次いで分析用Ｎｕｃｌｌ！ｏｉｓｌｅカラムで ＦＩＰＬＣにより検査する。

ビオチニル化率は２１％〜２３％である。５’Ｂｉｏｔ＝３．１８ＤＯ０実施例 ２ 前記と同様の操作を行ってプローブ２及び３を製造する。

プローブ２　：　３’　ＮＦＩｚ＝５．２３ＤＯ３’　Ｂｉｏｔ；１．１２４０ ０　効率＝２１．５％プローブ３：５°３’　ＮＨｚ：ＩＤＯＳ’　３’　Ｂｉ ｏｔ＝０．２２８ＤＯ効率＝２２．８％実施例３：ビオチニル化プローブのドツ トプロットの発色前記プローブを使用して、ＢＲＬ社から市販されている２種類 のビオチニル化ＤＮＡ検出キットの性能を調べた。これらのキットは下記の通り である。

１、核酸検出用生成物、ｖｅｒ、　８２３９Ｓ＾。

２　、　Ｂｌｕ　にＥＮＥ”、ｒｅｆ、　８２７９　Ｓ＾。

これら２種類の酵素検出法は、ビオチンがアビジン又はストレプタビジンという タンパク質に対して極めて大きい親和性を有するという事実に基づいて開発され たものである。

最初の発色はビオチニル化プローブのドツトプロットについて行った。

プローブを種々の濃度（Ｌｏｏｐ輸。１〜０．５℃ｍｏｌ）でニトロセルロース 上に配置し、次いで８０℃の炉に１時間通すことによって固定する。

０、ＩＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）；０．１５８　ＮａＣｌバッファ中３％ のウシ血清アルブミンにより、５５℃で２時間フィルタをブロック処理する。

使用した検出キットでは、発色が２つ又は３つの段階で生じる。

第１の市販検出キット１は３ステツプからなるプロトコールに従う。

１、ストレプタビジンとの一合、 ２、ビオチニル化アルカリ性ホスフェートとの結合、３、ニトロブルーテトラゾ リウム（ＮＳＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドニルホスフェート（ ＢＣＩＰ）との着色酵素反応。

ストレプタビジンが４つのビオチン分子を結合する性質を有するために、増幅シ グナルを得ることができる。

第２のキット２では発色が２つのステップで生じる。

１、ストレプタビジンーアルカリ性ホスファターゼとの結合、 ２、ＮＢＴ及びＢＣＩＰとの着色酵素反応。

発色の強度を視覚で評価する。

合成ビオチニル化７０−ブの各発色を、酵素によってビオチニル化し且つ種々の 濃度でニトロセルロース上に配置したＩＩＩＲＬ社のＤＮＡの発色と比較し、そ れによって各ＤＮＡ検出の感度を調べる。

ニトロセルロース上に配置したビオチニル化プローブでは５０ｆ−０１のＤＮＡ が発色した。

−ニトロセルロースフィルタの製造 ＾Ｔ　ＩＩＩのｃＤＮ＾に対応する１、６ｋｂを挿入した標的プラスミドＤＮ＾ とｐＢＲ３２２制御ＤＮ＾とをニトロセルロース上に配置した。

制限酵素旧ｎｄｌｌｌで予め線状化したこれらのＤＮＡを２倍ずつ希釈して、１ ０■〜０．０１，１１の濃度範囲を得、１０分間１００℃に加熱することによっ て変性させ且つ０．５８　Ｎａ０ｆｆを実験室温度で２０分かけて加え、次いで 水中で０．３８　）ＩｃＩ、０．３Ｎ　ＮａＣ１，０，１５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＦＩ ＣＩ（ｐＨ８）、０．１Ｈクエン酸ナトリウムにより中和し、各希釈物をニトロ セルロース上に７．５．１ずつ配置した。フィルタを１時間風乾し、次いで８０ ”Ｃの炉で２時間乾燥した。

−バイブリド形成 ニトロセルロースフィルタを、６ｘＮＥＴ（１ｘＮＥＴ＝０．１５ＭＮａＣｌ、 　０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｔｌｃＩ（ｐＨ７，５）、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴ＾） 、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’５（１００Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ：０．０２％ウシ血 清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコール）、５ ％硫酸デキストラン、０，１％ＳＤＳ及び１１００ｐ／＋ｓｌの音波処理したサ ケ精液ＤＮＡを用いて、３７℃で２時間プレバイブリド形成にかけた。バイブリ ド形成は、５゛でポリヌクレオチドキナーゼにより［３２ｐｌ標識されたプロー ブを１論１当たり１０’ｃｐ−含むか、又はビオチニル化プローブを１１００ｎ ／ｍｌ含む同一溶液中で、３７℃で２０時間行った。これらのフィルタを４℃の ６ＳＳＣで１５分かけて３回洗浄し、４０℃で５分かけて１回洗浄し、その後オ ートラジオグラフィー又は着色反応にかけた。

本発明の方法では、核酸の相補的配列を検出するプローブとして使用できるオリ ゴヌクレオチドを化学的に製造することができる。ちなみに、ストレプタビジン ーアルカリ性ホスファターゼキットの検出限度は約１５ｆｅｎｔｏｍｏｌｅであ る０本発明のプローブはまた、支持体上の分子と接触する溶液中に含まれる相補 的ポリヌクレオチドを分離する場合にも極めて有用である。このような検出又は 分離は、相互的バイブリド形成を生起させるような条件で行う、支持体上には二 重鎖が形成されるため、ＤＮＡフラグメントとの間で相互作用を生じるタンパク 質を精製することもできる。

本発明者等は、標識用の基を５゛側に導入すると、この基を３゛側に配置したと きより安定した二重鎖がバイブリド形成時に得られることを発見した。

１１え１ ＜１　）　Ｒ，Ｋｏｓｔｅｒ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４０，１０３．ｔ９ ８４゜（２）　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ ｅｒｓ、２１，７１９．１９８０゜（３）　Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ他、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１０．６２４３．１９８２゜（４）　Ｋ、 、Ｉｔａｋｕｒａ他、Ｈｕｅ！ｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８，５ ５０７，１９８０゜（５）＾、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４，１６９１，１９８３゜＜６　）　Ｃ０に、Ｂｒｕｓｈ 他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１０，６２９５，１９８ ２゜＜７　）　Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ、２１，２２６５，１９８０゜＜８）　Ｉ’１．Ｌ、Ｓｕｎｇ、Ｊ、Ｏｒｇ、 Ｃｈｅｍ、、４７，３６２３，１９８２゜（９）　Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅ他、Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅ ｓ　７．Ｋｏｓｔｅｒｌｉ　、ｐ、５゜（１０）　Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅｆｌ！ｔ 、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２，４７５５，１９８１゜（１ １）　Ｒ，＾、Ｊｏｎｅｓ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０ ，３．１９８４゜国際・調査報告 Ｓ＾　２４０７７

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．標識オリゴヌクレオチドを化学的に製造する方法であって、 −構成すべきオリゴヌクレオチド配列を固相法で化学的に合成する時に、その配 列に存在する筈のシトシンの代わりに、４位が活性化作用基で置換された１つ又 は複数のチミンを夫々組込み、 −構成されたオリゴヌクレオチド配列を式Ｒ−Ａ−Ｒ′［式中、 Ｒ及びＲ′は互いに同じであって−ＨＨ２基、−ＳＨ基もしくは−ＯＨ基を表し 、又はＲ及びＲ′が互いに異なり、一方が−ＮＨ２基、−ＳＨ基もしくは−ＯＨ 基を表し、他方が−ＮＨ−Ｘ基、−Ｓ−Ｘ基もしくは−Ｏ−Ｘ基を表し、但しＸ は当該分子の標識として機能できる基であり、 Ａは炭素原子数的４〜２０のアルキル鎖であって、必要であればＯ、Ｎ又はＳの ようなヘテロ原子を含む］で示される化合物と反応させて、１つ又は複数の活性 化チミンの代わりに４位に置換鎖をもつ５−メチル−シトシンを形成し、化合物 Ｒ−Ａ−Ｒ′が標識用の基を含まない場合には、−メチル−シトシンの置換鎖に 標識用の基を導入するステップを含むことを特徴とする方法。
2. ２．チミンの４位を活性化する操作が、トリアゾール、特に１，２，４−トリア ゾール、ニトロ−トリアゾールもしくはテトラゾール、イミダゾールのタイプの 複素環誘導体又は酸塩化物を前記頂点に固定する操作を含むことを特徴とする請 求項１に記載の方法。
3. ３．鎖を構成するためのヌクレオシド又はヌクレオチドの結合を、固体支持体へ の一単位の固定の後で、単位毎に又はヌクレオチドブロック毎に行うことを特徴 とする請求項１又は２に記載の方法。
4. ４．式Ｒ−Ａ−Ｒ′の化合物がジアミノアルカン特に１−１０−ジアミノデカン 、グリコール又はα，ω−アミノアルコールであることを特徴とする請求項１か ら３のいずれか一項に記載の方法。
5. ５．ジアミノアルカンによる活性化チミンの置換を、ビリジンのような有機溶媒 中で、好ましくは過剰量のアミンを用いて行うことを特徴とする請求項４に記載 の方法。
6. ６．４位に置換鎖を有するメチル−シトシン単位を含むオリゴヌクレオチドを支 持体から切り離し、次いでブロック解除し、且つ１種類以上の精製にかけること を特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. ７．置換されたメチル−シトシン単位を１つ以上含むオリゴヌクレオチド配列を 、該分子の標識として機能し得る１つ又は複数の基と反応させることを特徴とす る請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. ８．標識用の基を、ペプチド、ハプテン、着色基もしくは蛍光性基、例えばロー ダミン、フルオレセインもしくはダンシル、又はアルカリ性ホスファターゼもし くはペルオキシダーゼのような酵素から選択することを特徴とする請求項７に記 載の方法。
9. ９．標識用の基がビオチンであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
10. １０．請求項１から９のいずれか一項に記載の方法で製造したオリゴヌクレオチ ドの核酸相補的配列検出用低温プローブとしての使用。