JPH03500408A - 増強された安定性を有するペプチド複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質は本質的にすべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を有する。

例えば、タンパク質は酵素として働き、多くの分子およびイオンの輸送および貯 蔵、遺伝情報の制御した発現における機能は、外来の物質に対する免疫の応答お よび保護において重要であり、そしてそれら自体抗原性である（すなわち、それ らを外来または自分以外として認識する宿主中へのそれらの導入は免疫応答を誘 発する）。

タンパク質の基本的構造成分はアミノ酸であり、それらの各々は炭素原子（アル ファ炭素）から成り、それにアミノ基、カルボキシル基、水素原子および明確な 側鎖またはＲ基が結合している。アミノ酸はペプチドまたはアミド結合により結 合されており、ここでアル７フーカルボキシル基は第２アミノ酸のアルファアミ ノ基に接合していて、ポリペプチド鎖を形成する。ポリペプチド鎖内の各アミノ 酸単位はアミノ酸残基と呼ぶ。ポリペプチド鎖の主要な鎖または主鎖は、鎖の規 則的な反復単位ミノ酸の明確な側鎖またはＲ基から構成されている。ポリペプチ ド鎖は、一般に、かなりの柔軟性を有し、この柔軟性は原子の間の結合の回りの 原子の自由な回転から生ずる。

結局、タンパク質分子は、ｌまたは２以上のポリペプチド鎖から構成されており 、理論的には、多くの三次元の形状おりフン７オメーシヨンのいずれの１つをも 取ることができる。しかしながら、はとんどのポリペプチド鎖は可能なコンフォ メーションのただ１つに折り重なり、そして生物学的条件下にタンパク質が取る コンフォメーションはタンパク質を構成するポリペプチド鎖のアミノ酸配列によ り決定される。例えば、アミノ酸側鎖の間およびアミノ酸および水の間の相互作 用は、タンパク質の特定の安定性の１つのコンフォメーションを与える力に寄与 する。

所定のタンパク質が取ったフンフォメーションに寄与する重要な力は、折り重な ったポリペプチド鎖中の極性および非極性の側鎖の存在および分布および互いに 密接するシスティン−３Ｆ基の間のジサルファイド結合（またはＳ−５架橋）の 形成である。一般に、その結果、タンパク質分子は自発的に特徴ある独特のコン フォメーション）例えば、圧縮したおよび球状または長いおよび繊維状）にに折 り重なる。

各タンパク質分子の合計のフン７オメーシ薦ンは独特であるが、反復して起こる ことが分かった折り重なりのいくつかのパターンが存在する。

２つのパターンは、側鎖の相互作用のそれよりむしろ、タンパク質中のペプチド ジサルファイド結合の間の水素結合の結果であるので、とくに頻繁に起こる。

これらの折り重なりの１つは、アルファーらせんと呼び、ポリペプチド鎖がそれ 自体の回りに規則的に回転するとき生ずる。これにより、剛性の円筒または棒が 生じ、ここでコイル状になったペプチド鎖は棒様構造の内部であり、そしてアミ ノ酸の側鎖またはＲ基は外方に伸びる。主なペプチド鎖のＮＨ基およびＣＯ基の 間の水素結合はアルファーらせんを安定化する。

折り重なるパターンの第２は、ベータのひだのシートと呼び、アルファーらせん と非常に異なる。例えば、前者はポリペプチド鎖が殆ど完全に伸びているシート であり、そして後者は緊密にフィル状になっている。

ベーターシートの安定化は、タンパク質分子中の異なるポリペプチド鎖中のＮＨ 基およびＣＯ基の間の水素結合から生ずる。ベーターシート中の隣接する鎖は平 行である（すなわち、それらは同一方向に走る）か、あるいは反平行である（す なわち、それらは反対方向に走る）。

タンパク質は構造敵に異なる「レベル」の有機化を表すことが示された。タンパ ク質のアミノ酸配列は第ルベルである：これはタンパク質の一次構造としばしば 呼ばれる。タンパク質の折り重なりまたは構造の第２レベルは、互いに密接して 位置するアミノ酸の水素結合の相互作用により形成される。アルファーらせんお よびベーターシートは二次構造の例である：二次構造の多くの他の型は、隣接す るペプチド結合の間に形成された二面角に基づいて規定される。タンパク質の折 り重なりの第３レベル（三次構造）は、アミノ（線状）酸配列において非常に離 れているアミノ酸残基の間の相互作用により形成される。最後に、四次構造は、 タンパク質を構成する多数のポリペプチド鎖が一緒に詰められている方法を呼ぶ 。

タンパク質の機能の重要な決定すべきものは、そのフンフォメーション、まＩ； はその成分の三次元の配置である。タンパク質は、一時的にアルファーらせんま たはベーターシートの形態をとるそれらにおける短い領域まＩ；は伸長の関連ま たは相互作用により、折り重なり、そしてそれらの特徴あるフン７オメーシヨン を達成するように思われる。

一般に、自然または完全なタンパク質のある領域においてアミノ酸配列に相当す るアミノ酸配列を有する短いペプチドは、生理学的条件下に発生せず、自然タン パク質の等しい領域が取るのと同一のコン７オメーシヨンを取る。結局、ペプチ ドまたはタンパク質の「断片」は、通常、完全なタンパク質が照明するもの（完 全なまたは自然タンパク質中の等しい領域）と同一の機能的特性（例えば、酵素 、抗体、抗原などとして）をもたない。

安定な構造および完全なタンパク質の機能的特性をもつポリペプチドを産生ずる ことを希望して、全体のタンパク質の自然構造に折り重なる、アミノ酸の短い鎖 、またはポリペプチドを開発するためにかなりの努力がなされてきた。これは合 成ワクチンの開発の領域において特定の注意を受けたが、成功は制限された。例 えば、ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）および共同研究者およびドーリトル（Ｄｏｏ　 １　ｉ　ｔ　ｔ　Ｉｅ）および共同研究者は、ウィルスの外側のコートの非常に 小さい領域をまねるように設計された、合成ペプチド／短いタンパク質である合 成ワクチンを記載した。彼らの試みにおいて、宿主中に導入したとき免疫応答を 誘発するウィルスの領域（すなわち、折り重なったタンパク質抗原の表面）にお いて存在する短いアミノ酸配列を選択し、そしてペプチドに対するどの抗体が全 体のウィルスと反応するかを決定した。

米国特許第４．５４４，５００号において、ビトル（Ｂｉｔｔｌｅ）およびラー ナー（Ｌｅｒｎｅｒ）は、アミノ酸配列が足および口の病気のウィルス（ＦＭＤ Ｖ）ＶＰ、タンパク質の特定の領域に相当する合成ペプチドの開発を記載してい る。とくに、配列がＦ　Ｍ　Ｄ　Ｖ　Ｖ　Ｐ　ｒタンパク質の位置１３０〜１６ ０および位置１４１−１６０に相当する単一のベプチＦ（Ｔなわち、はぼ２０ア ミノ酸の長さ）は「抗原的に極めて活性」であると記載されている。

リッチマン（Ｒｉ　ｃ　ｈｍａ　ｎ）およびリーズ（Ｒｅｅｓｅ）の報告による と、マラリア寄生体Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの７５ＫＤａ 表面タンパク質に対する抗体をレイズ（ｒａｉｓｅ）するであろう２８残基のペ プチドが記載された。リッチマン（Ｒｉ　ｃｈｍａｎ）、Ｓ、Ｊ、およびＲ，Ｔ 、リーズ（Ｒｅｅｓｅ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、ＵＳＡ 、８５．１６６２−１６６６　（１９８８）。

この研究に基づいて、対応する完全なタンパク質に強く結合するタンパク質の個 々のまたは単一のペプチド断片を使用して抗体を産生ずるためにかなりの努力が 払われた。

しかしながら、このような努力は比較的不成功に終わった。多分これらの短いペ プチドは自然タンパク質のそれに類似する安定な構造に生理学的条件下に適合す ることができなかっｔ；ためである。短いペプチドが、アミノ酸配列（一時構造 ）によるばかりでなく、かつまた二次構造（例えば、アルファーらせんまたはベ ーターシートの形成）、折り重なり、およびフンフォメーションにより自然また は完全なタンパク質の等しい領域を「まねる」ように構成ことができる手段は、 合成ワクチンの開発においておよびタンパク質が重要な考察である多くの他の領 域において非常に有用であろう。

発明の説明 少なくとも２つの短いペプチド単位を含み、前記ペプチド単位の各々は問題のタ ンパク質中のアミノ酸配列にアミノ酸配列が相当し、そして自然または完全なタ ンパク質の領域が相互作用するのと非常に同一の方法で短いペプチド単位が互い に相互作用するように接合されいるペプチド複合体、ならびにそれらの調製方法 および使用は、本発明の主題である。

短いペプチド単位は、各々が一般にほぼ５〜３０のアミノ酸残基を有し、そして アミノ酸配列が問題のタンパク質の明確な領域に相当し、短いペプチド単位の共 有結合により接合されてペプチド複合体を産生じ、そしてペプチド複合体は、生 理学的条件下に、個々のまたは単一のペプチドである、現在入手可能なペプチド より安定性である。本発明の１つの実施態様において、２つの短いペプチド単位 の各々は、３〜３０の残基を含み、そして配列が規定した二次構造を形成する完 全なタンパク質中の配列に相当し、そして、必要に応じて、完全なタンパク質の 他の領域における配列に相当する配列に相当し、これらの単位を共有結合により 接合する。生ずるペプチド複合体は、２つのペプチド成分単独のいずれよりも安 定な構造を形成する。

本発明のペプチドの特定の実施態様において、２つの短いペプチド単位の各々は 、システィン残基を含み、そしてウシ膵臓トリプシン阻害因子（ＢＰＴＩ）の明 確な領域に相当し、そしてこれらの単位は各々中に存在するシスティン残基の間 のジサルファイド結合により接合されている。ペプチド単位の１つは１６アミノ 酸残基を有し、システィン残基を含む；単位のすべてまたは部分は、完全なタン パク質中でアルファーらせんに折り重なる、ウシ膵臓トリプシン阻害因子（ＢＰ ＴＩ）の明確な領域に配列が相当する。他方の短いペプチド単位は１４アミノ酸 残基を有し、またシスティン残基を含む。それは、完全なタンパク質中でベータ ーシートに折り重なる、ウシ膵臓トリプシン阻害因子の明確な領域に配列かに相 当する。合成ペプチド対のアミノ酸配列は、プロテアーゼ阻害因子の配列を含有 するアルツハイマー病の特徴あるアミロイド≦二叉−タンパク質の前駆体のドメ インに対して相同性である。生ずるペプチド複合体は、円形ジイクロイズム（ｃ ｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ”）ｓ核磁気共鳴および紫外線吸収スペク トルを使用して、構造の形成のだめの基準として、個々の短いペプチドより安定 であることが示されｔ；。期待するように、個々の短いペプチドは、存在したと しても、水溶液中で構造の形成をほとんど示さなことが明らかされたばかりでな く、かつまたペプチド複合体は水溶液中で個々の短いペプチドより安定であるこ とが明らかにされた。

本発明のペプチド複合体は、完全なまたは自然のタンパク質の抗原の配列の部分 をまねた配列を有するペプチドである、合成ワクチンの設計および産生において 使用することができる。これに関して、ペプチド複合体は、生理学的条件下に安 定であるコン７オメーシヨンまたは構造を形成するので、とくに価値がある。こ のようなワクチンは、免疫応答を望ましい個体（例えば、ヒト、他の哺乳動物ま ｔ；は哺乳動物以外の動物）に投与することができる。

同様な方法で、本発明のペプチド複合体は治療、予防または診断の領域において 人工的タンパク質として使用することができる。例えば、それらは薬物としであ るいは天然に産出するタンパク質、例えば、酵素およびホルモンの代わりに使用 することができる。例えば、本発明のペプチド複合体は、天然に産出する酵素の 機能的成分または活性部位を、単独であるいは酵素の他の選択しちゃ領域と組み 合わせて、組み込むように構成することができる。

さらに、本発明のペプチド複合体は診断に使用することができる。例えば、本発 明の選択したペプチド複合体を使用して、現在入手可能なペプチド抗原より診断 試験における使用のためにより適当なペプチド抗原を産生ずることができる。な ぜなら、本発明のペプチド複合体は、免疫応答を体に与える完全な／自然のタン パク質に挙動が類似するからである。このようなペプチド複合体は、また、複合 体および完全な／自然のタンパク質の対応する区画と反応することができる抗体 を産生ずる！こめに使用することができる。このような抗体は、また、診断の用 途を有する。

本発明の合成ペプチドは、アルツハイマーのアミロイドタンパク質に対する相同 性を有するので、組織中のアミロイドタンパク質の存在および、こうして、病気 の存在を検出する診断に使用することができる。この場合において、ペプチド複 合体中の２つの短いペプチド単位の各々は、前述したように、ＢＰＴＩのある領 域に相当する。ペプチド複合体に対する抗体は、既知の技術を使用して、産生ず ることができる。本発明のペプチド複合体は、また、不連続のエピトープのマツ ピングおよび／またはスクリーニングに有用である。不連続のエピトープを発現 するペプチドは合成が困難である。本発明は、不連続のエピトープの設計および 構成および合成配位子の構成において有用である。本発明によりつくられた合成 配位子を使用して、例えば、感染因子（例えば、ヒト免疫欠損ウィルス、ＨＩＶ ）が細胞受容体（例えば、Ｔ４　リンパ球）に結合する能力を妨害しそして、こ うして、感染を防止することができる。この場合において、感染因子が相互作用 する細胞上の受容体または部位の特性上固定すること、本発明の方法を使用して 、感染のプロセスにおいて細胞と通常相互作用する感染因子上の細胞の受容体ま たは部位と相互作用する、合成類似体を設計および産生ずること、および感染因 子が細胞を感染する能力を妨害することができる。また、本発明の方法を使用し て、タンパク質の触媒のサブドメインまたは領域を包含するペプチド複合体を設 計および産生ずることができる。例えば、問題の酵素の触媒のサブドメイン、ま たは酵素サブドメインを決定し、そして完全なまたは自然のタンパク質の酵素活 性を示す２またはそれ以上の短いペプチド単位のペプチド複合体を産生ずること ができる。同様な方法において、本発明の方法を使用して、完全なまたは自然の タンパク質より低い免疫原性である免疫原タンパク質の合成類似体を産生ずるこ とができる。これは次のようにして実施することができる。タンパク質結合部位 の必要な特性および配列を決定し、そして同様な特性を有するが、免疫原性の原 因となるタンパク質の残部を欠く、ペプチド複合体を産生ずる。

第１図は、本発明のペプチド複合体の設計のためのアプローチを表す。

第２図は、ウシ膵臓トリプシン阻害因子（ＢＰＴＩ）のアルファ／ベータペプチ ド複合体の’ＨＮＭＲスペクトルである。

第３図は、アルファ／ベータペプチド複合体の芳香族領域の’ＨＮＭＲスペクト ルである。チロシンまたはフェニルアラニンの側鎖中の芳香族炭素へ結合したプ ロトンのための共鳴は、この領域に存在する。

第４図は、種々の温度におけるアルファ／ベータペプチド複合体（参照、第３図 ）の’ＨＮＭＲスペクトル中の芳香族のビークＡの化学シフトのグラフの表示で ある。

第５図は、アルファ／ベータ複合体（ＰａＰβ）のすべての割り当てたアミドお よびアルファのプロトンの化学シフト対ＢＰＴＩ中の対応する残基について観測 されたもののグラフ表示である。モデルの「ランダムコイル」においてアミドお よびアルファのプロトンについての化学シフトの値の範囲は、正方形で示す。

第６図は、アルファおよびベータペプチドおよびアルファ／ベータペプチド複合 体の円形ジイクロイズムのスペクトルを表す。

第７図は、アルファおよびベータペプチドおよびアルファ／ベータペプチド複合 体の変化する温度および波長において円形ジイクロイズムの楕円率を表す。

第８図は、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）の存在または不存在における、アル ファ／ベータ複合体についての２１８ｎｍにおけるＣＤシグナルの温度依存性の グラフの表示である。インセットは、ＧｕＨＣｌの不存在下の温度依存性の一次 導関数を示す。

第９図は、変化する温度および２８５．５ｎＭにおいてチロシンのｔ；めの紫外 線の吸収を表す。

第１Ｏ図は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のアミノ酸配列と本発明の ＢＰＴ夏アルファ／ベータ複合体のアミノ酸配列とを比較しそして、また、天然 に産出するＢＰＴＩのアミノ酸配列およびウシ血清阻害因子（ＢＳＩ）タンパク 質のアミノ酸配列を表す。

第１１図は、複合体を注射しｔ；３羽のウサギ中の本発明のアルファ／ベータペ プチド複合体に対する抗体の産生についてのアッセイの結果のグラフの表示であ る。Ｐｒｅは動物についての対照（注射前の）値を示す；１ｓｔは動物について の注射後の値を示す。動物は数（２７６，２７７，２７８）により示す。

λ盟０膠胆１塁厘 伝統的には、単一のドメインのタンパク質の断片は水溶液中で折り重なることが できず、そしてタンパク質の折り重なりの最小の共同単位は１つのドメインであ ることが考えれてきている。本発明は、短いペプチドを接合して（例えば、共有 結合により）、完全なまたは自然のタンパク質中の対応する領域と非常に同一の 方法で相互作用するペプチド複合体を形成することができるという発見に基づく 。

本発明は、少なくとも２つの短いペプチドから構成され、それらの各々が問題の タンパク質の選択したセグメントのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列（−次 配列）を有し、そして自然または完全なタンパク質中の領域が相互作用するのと ちょうど同じよにそれらが相互作用するような方法で接合されている、ペプチド 複合体に関する。本発明は、また、それらを調製する方法および使用する方法に 関する。このようなペプチド複合体は、合成ワクチンとして、診断試験において 使用すべき抗体をレイズするときの合成配位子として、薬物（例えば、ホルモン 、酵素）として、エピトープのマツピングにおいておよびタンパク質の設計にお いて有用である。

本発明のペプチド複合体の開発における重要な要素は、少なくとも２つの短いペ プチド単位を、共有結合により、生ずる複合体の安定性を増強する手段として、 接合することである。複合体中のペプチド単位のアミノ酸配列は、自然のまたは 完全なタンパク質中で相互作用する規定した二次構造の領域のアミノ酸配列に相 当する。本発明のペプチド複合体からなる短いペプチド単位は、後述する方法に より、完全なタンパク質中で起こる相互作用に基づいて選択される。この方法で 選択されるペプチド単位は、配列が、規定した二次構造（例えば、アルファーら せん、ベーターシート）を形成する完全なタンパク質中のセグメントに相当する 。ペプチド単位は、また、ペプチド複合体の安定性を増強する完全なタンパク質 の他のセグメントに相当する配列を包含する。

完全なタンパク質中の選択しｔ；セグメントに相当するペプチド単位の配列は、 選択したセグメントのそれと同一であるすることができるか、あるいは１まｔ； は２以上のアミノ酸の置換を包含することができる。置換は、問題の自然のまｌ ；は完全なタンパク質において観測される二次構造を形成する同一の傾向を有す るアミノ酸による。例えば、アラニンまたはセリンの残基は、第１図に表すペプ チド複合体の残基５５に存在するシスティン残基と置換することができる。

２つの単位の結合は、一般に、性質が共有結合でありそして、とくに、ジサルフ ァイド結合であろう（ペプチド単位の各々上の少なくとも１つのシスティン残基 の間）。短いペプチド単位の間の結合は単位を一緒にを保持しかつ溶液中で互い から拡散する傾向を克服するために十分でなくてはならないので、共有結合を使 用する。あるいは、フンフォメーションを破壊または変更する共有結合を使用す ることができる（例えば、カルボキシル／アミノアミド結合、例えば、ｇｌｕ／ ｌｙｓ結合）。

本発明のペプチド複合体中に組み込むべき短いペプチド単位の選択は、少なくと も２つの異なる方法で実施することができる：結晶構造が知られているタンパク 質について１つおよび結晶構造が知られていないタンパク質についてｌ）、両者 場合において、使用する短いペプチド単位の長さは、安定な、非ランダム構造を 生理学的条件下に産生ずるために必要なアミノ酸残基の数により規定または限定 されるであろう。

タンパク　の結晶構造が知られている場合の短いペプチド単位の選択多くのタン パク質の結晶構造は既に知られており、そして追加の構造のデータは既知の技術 を使用して得ることができる。Ｌｅｓｚｃｚｙｎｓｋｉ、Ｊ、Ｆ、およびＧ、Ｄ 、Ｒｏｓｅｓ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　２３４：８４９−８５５（１９８６）；Ｂｒ ｏｏｋｈａｖｅｎ　ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔ　Ｂａｎｋ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、 ＩＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｓＮｏ、４Ｌ ｓｐｐ−３４１、−ニューヨーク（７／８７）。結晶構造が知られているタンパ ク質の場合において、短いペプチド単位の選択は次の方法で実施される：問題の タンパク質の結晶構造を、よく規定された二次構造の２つの領域の間の４人より 小さい接触の発生について最初にアッセイする：このような接触はこれらの領域 の間の好都合な相互作用を示す。次いで、これらの領域を規定し、そして接触、 例えば、２つの領域の間のの水素結合、ファン・デル・ワールスの接触および塩 の架橋（ここで陽性および陰性の側鎖の相互作用）を同定する。短いペプチド単 位を構成するＩ；めに使用する特定の配列は、接触をつくるアミノ酸残基に基づ いて決定する。

本発明の１つの実施態様において、問題のタンパク質の結晶構造をタンパク質の 領域の間の接触の規定された領域についてアッセイする。これらの領域がいった ん規定されると、ジサルファイド結合の位置を決定し、次いでタンパク質の領域 の間の他の聾の接触の発生および位置を決定す□る。

このアプローチを使用して、ウシ膵臓トリプシン阻害因子（ＢＰＴＩ）の結晶構 造をアッセイした。これは次の方法で実施した：ＢＰＴ夏の結晶構造を４人より 小さい領域の間の接触について探索した。この場合において、ジサルファイド結 合の発生は特に興味があった。これは完全なタンパク質中の一次配列の２つのセ グメントの同定を生ずる：自然タンパク質中のアルファーらせんを形成する１つ およびベーターシートを形成する１つ。２つのセグメントの配列、ならびに４人 より密接する２つの間で作られた接触を第１図に表されている。

これに基づいて、第１図に示す２つの配列を決定しｌ；。生ずる１つの配列（配 列１）は、アルファーらせんの１０アミノ酸配列（第１図において残基４７〜５ ６）および、さらに、多数の接触がベーターシートでなされている４アミノ酸残 基のセグメント（４３〜１６を含む）を含む。

第１図に示すように、第２ペプチドは１４アミノ酸残基（配列２）を含む。

完全なタンパク質中の２つの領域の間で起こる４人より密接する接触は、第１図 において、疎水性の「ポケット」の接触、二次構造の接触およびジサルファイド 結合の接触として表されている。

タンパク質の結晶構造が未知である場合の短いペプチド単位の選択結晶構造が未 知である問題のタンパク質の場合において、既知の結晶構造のタンパク質におけ る短いペプチド単位の選択について前述のものに類似する手順を使用する。

問題のタンパク質のアミノ酸配列の評価（例えば、既知の技術および装置を使用 して、決定するか、あるいはこのタンパク質をエンコードするＤＮＡのヌクレオ チド配列から推定した）を実施して、規定した二次構造を有することができる一 次配列中の特定のセグメントを同定し、そしてこれらの領域中のシスティン残基 の数を決定する。問題のタンパク質の多数のより短い断片を発生させる、部分的 タンパク質分解により、これらのセグメントを接続するジサルファイド結合が存 在するかどうかを決定することができる。これらのセグメントを接続するジサル ファイド結合の発生は、完全なタンパク質中の二次構造の相互作用を示す。この ようにして規定されたセグメントに相当する短いペプチド単位は、後述するよう に、合成することができる。問題のタンパク質がそれ自体利用され得ないが、ア ミノ酸配列が知られている（それをエンコードするヌクレオチド配列からの推定 による）場合において、システィン残基が存在しそしてこうして、ジサルファイ ド結合が、まｌ；、存在しうる、アミノ酸配列中の領域を見ることができる。

短いペプチド単位およびペプチド複合体の構成接触が起こるセグメントがいつｔ ；ん同定されそしてアミノ酸配列が決定されると、配列が自然タンパク質中のこ れらの２つのタンパク質の各々のアミノ酸配列に相当するペプチド単位をつくる 。このようなペプチドは機械的につくることができ（すなわち、タンパク質合成 装置で）；既知の遺伝子工学の技術を使用して産生ずることができ、ここで各ペ プチドをエンコードするＤＮＡをクローニングまたは合成および発現され、次い でペプチド単位を回収する：あるいは天然に産出する源から分離または精製する ことができる。

このようなペプチド単位をＢＰＴＩのためにつくりそして接合した。

とくに、アルファーらせんにおよびベーターシートの実質的な分画に相当する領 域を産生じそして接合した。

ウシ膵臓トリプシン阻害因子（ＢＰＴＩ）は、タンパク質分解活性を示す、１系 列の酵素の１つである。Ｔｒａｖｉｓ％Ｊ、およびＧ、Ａ。

Ｓａ　ｌｖｅ　５ｅｎｓ　Ｒｅｖ、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　、５２　：　６５５− ７０９（１９８２）。このような酵素は、セリンプロテアーゼを包含するｌ系列 の表面に関係するタンパク質分解の事象を必要とする、細胞の増殖および分化に おいて重要である。ＢＰＴＩは、３つのジサルファイド結合、アルファーらせん 、短い３．。らせんおよび３鎖のベータシ−トを含有する。ＢＰＴＩ　（５８残 基）の構造は、３つの異なる結晶の形態において決定されＩ；。

ＢＰＴＩについて前述した２つの短いペプチド単位の合成を、実施例１に詳細に 記載する。ＢＰＴＩの場合において、１つの短いペプチドを、アルファペプチド と呼び、次の配列を有するように機械的に合成した；ＮＮＦＫＳＡＥＤＣＭ 入ｓｎ−人ｓｎ−Ｐｈｉ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ− Ｍｅｔ−ＴＡＧＧＡ Ａｒｇ−Ｔｈｒ−人１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−人１ａ５３　５４　５５　５６　５ ７　５Ｂ それはＣ末端のアルファらせんおよびベータシートの短いセグメントを含む。残 基４７〜５６は、ＢＰＴＩのアルファーらせんを構成するものである。残基４３ 〜４６は、前述したように、水素結合「ポケット」と呼び、ベータペプチド中の 残基と４人より密接する接触する。このペプチドにおいて、アラニン（Ａｌａ） 残基を、自然タンパク質中のその位置に存在するシスティン（Ｃｙｓ）の残基５ ５において置換した。結局、使用するアルファペプチドは、自然ＢＰＴＩの場合 にけるように、２つよりはむしろ１つのシスティン残基のみを含む。

第２の短いペプチド単位は、ベータペプチドと呼び、そしてまた機械的に合成し 、次の配列を有する： Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ このアミノ酸配列は、自然のそれと同一である。システィン残基３０および５１ の間のジサルファイド結合を使用して、成分を接合して、アルファ／ベータ複合 体と呼ぶ、ペプチド複合体を産生ずる。ＢＰＴＩにおいて、３０〜５１のジサル ファイドはＣ末端σ−らせん領域（Ｃｙｓ−５１）を中央の反平行β−シートの 鎖（Ｃｙｓ−３０）に接続する。

したがって、アルファ／ベータ複合体のコア領域は、σ−らせんおよび中央の反 平行β−シートの実質的な部分に相当する残基を含む。このコア領域より外側の 残基は、また、含まれた。１つの目的は、ペプチドを大きくし過ぎないで第２ペ プチド（すなわち、自然構造）中の残基と相互作用する１つのペプチド残基を含 む。複合体はＢＰＴＩのほぼ半分を表し、そしてタンパク質の疎水性のコアの１ つの大部分を含む。

結合の他の形態を使用して、ペプチド複合体を構成する２またはそれ以上のペプ チド単位を接合することができる；コンフォメーシクンを破壊または変更しない 共有結合を使用することができる。

本発明のペプチド合成複合体はは、水溶液中で非常に可溶性であり、そして凝集 しない。円形ジイクロイズム（ＣＤ）およびＮＭＲにより判断するとき、ペプチ ド複合体は４℃において水溶液（ｐＨ６）中で９０％以上に折り重なっている。

ジサルファイド結合が還元されるとき、構造はアンフォルト（ｕｎｆｏｌｄ）す る。２次元の核オーバーハウザー（Ｏｖｅ　ｒｈａｕ　ｓｅ　ｒ）効果の分光分 析（ＮＯＥＳＹ）により、それは自然ＢＰＴ■の対応する領域に存在する二次構 造および三次構造の多くを含有する。これらの結果が示すように、自然様構造は タンパク質の折り重なりにおいて早く形成することができ、そして一時的折り重 なり中間体の構造を特性決定することができる。

個々のペプチド単位およびペプチド複合体の特性の物理化学的評価いったんペプ チド本位を合成しそして接合してペプチド複合体を生成すると、多くの型の測定 を使用して生理学的条件下のペプチド複合体の構造を特性決定することができる 。例えば、高い分解能の核磁気共鳴、円形ジクロイズム、紫外線吸収、Ｘ線結晶 学および他の測定技術を使用するすることができる。高い分解能の核磁気共鳴、 円形ジクロイズムおよび紫外線吸収の使用を、記載するＢＰＴＩ中の明確な領域 に相当する２つの短いペプチド単位およびジサルファイド結合により接合すると き形成されるペプチド複合体に適用するとき、下に記載する。しかしながら、同 様なアプローチを使用して複合体の構造を特性決定することができる。

Ａ、高い分解能の核磁気共鳴 高い分解能のプロトン（１Ｈ）核磁気共鳴（’ＨＮＭＲ）スペクトルは、ＢＰＴ ＩのＢＰＴＩアルファ／ベータ複合体（前述および実施例１に記載する）につい て得ｔ；。第１図はアルファベータ複合体についての全体の’ＨＮＭＲスペクト ルであり、そして第２図はＩＨＮＭＲスペクトルの温度の芳香族の化学シフトの 領域である。第３図に表すスペクトルは、第２図におけるピークの左のほとんど の系列（例えば、約６゜５〜７．５ｐｐｍから）についてのものである。第３図 において、示されている共鳴は芳香族アミノ酸のフェニルアラニンおよびチロシ ンの側鎖（中に見いだされるベンゼン環）上のプロトンに相当する；第１図中に 示すように、フェニルアラニンはペプチド配列２中に２回存在し、そして配列ｌ に１回存在し、そしてチロシンは配列２中に２回存在する。

ま！；、第１図に示すように、配列２中に存在するフェニルアラニン残基の１つ およびチロシン残基の両者、ならびに配列ｌ中に存在するフェニルアラニンは、 親水性「ポケット」と呼ぶものの中で４人より近い接触において参加する。第３ 図に示すように、共鳴のあるものの振動数（化学シフト）は温度とともに変化す るが、他のものはそうではない。とくに、ピークＡの共鳴は温度依存性化学シフ トを示す：ピークＢのそれは示さない。

Ａの化学シフトは、相対的個体数が温度とともに変化する、少なくとも２つの急 速に相互に変換する種の共鳴の時間平均である。これらの種の１つは多分構成さ れない複合体であるが、他のものは構造を有するようである。

第４図はいくつかの温度におけるピークＡの化学シフトである。ペプチドの構造 以外の多くの因子は、温度依存性の化学シフトに導くことができるであろう。し かしながら、これらの因子は典型的には直線の温度依存性を生ずるであろう。こ の共鳴を生ずるペプチドの領域が約４０℃においてにおける熱転移を行うことか ら明らかなように、ピークへの化学シフトについて第４図に直線からの偏りを取 ることができる。温度が４０℃より上昇するとき、この熱転移はアルファ／ベー タ複合体中の構造の損失から生ずる。これは４０℃以下の温度で構成されたアル ファ／ベータ複合体の存在を示す。

二次元ＮＭＲ分光分析（２Ｄ−ＮＭＲ）を使用して、アルファ／ベータ複合体中 の構造をさらに特性決定した。アルファ／ベータ複合体のスペクトル中の共鳴の ９０％は、序列の方法を使用して割り当てた。Ｗｕ−ヨーク（１９８６）。明白 な出発の割り当ては実施例２に記載するように得られた。

アルファ／ベータ複合体についてのＮＭＨの割り当てはＢＰＴＩについて独立で あるが、２つの種における相対的シフトは顕著に類似する（第５図）。比較のた め、モデルの「ランダム−コイル」のペプチドにおけるアミノ酸残基についての 化学シフトの範囲、Ｂｕｎｄ　ｉｂ　Ａ−およびＷｕｔｈｒｉｃｈ、に、、Ｂｉ ｏｐｏｌｙｍｅｒｓ１上８２８５−２９７（１９７９）を、第５図に正方形で示 す。これらの結果が示唆するように、複合体および自然ＢＰＴＩにおける構造は 類似し、そして４℃における折り重なったアルファ／ベータ複合体分子の個体数 は高い。

二次元の核オーバーハウゼル効果の分光分析（ＮＯＥＳＹ）データが示すように 、ＢＰＴＩの対応する領域中に存在する二次構造の、全部でなくても、大部分は 、また、アルファ／ベータ複合体の折り重なったフンフォメーション中ｔ：また 存在する。とくに、Ｃ末端のａ−らせんおよび中央の反平行のβ−シートは完全 であるように見える（表り、二次構造のこれら領域の間の第３相互作用は、また 、アルファ／ベータ複合体中に存在する（表り、これらの第３相互作用は完全な りＰＴＩ中に見いだされるものに類似する。

嵐Ｉ　ＰａＰβのＮＭＲスペクトル中に観測される選択しｔ：ＮＯＥ観測された 　ＢＰＴＩの結晶構造 ＊＊　ｇ羞ユイユ２　中の距離 β−シート　２１ａ　−３２ａ　２．４Ａ２３ａ　−３ＯＮ　４．４Ａ ２４α−２９Ｎ　３．４人 ５２ａ　−５５５４，２に ２：ｌ（−５５β　４．ｌＡ ２３β　−５５β　２．５Ａ コ０β　−４８β　３．５Ａ すべての列挙したＮＯＥは交差ピークとして観測され、これらのピークは４℃に おけるアルファ／ベータ複合体のＮ０ＥＳＹスペクトルにおいて明瞭に割り当て ることができるであろう（すなわち、関連するプロトンに対する共鳴の明確な割 り当て、および他の共鳴とのオーバーラツプの不存在）。交差−ピークは、２５ ０ｍ５ｅｃおよび３５０　ｍ　ｓ　ｅ　ｃの混合時間を使用して蓄積された両者 のスペクトルにおいて観測された。

比較のため、ＢＰＴＩの結晶構造中の対応するプロトンの間の距離が示円形ジク ロイズム（ＣＤ）は、溶液中のペプチドの全体のらせんの含量の測定において有 用である。ｎ−ｅ　＊吸収バンドは、２２２ｎＭに中心をもち、ペプチドの主鎖 中に見いだされるアミド結合のためである。このバンドのＣＤ楕円率は、ペプチ ドおよびタンパク質のアルファらせんの含量の指示として使用した。５ｃｈｅ　 １１ｍ１ｎ、Ｊ、Ａ、およびＢ＋ｅｔｙｓ８ヱ：２１８　（１９６５）、ＣＤは 、実施例２に記載されているように、使用して、アルファ／ベータ複合体が個々 のペプチド単位のいずれか、あるいは両者中に存在するより安定であるかどうか を決定した。この評価の結果を第６図および第７図に表す。

第６図は、０および６０℃におけるアルファペプチド単位（５Ａ）、５℃におけ るベータペプチド単位（５Ｂ）および０，１０．４０および６０℃におけるアル ファ／ベータ複合体（５Ｃ）のＣＤデータを示す。

アルファおよびベータペプチドのスペクトルは、このような構造が好適であろう 低い温度においてさえ、これらのペプチドの安定な構造の証拠を示さない。しか しながら、第５Ｃ図に示す低い温度におけるアルファ／ベータ複合体のスペクト ルは、２２２ｎＭ付近のマイナスの楕円率および２２２および２０８　ｎ　ＭＩ ：８いて楕円率の比により示されるように、アルファらせん構造の存在の証拠を 事寅示す。これらの基準はペプチド中の楕円の存在の検出に従来使用されてきた 。Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｋ。

Ｒ１酵素活性、「ペプチドのらせんのアン７オルデイングの円形ジクロイズムの 測定（Ｃｉｒｃｕｌａｒ　Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ 　Ｐｅｐｕｔｉｄｅ　Ｈｅ１ｉｘ　Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）Ｊ、Ｔｅｎｔｈ　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、ｊｕｎｅ１９８７゜ アルファ／ベータ複合体中の安定な構造の存在およびアルファまたはベータのペ プチド単独中のその欠乏についての追加の証拠は、第７図に示す。第７Ａ図、第 ７Ｂ図および第７Ｃ図は、ペプチドのアルファ、ベータおよびアルファ／ベータ 複合体についての２２２ｎＭにおけるＣＤ楕円率を示す。ＮＭＲの化学シフトの 場合のように、このパラメーターの非線状の温度の依存性は熱転移（例えば、構 造の変化）についての証拠として取ることができる。第７Ｂ図に示すように、ベ ータペプチドのＣＤシグナルの温度の依存性は完全に直線であり、熱転移の不存 在を示し、したがって多分このペプチド中の温度における構造の欠如を示す。

アルファペプチドについてのデータ（第７Ａ図）は、１０〜２０℃の間の可能な 熱転移を示す。これに基づいて、ペプチドは低い温度において弱いらせんを有す ることができる。しかしながら、低い転移温度のたのに、アルファペプチドが生 理学的温度（すなわち、３７℃）における有意の量の構造を示すことはないよう である。対照的に、アルファ／ベータ複合体についてＭ６Ｃ図に示すデータは４ ０°Ｃ付近における熱転移を示し、ＮＭＲスペクトル（参照、第４図）中のピー クＡの化学シフトの温度依存性に見られる明らかな転移温度と一致する。これが 示すように、アルファ／ベータ複合体はその成分のペプチドのいずれよりも非常 に安定な非ランダム構造を有し、そして生理学的条件下にこの複合体中に存在す る構造の有意の量が存在するようであり。

ＣＤスペクトルが示すように、アルファ／ベータ複合体は水溶液の自然様コン７ オメーシヨンに折り重なり、そしてこの構造は増加する温度とともにアンプオル トすることができ、これに対してジサルファイド結合が還元するとき支質的に折 り重なる構造についての証拠は存在しない。

ＣＤにより監視するとき、複合体について熱のアンフォルディングの転移は広が り、６０℃を越えて拡大し、そして最後に折り重なったベースラインはＯ″Ｃに おいてさえ到達しされない（第８図）。試料を使用前に脱気するかぎり、転移は ８０℃まで完全に可逆的であり、そして変性剤のＧｕＨＣＩの添加により排除す ることができる。複合体は、ゲル濾過により判定して、凝集せず、そして２０倍 の範囲にわたるペプチド濃度へのＣＤシグナルの有意の依存性は存在しない。

Ｃ０紫外線吸収 第９図に、２８５．５ｎＭの波長および種々の温度における、チロシンによる紫 外線吸収を表す。チロシンの吸収の温度依存性を使用して、タンパク質の熱のア ン７オルデイングを監視した。Ａｔ１ａｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎ　５ｐｅｃｔｒ ａ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ａｎｄ　Ｖｉｓｉｂｌｅ　Ｒｅｇ ｉｏｎｓ、Ｄ、Ｍ、Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍ編、ＩＦＩ／Ｐｌｅｎｕｍ、ニュ ーヨーク（１９７２）。

再び、温度へのこのパラメーターの非直線の依存性は熱転移の指示である。第９ 図に示すように、直線からの偏りはチロシンの吸収について約４０℃において起 こり、この温度における熱転移を示す。これはＣＤ８よびＮＭＲの結果と一致し 、再び生理学的温度におけるアルファ／ベータ複合体中の安定な構造を示す。

！杓 前述の測定の３つの型を使用する分析は、次の事実を支持する：ｌ、個々の短い ペプチド単位（すなわち、アルファペプチドの配列およびベータペプチドの配列 ）は、生理学的温度において二次構造を表さない。

２、アルファ／ベータ複合体は、すべての３つの測定における複合体により立証 される温度依存性の直線性からの偏りにより示されるように、熱転移を示す。お よび ３．３７℃の普通の生理学的温度を越える４０℃において熱転移の存在は、アル ファ／ベータ複合体が有意の量の安定な、非ランダム構造を生理学的条件下にを 有することを示す。

これらの結論は有意である。なぜなら、構成されたペプチド複合体の相対的個体 数強い免疫応答および自然タンパク質と強く交差反応する抗体の産生を引き起こ すその能力に対して極めて重要であるからである。

現在の方法により得ることができるペプチド抗原において欠けるのは、この性質 、すなわち、生理学的温度中の有意の量の構造の存在である。

温度依存性の直線性から偏り（すなわち、非直線の温度依存性）が、少なくとも ２つの短いペプチド単位から構成され、それらの配列が、前述したように、問題 のタンパク質中の少なくとも２つの領域におけるアミノ酸配列に相当する、ペプ チド複合体による二次構造の形成の重要な基準または支持である、同様な分析を 使用して、任意のペプチド複合体の安定性を評価することができる。

こうして、前述のアプローチを使用して、タンパク質の折り重なりにおいておよ び、こうして、タンパク質の安定なコン７オメーシヨンのために、含まれ（その 原因となる）問題のタンパク質の領域は、任意の問題のタンパク質について同定 することができる。アミノ酸配列が選択した領域に相当する短いペプチドは、既 知の技術を使用して、合成することができる。次いで、少なくとも２つの短いペ プチド単位を、好ましくはジサルファイド結合であることができる、共有結合に より接合して、ペプチド複合体を産生ずる。生ずる複合体は個々の短いペプチド より水溶液中で安定である。ペプチド複合体のフンフォメーシオンは、必要に応 じて、ＢＰＴＩペプチド複合体の安定な構造の形成の評価について記載した３つ の方法の１または２以上により評価することができる。

本発明を次の実施例により説明するが、これらの実施例はいかなる方法おいても 本発明を限定しない。

実施例１　ペプチド複合体の形成 ペプチドのアルファおよびベータをアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の４３０Ａ型のペプチド合成装置で標準の反応サ イクル（ｓｔｄ−１ｒ）を使用して合成した。アプライド・バイオシステムス（ Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ペプチド合成装置４３０Ａのウーザー のマニュアル、パージコン１．２（１９８５）。すべてのアミノ酸はｔ−ＢＯＣ で保護されたアルファーアミノ酸であり、対称無水物としてカップリングしたが 、ただしＨＯＢ　をエステルとしてカンブリングしたアスパラギン、グルタミン およびアルギニンを除外した。側鎖の保護基は次のとおりであった：アルギニン 、ＭＴＳ；メチオニン、スルホキシド；システィン、４−メトキシ０−ベンジル ；リジン、２ＣＩ−Ｚ；チロシン、Ｂｒ−Ｚ；セリンおよびスレオニン、ベンジ ル；グルタメート、ｏ−ベンジル。アルファの合成のために、ＰＡＭ−アラニン を使用した。ベータの合成のために、ＰＡＭ−フェニルアラニンを使用しｔ；。

ニンヒドリンの測定はカップリング毎に行い、そして多数のカップリングを使用 して少なくとも９９％のカップリング効率を生成しｔ；。両者のペプチド−制限 は「低い−高いＪ　ＴＦＭＳＡ切断を使用して切断した。Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅ ｔｉｎ　Ｎｏ、１６、Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（１９８６）。粗製のペプチド産生物はセファデッ クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１５で５％の酢酸／Ｈ、Ｏ中で精製した。各ペプ チドの溶離は八２３４により監視し、そして空隙体積において溶離されることが わかった。Ｇ−１５精製したペプチドを凍結乾燥し、そして乾燥下に一２０℃に おいて貯蔵した。

アルファ／ベータ複合体の形成 アルファ／ベータ複合体は、Ｇ−１５精製したアルファおよびベータを使用して 産生じた。ジサルファイド結合の酸化は、０．１モルのトリス、０．２モルのＫ ＣＩ　ｐＨ８，７中で、はぼ２０ミリモルのベプチ２９３　Ｃ１９７７Ｌ酸化反 応は空気中で激しく撹拌しながら３０時間４℃において実施した。粗製反応混合 物を凍結乾燥し、そして乾燥下に一２０°Ｃにおいて貯蔵した。

アルファ／ベータ複合体は、また、次の方法で産生じｌ；：ベータペプチドを酸 化したグルタチオン（Ｇ　Ｓ　Ｓ　Ｇ）と反応させ、そして混合したジサルファ イドをＨＰＬＣにより精製してＰ−ベータＳＳＧを産生した。

次いで、Ｐ−ベータＳＳＧをＰアルファと反応させて、ＰアルファＰベータを産 生した。

アルファ、ベータおよびアルファ／ベータ複合体のＨＰＬＣ精製研究したペプチ ドの各々は、半調装用逆相ＨＰＬＣによりＣ−１Ｃ−１８（ｌＸ２０カラム（Ｖ ｙｄａｃ）を使用して精製した。ペプチドは、各ペプチドについて最適化した。

Ｈ，Ｏ中の０．１％のＴ　Ｆ　Ａ　／　Ｈ２０中の０．１％のＴＦＡ、３０％の ＣＨ，ＣＮの直線の勾配で溶離した。

溶離はＡ　２　！　Ｉで監視し、そして分画を集めそして凍結乾燥した。分析用 逆相ＨＰＬＣにより評価した、各ペプチドの純度は９９％より太きかつに。

アルファベータ複合体の組成は、１０ミリモルのＤＤＴ、０．１モルのトリス、 ｐＨ７，０中でジサルファイド結合をの還元し、次いで分析用逆相ＨＰＬＣによ りアルファおよびベータのそれらに同一の保持時間をもつピークを生成すること によって確証した。アルファおよびベータの配列は、アプライド・バイオシステ ムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ’ｔｅｍｓ）の４７０Ａ型気相配列決定装 置を使用して確証した。

実施例２　アミロイドベータタンパク質前駆体内のプロテアーゼｉｎｒ配列に対 するＢＰＴＩのアルファ／ベータ複合体の相同性この実施例において、本発明に おいて合成したアルファ／ベータ複合タンパク質のペプチド複合体内の、プロテ アーゼ阻害因子の配列を含有するタンパク質のドメインとの相同性を実証するこ とを説明する。

アミロイドベータータンパク質／アミロイドＡ４は、アルツハイマー病またはダ ウン症候群（ｔｒｉｓｏｍｙ　２１）をもつ個体における、神経症の芝、神経線 維の絡み合いおよび脳血管の沈積中に存在するペプチドであることが示された。

それはアルツハイマー病の病原性に含まれることがある。Ｔａｎｚｉ、Ｒ，Ｅ、 　ｅｔ　ａｌ−１Ｎａｔｕｒｅ。

主点上：　５２５−５２７　（１９８８）。アミロイドタンパク質は、最近、ア ミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）と呼ぶ遺伝子により、より大きいタンパク 質（アミロイドタンパク質の前駆体）の部分硫酸アンモニウムエンコードされる ことが示された。Ｐｏｎｔｅ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ％３３土：５２８　５３０　（１９８８）；Ｔａｎｚｉ、Ｒ。

Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５２５−５２７　（１９８８）；Ｋ ｉｔａｇｕｃｈ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：　５３０−５３２ 　（１９８８）。

第１０図は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のドメインを本発明のＢＰ ＴＩアルファ／ベータ複合体と比較する。また、天然に産出するウシ膵臓トリプ シン阻害因子のタンパク質およびウシ血清阻害因子タンパク質（ＢＳＩ）の残基 を示す。ＢＰＴＩのアルファ／ベータ複合体のペプチドの配列は第１０図に示さ れている（参照、ＢＰＴＩの配列およびアミロイド前駆体タンパク質の相同性の 配列の下線）。

番号は、Ｐｏｎｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、およびＫｉｔａｇｕｃｈ　ａｔａ】１、上 を参照、に規定されているように、推定したアミロイドタンパク質の配列に基づ く。

基本的チロシン阻害因子の族の高度に保存された配列に対して相同性ｏｎｅ）プ ロテアーゼ阻害因子、およびラッセルのパイパーベンム（Ｖｉｐｅｒ　ｖｅｎｏ ｎ）基本プロテアーゼ阻害因子（Ｋｉｔａｇｕｃｈ、Ｎｏ、ｅｔ　ａｌ、、ｉｄ ）を包含する、を暗いオーバーラインで第８図に示す。活性部位における基本ア ミノ酸残基（アルギニン）を星印で示す。

アルファおよびベータの配列は、アミロイド前駆体タンパク質と整列する。ＡＰ Ｐに示す５６残基のうちで、アルファ／ベータ複合体の１３残基（２３％）は同 一である。

本発明のアルファ／ベータＢＰＴＩペプチド複合体を注射しｆ−３羽のウサギに おける抗体の産生を、次の方法で評価した：注射前に、動物を採血して注射前の （ベースライン）の値を得た。引き続いて、動物を前述のようにアルファ／ベー タ複合体で注射した：複合体を１系列の投与量でアジュバント中で投与した。引 き続いて、動物を採血し、そしてそれらの血清を、ＥＬＩＳＡ技術により、アル ファ／ベータ複合体の抗体の産生についてアッセイした（アルファ／ベータ複合 体に対してレイズされた抗体への自然ＢＰＴＩの結合）。結果（注射の前および 後）を表中に表し、そして第１１図にグラフでを表す。３羽のウサギの１羽（２ ７８）において、結果が明瞭に実証するように、複合体は有効な抗原である。

表　４１ＯＮＭにおける光学密度 ＬＯＧ　Ｄ工Ｌ　ＰＲＥ　２７６　１ＳＴ　２７６　ＰＲＥ　２７７　１ＳＴ　 ２７７　ＰＲＥ　２７８　１ｓＴ　２７８１　濃度　０．０５８　０．０８）　 ０．１３０　０．１５２　０．０４１　１．０７９２　１　０．０５３　０．０ ７８　０．Ｏｎ　Ｏ，０８２０，０３５１，０７９３２０，０２４０，０２９０ ，０１Ｂ　０．０３９　０．０２Ｂ　０．９６０５　４　−０−００６　−０＋ ００９　−０．００８　−０．００９　−０．００９　０．０３５夾施例４　ア ルファ、ベータおよびアルファ／ベータ複合体の構造の高い分解能の核磁気共鳴 （’ＨＮＭＲ）の特性決定ホームビルト（ｈｏｍｅ−ｂｕ　ｉ　Ｉ　ｔ）のＮＭ Ｒスペクトロメーターで５００ＭＨ２（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、Ｍ、Ｉ。

Ｔ、）で、’ＨＮＭＲスペクトルを得た。精製したアルファ／ベータ複合体をり 、Ｏで予備交換し、凍結乾燥し、そして９９．９９５％のり。

０中に２７ｍｇ７ｍＱの濃度に取っｔ；。生ずる溶液のｐＨはほぼ５．０であっ た。’ＨＮＭＲスペクトルを単一のｌ相配列を使用して３秒のリサイクルの遅延 で集めた。はぼ８０の走査を各スペクトルについて集めＩ；。化学シフトはＴＭ ＳＰ（トリメチルシリルプロピオネート）の内部標準を参照した。温度を±Ｏ， ｌの精度に維持した。

円形ジクロイズムのスペクトル アルファ、ベータおよびアルファーベータ複合体のＣＤスペクトルを、ＡＶＩＶ ６００ＨＣＤ分光光度計で得た。温度はＨＰ８９１００Ａ熱電流温度制御装置で 制御した。スペクトルを種々の温度および波長において集め、そして各温度にお いて集めた緩衝液のブランクを減することによって補正した。ペプチドの濃度は 、５ミリモルのリン酸カリウム、０．１モルのリン酸水素二ナトリウムから成る 緩衝液ｐＨ６，０中で０゜１ｍｇ／ｍ（ｉであった。アルファおよびベータのス ペクトルはＤＴＴの存在下に集めた。

二次元のＮＭＲスペクトル分析 ダブル−フンタム（ｄｏｕｂｌｅ−ｑｕａｎｔｕｍ）ＣＯＳＹＳＲＥＬＡＹ、Ｔ ＯＣＳＹ８，１−び相感受性Ｎ０ＥＳＹ７．ベクトル（８００ｔ。

Ｘ２０４８ｔ、）を、５００ＭＨｚのブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）分光光度形で ファックス・チェース・メディカル・センター（Ｆｏｘ　Ｃｈａｓｅ　Ｍｅｄｉ ｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）（ペンシルバニア州うイラデルフィア）において２．５ 秒のリサイクルの遅延で集めた。Ｎ０ＥＳＹスペクトルの混合時間は２５０まＩ ；は３５０秒であった。ペプチドの濃度は１５ミリモルであった。５ｋＨｚのス イープ幅を両者の次元において使用し、そして相シフトサイン−ベル（ｐｈａｓ ｅ−ｓｈｉｆｔ　５ｉｎ６−ｂｅｌ＋）機能を使用して分解能を増強した。順次 のでのための出発点として働く明確な割り当てを次のように実施した：Ａｌａ− ２５およびＡｌａ−４８のメチルの共鳴は、それらの部位にデユーチリウム化ア ラニンを含有する（ペプチド合成により導入した）を使用して割り当てた。ロイ シン、Ｌｅｕ−２９のメチルの共鳴は、独特のｃｏｓｙパターンに基づいて割り 当てた。それぞれ、アルファおよびベータのペプチド中に見いだされる唯一のス レオニン残基である、Ｔｈｒ−５４８よびＴｈｒ−３２のメチルの共鳴は、それ らのｃｏｓｙパターンおよび固有の化学シフト値に基づいて高い温度（６０℃） において分離したペプチドのスペクトル中で最初に割り当てた。次いで、これら の割り当てを６０℃（すなわち、アンフォルディングの条件）におけるアルファ ／ベータ複合体のスペクトルに移し、そして共鳴を４℃への温度の関数硫酸アン モニウム追跡した。これらの出発点がら、これらの出発点、順次の割り当ての方 法を使用した。Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、に、５ｕｐｒａ。

紫外線吸収のスペクトル アルファベータ複合体の３２５〜２５０ｎＭｎｏ紫外線吸収を、ＡＶＩＶＩ　１ ８Ｄｓ型分光光度形で種々の温度において得た。アルファーベータ複合体を、Ｃ Ｄ種について使用し！このと同一緩衝液中に３ｍｇ／ｍＱの濃度に溶解した。種 々の温度において得られたスペクトルと２℃において得られたスペクトルとの間 の２８５．５ｎＭにおいて吸収の差を、特別のスペクトル減法を使用して計算し た。

ｇ里作 ここに記載するペプチド複合体および方法は、少なくとも２つの短いペプチド単 位を含み、それらの各々が問題のタンパク質の選択した領域のアミノ酸配列に相 当し、そしてそれらが「まねる」完全なまたは自然のタンパク質の領域が相互作 用するのち非常に同一の方法で、ペプチド単位が相互作用ような方法で接合され ている、ペプチド複合体をつくるとき有用である。結局、本発明のペプチド複合 体は、また、完全なまたは自然のタンパク質の対応する領域の機能的または活性 をまねる。結局、それらは、ここに記載するように、それらに対して向けられＩ ；抗体の産生に使用することができる。本発明により産生された合成配位子は、 タンパク質の結合部位の研究においてことに有用である。さらに、アルファ／ベ ータＢＰＴＩに対してレイズされた抗体は、アルツハイマー病のアミロイドタン パク質の検出に使用することができ、こうして、このタンパク質に対して向けら れた診断および免疫治療学的試薬において使用することができる。

同等の実施態様 当業者は、日常の実験を越えない実験を使用して、ここに詳細に記載した本発明 の特定の実施態様と多くの同等の実施態様を認識するが、あるいは確認すること ができる。このような同等の実施態様は、次の請求の範囲の範囲内に包含される ことを意図する。

残基４３〜５８からのＢＰＴＩの配列 化学シフ）　（ＰＰＭ）（ＴＭＳに関する）アルファーベータ複合体（ｐｌ−１ ５）Ｔ（’Ｃ） ナノメーター ナノメーター アルファの温度依存性（ｐＨ６，５） Ｔ（’Ｃ） ベータの温度依存性（ｐＨ６，５） アルファーベータ複合体（ｐＨ６，７）Ｔ　（’Ｃ） アルファーベータ複合体（ｐＨ６，７）Ｔ　（’Ｃ） アルファ／ベータ抗体の産生４／２８ ＣＯＮＣ，１２３４ 希釈 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年３月５日ｔ ｌ：、。

特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０３０３３ ２、発明の名称 増強された安定性を有するペプチド複合体３、特許出願人 住　所　アメリカ゛合衆国マサチュセツツ州０２１４２ケンブリッジ・ナインケ ンブリッジセンター（番地なし）４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９８９年９月２６日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 本発明は、少なくとも２つの短いペプチドから構成され、それらの各々が問題の タンパク質の選択したセグメントのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列（−次 配列）を有し、そして自然または完全なタンパク質中の領域が相互作用するのと ちょうど同じよにそれらが相互作用するような方法で接合されている、ペプチド 複合体に関する。本発明は、また、それらを調製する方法および使用する方法に 関する。このようなペプチド複合体は、合成ワクチンとして、診断試験において 使用すべき抗体をレイズするときの合成配位子として、薬物（例えば、ホルモン 、酵素）として、エピトープのマツピングにおいておよびタンパク質の設計にお いて有用である。

本発明のペプチド複合体の開発における重要な要素は、少なくとも２つの短いペ プチド単位を、共有結合により、生ずる複合体の安定性を増強する手段として、 接合することである。複合体中のペプチド単位のアミノ酸配列は、自然のまたは 完全なタンパク質中で相互作用する規定した二次構造の領域のアミノ酸配列に相 当する。本発明のペプチド複合体からなる短いペプチド単位は、後述する方法に より、完全なタンパク質中で起こる相互作用に基づいて選択される。この方法で 選択されるペプチド単位は、配列が、規定した二次構造（例えば、アルファーら せん、ベーターシート）を形成する完全なタンパク質中のセグメントに相当する 。

ペプチド単位は、また、ペプチド複合体の安定性を増強する完全なタンパク質の 他のセグメントに相当する配列を包含する。例えば第１及び第２の短いペプチド は、ペプチド複合体の安定性を単独または結合して増強する完全なタンパク質の 第３及び第４のセグメントのアミノ酸配列に各々相当する追加のアミノ酸配列を 含有する。

請求の範囲 １１少なくとも２つの短いペプチド単位を共有結合することからなり、前記ペプ チド単位の各々は問題の完全なタンパク質中のアミノ酸配列にアミノ酸配列が相 当し、前記アミノ酸配列は前記問題の完全なタンパク質中で規定した二次構造を 形成し、完全なタンパク質中の前記アミノ酸配列はそのタンパク質の一次構造中 に隣接しない２つの短いペプチド単位に相当する、ペプチド複合体をつくる方法 。

２、上記第１項記載の方法により産生されたペプチド複合体。

３、各短いペプチド単位は、はぼ５アミノ酸残基からほぼ３０アミノ酸残基まで の長さである、上記第１項記載の方法。

４、上記第３項記載の方法により産生されたペプチド複合体。

５、共有結合はジサルファイド結合である、上記第１項記載の方法。

６、上記第５”Ｊ記載の方法により産生されたペプチド複合体。

７、少なくとも２つの短いペプチド単位からなるペプチド複合体をつくる方法で あって、各短いペプチド単位のアミノ酸配列は問題の完全なタンパク質のセグメ ントのアミノ酸配列に相当し、そして水溶液中で安定な構造を有し、前記方法は 少なくとも第１の短いペプチド単位および第２の短いペプチド単位を接合するこ とからなり、前記第１の短いペプチド単位は問題の完全なタンパク質中でアルフ ァーらせんに折り重なる問題の完全なタンパク質中の第１セグメントに相当し、 前記問題の完全なタンパク質中でベーターシートに折り重なる問題の完全なタン パク質中のｗｉ２セグメントに相当し、第１領域および第２領域は問題の完全な タンパク質中で互いに相互作用する、少なくとも２つの短いペプチド単位からな るペプチド複合体をつくる方法。

２５、第２ペプチド単位は、さらに、ペプチド複合体の安定性を増強する問題の タンパク質の部分のアミノ酸配列に相当するアミノ酸を含む、上記第２４項記載 のペプチド複合体。

２６、少なくとも２つの短いペプチド単位からなるペプチド複合体であり、前記 単位の各々は、規定した二次構造を形成する問題の完全なタンパク質のセグメン トのアミノ酸配列にアミノ酸配列が相当し、短いペプチド単位は共有結合により 接合されている、ワクチン。

２７、上記第２３項記載のペプチド複合体に結合することができる抗体。

２８、試料を上記第２３項記載のペプチド複合体を結合することができる抗体と 、抗体およびアミロイドタンパク質の前駆体の結合を起こすｔ；めに適当な条件 下に、接触させることからなる、アミロイドタンパク質の前駆体を検出する方法 。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも２つの短いペプチド単位を共有結合することからなり、前記ペプ チド単位の各々は問題の完全なタンパク質中のアミノ酸配列にアミノ酸配列が相 当し、前記アミノ酸配列は前記問題の完全なタンパク質中で規定した二次構造を 形成する、ペプチド複合体をつくる方法。 ２、上記第１項記載の方法により産生されたペプチド複合体。 ３、各短いペプチド単位は、ほぼ５アミノ酸残基からほぼ３０アミノ酸残基まで の長さである、上記第１項記載の方法。 ４、上記第３項記載の方法により産生されたペプチド複合体。 ５、共有結合はジサルファイド結合である、上記第１項記載の方法。 ６、上記第５項記載の方法により産生されたペプチド複合体。 ７、少なくとも２つの短いペプチド単位からなるペプチド複合体をつくる方法で あって、各短いペプチド単位のアミノ酸配列は問題の完全なタンパク質のセグメ ントのアミノ酸配列に相当し、そして水溶液中で安定な構造を有し、前記方法は 少なくとも第１の短いペプチド単位および第２の短いペプチド単位を接合するこ とからなり、前記第１の短いペプチド単位は問題の完全なタンパク質中でアルフ ァーらせんに折り重なる問題の完全なタンパク質中の第１セグメントに相当し、 前記問題の完全なタンパク質中でペーターシートに折り重なる問題の完全なタン パク質中の第２セグメントに相当し、第１領域および第２領域は問題の完全なタ ンパク質中で互いにに相互作用する、少なくとも２つの短いペプチド単位からな るペプチド複合体をつくる方法。 ８、上記第７項記載の方法により産生されたペプチド複合体。 ９、第１の短いペプチド単位および第２の短いペプチド単位の各々は、ほぼ５ア ミノ酸残基からほぼ３０アミノ酸残基までの長さである、上記第７項記載の方法 。 １０、上記第９項記載の方法により産生されたペプチド複合体。 １１、短いペプチド単位は共有結合により接合されている、上記第９項記載の方 法。 １２、上記第１１項記載の方法により産生されたペプチド複合体。 １３、水溶液中で、問題のタンパク質の領域の構造に類似する安定な構造を有す るペプチド複合体をつくる方法であって、工程：ａ、少なくとも第１の短いペプ チド単位および第２の短いペプチド単位を選択し、第１の短いペプチド単位は問 題のタンパク質の第１領域のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有し、そし て第２の短いペプチド単位は問題のタンパク質の第２領域のアミノ酸配列に相当 するアミノ酸配列を有し、第１領域および第２領域は問題のタンパク質中で互い に相互作用し、そして ｂ、第１の短いペプチド単位および第２の短いペプチド単位を少なくとも１つの 共有結合により接合し、こうして２つのペプチド単位は問題のタンパク質中の第 １領域および第２領域の間の相互作用に類似する方法で互いに相互作用する、 からなる方法。 １４、少なくとも２つのペプチド単位からなり、水溶液中で安定な構造を形成す るペプチド複合体をつくる方法であって、ａ、ほぼ５〜ほぼ３０アミノ酸残基の 第１ペプチド単位、その配列は少なくとも１つのシステイン残基を含み、そして 問題のタンパク質の規定した二次構造に相当する、および ｂ、ほぼ５〜ほぼ３０アミノ酸残基の第１ペプチド単位、その配列は少なくとも １つのシステイン残基を含み、モしてａ）におけるのと同一の問題のタンパク質 の規定した二次構造に相当する、を接合することからなり、第１ペプチド単位お よび短いペプチド単位は少なくとも１つのジサルファイド結合により第１ペプチ ド単位中のシステイン残基および第２ペプチド単位中のシステイン残基の間で接 合される、前記ペプチド複合体をつくる方法。 １５、上記第１４項記載の方法により産生されたペプチド複合体。 １６、少なくとも２つの短いペプチド単位からなるペプチド複合体をつくる方法 であって、ジサルファイド結合により、ａ、ほぼ１４アミノ酸残基の第１ペプチ ド単位、第１ペプチド単位のアミノ酸配列はウシ膵臓トリプシン阻害因子のセグ メントのアミノ酸配列に相当し、前記セグメントは少なくとも１つのシステイン 残基を含み、そしてウシ膵臓トリプシン阻害因子中のアルファーらせんに折り重 なる、および ｂ、ほぼ１４アミノ酸残基の第２ペプチド単位、第２ペプチド単位のアミノ酸配 列はウシ膵臓トリプシン阻害因子のセグメントのアミノ酸配列に相当し、前記セ グメントは少なくとも１つのシステイン残基を含み、そしてウシ膵臓トリプシン 阻害因子中のベーターシートに折り重なる、接合することからなる、前記ペプチ ド複合体をつくる方法。 １７、上記第１６項記載の方法により産生されたペプチド複合体。 １８、少なくとも２つの短いペプチド単位：３）第１の短いペプチド準位、その アミノ酸配列は問題のタンパク質中で規定した二次構造を形成する問題のタンパ ク質の第１セグメントのアミノ酸配列に相当する、および ｂ）第２の短いペプチド単位、そのアミノ酸配列はａ）におけるのと同一の問題 のタンパク質中で規定した二次構造を形成する問題のタンパク質の第２セグメン トのアミノ酸配列に相当する、からなり、第１の短いペプチド単位および第２の 短いペプチド単位は共有結合により接合されている、ペプチド複合体。 １９、２つの短いペプチド単位の各々はほぼ５アミノ酸残基からほぼ３０アミノ 酸残基までの長さを有し、そして各々は少なくとも１つのシステイン残基を含み 、そして共有結合は第１の短いペプチド単位中のシステイン残基および第２の短 いペプチド単位中のシステイン残基の間のジサルファイド結合である、上記第１ ８項記載のペプチド複合体。 ２０、第１の短いペプチドのアミノ酸配列は、さらに、ペプチド複合体の安定性 を増強する完全なタンパク質の第３セグメントのアミノ酸配列に相当するアミノ 酸を含み、第２の短いペプチドのアミノ酸配列は、さらに、ペプチド複合体の安 定性を、単独であるいは組み合わせで、増強する完全なタンパク質の第４セグメ ントのアミノ酸配列に相当するアミノ酸を含む、上記第１８項記載のペプチド複 合体。 ２１、ａ、ほぼ５アミノ酸残基からほぼ３０アミノ酸残基までの長さを有し、問 題のタンパク質中でアルファーらせんまたはペーターシートを形成する問題のタ ンパク質のセグメントのアミノ酸配列に相当するアミノ酸を有する、第１ペプチ ド、およびｂ、ほぼ５アミノ酸残基からほぼ３０アミン酸残基までの長さを有し 、ａ）におけるのと同一の問題のタンパク質中でアルファーらせんまたはペータ ーシートを形成する問題のタンパク質のセグメントのアミノ酸配列に相当するア ミノ酸を有する、第２ペプチド、からなり、第１ペプチドおよび第２ペプチドは 少なくとも１つの共有結合により接合されている、ペプチド複合体。 ２２、ａ、ほぼ１４アミノ酸残基の長さを有し、ウシ膵臓トリプシン阻害因子中 でアルファーらせんを形成し、そしてシステイン残基を含む、ウシ膵臓トリプシ ン阻害因子の選択したセグメントのアミノ酸配列に相当するアミノ酸を有する、 第１ペプチド、およびｂ、ほぼ１４アミノ酸残基の長さを有し、ウシ膵臓トリプ シン阻害因子中でペークーシートを形成し、そしてシステイン残基を含む、ウシ 膵臓トリプシン阻害因子の選択したセグメントのアミノ酸配列に相当するアミノ 酸を有する、第２ペプチド、 からなり、第１ペプチドおよび第２ペプチドはジサルファイド結合により接合さ れている、ペプチド複合体。 ２３、ａ、次のアミノ酸配列を有する第１ペプチド：【配列があります】 お よび ｂ、次のアミノ酸配列を有する第２ペプチド：【配列があります】、 からなり、第１ペプチドおよび第２ペプチドはジサルファイド結合により接合さ れている、ペプチド複合体。 ２４、少なくとも次の： ａ、５〜３０アミノ酸残基の第１ペプチド単位、前記単位のアミノ酸配列は問題 の完全なタンパク質の第１セグメントのアミノ酸配列に相当し、前記セグメント は完全なタンパク質中で規定した二次構造を形成する第１部分およびペプチド複 合体の安定性を増強する第２部分を含む、および ｂ、５〜３０アミノ酸残基の第１ペプチド単位、前記単位のアミノ酸配列は問題 の完全なタンパク質の第２セグメントのアミノ酸配列に相当し、前記セグメント は完全なタンパク質中で規定した二次構造を形成する、 からなり、前記第１ペプチド単位および第２ペプチド単位は共有結合されている 、ペプチド複合体。 ２５、第２ペプチド単位は、さらに、ペプチド複合体の安定性を増強する問題の タンパク質の部分のアミノ酸配列に相当するアミノ酸を含む、上記第２４項記載 のペプチド複合体。 ２６、少なくとも２つの舞いペプチド単位からなるペプチド複合体であり、前記 単位の各々は、規定した二次構造を形成する問題の完全なタンパク質のセグメン トのアミノ酸配列にアミノ酸配列が相当し、短いペプチド単位は共有結合により 接合されている、ワクチン。 ２７、上記第２３項記載のペプチド複合体に結合することができる抗体。 ２８、アミロイドタンパク質の前駆体のプロテアーゼ阻害因子ドメインに結合す ることができる抗体。 ２９、試料を上記第２３項記載のペプチド複合体を結合することができる抗体と 、抗体およびアミロイドタンパク質の前駆体の結合を起こすために適当な条件下 に、接触させることからなる、アミロイドタンパク質の前駆体を検出する方法。