JPH03500368A - 形質転換した赤痢菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換した赤痢菌 発明の背景 本発明は、赤痢菌株が感染した宿主の細胞及び組織に実質的に侵入できず、宿主 の感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に実質的に拡散できず、相当数の 宿主細胞を殺滅させるであろう毒素を産生できなくなるように、赤痢菌の腸侵入 性野生株のゲノムを改変する方法に係る。本発明は、特定的には、宿主を赤痢菌 野生株に対して免疫感作するのに使用しうろこのような赤痢菌の改変株に関する 。

シゲラ症（ｓｂｉｇｅｌｌｏｓｉｔ）すなわち細菌性赤痢は世界中の風める熱帯 地方や開発途上国では特に深刻な公衆衛生上の問題である。先進工業国では、シ ゲラ症の散在例がフレクスナー赤痢細菌性赤痢の疾病の成立ちの第一ステップは 赤痢菌（Ｓｂｉｇｅｌｌｌ）がヒトの結腸粘膜に侵入することである（２３）。

粘膜への侵入にはいくつかのステップがあり、細菌が上皮細胞へ入り込み、細胞 内で増殖し、宿主細胞を殺滅し、最終的には隣接する細胞や結合組織へも拡散す るというステップを含んでいる（９．４１．５５．５６）。通常は粘膜表面に限 定される全体的な過程により強力な炎症反応が起り、これが腫瘍や潰瘍の原因と なる（２３゜４１．５５）。

赤痢がシゲラ症の特徴ではあるが、その前に水のような下痢をすることがある。

下痢は結腸での再吸収の障害と空腸での分泌の増加の結果であるように思われる が、赤痢は純粋に結腸での過程によるものである（２１４１）。シゲラ症、主と して古賀赤痢菌１による例では、発症の途中で全身症状が認められることもある 。これらの症状には中青性の巨大結腸、白血病性反応モして溶血性−尿毒症症候 群（“ＨＵＳ”）が含まれている。

ＨＵＳは開発途上国でのシゲラ症による死亡の主因となっている（１１．２２． ３８）。

１； 古賀赤痢菌１が大量絵産生するＳｈ；１−毒素（６）及びフレクスナー赤痢菌及 びソンネ赤痢菌が少量産生するＳｈｉｇａ様毒素（“ＳＬＴ“）（１９，３０） がシゲラ症の４つの段階（すなわち、個々の上皮細胞への侵入、組織への侵入、 下痢そして全身症状）で果す役割はよく判ってはいない。概説に関しては０’　 ：ｊｌｅｌｌ及びＨｏｌ＋ｎｅｉ　（３２）を参照せよ。１８１１〜２２Ｑキロ 塩基（ｋｂ）のプラスミドは全ての種の赤痢菌にとって個々の上皮細胞への侵入 に不可欠である（４１．４２．４４＞。これには侵入、細胞内での増殖及び宿主 細胞を早期に殺滅することを含んでいる＋４．５．４６）。この段階での桂ユと 一毒素及びＳ’ｌ−Ｔの役割は明らかではない。多ｈｉＢ　−毒素及びＳＬＴは 細胞内増殖及び早期の殺滅に重要な役割を果しているようではない（４，１，２ ，４６）。しかしながら、今までに行われてきた実験の中には適切な細胞アッセ イ系で同一遺伝子の変異株を比較Ｉ７ているものはない。最近の知見は５ｈｉＨ −一毒素がヒト結腸細胞の一次培養に対し細胞毒性であることを示している（２ ７）。組織への侵入には他の染色体でコードされた生成物、すなわち滑面（ｓｍ ｏｏｔｈ）リポ多糖類じＬ　Ｐ　Ｓ　’）　（４４，５７）、遺伝子座Ｋｅｐの 非特性化生成物（８，４４）及びエアロバクチン［ｘｅｒｏｂａｃｊｉｎ）　（ ２４，２ａ）を必要としている。ウサギの回腸係蹄での体液の産生に必要なフレ クスナー赤痢菌染色体の部分は匹１−ｍ１ｌ領域とリジンデカルボキシラーゼ部 位近くに局在している（４４）。しかし、体液貯留をもたらす能力がフレクスナ ー赤痢菌のＳＬＴによるものであることを示す証拠は提示されていない。従って 、シゲラ症の全身性合併症の発症における±−ｇａ　−毒素の役割は未だ仮説的 なものである。しかし、ＨＵＳで認められる毛細血管での病変はこの毒素を注射 した動物の脳血管で認められるものと類似しているために、Ｓｈｉｇ＊−毒素は 血管の損傷を仲介することができる（１．２．２２）。

５ｂｉＨ毒素又はＬＳＴを欠く変異株は疾病過程におけるこれら毒素の役割を示 しうるであろう。５ｅｋｉ！ｘ目ら（４８）がＢｅｔｓ細胞アッセイ及びＳｅ＋ １ｎ７テスト（４９）で野生株と同様の侵入性を示すこのような変異株を得ては いたが、この細胞毒素を最も大量に産生ずる古賀赤痢菌１はＳｈｉｇ＊−毒素陰 性変異株（Ｔｅｘ−）ｉユ形を転換することができ、毒素の役割を示すために最 も役立てることができた。更に重要なことに、このようなＴｅｘ−変異株を使用 し、侵入できず、そして宿主細胞内で実質的に増殖できず、又、宿主の感染細胞 内でそしてこれら感染細胞から宿主の未感染細胞へ実質的に拡散することができ ず、又、相当数の感染及び非感染宿主細胞を殺滅する毒素を産生できない変異株 を作ることができる。その結果、Ｔｅｘ−変異株を使用して赤痢菌野生株に対し て宿主を免疫感作することができた。

を交換することにより、古賀赤痢菌１野生株のＴｅｘ−変異株を遺伝子操作する 。細胞アッセイ系や動物でのこの突然変異の作用から、変異株を更に遺伝子操作 して実質的に侵入できず、次いで宿主細胞内及び間で拡散できず、しかも宿主細 胞内で又、本発明によると、古賀赤痢菌１野生株のＴａｒ−変異株は次のもので の対立遺伝子交換により遺伝子操作する：ｉ）古賀赤痢菌１が宿主細胞及び組織 に侵入するために必要な蛋白質をコードする古賀赤痢菌ｌの遺伝子、例えば、鉄 のキレート化及び／又は古賀赤痢Ｗ１への鉄の輸送に必要な蛋白質をコードする 遺伝子（例えば、古賀赤痢菌１のエンテロバクチン（ｅｎｊｅｒｏｂ＊Ｃｔｉｏ ）又はエンテロケリン（ｅｌｅｒｏｃｈｅｌｉａ）遺伝子）をｉｎ　ｔｉｒＯで 変異誘発させたちの；及びｂ）感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に古 賀赤痢菌１が拡散するために必要な蛋白質をコードする古賀赤痢菌１の本発明に よると、更に、（Ｉ）宿主細胞及び組織にフレクスナー赤痢菌が侵入するために 必要な蛋白質をコードするフレクスナー赤痢菌の遺伝子、例えば鉄のキレート化 及び／又はフレクスナー赤痢薗への鉄の輸送に必要な蛋白質をコードする遺伝子 （例えば、フレクスナー赤痢菌のエアロバクチン遺伝子）をｉｎ　ｖｉｔｒｏで 変異誘発させたもの、及び（ｂ）宿主細胞内及び間にフレクスナー赤痢菌が拡散 するために必要な蛋白質をコードする遺伝子、例えばｉｃｔ　Ａ遺伝子をｉｎ　 ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもので対立遺伝子交換してフレクスナー赤痢菌野生 株の変異株を遺伝子操作する。

本発明により、更に、本発明の赤痢菌変異株を使用して赤痢菌野生株に対するワ クチンを作成する。

図式的に示している。図のプラスミドｐＨＳ　？２０Ｌ　ｐＨＳ　７２０２及び ｐＨ３７２０，３中：黒の部分はＡサブユニット遺伝子からの配列を示し；点描 部分はＢサブユニット遺伝子の配列を示し；斜線部分はΩ挿入要素からの配列を 示している。

ように腸侵入性赤痢菌を改変する方法が提供される。宿主特にヒトの感染細胞内 に侵入及び次にそこで増殖することができず、そして宿主の感染細胞内及び感染 細胞と非感染細胞との間に実質的に拡散できず、又、相当数の宿主の感染及び非 感染細胞を殺滅する毒素を産生できなくなるように赤痢菌野生株を改変する。こ の方法には、感染した宿主細胞及び組織に菌株が侵入するために必要な１つ以上 の蛋白質をコードする野生株の遺伝子（例えば、アエロバクチン（ｓｅｒｏｂｓ ｃｌｉｎ）遺伝子）及び感染した宿主細胞内及び間に菌株が拡散するために必要 な１つ以上の蛋白質をコードする野生株の遺伝子（例えばｉｃｓ　Ａ遺伝子［６ ０，６１））が全部又は部分的に除去、又は永久的に不活性化され、好ましくは 少なくとも部分的に除去されるように、赤痢菌の野る。古賀赤痢菌１のような野 生株のゲノムをｔｔ＝ｔ’換するためには、Ｓｂ１ｇ＊−毒素をコードする遺伝 子、好ましくは正にＡサブユニット遺伝子を全部もしくは部分的に除去し、又は 永久的に不活性化し、好ましくは、少なくとも部分的に除去することもその方法 に含んでいるのが好ましい。

本発明方法では、赤痢菌野生株の遺伝子が慣用法例えばｉｎマ自ＩＪで変異誘発 させた遺伝子による対立遺伝子交換で完全に又は部分的に除去或いは永久的に不 活化でき）少なくともその大部分は除去されているのが好ましい。この点に関し 、て本発明ワクチンを製造するときに使用する突然変異させた遺伝子は、遺伝子 １：挿入され、そして次世代の赤痢菌においてニューｉ　＋　Ｉ　Ｏで再生され るときに遺伝子から消失しうるトランスポゾンによって不活化させただけのもの ではないことが好ましい。むしろ、変異誘発させた遺伝子の大部分が欠損してお り、好適なワクチンに適合性のマーカー遺伝子をこのような欠損部分に挿入する のが好ましい。このようなマーカー遺伝子により、そうして形質転換した赤痢菌 が容易に同定される。好ましいマーカー遺伝子は水銀、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、アン チモン、カドミウム、亜鉛及び／又はコバルトに耐性の遺伝子のような重金属耐 性遺伝子である（６２．６３．６４．６５）。

改変した菌株の細胞は慣用法で培養し、次いで減弱させることができる。次に、 細胞を慣用の薬剤として許容されるベヒクル（例えば、食塩水溶液）及び適宜、 慣用の賦形剤（例えば、薬剤として許容される洗剤）と混合して野生株に対する ワクチンを形成することができる。ワクチンは、細胞物質を最終濃度０．２〜５ ■／ｍｌ、好ましくは０．５〜２■／ｍｌ含有するように処方しうる。処方後、 ワクチンは滅菌容器に入れることができ、次いで、これを密封し、低温（例えば ４℃）で保存するか、或いは凍結乾燥させることもできる。

ヒト宿主で赤痢菌野生株に対する免疫性を誘導するためには、約１０９〜１０１ １の凍結乾燥した赤痢菌細胞を含有するような用量で、好適に処方したワクチン を１回以上投与することができる。

ワクチンは慣用法で経口投与することができる。治療は、ワクチンの１回投与又 は長期に亘る複数回の投与からなりうる。

次の実施例で本発明を説明する。

実施例 特記しないかぎり、本実施例で使用するクローニング及び形質転換の手順及び手 法はＭｘｎｉａｆｉ＋らのｒＭｏｌｅｅｏｌａ＋　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａ ｂｏｒｘｊｏ＋ｙ　１ｌａｎＩｌａｌ　Ｊ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ ａｒｂｏ＋　Ｌｔｂｏｒａ＋ｏｒ７（１９８２）に一般的に記載されているもの と同じである。

実施例１〜６で使用する菌株及びそのファージ又はプラスミドの内容は第１表に 示す。

実施例では２つの培地を使用した二Ｍ９最少培地（Ｎ　ａ、ＨＰ　０　・１２Ｈ Ｏ：　１５ｇ／Ｊ　、Ｋ’Ｈ２Ｐ　０４　：　３　ｇ／ｌ、ＮａＣｌ　：Ｌ５　 ｇ／ｌ、ＮＨ４ＣＪ　：　１ｇ／ｌ、Ｍ　ｇ　Ｓ　０　・７　Ｈ２０：　０．０ ５　ｇ　／　１　）及びトリプトカゼインツヤブロス（Ｔｒｙｐｊｏ　Ｃａ１ｅ ｉｎ　５ｏｙｓ　Ｂｒｏｔｈ）　（Ｄｉｉｇｎｏ自１ｅｓＦａｓｔｔＩｌｒ、　 ＭａｒｎｅｌＩｔ　ＣｏｑｃｅＮｅ　、フランス）。

Ｉｎ５ｊｉｔｕｊ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　（パリ、フランス）から入手した野生型の 抗生物質感受性の古賀赤痢菌ｌ菌株５Ｃ５１１０から全ＤＮＡを調製した（５０ ）。ＤＮＡｔＯ，ｃｃｇをＥｃｏＲＩ　（Ａｍｅｒｓｈｘｍ。

Ｂｍｃｋｉｎｇｈｉｍｓｈｉｒｅ　、英国）で消化し、０，７％のアガロースゲ ル上に載置した。３．５〜４．５ｋｂの断片を電気溶離した。精製した断片０． １μｇを、１μｇのｃｏｓ一連結し、ＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸したλＧＴ ＩＩアーム（ＳＩｒａｌＢｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｌｅｍ　、サンディ エゴ、米国）に連結し、販売元の指示に従ってＰａｋｍｇｅｎｅＳｙｓｔｅｍ　 （Ｐｒｏｇｅｍａ　Ｂｉａ＋ｃｅ、　Ｍａｄｉｓｏｎ　、米国）を使用してＩク ツケージングした。次いで、パッケージングしたＤＮＡを大腸菌Ｙ　１０９０　 （５９）にトランスフェクトした。次に、λＧＴＩＩバンクを、Ａ、Ｄ、Ｏ’Ｂ ｒ１ｅｎ、　Ｕ、Ｓ、Ｕ、Ｓ、Ｈ，Ｂｅｊｈｅｉｄａ、　ＭＴＩ、米国から入手 した５ＬＴＩのＢサブユニットに特異的なモノクローナル抗体である１３Ｃ４（ ５４）でスクリーニングした。ｌ−個の組換えファージをＬＢソフトアガー中の Ｙ　１０９０上にまいた。プレートを３７℃で１２２時間インキュベートた。予 め１０ｍ１Ｊのイソプロピルチオガラクトシド（“Ｉ　ＰＴＧ”）溶液（Ｓｉｇ ｍａ、Ｓｔ　Ｌｏａｉｓ、　ＭＯ，米国）に漬けたニトロセルロースフィルター （Ｓｅｈｌｅｉｅｈｅｒ及び５ｃｈｕｌｌ。

Ｄａａｓｅｌ、西独）をプレートに適用し、次いで、４２℃で２．５時間インキ ュベートした。フィルターをプレートから取り出し、ＰＢＳ−ミルク（ＩＸＰＢ Ｓ中脱水低脂肪ミルク５０ｇ／Ｊ）中、３７℃で１時間インキュベートし、１ｘ ＰＢｓで５回洗い、希釈していないハイブリドーマ細胞上清中の１３Ｃ４モノク ローナル抗体と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ミルクで５回洗った後 、アルカリ性ホスファターゼと抱合した羊抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｙｓ、 　ＣｏｌＣｏ１ｌ１ｐｔｅ　、フランス）の１／２００希釈液を含有するＰＢＳ −ミルク中、３７℃で、１時間、フィルターをインキュベートした。フィルター を再度１ｘＰＢＳで洗い、染色溶液にトロープルーテトラゾリウム０．３３■／ ７．リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル０．１６■／ｌ　（両化合 物共ｇｉｇｍｍ製）　、１００ｍＭ　トリスＨＣ１ｐＨ９，５、ｌ［ｌｈ＋Ｍ　 Ｎ　ａ　Ｃ１５５０ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２　）中に置いた。陽性のクローンを プラーク精製し、Ｙ２Ｏ２Ｓにトランスフェクトした（５９）。次に、ＤＮＡを 溶原菌から調製した（１３）。大腸菌ＪＭ８３のプラスミドベクターｐＵｃ８の Ｅ　ｃｏＲＩ　ｍ位テサブクローニングした（５８）。上記のように、但し、次 のような変更を行って、モノクローナル抗体１３Ｃ４で大腸菌ＪＭ８３のサブク ローンをテストした：乾燥したニトロセル。−スフイルターをプレート上に置き 、ＰＢＳ中２■／１のポリミキシンＢ溶液２　ｍｌをフィルター上に加えた。次 に、ＰＢＳ−ミルクインキュベーションを始める前に、プレートを３７℃で４５ 分間インキュベートした。５ＬＴＩのＢサブユニットを含む大腸菌ＪＭ８３中の サブクローンｐＨ８７２０１が同定された。

遺伝予電効果によって、大腸菌ＪＭ８３のサブクローンｐＨ３７２０１は、１３ Ｃ４モノクローナル抗体の存在下でのコロニー免疫プロットアッセイで親株５Ｃ ５０［１より強いシグナルを有することが判った。ｐＨ９７２０１のＳｈｉｇｔ −毒素コード領域の制限地図は　５ＬＴＩのものと同じであった（１４）。Ａサ ブユニット遺伝子は、実施例２に記載したようにカセットを挿入しうるＡＴＧ出 発コドンから３１０ｂｐ下流にある独特なＨｐ＊１部位を有することが判った。

実施例２・・・Ｓｈｉｇｘ−毒素Ａサブユニット遺伝子のｉｎマ１ｌｒｏでの変 異誘発 サブクローンｐＨＳ　７２０１では、４．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片内に 全Ｓｈｉｇ！−毒素オペロンが含まれている。スペクチノマイシン耐性をコード し、Ｔ４翻訳転写停止信号が各側１；あるインターボシンΩ（３７）を挿入する ことによってＡサブユニット遺伝子のｉｎ　ｖｉｌｒｏでの変異誘発を実施した 。ΩはＨｉｎｄｌＩ２ｋｂ断片として精製され、その末端にはＤＮＡポリメラー ゼエのフレノウ断片が充填されていた。次に、ΩをＨｐ＊Ｉ線状化ｐＨ３７２０ １に連結させて、図に示すような組換えプラスミドｐＨ３７２０２を生成した。

次に、変異誘発した配列を含有する６、２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片を精製し、自殺 プラスミドベクターｐＪＭ７０３．１　（５１）のＥｅｏＲ１部分に連結させて 図に示すような組換えプラスミドｐＨ３７２０３を生成した。大腸菌５Ｍｌ０の ゲノムに組み込まれているラムダファージに含まれる９１１機能をインドランス （１ｎ−１ｒｇｎ＋）でその欠損Ｒ６Ｋ源に補足したときのみにｐＪＭ７０３． １は複製する（２１）。大腸菌５Ｍｌ０はその染色体に統合されてしする広範な 宿主域のＩ　ｎｃＰ−型プラスミドＲＰ４の転移遺伝子も含有している。従って 、ｐＪＭ７０３．１は、ＲＰ４からのＭｏｂ部位を含有している（５１）ために 、５Ｍｌ０λｐｉｒ（２１）で可動化されうる。このようにして、ｐＨ３７２０ ３は菌株５Ｍｌ０λｐ１ｒ中で安定して保持されており、次に、野生型古賀赤痢 菌１株５Ｃ５０Ｇに捨金的に移行させた。セロファン膜上で交配を行い、チアミ ン、メチオニン、トリプトファン及びニコチン酸を各々１０μｇ　／　ｍｌの濃 度、グルコース０．２％及びスペクチノマイシン５０μｇ　／　ｍｌを補ったＭ ９最少培地でブレーティングすることにより選択した。選択培地上で増殖してい るコロニーを精製し、特異的なウサギの抗血清（Ｄｉ＋Ｈｎｏｓｔｉｃ＋　Ｐｘ ｌｅｎ＋）で凝集させることにより古賀赤痢菌１と同定した。

野生型染色体のＳｈｉｇｔ−毒素遺伝子とＳｈｉｇｔ−毒素遺伝子をｉｎマ１ｌ ｒｏで突然変異させたものとの間の対立遺伝子交換は、Ｔｏｓ−表現型を発現す る古賀赤痢菌１を検出するモノクローナル抗体１３Ｃ４を使用したコロニープロ ットイムノアッセイにより示された。

古賀赤痢菌ｌ細胞のゲノムでのＴＯＩ−改変の存在は、上記のらのＡサブユニッ ト遺伝子の一部とＢサブユニット遺伝子全体を含む６５５ｂｐのＨｉｎｄ　ｍ　 −Ｈｉｎｃ　Ｉ［断片から作成したプローブで立証された。Ωインターボシンを 含有する上記の２ｋｂＨｉｎｄｍ断片もプローブとして使用した（３７）。プロ ーブとして使用したＤＮＡは３２Ｐ−標識５　’　−ｄ　ＣＴ　Ｐ　（Ａｍｅ＋ ｓｈｇｍ）によイブリッド形成により分析した。５ｏｉｈｔｒｎの方法（５３） により、ＤＮＡ断片をアガロースゲルからニトロセルロースフィルター　（Ｓｃ ｈｌｅｉｃｈ！ｒ及びＳｔｂ＋＋Ｉｌ）へ移した。６５℃、−晩でハイブリッド 形成し、６×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄した。プローブは、両方のプローブとハイ ブリッド形成するＴｏｘ−変異株では、毒素遺伝子を含有する古賀赤痢菌１から の４．２ｋｂ　ＥｃｏＲＴ断片が６．２ｋｂ断片で置換されていることを示して いた。この結果から、ｐＨＳ　７２０３の突然変異した毒素遺伝子の各側に側面 を接した領域は５Ｃ５００ゲノム中のその相手と組換わっており、野生型Ａサブ ユニット遺伝子を変異した遺伝子で置き換えたことを示していた。

これらＴＯＩ−クローンの１つである５Ｃ５０１を更に研究するために選択した 。クローン５Ｃ５０１は１９８８年６月３０日に受託番号！−７７４としてＣｅ ｎ１ｒｅ　Ｎｎ＋１ｏｎａｌｅ　ｄｔ　Ｃｕ１ｌ＋ｅａ　ｄｅＭｉｅ＋ｏｏＢｘ ｎｉＩｍｅｓ　ｏｌ　１ｎｓｌｉｔｎｌ　Ｐａ５ｔｅＩＩｒ　（パリ、フランス ）に寄託した。

実施例３・・・細胞毒性、ｌ’１ｅＬａ細胞内での増殖１マクロフアージの剥離 並びにウサギ結腸係蹄及びサルでの細胞毒性のアッゞイ５Ｃ５００及び”ＥＣ５ ０１並びに各々その非侵入性誘導体である５Ｃ５０２及び５Ｃ５０３（これらは 、細胞の侵入に必要な大きな発病性プラスミドｐＨ３７２００の自発的治癒（す なわち消失）により得た）を鉄欠乏培地２００ｍ１中で４８時間増殖させた。ガ ラス器具は６Ｎ　ＨＣｊ！で予備処理し７、鉄を含まない水でよくすすいだ。培 地はＣａ　Ｃｊ！　２１５　μｇ　／　”、カザミノ酸５■／ｍｌ、グルコース ２■／ｍｌ、チアミン５０μｇ／ｍｌ、Ｌ４リプトファン２０μｇ　／　ｍｌ　 、ニコチン酸１０μｇ／ｍｌ及びヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）　１５０ μｇ／ｍｌを補ったＭ９塩を含有していた。細菌は食虐水で２回洗い、３　ｍｌ のＰＢＳに再懸濁させた。最終濃度０．２■／　ｍｌでリゾチームを加えた。室 温（２５℃）で３０分間インキュベートした後、ＥＤＴＡ　Ｏ，５Ｍ　（ｐＨ８ ）　３０μｌを加え、細胞を水浴に移し、超音波処理した。超音波処理抽出物を フィルター滅菌し、−２０℃で凍結保存した。フィルター滅菌した培養上清及び 細菌抽出物を、１０％の牛胎児血清（Ｇｉｂｅｏ）を補ったＮ−グルタミン（Ｇ ｉｂｅｏ、Ｐａ１ｃｌｅ１．スコツトランド、英国〕及びＥａｒｌｅ塩を有する 最少必須培地で増殖させたＨｅＬａ細胞への細胞毒性１：ついてアッセイした。

マイクロタイタープレート内で細胞培養培地（１００μＩ）を順次希釈した。各 ウェルには１００μ！中に２　Ｘ　１０’個の細胞を接種した。次に、プレート を５％Ｃｏｚ中、３７℃で２４時間インキュベートした。ウサギポリクローナル 血清及び１３Ｃ４モノクローナル抗体の両者で中和アッセイを実施した。プレー トを光学顕微鏡で調べてからＧｉｅｍｘａ染色した。抽出物蛋白質１■当りの５ ０％細胞毒性用量（ＣＤ５０）として細胞毒性を計算した。

ＨｅＬｉ細胞内での細菌の増殖をアッセイした（４６）。３５膿のプラスチック 製組織培養皿（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｖａ＋ｅ、　Ｏ！ｎ ａｒｄ、ＣＡ、米国）中のＢｅＬａ細胞の非融合単一層に、最少必須培地（”Ｍ ＥＭ”　、　Ｇｉｂｅｏ）２ｍｌに１００の感染倍数（”ＭＤＩ”）で再懸濁さ せた細菌を接種し、２．２ＨＸｇで１０分間遠心分離し、３７℃で３０分間イン キュベートして侵入させた。次に、ブＩノートを、　Ｅｓｒｌｅ’ｉ　Ｂ１１ｎ ｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　（”Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ｓ”　、　Ｇｉｂｃｏ ）で３回洗い、ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭ　Ｅ　Ｍ　２　ｍｌ で覆った。これを時間０（Ｔｏ）とした。３７℃で１時間インキュベートした後 、調製物を再度ＥＢＳＳで洗い、抗生物質を含まないＭ　Ｅ　Ｍ　２　ｍｌで覆 った（Ｔ１）。更に３時間インキュベージタンを続けた（Ｔ１〜Ｔ４）。毎時間 、２枚のプレートを取り出した。１枚のプレートはＥＢＳＳで３回洗い、ＧＩＣ ＩＩＩ目染色し、感染した）ＩｅＬａ細胞を計算した。もう一方はＥＢＳＳで５ 回洗い、成育しつる細胞外細菌を除去した。細胞をトリプシン処理し、計測し、 蒸留水中０．５％のデオキシコール酸ナトリウムで溶解させた。希釈物をＴｙｐ ＋１ｅａｓｅ　ＳｏＩ　Ａｇａｒに載置した。感染ＨｅＬａ細胞当りの細菌の平 均数を計算した。実験は４回繰り返した。細胞内での増殖曲線を書き、指数関数 相の傾斜を計算した。

マクロファージの剥離及び殺滅についてのアッセイは、補体不活性化牛胎児血清 （Ｇｉｂｅｏ）及び２ｍＭグルタミシ（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＲ　ＰＭ　Ｉ　１ ６４０　（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ！Ｉｎｃ、　Ｉｊｃｌｅｉｕ　Ｕ Ａ、米国）内に保拷したＪ７７４マクロファージ（５２）を使用して実施した（ ４）。感染の１８時間前に、１ｍｌ当り０゜５μＣｉの［３Ｈ］ウリジンを含有 する培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で、３５皿のプラスチック製組織培養皿（Ｂｅ ｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉａａｏｎ　Ｌａｂｖｍｒｃ）内の７　Ｘ　１（１５個のマ クロファージを標識した。Ｍｏｌが１００でのＲＰＭ１１６４１１中細菌懸濁液 １ｍｌを添加する前に、細胞をＥＢＳＳで３回洗った。５％Ｃｏ２中、３７℃で １時間感染させた。次に、単一層をＥＢＳＳで３回洗い（Ｔ）、５％ＣＯ２下、 ３７℃で、２ＩＩＩＭグルタミンとゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌを補ったＲＰ ＭＩ２ｏｔ１で１時間覆った（Ｔ１）。次に、プレートをＥＢＳＳで３回洗い、 ５％Ｃｏ２下、３７℃で、ゲンタマイシンを含有しないＲＰＭ！グルコース内で 更に３時間インキュベートした（Ｔ　−７４）。

■ 毎時間、２枚のプレートを取り出し、培養物をＥＢＳＳで３回洗い、プラスチッ ク表面にまだ接着している細胞中の成育しえないマクロファージの割合をＴｒｙ ｐａｎ　Ｂｌｕｅ染色により測定した。

次に、皿の中に残留している放射活性量を測定することにより残留しているマク ロファージの割合を測定した。蒸留水中０．ｓ％のデオキシコール酸ナトリウム １ｍｌで粘着細胞を溶解し、この溶解物１００μｌを沈殿させて計量した（４） 。

６％のペンタパルビタールナトリウム０．５ｍｌ／ｋｇで麻酔した約２ｋｇのウ サギで、１０ａｌ＋のウサギ連結結腸係蹄を調製した。

Ｔｒ７ｐｌｉｃ■Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ　１．ｍｌ中１０７及び１０９個のＣＦＵ の接種物をテストした。１８時間後にウサギを殺した。係蹄内の液体貯留を記録 し、容量と長さとの比（’Ｖ／Ｌ”）を計算した。

感染した係蹄の部位を１０％緩衝ホルマリン中に固定した。検体を標準法で処理 し、ヘマトキシリネオシンーサフラニンで染色した。

体重３．５〜４．５の８匹の赤毛猿に塩酸ケタミン（１ｍｚｌＨｎｅ５００・　 Ｒｈ’ｊｎｔ　ＩＦ’山ｖＸ、ジョン。フランス）５０■を筋注した。

Ｔｒｐｌｉｃｚｓｔ　５ｏｙＢｒｏｊｂ及び１４ｇ／ｊの重炭酸ナトリウム（５ ｏ１５　Ｇ　）　２０　ｍｌに再懸濁させた５Ｃ５００及び５Ｃ５０１微生物１ ．５Ｘ１．１１個を各動物の胃の内に接種した。接種物をＣｏｎｇｏ−ｒｅｄ寒 天にブレーティングすると、接種物中の細菌の１％以上が侵入特性を失ったこと が示された（２６）。下痢、１１１％粘液及び血液の存在について便を毎日調べ た。これらの症状の各々の強度は、毎日、０〜３＋で評価した。各動物について は、所与の症状の重篤度を、各症状の「＋」の合計を表わす指数で表現した。電 撃性赤痢で死亡したサルは直ちに培検した。ウサギの組織について上記したと同 様に検体を処理した。

結果 細胞毒性アッセイでは５Ｍｌ０λｐｉｔ　（ｐＨＳ　７２０３）は非細胞毒性で あった。古賀赤痢金にｐＨ３７２０３を抱合的に移した後、ＡｍｐＳＳｐ【２表 現型を示すクローンをコロニーイムノプロットアッセイでテストした０５％がＴ ｏＸ−の表現型を示した。

５Ｃ５０１は３４７　ＣＤ５０／蛋白質■の細胞毒性を示し、この値は良く知ら れている大腸菌に１２の値（４１２ＣＤ５Ｇ／■）と同程度であった０３Ｃ５０ １由来の残りの細胞毒性は抗Ｓｂｉｇｘ毒素ポリクローナル抗体で中和できなか った。

野生型菌株５Ｃ５００の指数増殖率（世代／時間）は２．５±０．６であるのに 対し、菌株５Ｃ５０１中のＴｏＸ−変異株の指数増殖率は２．６±０．７である ことから、菌株５Ｃ５０１中のＴｏｘ−変異株の存在によりＨｅＬｘ細胞内での その増殖能が顕著に変化することはなかった。更に、５Ｃ５００及び５Ｃ５０１ によるＪ７７４マクロファージの急速な殺滅の有効性でも顕著な差は認められな かった。細胞の剥離及びＴｒ７ｐｘｃ　Ｂｌｕｅ陽性細胞の出現の両者が４時間 に亘り同様な速度で進み、従って、感染細胞内に放出されたＳｈｉｇａ−毒素は 細胞内増殖速度に顕著に影響することも、宿主細胞の迅速な殺滅を増加させるこ ともないことが示された。

ウサギの連結係蹄モデルでの古賀赤痢菌の病因性に対するＩｎｖ−及びＴｏＸ− 変異の作用を係蹄内での液体産生に対する作用によって測定した。各菌株につい ての６つの係蹄に２種の接種物（すなわち１０　及び１０７ＣＦＵ）のいずれか で得た結果から算出をして平均及び標準偏差を得た。侵入性菌株（すなわち、Ｓ 　Ｃ５０１１ｓ　Ｉ　ｎｖ、　、ＴＯ４及びＳ　Ｃ５０１、Ｉ　ｎｖ−、Ｔｏｘ −）の両方の接種物では、Ｓｈｉ！ａ毒素の産生がなくなると液体の貯留は減少 したが、差異は統計的に有意ではなく、侵入とそれに続く炎症が液体貯留の第一 の原因であることを示している。非侵入性菌株（すなわち、Ｓ　Ｃ５０３、ＴＯ Ｘ　及びＳ　Ｃ５Ｇ２　、ＴＯＸ−）については、ＳｈＩｇ！−毒素を産生ずる 菌株のみが液体貯留を誘発したことから大きな差異が認められた。このことは、 疾患の間でこのエンテロトキシンがどのような役割を果すにしても、ウサギのモ デルではＳｈｉｇｘ−毒素が古賀赤痢菌ｌの唯一のエンテロトキシンであること を示していた。組織病理学的研究により、５Ｃ５００又は５Ｃ５０１による接種 物のいずれでも多くの絨毛を破壊している腫瘍及び潰瘍を含む重篤な病巣が示さ れた。

一般に、野生型菌株に感染した係蹄での病変がより重篤でありたが、差が小さか ったとの観察は侵入が病原性の主要因子であることを示した。

非侵入性Ｔｏｘ　株である５Ｃ５０２に感染した係蹄は、絨毛の膨潤及び短縮、 固有層の浮腫及び炎症、杯細胞から分泌される大量の粘液による上皮細胞の変化 並びに核濃縮した核による殺滅腸細胞部分を伴い重篤に変化した。しかしながら 、最も大きな特徴は上皮層全体に亘る出血であった。

古賀赤痢菌１の病原性についてのＴｏｘ−変異の影響をサルで示した。５Ｃ５０ ０注射群及び５Ｃ５０１の注射群の両群で４日目に電撃性赤痢により２匹のサル が死亡し、各群は、Ｓｈｉｇ！−毒素は致死的な赤痢に必要ではないことを示し ていた。膿及び粘液の量を正確に定量することは困難であるが、下痢便の容量並 びに膿及び粘液の量に顕著な差は認められなかった。一方、５Ｃ５０Ｑに感染し た動物での異常便では血液の存在は不変の特徴であったが、５Ｃ５０１に感染し た動物では一匹のみで微量の血液が一時的に見られただけであった。動物の死亡 直後に実施した剖検は結腸腹膜中皮で明白な違いを示した。結腸腹膜中皮は、５ Ｃ５００に感染した動物の場合の６でパッチ状の出血部分が観察されうるＳ状表 面で特に明らかであった。平均すると、腫瘍の数や重症度は同様であったが、リ ーベルキューリ腺での破壊を伴う粘膜の化膿性壊死は５Ｃ５００に感染した動物 でのみ部分的に認められた。絨毛膜、粘膜下組織及び腹膜の炎症性浸潤もこれら の動物でより重篤であった。更に、５Ｃ５０１に比しＳ　Ｃ５００に感染した動 物に特徴的である腹膜中皮の炎症性浸潤は主として血管周囲のものであり、従っ て、重篤な腹膜脈管炎の存在を示唆する肉眼的検査を確認した。しかしながら、 顆粒細胞内絨毛膜内の毛細管循環のレベルで最も大きな差が観察された。ＳＣ５ ◎０で感染したサルでは粘膜の上部構造を破壊する出血が認められた。上皮内膜 を局所的に損傷している微細な膿瘍を介して赤血球が小腸管腔内に拡散している のが観察できた。

これらの出血は明らかに毛細管係蹄の破壊によるものである。

一方、５Ｃ５０１に感染したサルは毛細管係蹄の拡張は示すが、破壊は示さなか った。感染前及び感染後３８目に実施した白血球数の計測は以下のように示した ：０日８には、多形核白血球（“ＰＭＮ”）数には有意差はなく、骨髄増加はな かった：３日８には、血液ＰＭＨの低下及び骨髄増加の程度の各々は５Ｃ５００ に感染したサルでより明らかであった。

結論 ヒトにおける状況証拠はＳｂｉｇａ−毒素が真の病原性要素であるという仮説を 支持している。古賀赤痢菌１の侵入性で毒素産生が低い、塩素酸塩耐性変異株の 菌株７２５を摂取した志願者は、野生株Ｍ１３１を摂取した者より重症度の低い 症状を示した（２５）。

自然に感染した患者では、古賀赤痢菌１に感染したときには他の血清型の赤痢菌 に感染したときより、ＨＵＳを含めより重篤な症状となるのが普通である（７） 。これらは毒素中和抗体を速やかに発達させる（１８）。

古賀赤痢菌ｌのＴ［−変異株である５Ｃ５０１は大腸菌に１２と同様の残留量の 細胞毒素を産生ずることが示されている。この変異株は古賀赤痢菌１の病原性に おけるこのＳｂｉｇａ−毒素の役割を調べるための研究に使用されてきている。

細胞アッセイ及びより確実な動物モデルが使用されている。

ＢｅＬａ細胞や単一層内のＪ７７４マクロファージを使用するアッセイは、以前 の研究（４６）がフレクスナー赤痢菌でのＳＬＴについて示唆しているように、 Ｓｈｉｇａ−毒素の分泌は感染細胞内での指数増殖速度には影響しないことで示 した。これらの結果は、５Ｃ５０１に変異株及び２つの他の毒素産生の低い変異 株（２５，４Ｂ）が、上皮内での細菌の増殖能に相関することが知られている角 結膜炎に影響を与えない（４９）という観察と一致している。又、以前に示唆さ れているように（４，１２）、Ｓｂｉｇａ−毒素の産生と宿主細胞の早期殺滅と の間には相関関係が観察されなかった。このようなデータは実際の感染により類 似しているアッセイで確認することが必要であるが、工止−毒素が感染の細胞内 段階では主要な役割を果していないことを明示している。侵入が、５ｈｉｐ　− 毒素のゆっくりと作用する過程（１２）よりもより速く宿主細胞の殺滅を仲介す る早期の代謝の引き金になるように思われる。

ウサギの連結した小腸係蹄の感染では、５Ｃ５００及び５Ｃ５Ｄ１接種物の両者 で、１８時間後の粘膜病変の重症度がわずかしか違わないことを示していた。し かしながら、露出の時間や係蹄の閉塞が細胞毒素産生の作用を隠し、侵入を第一 のものとしているのかもしれない。腸毒性に関する結果は侵入性細菌の場合に分 析がより困難であった。それは、産生された液体の量が、Ｔｏｘ−変異株の両方 の接種物でより少かったが、野生菌株により分泌されたものと有意には異っては いなかったからである。このことは、上皮の再吸収機能を阻止するには組織への 侵入で十分であることを示していた。一方、非侵入性のＴ　Ｏ！”及びＴｏ！− 変異株の間で観察された大きな違いは、ウサギモデルの感受性の限度内ではＳｈ ｉｇｘ−毒素が古賀赤痢菌１の唯一のエンテロトキシンであることを示している 。このことは以前の研究（１６，１７，３３）とも一致する。しかし、Ｉｎｖ　 及びＩｎｖ−の変異株での液体貯留を観察すると、産生された液体の性質は感染 している菌株によって異なっている。侵入性菌株は、産生されたＳｈｉｇｇ−毒 素の量とは無関係に、管腔内で潰瘍化した膿瘍の程度を反映しているであろう粘 性で粘膜病原性で、時には血液を含む液体の産生を誘発するが、非侵入性のＴａ ｘ　菌株は腸毒性や細胞毒性をより反映している水様で時には血液を含む液体を 産生する。Ｉｎｖ−、Ｔｏｘ　変異株である５Ｃ５０２に感染した係蹄からの組 織サンプルを組織病理学的に研究すると、固有層の重大な炎症性浸潤及び主とし て短かくなった絨毛の先端での重大な変化を示していた。このことによりｉｎ　 ｖｉｖ；での腸細胞に対するＳｂｉｇａ−毒素の細胞毒性が確認される（２７） 。しかし、最も大きな特徴は、大量の粘液と共に管腔内に流れ出てくる赤血球に よる上皮内膜の浸潤であった。大きな血管変化が固有層内で起っていることを示 すこの観察は次にサルのモデルでも確認された。

赤毛猿の胃内に５Ｃ５００及び５Ｃ５０１を接種すると、Ｓｈｉｇａ−毒素産生 とは無関係に致死的な電撃性赤痢が発生しうろことを示した。下痢及び層内の膿 や粘液の量には顕著の差は認められなかった。水様の下痢が存在しなかったこと 及び便の量が等しかったことは、ｊ　ｈ　ｉ　ｇ　＊−毒素による空腸分泌増加 を示唆する以前の研究（４１）とは一致しなかった。唯一の大きな違いハ、野生 型菌株に感染した動物の赤痢の便には血液が存在していたことであった。最近の 論文は、赤痢患者の中で、より細胞毒性の高い菌株を排出する患者の便に血液が 存在する傾向が強いことを報告していた（３６）。組織病理学的観察により、Ｓ 状結腸で特に特徴的に現れる血管損傷が存在することが確認された。これは、野 生型菌株に感染したサルでは絨毛膜内の毛細管係蹄の全面的破壊が見られたのに 対し、ＴＯ！−変異株に感染した動物の血管系では膨満しているがほとんど無傷 の血管を示したからであった。このことにより前者の群での血便の存在が確かに 説明される。更に、腹膜中皮の観察は浮腫と重篤な炎症性脈管炎を示していた。

このように、組織内に細菌が侵入してＳｈｉｇａ−毒素を放出すると、絨毛膜血 流を破壊し、腹膜そして恐らく腸間膜の循環を変更させることによって局所的な 虚血が生じ、そのために粘膜の病変の重症度が局所的に高まる。疾患のこの段階 では腎臓の組織観察は毛細管の脈管炎の証拠を示していなかった（データは示し ていない）ため、この作用は局所的又は局部的であると思われる。このような血 管の変性は、虚血性大腸炎の放射線学的側面について述べている（３４）大腸１ １０１５７　：　）！　７（４０）による出血性大腸炎での観察と一致しうる。

これらの菌株は内皮細胞の分化に対し直接的細胞病原性作用を有する５ＬＴＩ（ ３１）を大量に産生ずる（Ｉ５）。

Ｔｏｘ　及びＴｏｒ−の菌株で感染させた動物の間で観察されたもう１つの違い は粘膜の炎症とそれに続く膿瘍の重症度であった。Ｓ状結腸及び横行結腸の多く の部分では病変は同様の強度であフたが、ｓ　Ｃ５ｔｉ１１に感染した動物のみ で粘膜組織が非常に膜状破壊されている部分があった。

化膿性滲出がより強度であることは、感染３日目での血液ＰＭＮのより劇的な低 下とそれに続く骨髄増多に反映されていた。赤痢の間には、骨髄及び血管区分（ ｃｏｍｐ１目ｍｅＩ１１）の他に第三のＰＭＮ区分が結腸レベルで開いていると 信じられている。

滲出及び粘膜組織内へのＰＭＮの直接放出を増加させる血管の変化を通して、こ の新しい区分内にとらえられているＰＭＮの数をＳｈｉｇａ−毒素が増加させる ことが予期されている。このことが、野生型菌株に感染した動物で認められる急 速で重篤な顆粒球減少、及び重篤な赤痢の間に時として観察される白血病様反応 に相当しうるそれに引き続くより激しい骨髄増多を説明しよう。このようなモデ ルはＳｈｉｇａ−毒素の全身作用を仮定するものではない。

従って、上記の結果は、５ｈｉＨ−毒素は上皮細胞及び食細胞内で細胞内に放出 されたときには限定的な役割しか果していないことを示唆している。しかしなが ら、感染細胞内に放出され実施例２の手順を使用して、５ｃｓｏｉのエンテロケ リンをコードするオペロンをＩＤ月＋ｒｏで突然変異させて５Ｃ５０１を遺伝子 操作する。使用する自殺プラスミドベクターｐＪＭ７０３．１は古賀赤痢Ｗ１の エンテロケリンオペロンを含有しており、そのｅａｔ　Ｆ、ＦｅｐＥ、ＦｅｐＣ 及びＦ　ｅｐＤサブユニットの各々は除草剤Ｂ　ｉｏｌ＊＋ｏｓに対する耐性を コードするインターボシンと除草剤耐性遺伝子の好適プロモータで突然変異させ ていた。得られたクローンＳ　Ｃ５０４はＴｏｓ−及びエンテロケリン−（’Ｅ ｎｔ−’）実施例２０手順を使用して、５Ｃ５０４のｉｃｓ　Ａ遺伝子をｉｎ　 ｖｉｌｒｏで突然変異させて５Ｃ５０４を遺伝子操作する。使用した自殺プラス ミドベクターｐＪＭ７０３．１はフレクスナー赤＃１菌製造に使用できる。

実施例６ 実施例２の手順を使用して、野生型の７レクスナー赤痢菌のエアロバクチンをコ ードする遺伝子及びｉＣｓ　Ａ遺伝子を突然変異させてこの菌株を遺伝子操作す る。使用した自殺プラスミドベクターは各々インターボシンで突然変異させであ るフレクスナー赤痢菌のエアロバクチン及びｉｃｓ　Ａ遺伝子を含有している。

得られたクローン５Ｃ５０６はエアロバクチン−及びｉｃｓ　Ａ−でありフレク スナー赤痢菌に対するワクチンの製造に使用できる。

実施例７ 実施例１．２及び４０手順を使用して、５Ｃ５００菌株の古賀赤痢菌由来のＤＮ Ａ断片中のＳｈｉｇａ−毒素オペロンのＡサブユニット遺伝子内で、唯一のＨｐ ＊１部位から出発し、４００塩基対Ｂｓ１３１を欠損させる。得られた断片をｐ ＢＲ３２２のＰ１ブロモ−タを含有する２５７塩基対断片と再連結させてＢサブ ユニット蛋白質を高度に光現させる。突然変異させた毒素Ａ遺伝子を含有するこ の断片を、大腸菌＋１’ｃプロモータとカナマイシン耐性遺伝子の制御下で起源 の複製を含有する条件自殺ベクターにクローニングする。古賀赤痢Ｗｌ中で、こ のベクターは培地内にＴ　ＰＴＧが存在するときにのみ複製するであろう。突然 変異させたＡサブユニット遺伝子から上流に水銀耐性カートリッジ＋６５）ヲ挿 入する。得られたプラスミドを、ＩＰＴＧの存在下で、野生型古賀赤痢菌１株５ Ｃ５００に形質転換する。得られた赤痢菌クローンのコロニーはＨｇ及びカナマ イシン耐性である。この赤痢菌クローンをＩ　ＰＴＧなしに数世代に亘り増殖さ せる。

次に、培養物をＨｇ−耐性でカナマイシン−感受性のクローンの存在に関してス クリーニングする。３つのクローンを単離し、更に特徴化する。サテン法により 、それらのクローンはもうＡサブユニット遺伝子の内部プローブとはハイブリッ ドを形成しないが、モノクローナル抗体による分析から明らかなようにＢサブユ ニット蛋白質はまだ生成し、もう細胞毒性ではないことが示される。

同じ手順を使用して、このＴ　Ｏ！Ａ−クローンのエンテロケリンをコードする オペロンを圧ユ１−四旦で突然変異させてこのクローンを遺伝子操作する。使用 する自殺プラスミドベクターは大腸菌（６６）のエンテロケリンオベロンを含有 しており、その＋ｎｌ　Ｆ、ＦｅｐＥ、　ＦｅｐＣ，及びＦｅｐＤサブユニット 遺伝子は制限部位に顕著な欠損を有し、そこには亜ヒ酸塩耐性をコードする断片 （６２）と亜ヒ酸塩耐性遺伝子の好適プロモータが挿入されている。得られたク ローンはＴ　［Ａ−及びＥｎｊ−である。

同じ手順を使用して、このＴ　０ＸＡ−及びＥｎｊ−のクローンのｉｃ＋　Ａ遺 伝子をｉｎ　ｖｉｌｒｏで突然変異させて、このクローンを遺伝子操作する。使 用した自殺プラスミドベクターはフレクスナー赤痢菌のｉｃｓ　Ａ遺伝子ｆ６ｆ ｌ、６１）を含有しており、制限部位で顕著な欠損があり、カドミウム耐性をコ ードする断片（６３，６４）とカドミウム耐性遺伝子の好適なプロモータが挿入 されている。

得られたＴｏｘＡ〜及びＥｎｌ−、ｉｃ＋　Ａ−の古賀赤痢菌Ｉクローンの特徴 はその侵入性が著しく低下していることであり、そのために、古賀赤痢菌１に対 するヒト用ワクチンの作成に好適なものとなる。

本発明及び本発明に付随する利点の多くは以上説明より明らかであり、本発明の 精神又は範囲から離れることなく或いはその物質の利点の全てを犠牲にすること なく上記方法及びワクチンについて変更しうるちのであり、上記の実施態様は単 に好ましい実施態様であることは明らかであるものと信じている。

上記に引用した参考文献は次の通りである。

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Ｒａｊａｕｎａｎ、Ｍ、Ａ、）ｌａｊｉｄ、Ｓ、Ｘｓｌａｍ、ａｎｄ　Ｒ−Ｃ， 讐ｉ１１ｉｍｓ　Ｊｒ、１９フ７．　Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ−ｕｒｅｏ＋ｉｃ　５ ｙｎｄｒｏ＋ｎｅ　ａｆｔｅｒ　ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ、　Ｒｅ１ａｔｉｏｎ 　ｔｏ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ａｎｄ　モ奄窒モ浮撃＝| ｅｉｎｇ　Ｂ＋ｍｕｎｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ、　Ｎ、　Ｅｎ　１．　Ｊ、　Ｍ ｅｄ、　２９８＋９２７゜２３、Ｌａｂｒｅｃ、Ｅ、Ｈ，、Ｌ　５ｃｈｎｅＬｄ ｅｒ、丁、Ｊ、Ｍａｇｏａｎｉ、ａｎｄ　Ｓ、Ｂ、Ｆｏｒ＋ｍａ１．１９６４゜ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｃｌｌ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ａｓ　ａｎ　ｅｓ ｓｅｎｔｉａｌ　５ｔｅｐ　Ｌｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅ獅■■奄香@ｏｆ ｂａｃｉＬｌａｒｙ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ、　Ｊ、　Ｂａｃｅｅｒｉｏｌ、　８ Ｂ＋１５０３゜２４、　Ｌａｖｌｏｒ、　Ｋ、）ｌ、　Ｐ＋人、　Ｄａｇｋａｌ ｅｒｏｓ、　Ｒ，Ｅ、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　ａｎｄ　Ｓ、Ｍ、　Ｐａｙｎ■A 　１９８７゜ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　１ｒｏｎ仁ｒａｎ寥ｐｏｒｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏ ｆ　％　ｆｌｅｘｎｅｒｉ　ａｎｄ　ｕｔｉｌｉｚａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｓ 【１ｒｏｎ　ｅｏ＋＋＋ｐｏｕｎｄｓ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｎ＋ｕｎ、　５ ５＋５９４゜２５、Ｌｅｖｉｎｅ、）１．Ｍ、、）１．Ｌ、ＤｕＰｏｎｔ、Ｓ、 Ｂ、Ｆｏｒｍａｌ、ＲｏＢ、Ｈｏｒｎｉｅｋ、Ａ、丁ａｋｅｕｃｈｉ、ＥAＪ− にａｎｇａｒｏｓａ、Ｍ、Ｊ、Ｓｔ＋ｙｄｅｒ、ａｎｄ　Ｊ＋Ｐ、　Ｌｉｂｏｎ ａｔｉ、１９７３−　Ｐａｊｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｒ、＝２１ｊｊ２＝１ｊＬ ！２７　ｌ　（Ｓｈｉｇａ）　ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ、Ｊ、工ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ 、１２７＋２６１゜２６、Ｍｉｕｒｅｌ１５　Ａ＋丁＋ｌ　Ｂ＋　Ｂｌａｃｋ＆ Ｉｎ、ａｎｄ　ｉｔ、Ｃｕｒｔｉｓ　ＸＩｌ、１９８４．Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｐｉ ■翌氏| ｔａｔＬｏｎ　ｉｎ　杢ｙすｊＰｌＬｌｉ　ｆｌｃｘｎｅｒｉ　２ａ　ｉｔ　ｃ ａｒｒｅｌａｅｄ　ｖｉｅｈ　１ｏｓｓ　ｏｆ　ｖｉｒｕｌ■秩{ｅｅ　ａｎｄ マｉｒｕ’１ｃｎｃｃ−ａｓｓｏｃｉａｅｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄ、　Ｉｎｆｅｃ ｔ、　Ｙｍｕｎ、４３＋３９７゜２７、Ｈｏｙｔｒ、Ｎ、！’、、Ｐ、Ｓ＋　Ｄ ｉｘｏｎ、Ｓ、Ｗ、Ｒｏｔｈ＋ｍａｎ、ａｎｄ　Ｊ、Ｅ、Ｂｒｏｗｎ、１９８７ ．Ｃｙｔｏ−ｅｏｘｉｃｉｅｙ　ｏｆ　Ｓｈｉｇａ　ｔｏｘｉｎ　ｆｏｒ　ｈｕ ＋ｏａｎ　ｃｏｌｏｎｉｅ　ａｎｄ　１ｌｅａｌ　ｅｐｉｅｈｅｌｉａｌ@ｃｃ ｔｌｓ。

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３９＋Ｒｉｇｂｙ、　Ｐ、Ｗ、Ｊ、、　Ｈ，Ｄｉｅｃｌｃ＋ｍａｎｎ、　Ｃ，Ｄ ｏｄｅ榔、　ａｎｄ　？、　！ｌｅｒｇ、　１９７７、　Ｌ≠ｂ■撃奄獅■@Ｄ ＮＡ ｔｏ　ｈｉｇｈ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｅｙ　ｉ＋＋　ｖｉ’ｔｒｏ 　ｂｙ　ｎ１ｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＤmＡ ｐｏｌＦｅｒａｓｅ　Ｘ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｉ、Ｓ１３＋２３７゜４０、　Ｒ １１ｅｙ、　Ｌ、Ｗ、、１．ｓ、　Ｒｅ＋ａｉｓ、　Ｓ、Ｄ、　Ｈｅｌｇａｒｓ ｏｎ、　１１．Ｂ、　Ｍｅ（：ｅｅ、　Ｊ−Ｃ，vｅｌｌｓ、　Ｂ−Ｒ− Ｄａｖｉｓ、　１１．Ｊ、　Ｈｅｂｅｒｔ、　Ｅ、Ｓ、　０ｔｃｏｅｔ、　ＬＪ −Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｎ−Ｔ、　ＲａｇｒｅｔＣ，Ｐ−Ａ。

Ｂｌａｋｅ、ａｒｉｄ　Ｍ、Ｌ、、Ｃｏｈｅｎ、１９８コ、）Ｉｅ＋ｎｏｒｒｈ ａｇｉｅ　ｃｏｌｆｉａ　ａｓｓｏｃｉａＬｅ＋５　ｗｉｔ■@ａ　ｒａｒｅ Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　＃ｅｒＯｅ７ｐｅ、　Ｎ、　Ｅｎ　１．　 Ｊ、　）４ｅｄ、　：Ｓ０８＋６８１゜４１、　Ｒｏｕｔ、ν、Ｒ，，５，！１ ．　Ｆｏｒｍａｌ、Ｒ，Ａ、　Ｃ１ａｎｎｅｌｌａ、　ａｎｄ　（：、Ｊ、　Ｄ ａ＋ｅａ＋ｉｎ、　P９７５−　Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　％　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｉｎ　ｔｈｅ 　Ｒｈｅｓｕｓ　ｍｎｋｅｙ　１　１ｎｅｅｓｔｉｎａｌｔｒａｎｓｐｏｒｔ、 　＋＋ｅｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂａｃｅｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔ ｕｊｉｅｓ、シ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏ撃純n ロ１ｈ２７０゜ ４２＋　５ａｎｓｏｎｅｅｃｉ、Ｐ、Ｊ、、Ｄ、Ｊ、Ｋｏｐｅｃｌｃｏ、ａｎｄ 　５．Ｎ１．　Ｆｏｒ＋ｍａｔ、１９８１４　ａｏｎｎｅｉｐ１ｍｓ＋ｍ１ｄｓ 　ｒ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｔｈａｅ　ａ　ｌａｒｇｅ　ｐＬａｍｉｄ　ｉｍ　ｒ ｉｅｅｅｅｓｍａｒｙ　ｆｏｒ　ｖｉｒ普A１ｅｎｅｅ。

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Ｘｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｒｔ　ｏｆ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｒｕ３Ｈ ｓ　ａｇａｉｎｓｅ　Ｄｉａｒｒｈｅａ、　（Ｊ、　Ｈｏｌ高■窒■氏A　Ａ。

Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、　ａｎｄ　Ｒ，ＭＢＬｌｂｙ　Ｅｄｓ、）　１１ｔｈ　Ｎｏ ｂｅｌ　Ｃｏｎｆ、　Ｓｅｏｃｋｈｏ１ｍ＋、　１９８５．f　ｐ。

１０７−１２６゜ ５８、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、：Ｌ９Ｂ２．　Ｔｈ ｅ　ｐＵＣｐｌａｓｍｉｄｓ。

ａｎ　Ｍβｍｐ７　ｄａｒｉｖｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　１ｎｓｅｒｔｉｏ ｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｇｉｓ　ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　５ｙｎ ｔｈｅｔｉｃ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｉｅｒｓ、Ｇｅｎｅ。

１９：２５９゜ ５９、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，λ、、　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　１９８ ３．　Ｙｅａｓｔ　ＲＮ入ｐｏｌｙｎ＋ｅｒａｓｅ　エエｇｅｎｅ　：　工５ｏ ｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｂｅｓ＋５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２２ニア７Ｂ。

６ＣＬ　Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ　ａｔ　ａｌ、１９８９．　工ｄｅｎｔｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｃｓＡ、ａｐｌａｓｍｉｄ　１ｏｃｕｓ　ｏｆ　里状憇λ ≧ｆｌｅｘｎｅｒｉ　ｔｈａｔ　ｇｏｖｅｒｎｓｂａｃｔｅｒｉａｌ、　ｉｎし ｒａ−ａｎｄ　１ｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　５ｐｒｅａｄ　ｔｈｒｏｕｇｈｉ ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｆ−ａｃｔｉｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入ｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ入。

８６：　３８６７−３８１１．。

６１、　Ｌｅｔｔ　ｅｔ　ａＬ　１９８９．　工ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　 ｏｆ　ｔｈｅ　ｖｉｒＧ　ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ　ｄｅｔａｒｍｉｎａｔｉｏｎ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ：　λｐ ｌａｓｍｉｄ−ｃｏｄｅｄ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅ　ｏｆ　゛尉佳髪工ｖ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｌｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、１７１＝　３５３−３５９ ゜６２＋Ｍｏｂｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ、１９８７．　Ｐｌａｓｍｉｄ −ｅｎｃｃｘｉｅｄ　１ｏｎｔｒａｎｐｏｒｔ　ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｏｎ　Ｔｒ ａｒ＋ｓ　ｏｒｔ　１ｎ−２匹とす四シ乏−Ａｃａｄｅｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、工 ｎｃ、３０５−３２６゜６３、Ｎ１ｅｓ　ａｎａ　５ｉｌｖｅｒ、１９Ｂ９．　 Ｐｌａｓｍｉｄ−ｄａｔｅｒｍｉｎａｄ　１ｎｄｕｃｉｂｌａｅｆｆｌｕｘ　ｉ ｓ　ｒａｓｐｏｎｓｉｂｌａ　ｆｏｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｃａｄｍ ｉｕｍ、　ｚｉｎｃａｎｄ”　ｃｏｂａｌｔ　ｉｎ　がＳ耐士述単狙二店真史戻 ｚｓ、　Ｊ、　ｏｆＢａｃシ■粘江ｚα、１７１（２）：　８９６−９００゜６ ４、Ｎｕｃｉｆｏｒａ　ｅｔ　ａｌ、　１９８９．　Ｃａ山ｎｉｕｍ　ｒｅｓｉ ｓｔａｎｃｅ　ｆｒｏｍＳｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒａｕｓ　ｐｌａ ｓｍｉｄ　ｐＩ２５８　ｃａｄＡ　ｇｅｎｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ６５、Ｂａｒｒｉ ｎｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、１９８４．　＋：ｒ、ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃ、λｎｄ　λ　 １゜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２．６０１−６１９゜６６、Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ　ａ ｔ　ａｌ、１９８７．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｍｕ ｌｔｉｐｌｅ　蝕ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｆｅｒｒｉｃ　ｅｎｔａｒｏ ｂａｃｔｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｆｕｎｃｔｉ、ｏｎｓ　ｉｎ　Ｅ、　ｃｏ’ ｌ卦Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ　。

１６９（８）＝　３６３８−；３６４６゜第１表：Ｗ株、プラスミド、ファージ 及びその特性ニングした突然変異させた毒 国ＷＡｙ４査報告 −−−−１１１−、−−〜−ＰＣＴ／ＥＰ　８９１００８３１ＰＣＴ／ＥＰ　８ ９１００８３１ １“°−°”°１゛Ａ”５°゛−″”　−３−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．赤痢菌野生株に対するワクチンの製造に使用しうる赤痢菌改変株を作成する ための腸侵入性赤痢菌野生株の修改変法であって、宿主細胞に実質的に侵入でき ず、宿主の感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に拡散することができず 、しかも相当数の宿主の非感染細胞と感染細胞の両者を殺滅するであろう毒素が 産生できないように赤痢菌野生株のゲノムを変換するステップを特徴とする方法 。 ２．赤痢菌野生株が宿主の細胞及び組織に侵入するために必要な蛋白質をコード する第一の遺伝子と、赤痢菌野生株が宿主の感染細胞内及び感染細胞と非感染細 胞との間に拡散するために必要な蛋白質をコードする第二の遺伝子とを全部もし くは部分的に除去する又は永久的に不活化するように赤痢菌野生株のゲノムを改 変する請求項１の方法。 ３．赤痢菌がフレクスナー赤痢菌であり、第一の遺伝子がフレクスナー赤痢菌に よるエアロパクチンの産生及び使用をコードする請求項２の方法。 ４．第二遺伝子が細胞内及び細胞間の拡散をコードする請求項３の方法。 ５．赤痢菌が志賀赤痢菌１であり、志賀赤痢菌１によるるｓｈｉｓｌ毒素の産生 又は使用をコードする第三遺伝子を全部もしくは部分的に除去し、又は永久的に 不活化するように志賀赤痢菌１ゲノムを改変する請求項２の方法。 ６．志賀赤痢菌１の第一遺伝子が志賀赤痢菌１によるエンテロケリンの産生又は 使用をコードする請求項５の方法。 １．第二遺伝子が細胞内及び細胞間の拡散をコードする請求項６の方法。 ８、第一遺伝子が、志賀赤痢菌１のエンテロケリンオペロンのｅｎｔＦ，Ｆｅｐ Ｅ．ＦｅｐＣ及びＦｅｐＤサブユニット遺伝子を含む請求項６の方法。 ９．第一、第二及び第三遺伝子を突然変異させている請求項５〜８のいずれかの 方法。 １０．１つ以上のｉｎＴｔｒｏで突然変異させた遺伝子、特にそのかなりの部分 を削除し突然変異させた遺伝子、特にマーカー遺伝子を挿入し突然変異させた遺 伝子で対立遺伝子交換することにより、１つ以上の遺伝子を不活化する請求項２ から９のいずれかの方法。 １１．請求項１から１０のいずれかの方法で改変した赤痢菌又はその子孫。 １２．請求項１１の改変赤痢菌から製造したワクチン。 １３．Ｓｈｉｇｉ−毒素−、特にＳｈｉｇｉ−毒素Ａ−である赤痢菌。