JPH03500482A - ホスホエノールピルベート カルボキシキナーゼに係る遺伝子のプロモーターの制御下における、遺伝子導入動物の外来遺伝子の発現の食餌およびホルモンによる調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

に係る遺伝子のプロモーターの制御下における、遺伝子導入動物の外来遺伝子の 発現の食餌およびホルモンによる調節 関連出願 本出願は現在、審査中であり、ここに引用して組入れる、１９８７年６月１６日 付出願のＳｅｒ、　Ｎｏ、０７／６２．６５４の一部継続出願である。 優先権が３５　Ｕ、Ｓ、Ｃ，１２０に基づき主張される。 発明の背景 発明の分野 本発明は遺伝子導入動物および組織培養細胞における外来遺伝子の発現の制御に 関する。 清報開示 農業において動物が特定の特質［ｔｒａｉｔ］を有することが、しばしば望まれ る。伝統的にこれは、この特質の交配によって達成されていた。しかし交配には 多くの欠点がある。すなわち動物ラインで所望の特質を定着させるためには、何 世代もが必要とされる。交配された動物が最終的にその特質を獲得した時には、 これらの動物はまた、別の望ましからざる特質をも取得してしまう。特定の各動 物が所望の特質を獲得することにつき保障はない。 そこで動物の表現型操作に関する、よりよく制御された手段が探求されてきた。 組換えＤＮＡ技術の発展は、このゴールを達成するのに有用な道を提供した。理 論的には、ある特質が動物に欠落している特定の遺伝子と組合わされている場合 には、この遺伝子を動物に導入することができ、これによってその特質を持つよ うに、その表現型を改質することが可能である。勿論、克服されなければならな い多くの障害がある。特定の特質と組合わされている遺伝子を同定しなければな らず、また単離しなければならない。適当な調節配列をこれらの遺伝子に機能的 に結合させ、特質を適度に発現させなければならない。生じるユニットは受容動 物の細胞中に安定に導入されなければならない。その時、寅にその時にだけ「導 入遺伝子Ｊ　（ｔｒａｎｇｅｎｅ）は意図したとおりに機能することができる。 導入遺伝子は、遺伝子導入動物において、選ばれたプロモーター／調節ドメイン の制御の下に発現させることができる。このプロモーター／調節ドメインはその 遺伝子が構造として（一定の比率および一定のレベルで）、発現されるか否か、 あるいは遺伝子が異なる環境刺激によって、沈黙しているか、または誘導される か、を決定する。シトゾールホスホエノールビルベート　カルボキシキナーゼ（ Ｐ　Ｅ　Ｐ　ＣＫ　ＸＥ　Ｃ４，１，１−３２）プロモーターは、後者のタイプ のプロモーター／調節ドメインの例である。 外来遺伝子が本質的に発現される場合には、この遺伝子の相当するタンパク質生 成物の一定の発現が宿主動物に対して望ましくない作用を有することがある。こ れは、遺伝子のプログラムされＩ；発現が通常の発育に必要である場合に、胚形 成期間中に特に有害である。従って、誘導性まＩ；は抑制性のプロモーターによ って、遺伝子の発現を制御することが望まれる。さらにまた、これらの変更は容 易に行われることから、食餌の変更に対して、制御可能な様相で応答できるプロ モーターを使用することが望ましい。 かなりの誘導しうるプロモーターが知られている。このようなプロモーターの一 つは、ＵｔｔｅｒおよびＫｕｒａｈａｓｈｉにより１９５４年に発見されｔ；糎 新生酵素であるＰＥＰＣＫのシトゾール型（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ　ｆｏｒｍ）の 遺伝子の発現を調節する。この酵素は肝臓、腎臓皮質および白色脂肪組織で高い 特異活性を有し、さらに低いレベルでは肺および空腸で特異活性を有する。Ｈａ ｎｓｏｎおよびＧａｒｂｅｒによるＡｍ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｎｕｔｒｉｔｉ ｏｎ、　２５　：　１０１０（１９７２）　；　ＵｔｔｅｒおよびＫｕｒａｈａ ｓｈ　ｉによるＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２０７　：　２８７（１９５４ ）。ＰＥＰＣＫのシトゾール型およびミトコンドリア型は、両方ともに、異なる 核遺伝子によってコードされる。両型のＰＥＰＣＫの発現はともに、種特異的変 異である。ラットおよび鶏における、この酵素のシトゾール型の遺伝子は単離さ れ、特徴付けられている。Ｙｏｏ−Ｗａｒｒｅｎ等によるＰＮＡＳ　８０　：　 ３６５６−６０（１９８３Ｘラツト）およびＲｏｄ、　Ｙｏｏ−Ｗａｒｒｅｎお よびＨａｎｓｏｎによる、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。 ２５９　：　１５６０９〜１５６１４（１９８４Ｘ鶏）。 糖新生は全ての背椎動物において、グルコース恒常性を支持するために、非ヘキ ソース前駆体をグルコースに変換するプロセスである。これは、肝臓および腎臓 皮質だけで生起する。うクテートからの糖新生（Ｃｏｒｉサイクル）は１３の酵 素を包含し、そしてまた、クエン酸サイクルにおいて、または解糖においても役 割を演じる数種の反応と、このプロセスに特異的である他の反応とを包含する。 グルコース合成の主要前駆体は、乳酸に加えて、ピルビン酸、アミノ酸（たとえ ば、アラニンまたはグルタミン）およびグリセロールである。この経路は、飢餓 期間中または糖尿病中に、刺激され、そして食餌炭水化物によって弱められる。 糖新生の主要ホルモン制御体は糖新生を刺激するグルカゴン（これはｃＡＭＰを 介して作用する）およびグルコースの合成を抑制する、インシュリンである。解 糖からのグルコースの新規合成（糖新生）を、肝臓および筋肉にグリコーゲンと して貯蔵されている、予め形成されているグルコースの分解と区別することは重 要である。ＰＥＰＣＫは糖新生経路において最初に行われるプロセスであり、こ のプロセスにおけるベース設定酵素（ｐａｃｅ−ｓｅｔｔｉｎｇ）である。この 酵素のための遺伝子の格別の誘発可能性は、ＰＥＰＣＫがグルコース恒常性を維 持する際に演じる重要な調節位置に反映する。 肝臓において、ＰＥＰＣＫはグルカゴン、エビ不フィリン、ノルエピネフィリン 、グルココルチコイド類およびチロキシンによって誘発され、そしてインシュリ ンによって脱誘発される。 腎臓においては、アシド−シスまたはグルココルチコイド類はＰＥＰＣＫ発現を 高め、他方、アルカロシスはＰＥＰＣＫ合成を阻害する。さらに、脂肪組織にお いては、ノルエピネフィリンおよびエビ不フィリンはＰＥＰＣＫレベルを押し上 げ、他方、インシュリンおよびグルココルチコイド類はこの酵素のレベルを減少 させるｏ　Ｔｉｌｇｈｍａｎ等によるＧｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ：　Ｉｔ ｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　５ｐｅｃｉｅｓ、　Ｈ ａｎｓｏｎおよびＭｅｈ１ｍａｎｇ＠（１９７６）の第２章として発表されたｒ Ｈｏｒ＋ｎｏｎａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｐｈｏｓｐｈ。 ｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　Ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ　（Ｇ　Ｔ　Ｐ　）　 ｉｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｉ”１ｓｓｕｅｓＪの表１参照。 ＰＥＰＣＫ遺伝子発現のホルモンによる調部は組織特異性である。（ｉ（ａｎｓ ｏｎおよびＭｅｈｌｍａｎによる前記文献参照）。しかしながら、この遺伝子の 組織特異性に対し、あるいは肝臓および脂肪組織のような組織中の不ルモンに対 する応答の差違に対し、応答できる配列に関しては僅かな情報しかない。 ＰＥＰＣＫの活性に対する食餌効果は知られている。２４時間の飢餓は酵素活性 の３倍の増加をもたらし、これは炭水化物含有量の高い食餌（たとえば、グルコ ース、７ラクトースおよびグリセロール）によって逆行され、あるいは高タンパ ク質食餌の再供給によって悪化される。ＳｈｒａｇＯ等によるＪ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、、　２３８　：　３１８８（１９６３）。ＰｅｒｅｔおよびＣｈａ ｎｅｚによるＪ、　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ。 １０６　：　１０３（１９７６）−二よれば、高タンパク質食餌は哺乳動物（ラ ット）に３いて、肝ＰＥＰＣＫの活性を誘発させ、食餌中のタンパク質含有量が 増加するほど、この活性は増大した。もう一つの糖新生酵素である、ピルベート 　カルボキシラーゼは、この方法では影響されなかった。 哺乳動物において、母親からの血液供給は出生時点で止められ、過渡低血糖が生 じる。これは、血漿インシュリンの濃度を降下させ、そしてグルカゴンのレベル を高める。この結果として、ＰＥＰＣＫの初期発現を誘発する、肝ｃＡＭＰの濃 度は増加する。この酵素の出現によって、糖新生経路は完成し、これによって、 肝糖新生が開始される。 シトゾール型ＰＥＰＣＫをコードする遺伝子の発現を天然で調節するプロモータ ーの配列はＷｙｎｓｈａｖ−Ｂｏｒ　ｉｓ等によるＪ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｂｅｍ、、　２５９　：　１２１６１（１９８４）の第１図に示されており、 これをここに引用記載する。ホルモンによって誘発された動物の肝臓からの核内 のＰＥＰＣＫ遺伝子の転写率は高いことが知られており、これは熱−シオック遺 伝子に関して報告されている転写率に匹敵する。Ｍｅｉｓｓｎｅｒ等による前記 文献（１９８３）の第Ｉ表参照。 ｒＰＥＰｃＫプロモーター」のある調節ドメインは同定されている。Ｗｙｎｓｈ ａｖ−Ｂｏｒｉｓ等によるＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６１　：　９７ １４（１９８６年７月２５日）　；　５ｈｏｒｔ等によるＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、　２６１：９７２１（１９８６年７月２５日）。このＰＥＰＣＫプロモ ーターはヘルペスウイＪレスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子およびトランスフ ェクションされたヘパトーマ（ＦＴＯ−２Ｂ）細胞中のアミノ−３′−グリセリ ンホスホトランスフェラーゼ（Ａ　Ｇ　Ｐ　Ｔもしくはネオレジスタンス）の両 方の発現の制御に使用されている。ＴＫおよびＡＧＰＴの合成は両方ともに、ｅ ＡＭＰおよびデキサメタソンに対して応答性である。Ｉｄ、；　Ｗｙｎｓｈａｖ −Ｂｏｒｉｓ等によるＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　４（２）　：　１０４（ １９８６）。 酵素（ヘキソキナーゼ１および２、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホグリ セレート　キナーゼ、チロ−スホスフェートイソメラーゼ、ホスホグリセレート 　ムターゼ、ピルベートキナーゼ、ホスホ７ラクトキナーゼ、エノラーゼ、７ラ クトーズ１．６−ジホス７エートアラドラーゼ、グリセルアルデヒド３−ホスフ ェート　デヒドロゲナーゼ、および解糖調節タンパク質）をコードする遺伝子を 制御する酵母プロモーターの使用を唱道した。これらのプロモーターは異種遺伝 子を結合し、形質転換した酵母細胞中の相当する遺伝子の発現の制御に使用され る。 Ｋａｗａｓａｋｉは、一般的方法として、適当な栄養培地を選択することにより 、その発現を調節することを引用している。しかしながら、彼はいずれかの組換 え遺伝子の発現および定められた遺伝子産物の産生については、酵母プロモータ ーおよび酵母細胞に制限されると述べている。この遺伝子産物はまた、これらが 酵母細胞から放出されるものであることによって、不都合にも、グリコジル化さ れてしまう。 さらにまた、この解糖できる酵母プロモーターは、完全動物では使用できず、ま た酵母以外の有機体では発現することができない。 Ｋｉｎｇｓｍａｎは、米国特許４，６１５．９７４において、イースト由りアル ファ　インターフェロン発現の制御に解糖経路プロモーターである酵母ホスホグ リセレート　キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを特定的に使用している。この生 成はグルコースを培養培地中に導入することによって誘発されている。 しかしながら、Ｋａｗａｓａｋｉ　またはＫ１１ｇ５＋ｎａｎのどちらにも、完 全動物の細胞における導入遺伝子の発現に対する食餌の使用、あるいは出生後に だけ実質的に活性である遺伝子系の選択に関しては検討されていない。 Ｋｏｎｒａｄは、米国特許４，４９９．１８８において、ＴＲＰプ０−Ｅ−一タ ーの制御下における形質転換細菌細胞中の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺 伝子の発現に関して述べている。この培地は初期に、トリプトファンに冨むもの であり、これによって、その遺伝子を抑制している。細菌の生育はトリプトファ ンを消費し、その結果として、遺伝子にスイッチが入る。しかし、このｔｒｐプ ロモーターの使用は原核細胞に制限されている。 Ｐａ１ｍ１ｔｅｒは、米国特許４，５７９．８２１において、組換えｒ　Ｄ　Ｎ 　Ａベクターを微量注入した胚から成長した成熟マウスにおけるヘルペス　ウィ ルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子発現を開示している。このベクターは、マ ウスメタロチオネイン−Ｉ（ＭＴ−■）プロモーターに作動できるような状態で 結合しているＴＫ遺伝子を含有する。このプロモーターはカルシウムのような重 金属またはデキサメタシンのようなステロイドホルモンの投与により調節可能で ある。遺伝子導入動物に重金属を供給することによって、このプロモーターまた はマウスＭＴ−ｎプロモーターを誘発させる方法は格別の急性および慢性の毒性 および奇形原性によって、本質的な制限を受ける。さらにまた、ＭＴ−Ｉプロモ ーターは、ＰＥＰＣＫプロモーターとは異なり、胎児発育中に活性であるので、 結合した外来遺伝子の胎内発現は遺伝子導入胎児に対して有害な作用を及ぼす。 ＰＥＰＣＫプロモーターはデキサメタシンを使用して誘発させることができるが ［Ｗｙｎｓｈａｗ−ｂｏｒｉｓ等（１９６６）参照］、グルココルチコイドに対 するよりも肝ｃＡＭＰに対して実質的により応答性である。確かに、肝ＰＥＰＣ Ｋ活性は副腎摘出動物において、飢餓により誘発させることができるが、栄養充 分の食餌を食べている。副腎摘出動物にデキサメタシンを注入しても、ＰＥＰＣ Ｋ活性は誘発されない。Ｒｅ５ｈｅｆ等によるＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 ２４４　：　５５７７−８１（１９６９）。 ＰＥＰＣＫプロモーターは、ＭＴｉＴｉブロモ−ターキサメタシンによる誘発に 比較して、さらに強力にかつまた容易に、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐにより誘発される。さ らに、遺伝子導入動物では、ＰＥＰＣＫプロモーターの発現は動物食餌のタンパ ク質含有量および炭本化物含有量の調節によって容易に変更される。 牛成長ホルモンまたは関連種の発現に、組換えＤ　Ｎ　Ａ技術を使用することが 格別に重要であったことは、下記の参考刊行物によって証明されている： ＭｉｌｌｅｒによるＥＰ出！　４７．６００；ＲｏｔｔｍａｎによるＥＰ出願６ ７．０２６；Ｄｅ　ＢｏｅｒによるＥＰ出！　７５．４４４；Ｄｅ　Ｇｅｅｔｅ ｒによるＥＰ出願８５．０３６；ＢｕｅｌｌによるＥＰ出願１０３．３９５；Ｒ ｏＬｔｍａｎによるＥＰ出願１１２．０１２；ＡｖｉｖによるＥＰ出！　１３１ ．８４３；ＨｓｉｕｎｇによるＥＰ出！　１５３．１２３：Ｋｏｐｃｈｉｃｋに よるＥＰＨ［１６１，６４０；Ｋｒ１ｖｉによるＥＰ出願１９３．５１５；Ａｖ ｉｖによるＧＢ　２．０７３．２４５：およびＦｒａｓｅｒによるＵＳ　４，４ ４３，５３９゜ＲｏＬｔｍａｎによるＥＰ出願６７．０２６は特に注目され、こ の出願にはｂＧＨ遺伝子のｃＤＮＡ複製を有する寄託されているプラスミド（Ｐ ＬＧ２３）が記載されており、モしてＥＰ出願１１２．０１２には、ゲノムＢＧ Ｈのヌクレオチド配列が記載されている。しかしながら、これらの刊行物には、 ｂＧＨ発現の制御にＰＥＰＣＫプロモーターを使用することは示唆されていない 。 本発明の要旨 我々は、ＰＥＰＣＫプロモーターが、遺伝子導入動物の選ばれ！二組織田で、Ｐ ＥＰＣＫ以外の遺伝子の発現の調節に、特−別の有用１生を有することを見い出 した。 第一に、動物の食餌を変えることによって、外来的に制御することができる。動 物に、高タンパク質で低炭水化物の食餌を与えると、グルカゴンおよび（または ）エビネフイリンの分泌が生じる。これら２種のホルモンは、目漂組織のｃＡＭ Ｐのレベルを高め、これによって、ＰＥＰＣＫグロモーター活性が次いで刺激さ れる。食餌中炭水化物が増加するほど、インシュリンレベルは高められ、ＰＥＰ ＣＫ選伝子の発現は押えられる。 食餌操作はホルモン処置に比較して、より簡単で、経済的で、そして宿主動物に 対する潜在的有害性が少ない。 第二に、ＰＥＰＣＫプロモーターは、出生の互後まで有意には誘発されない。す なわち、発育甲の胎児はＰＥＰＣＫプロモーターに結合している異種構造遺伝子 の発達期間中、発現と戦う必要がない。１！ｌ：寅として、ＰＥＰＣＫ遺伝子の 発現は母親からのグルコースの供給が、ヘソの賭の切断によって止められた後に だけ關始される。従って、本発明のＰＥＰＣＫ制御遺伝子発現系は、発達甲の胚 および胎児が結合した構造遺伝子の不適当な発現から防護されるという利点を有 する。 第三に、ＰＥＰＣＫプロモーターに結合した遺伝子は、正常では高レベルのＰＥ ＰＣＫを発現する細胞、すなわち肝臓および腎臓の細胞甲でだけ発現が認められ た。我々は、この組織特異性がこのプロモーターの近接４６０ｂｐにより付与さ れるものと考える。 第四に、ＰＥＰＣＫプロモーターは、誘発された時に、非常に高レベルの発現に よって特徴付けられる。Ｍｅｉｓｎｅｒ等によれば（１９８３年）、餓死したラ ットの肝臓中のＰＥＰＣＫ　ｍＲＮＡの転写工は３　、５００ｐｐｍであった。 これに対してドロソフイラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）の熱シＨ”／り遺伝子 では３　、０００ｐｐｍであり、中下垂体前葉のと成長享ルモンｍＲＮＡでは２ ７０ｐｐｍであり、そしてステロイド処置したラットの肝臓のメタロチオネイン ｍＲＮＡでは２６０ｐｐｍである。ＰＥＰＣＫに係るｍＲＮＡは約３０分の半減 期を有し、従って、ｍ　ＲＮ　Ａレベルは、転写レベルにほとんど依存する。 ＰＥＰＣＫプロモーターは遺伝子は遺伝子導入動物における外米遺伝子の発現の 制御に特に有用であるが、このプロモーターはまた、細胞培養における真核生物 遺伝子による遺伝子の発現の制御に有用である。この場合には、その容易な誘発 性および高い脱誘発性、ならびに高いブロモ−ター強さがその根本的な利点であ る。 外来遺伝子のインビトロ発現の場合には、ＰＥＰＣＫプロモーターは好ましくは 、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐによって誘発させ、そしてインシュリンによって脱誘発される 。すなわち、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐとインシュリンとは、遺伝子発現を最終的に制御す るための１組の誘発体−抑制体系である。 本発明のその他の利点は、不明細書の記載、図面および特許請求の範囲を考察す ることによって明白になるであろう。特許請求の範囲は一連の好適態様を表わす ものとして、明細ｗｒｃｐに例月することによって、ここに組入れられる。 図面の簡単な説明 第１９は、シトゾール型（１）およびミトコンドリア型（２）のＰＥＰＣＫ酵素 の位置を示す、糖新生経路の図表である。 第２図は、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子を有する遺伝子導入マウスおよび同腹の仔 （白色動物）を示すものである。左側の大きい黒色の動物は、そのゲノム守に安 定して組込まれているキノラＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子を含有する。 第３刃は、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ導入遺伝子を含有するマウスの成長速度を示すも のである。第２図に示されている動物ＴＧ：０ＰＣＫｂＧＨコ　９Ｆ１は０．７ ５ｍｇ／血清ｍＱで中成長ホルモンを示し、その同腹の仔のサイズの２倍に成長 した。 第４又は、遺伝子導入マウスにおける血清中のｂＧＨレベルに対する、高炭水化 物食餌効果、高タンパク質食餌効果およびＢｔ、−ｃＡＭＰ投与の効果を示して いる。パネルＡでは、低レベルの血清ｂＧＨを示す、代表的遺伝子導入マウスを 高炭水化物食餌状態に１週間、維持する。この動物に、次いで、炭水化物を含ま ない高タンパク質食餌を１週間与えた。指示間隔で、血液を尾静脈から採取し、 血清：ｂｃｕのレベルを測定した。 パネルＢでは高レベルの血清ｂＧＨを示す代表的な遺伝子導入マウスを２４時間 、飢餓状態におき、次いで高炭水化物食餌を１週間与えた。この動物に、次いで 炭水化物を含有しない高タンパク質食餌を、パネルＡに記載のように与えた。パ ネルＣでは、２−４ｎｙ／ｍＱ−１、Ａｕｇ／ｍＱの範囲の血清濃度でｂＧＨを 示す、４匹の遺伝子導入マウスに、３０分の間隔で３回連続して、Ｂｔ。 ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐおよびテオフィリン（両方ともに、３０＋ｎｇ／ｋｇ）を注射し た。９０分後に、マウスの尾静脈から採血し、血清中のｂＧＨ濃度を測定した。 血清中のｂＧＨレベルの変化は「ホールドインクリーズＪ　（ｆｏｌｄ　１ｎｃ ｒｅａｓｅ）で表わす。パネルＤでは、遺伝子導入マウスをパネルＣに記載のと おりに処置し、血清０ｂＧＨ濃度の変化を測定した。 第５図には、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子を含有する遺伝子導入マウスにおける中 成長ホルモンｍ　ＲＮ　Ａの組織特異的発現が示されている。ｂＧＨｍＲＮＡは 第６図に示されているｂＧＨ構造遺伝子およびＰＥＰＣＫプロモーターを含有す るＤＮＡ区分を、プローブとして使用するノーザン　ブロッティング法により分 析した。各列は、それぞれ、遺伝子導入マウスから採取した、種々の組織から抽 出した総ＲＮ　Ａ　３０ｕｇを含有する。キメラＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子によ って産生されたｍ　ＲＮ　Ａ　ｌｅｔ　ＰＥＰＣＫ　ｍＲＮＡ　７３ｂｐおよび ｂＧＨをコードするＲＮＡ　１．Ｏｂｐを含有する。これら両種のｍＲＮＡの位 置は分子サイズマーカーとともに、図にｌ接に示されている。パネルＡには、高 レベルのｂ　Ｇ　Ｈ（７５０ｎｇ／血清ｍＱ）を示す遺伝子導入マウスの結果が 列１〜７で示されている；１−肝臓；２−肺臓；３−腎臓；４−心臓；５−肺臓 ；６−脳；７−腸。パネルＢには、低レベルのｂ　Ｇ　Ｈ（１０ｎｇ／血清ｍＱ ）を示す遺伝子導入マウスの結果が示されており、列１〜７はパネルＡと貝−の 意味を有する。 第６図には、ｐ　Ｐ　ＣＧ　Ｈ溝築が示されている。ＰＥＰＣＫプロモーター／ 選伝子のＡ−５４８〜＋７３７ラグメントをｐｃＨ＝でクローン化し、ｐＰＣｂ ＧＨを得る。 第７図には、ＡＧＰＴまたはｎｅｏの構造遺伝子に結合したＰＥＰＣＫプロモー ターを含有するキメラ遺伝子の発現が示されている。第８図に示されている感染 性レトロウィルスから生じたｍＲＮＡ（ｐＬＪＰｃＫｎｅｏ）の定量的Ｓ１ヌク レアーゼマツピング；このレトロウィルスを、ＩＴｏ−２Ｂ肝腫瘍細胞の感染に 使用した、すなわち妊娠１９日のラットの腹腔内に注入した。ｐＬＪＰＣＫｎｅ ｏ　（第８図）からのＢ　ｇ　Ｉ　Ｕ　／　Ｅ　ＣｏＲＩフラグメント（８６０ ｐｂ）およびｐＢＲ３２２の６３０ｂｐを含有する、Ｉ４６０ｐｂのＰｖｕ　１ ７８ｇ　］　Ｕ７ラグメントを、Ｂｇ１１７部位で「ｐ３２」で末端・標識し、 細胞または肝臓から抽出した全ＲＮＡをハイブリッド形成させた。７２０ｂｐ− ｙラグメントはレトロウィルスの５　’　Ｌ　Ｔ　Ｒｉらの転写物であり（ウィ ルスＬＴＲＲＮＡ）そしテ３７５ｂｐ７ラグメントはＰＥＰＣＫプｔ７モーター からのＲＮＡ転写により保護される（ＰＣＫ−ｎｅ　ｏＲＮＡ）。 各列は下記のとおりであった：　ＣＯＮ：非ホルモン；ｃＡＭＰ；ＩＮＳ；イン シュリン；ｃＡＭＰ／ｒＮｓ；−緒に添加されたホルモン；　ＩＮＳ／ｃＡＭＰ 、ｃＡＭＰの前の２時間の時点で添加されたインシュリン；　ｃＡＭＰ＋　ＩＮ Ｓ、ｃＡＭＰ後の２時間の時点で添加されたインシュリン。胎児注入二側Ｉ〜５ ．１９ヨ今胎児として、子宮内でｐＬＪＰｃＫｎｅｏを注入され、そして２０分 の間隔でｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ　（２５ｎｇ／体重ｋｇ）を３回、ｒＪ腔内注入により 投与された、１ケ月令のラットの肝臓がらのＲＮＡ。 このＲＮＡをｌ離し、Ｓ１ヌクレア一ゼマンピング操作した。 右側の列１〜３は左側の列よりも長くさらした（４８時間）。 全列はそれぞれ、前記のとおりの動物の肝臓がら、または細胞から嵐離した総Ｒ Ｎ　Ａ　４０ｕｇを含有する。 第８図には、ＡＧＰＴまたはｎｅｏ構造遺伝子にＭ結されたＰＥＰＣＫプロモー ターを含有するレトロウィルスベクターが示されている。ＰＥＰＣＫプロモータ ーの位置は、指示されている種々の調節エレメントとともに、ＢａｍＨＩ／Ｂｇ １ｍ−７ラグメントとして示されている。レトロウィルスベクターｐＬＪは図の 右側にサークルとして示されている。下方の図は、ｎｅｏ構造遺伝子に連結し、 レトロウィルスベクターのＬＴＲの内部に含有されているＦ’ＥＰＣＫプロモー ター含有レトロウィしスベクターｐＬＪＰＣＫｎｅｏを示している。このプラス ミドｐＬＪＰＣＫｎｅｏは第７図に記載の寅験に使用されたものである。 第９ヌには、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ導入遺伝子を含有するマウスの５ｏｕｔｈｅｒ ｎプロット分析が示されている。尾生検試料から抽出したマウスＤＮＡをＰｖｕ 　ＩｆまたはＫｐｎＩのどちらかで消化した（ズ示されている）。マウスＤＮＡ は親動物＃３４および子孫３４−２．３４−４．３４−６３よび３４−７からの ものであった。プラスミドｐＰＣＧＨは、対照としてＫｐｎＩおよびＰｖｕｌｒ で消化しｊ；。制限酵素切断Ｄ　Ｎ　Ａ　２０ｕｇを電気泳動により取り出し、 ニトロセルロース　フィルターに移した。このフィルターを、ニック　トランス レーションにより標識したＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ７ラグメ ントとハイブリッド形成させた。 第１０図は、高レベルのｂＧＨを示すＦ１雄動物からのキメラＰＥＰＣＫ／ｂＧ Ｈの系統を示すディファレンシャル　トランスミッション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉａｌ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を示す血統図である。この図において、０ 印は雄を表わし、Ｑ印は雌を表わし、ダイアモンド印◇は導入遺伝子の組込みの ｔ；めの検定の前に死亡した動物を表わす。Ｎ印および■印はドツトプロット分 析法によって測定して、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子に対しへテロ接合体である動 物を表わす。遺伝子導入した雄の動物は、示されているように、Ｃ５７ＢＬ６Ｘ ＳＪＬ雌と交配させるか、またはへテロ接合体遺伝子導入雌を交配させた。血清 ｂＧＨレベルはｂＧＨｎｇ／血清ｒｎＱで表わす。表１に合わせて、Ｆｌ同腹仔 およびＦ２寛腹仔の番号を付ける。５００ｎｇ　ｂ　Ｇ　Ｈ／血清ｍＱを示す司 腹仔＃２からのへテロ接合体Ｆ１雄をヘテロＦ１雄と雌との間の交配を示してい る。 第１１図は、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子導入豚とそ遺伝子導入層仔との間の比較 を示すものである。遺伝子導入豚＃１１（０印）と対照豚＃１２（４Ｐ印）に係 る、経過時間に対する背口の脂肪（ｂａｃｋｆａｔ）の変化が示されている。背 田の脂肪の深さは、第−肋骨、最終肋骨および最終腰椎の部位で超音波により測 定し、得られた数値は平均した。 不発明の詳細な説明 水防Ｅ！ＡＩＦで使用されている「動物」の用語は、人間を含む、全ての背椎動 物を包含するものとする。この用語にはまた、胚および胎児状態を包含する全て の発生段階にある各動物を包含する。 添付されている特許請求の範囲の目的に対して、「遺伝子導入動物Ｊ　（ｔｒａ ｎｓｇｅｎｉｃ　ａｎｉｍａ＋）は、組換えウィルスを微量注入するか、または 組換えウィルスを感染させることによるなどの単細胞レベルにおける遺伝子操作 によって、直接あるいは間接的に受け取った遺伝情報を有する細胞の１個または ２個以上を含有する動物のいずれかを意味する。この用語は、古典的な交配また はインビトロ繁殖を包含することを意図するものではなく、むしろ、その１個ま たは２個以上の細胞が組換えＤＮＡ分子を有する動物を包含するものである。こ の分子は染色体内に組込まれていることができ、あるいは染色体外的複製ＤＮＡ であることができる。「生殖細胞ライン遺伝子導入動物」の用語は、遺伝１報が 生殖細胞ライン中に導入され、それによって、その情報を子孫に伝える能力が付 与されている遺伝子導入動物を意味する。このような子孫が寅際に、その情報の 一部または全部を有する場合には、これらの動物はまた、遺伝子導入動物である 。 情報は、受は入れ動物が属する動物種とは異種でることができ、たとえばラット 細胞中のと成長ホルモン遺伝子であることができる。情報は、その酵素を合成す る能力が先天的に欠けている個体甲に導入された、酵素をコードする遺伝子のよ うに、特定の各受容動物に対してだけ異種であることができる。あるいはぼた、 情報は、受容動物がすでに持っている遺伝情報であることができる。最後にあげ Ｉ；場合においては、導入された遺伝子は、作動の結果として、先天的遺伝子と は異なる条件の下で発現するか、またはさらに効果的に発現することができる。 さらにまた％　ｒｐＥｐｃＫプロモーター」の用語は、制限なしで使用する場合 には、いずれかの動物のゲノムのＰＥＰＣＫ遺伝子に係るプロモーターあるいは それらの人工的等個物、ならびにｃ　Ａ　Ｍ　Ｐおよびインシュリンに応答する その修飾物を包含する。従って、この用語は、ＰＥＰＣＫのミトコンドリア型ア イソザイムをコードする遺伝子のプロモーターは包含しない。 ＰＥＰＣＫプロモーターは、その食餌制御シグナルに対する応答性を有すること から、好適であるが、分娩後（出生後）にだけ有意に発現される他の遺伝子のプ ロモーターもまた、動物甲に導入された遺伝子の発現の制御に価値があることが ある。このようなプロモーターの一つはチロシンアミノトランスフェラーゼをコ ードする遺伝子のプロモーターである。プロモーターは、遺伝子導入動物が出生 前にその遺伝子を実質的に発現させ現は許容されうるものと理解する。遺伝子の 種類は、その出生前における特定レベルでの発現が受け入れられるか、または受 け入れられないかを指図する。先天的ＰＥＰＣＫプロモーターの場合には、２種 の成熟した動物が２４４０および３４３２ミリ単位（ＩＩＩＵ）　／肝臓ダラム を発現することが見い巳されているが、胎児は４０〜５０ｍｔｌ／肝臓ｇを発現 するだけである。すなわち、酵素活性の成熟対胎児発現の比率は約６０＝１であ る。好ましくは、本発明のプロモーターは、少なくともｌＯ：１の、結合遺伝子 の成熟対胎児発現比率を有する。好ましくは、本発明のプロモーターは少なくと もｌｏｏＯｐｐｍのシグナル強度、すなわちｂＧＨプロモーターまたはＭＴプロ モーターの約４倍のシグナル強度を有する。 さらにまた、食餌信号に対して応答性の他のプロモーターを使用できることも考 えられる。このようなプロモーターは、ＮＡＤＰ−マレニート　デヒドロゲナー ゼおよび脂肪酸シンセターゼをコードする遺伝子に係るプロモーターを包含しう る。これらは食餌グルコースにより刺激され（これはインシュリンを介して作用 する）、そしてグルカゴンにより阻害される。 ＰＥＰＣＫズコモーターは、対象の構造遺伝子のいずれもの、たとえば中成長ホ ルモン、アデノシンデアミナーゼ、チロトロピン−放＝性ホルモン、ベーターグ ロブリン（オンコゲンを含む）をコードする遺伝子およびヘルペス　ウィルスの チミジンキナーゼ遺伝子および細菌トランスポゾンＡＧＰＴ遺伝子のような標識 遺伝子の発現を制御するために使用することができる。 本明細書に記載の実験例において、ＰＥＰＣＫプロモーターは中成長ホルモン遺 伝子と結合させたが、本発明はＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ発現系に制限されるものでは ないと理解する。 ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨの使用の合理性は散型に存在する。第一に、ｂＧＨの発現は 遺伝子導入動物の血清中で、ラジオイムノアッセイによって容易に検知される。 第二に、ｂＧＨの発現は遺伝子導入動物を表現型に変え、かくして、この動物は ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ導入遺伝子を含有していない対照動物よりも大きいサイズに 成長する。第一に、牧畜用動物に適用すると、ＰＥＰＣＫのような活性プロモー ターの制御の下に３けるｂＧＨの発現は、遺伝子導入動物のサイズを増加しなが ら、まＩ；これらの動物のタンパク質対脂肪の比率を増加し、従って、その身体 組成が変えられる。家畜における身体組成の変更に対するＧＨの有用性は証明さ れている。しかしながら、現在、ＧＨ投与に関する唯一の方法は、動物へのＷ、 液注入である。それらのゲノムに組込まれたＧＨ遺伝子を含有する遺伝子導入動 物を得ることができることは、商業的に格別に重要である。 遺伝子により改良された動物において結合導入遺伝子を誘導するために、ＰＥＰ ＣＫプロモーターを使用するもう一つの例には、チロイド放！：２世ホルモン（ Ｔ　ＲＨ）遺伝子に連結しＩ；ＰＥＰＣＫプロモーターを含有するキメラ遺伝子 を鶏の生殖ライン甲に導入するために、レトロウィルスベクターを使用すること がある。ＴＲＨは成長因子である。このタンパク質を鶏に、それぞれ注入する方 法は労力を要し、かつまた高価である。 ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ系を使用する我々の実験的研究を下記に詳細に説明するが、 これは本発明を説明しようとするものであり、本発明を制限しようとするもので はない。 中成長ホルモンゲノム配列は知られている。ｂＧＨゲノム挿入配列は牛脂盤ライ ブラリィのラムダｃｈａｒｏｎ２８クローンがら分離した。Ｅｃｏ　ＲＩ制限消 化は完全構造遺伝子を含有する４、３ｋｂ配列、５′−７ランキング配列１．７ ｋｂおよび３′−７ランキング配列の４００ｂｐを取り出した。これを市販のプ ラスミドｐＢＲ３２２のユニークＥｃｏ　Ｒ１側守にクローン化した。生成する ｂＧＨ）ランスファーベクターは公的に入手することができる。Ｗｏｙｃｈｔｋ 等によるＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１０　：　７１９７（１９８２ 年）参照。 ｂＧＨ遺伝子、または他の対象遺伝子はゲノム白米のものである必要はない。こ れはｃＤＮＡ転写物であることができ、あるいは部分的に、または全体的に合成 されたものであることができる。「背景」の箇所で引用した、ｂＧＨクローニン グに関する技術を参照することができる。 天然のラット肝臓（シトゾールＷ）ＰＥＰＣＫグロモーターの官能性部分の配列 （−５４８〜−１）およびＰＥＰＣＫ構造遺伝子の一部の配列（＋１〜＋７３） を第６図に示す。これはＷｙｎｓｈａｖ−Ｂｏｒ　ｉ　ｓ等（１９８４年）にも とづいている。この文献に記載されているように、この６２１ｂｐ　Ｂａｍ　Ｈ Ｉ−Ｂｇｌｌｌフラグメントはチミジンキナーゼ構造遺伝子（ｐＰＣＴＫ−６Ａ ）に操作可能に結合されているプラスミドｐｏｐｐ中にクローン化されている。 グラスミドｐＯＰＦはまた、ＳＶ４０エンハンサ−を含有しているが、この因子 はＰＥＰＣＫプロモーターのホルモン応答を減少させない。 我々は、ラットからのシトゾール型ＰＥＰＣＫの遺伝子月のプロモーターを使用 したが、他のシトゾール型ＰＥＰＣＫプロモーターも、対象遺伝子の発現の制御 に有利に使用することができることは明白である。ミドフンドリア型のＰＥＰＣ Ｋ酵素は異なるプロモーターの制御の下で、構造として発現され、異なる遺伝子 によりコードされる。天然のミトコンドリア型ＰＥＰＣＫをコードする遺伝子と 組合されたプロモーターは本発明ではあまり価値がない。これは、このプロモー ターがシトゾール型の遺伝子と貝−の短時間の調節を受けられないからである。 我々は、シトゾールをのＰＥＰＣＫに係る天然プロモーターの官能性７ラグメン トを使用したが、天然プロモーターの欠失変異種または置換変異種も特定の場合 に有利であることができる。一連の５′−欠失変異種は、５ｈｏｒｔ等により開 示されている（１９８６年）、この文献および背景の記載箇所で引用されｔ；他 の文献はＰＥＰＣＫプロモーターの種々の調節ドメインの特徴を記載しており、 従って、これらの文献は配列の変化の場所に関する若干の指針を炎供している。 −例として、ｃＡＭＰ調面因子は−９１〜−８０にあるものと信じられる。−６ １〜−４１６ｘ分はホルモン的に活性なエンハンサ−として働くことができる。 Ｗｙｎｓｈａｗ−Ｂｏｒｉｓ等（１９８６年）。 さらに、その他のグルココルチコイド（メタロチオネイン）およびｃＡＭＰ（プ レグロソマトスタチン、グラスミノーゲンアクチベーター、バンアクティブイン テスティナルボリペズチド）応答因子の配列に関する考察はまた。ＰＥＰＣＫグ σモーターの望ましい非天然型の発達あるいはＰＥＰＣＫ遺伝子の制御発現と組 合わされたＤ　Ｎ　Ａの付加的調節領域を導く。 実験例に戻り、ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ７ラグメントはｂＧＨ−担荷プラスミド から分離し、前記のδ２１ｂｐＰＥＰＣＫグロモーター担持ユニットにより置き 換えた。置き換えられたＤＮＡは、第６又に示されているｂＧＨ配列上の標識に よって示されているように、ｂＧＨ遺伝子の完全５′−フランキング配列を包含 していた。生成した融合遺伝子は、そのＢｇＩＭ部位で、ｂＧＨの第一エキフン の開始部位に結合しているＰＥＰＣＫ構造道伝予の第一エキフンの７３ｂｐを含 有している。しかしながら、ＰＥＰＣＫの翻訳開始部位は＋７３よりもさらに下 流にあるので、ｂＧＨＪ伝子誘導子誘導ｍＲＮＡｂＧＨへの正常な翻訳は干渉さ れない。 ＰＥＰＣＫ遺伝子グ遺伝子タロモーター伝子への結合は、多分、別の制限酵素お よび（または）リンカ−あるいはアダプタ−分子の使用を包含する、買様の手段 により達成することができる。ＰＥＰＣＫプロモーターが官能性のままであり、 対象の完全構造遺伝子を発現し、そしてＰＥＰＣＫｆｆｉ伝子の一部が所望のポ リペプチドを包含する融合タンパク質の一部として発現しないことが基本的な考 え方である。 この点で、我々はキメラＰＥＰＣＫプロモーター／ｂＧＨ遺伝子担持プラスミド を有する。所望の発現系を有する遺伝子導入動物を調製するするためには、多く の従来から認められている技法を使用することができる。我々の寅験例では、所 望の宿主動物の胚細胞を微量注射により形質転換し、発達および成長を完了させ た。 微量注射用のキメラ遺伝子を調製するために、細菌配列をＥｃｏＲＩ消化により 取り呂した。これにより、また、ＰＥＰＣＫの５′−７ランキング配列の８７ｐ ｂが分離されＩ；が、このプロモーターは高タンパク質食餌により、およびｃＡ ＭＰにより、誘発性のままであつＩ；。 好適態様では、１個の細胞の胚を、多卵性にされたＣ５７ＢＬ６／Ｓ　Ｊ　Ｌマ ウスの卵管からフラッシュにより採取する。この卵子をヒアルロニダーゼで洗浄 し、汚染矧胞を除去し、ラクテートおよびピルベートを含有する塩媒質中の、微 量注射用スライドに移す。ＬｅｉＬｚ方向反転顕微鏡（ｄｉｖｅｒｔ　１ｎｖｅ ｒｔｅｄ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｅ）の下で、約１ｐＱのＤＮＡ溶液（２００コビ イのＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子）を含有する注射ピペットを、受精させた卵子の 雄生殖咳中に挿入し、このＤＮＡを注入する［この技術に関しては、ヨｏｇａｎ 、　Ｂ、　Ｃｏｎ５ｔａｎＬｉｎｉ、　ＦおよびＬａｃｙ、　Ｅ、によるｒＭａ ｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　！Ｊｏｕｓｅ　ＥｍｂｒｙｏＪ　、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。 １９８６年を参照できる１゜この卵子は１６時間、インキュベートする。このイ ンキュベーション時間の後に、生きている胚を偽擬妊娠マウスの卵管に再移植す る。ｗａｇｎｅｒ等によるＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（Ｘ１’）　７８　：　６３７６ 〜８０（１９８１年）。これらのマウスを次いで、生産させ、６〜１０匹の正常 のサイズの同腹子を得る。 遺伝子導入動物を調整するもう一つの方法は、対象の、または治療価値のある、 遺伝子を含有するレトロウィルスで予め移植した胚を感染させることによる方法 である。組換えＤ　Ｎ　Ａ技術を使用することにより、レトロウィルスゲノムを 操作し、外来遺伝子および外来プロモーターを含有させることができる。 この組換えレトロウィルスゲノムはそのウィルスキャプシド内に包む事ができ、 生きている感染性ウィルスとして使用することができる。１個の細胞段階または 発生の最終段階の胚を、この組換えレトロウィルスで感染させることができ、こ の外来遺伝子を含有するプロウィルスは宿主ゲノム中に、１個のコビイをして組 込むことができるようになる。従って、組換えレトロウィルスによる感染は胚ゲ ノム内のそれ自体のプロモーターまたはへテロブロモ−ターの制御の下に、外来 遺伝子の組込みを可能にする。感染された胚は次いで、微量注射された胚の移転 と同様の方法で、偽擬妊娠雌マウスに移すことができ、生じた子供を次いで、外 来遺伝子の存在に関して検定する。 我々は、ＡＧＰＴ遺伝子に結合しているＰＥＰＣＫプロモーターを含有するネズ ミおよび家禽のレトロウィルスベクターの両方を構築しＩ；；これらは培地中に おける繊維芽細胞の感染により発現に関して試験した。このＰＥＰＣＫプロモー ターはプロウィルス内で活性であり、感染細胞において、高レベルのＰＥＰＣＫ ／ＡＧＰＴ　ｍＲＮＡが検出された。転写は適当な出発部位で開始され、転写の 正確なホルモン調節が見られる。従って、このＰＥＰＣＫプロモーター／調節ド メインは遺伝子導入動物を生産するための、この別方法に非常に有用である。 初期圧段階において、外米ＤＮＡを動物に導入する必要はない。相通する構造遺 伝子に結合され、レトロウィルスベクターに組込まれた、ＰＥＰＣＫプロモータ ーは、発達期間甲の胎児動物の細胞の感染に使用することができる。我々は、１ ９日日令光の動物（発達の最終第三期）の腹腔口にレトロウィルスを注入すると 、肝臓の染色体中に、キメラＰＥＰＣＫ−ＡＧＰＴまたは１見！遺伝子が組込ま れることを証朗した。全部の肝臓細胞が感染されるのではないが、我々は肝臓で ｍ　ＲＮ　Ａを検出できる。この遺伝子の転写はｃ　Ａ　Ｍ　Ｐにより刺激され る。この方法は、肝臓がこの発生段階期間甲において、造血組織から肝組織まで 、多分、分化性であることから効果的である。この分化はＤＮＡ複製を包含し、 感染性レトロウィルスは次いで、肝細胞ゲノム田に組込まれる。レトロウィルス は複製欠失ウィルスであるので、動物は引続くウィルス感染段階は生じない。こ の技術は、比較的に非侵略的技術によって、遅い発生段階で、動物組織に遺伝子 を効果的に導入するための能力を有する。 さらにまＩ；、細胞増殖に好ましい条件の下に、ベクターを細胞口に導入するこ とができ、また形質転換細胞を動物に導入することができる。 導入遺伝子はまた、出生後の動物に導入することもできる。 ５匹のマウス（３週間令）の尾静脈に、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ転写ユニットを担持 する複製能力のないネズミ　レトロウィルスの１０７粒子を含有する組織培養培 地１ｍ１２量を注入した。４週間後に、血清試料は２０〜５０ｎｇ／ｍＱのｂＧ Ｈ濃度を示した。 本発明は動物に導入遺伝子を導入するいずれか特定の方法に制限されるものでは ない。 ホモ接合体（ｈｏｍｏｚｙｏｕｓ）遺伝子導入マウスラインを陽性の親動物（ｆ ｏｕｎｄｅｒ）　（微量注入された胚から竺じた陽性の仔）を河−ハイブリッド ラインの正常なマウスと交配することによって確立される。生産される２１世代 は、導入遺伝子が親動物の遺伝子細胞の全部を含有している場合には、導入遺伝 子の５０％へテロ接合体であるべきである。ヘテロ接合体Ｆ１動物を異種交配さ せると、生じたＦ２世代は導入遺伝子に関して２５％ホモ接合体と５０％へテロ 接合体と２５％野性型であらねばならない。 従って、Ｆ２世代動物によって、導入遺伝子に対してホモ接合体動物を生産する ことができる；これらの動物を別のホモ接合体マウスと交配させると、次の世代 は導入遺伝予圧で、１００％ホモ接合体であり、ホモ接合体ラインが確立された 。 親マウスはまず、外米ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨＤＮＡの存在に賀して、ドツト　プロ ット分析およびサザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ）分析法によりスクリーニングした。 これらの要件の両方でｉ＝であった（すなわち、異種遺伝子の存在を示し、かつ また予想された長さの制限フラグメントを生成した）マウスをＥＬ　Ｉ　ＳＡ検 定法によって、ｂＧＨの発現に関して試験した。 ＤＮＡは、Ｄａｖｉｓ等の方法［！Ｊｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６５　： 　４０４−４１１（１９８０年）］の改良方法に従い、尾の部分（約１ｃｍ）か ら抽出した。 潜在的、遺伝子導入マウスからの尾の一部分を液体窒素甲で粉砕し、粉末を生成 した。この乾燥した粉末を、プロテイナーゼ１１００ｕ、ｎ＋Ｑ％Ｓ　Ｄ　Ｓ　 ０．５％、Ｎ　ａ　ｃ　１　０．ＩＭ、　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５）５０ｏ＋Ｍお よびＥＤＴＡｌｍＭを含有する抽出緩衝液に加え、次いで５５℃で一夜にわたり インキュベートした。ＲＮアーゼＴ１を１（Ｈｌ／ｍ＋２の最終濃度で加え、こ の試料を３７℃で１時間インキュベートした。ＲＮアーゼ処理後に、ＤＮＡを、 等量のフェノールとクロロホルムとを含有する混合物で抽出し、次いで等量のク ロロホルムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。 陽性の遺伝子導入動物の第一次スクリーニングをドツトプロット分析法によって 行った。マウスの尾から抽出されたＤＮＡをＯｊＮ　Ｎ　ａ　ＯＨ／２．ＯＮ　 ａ　ｃ　ｌ中で変性させ、次いで５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｌｅの複 製装置上のニトロセルロース　フィルターに適用した。導入遺伝子のコピー数を 決定するための標準としては、既知量のｐＰＣｂＧＨプラスミドＤＮＡを使用し た。変性ＤＮＡ試料を３種の濃度で加えた後に、ニトロセルロースフィルターを ２時間焼き、１１００ｕ／ｍ（！の変性したサケ精巣Ｄ　Ｎ　Ａを含有する５０ ％ホルムアミド、２０＋ｎＭ　Ｐ　Ｉ　Ｐ　Ｅ　Ｓ、　０．５％ＳＤＳ溶液田で 予備ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成に使用したプローブを第６文に示 す（ＩＩＪＰＣＧＨ（７）ＥＣＯＲＩ−ＢａｍＨＩ　ＰＥＰＣＫ／ｌ：＋ＧＨセ グメント）。このＤＮＡフラグメントを對ｇｂｙ等の方法［Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂ ｉｏｌ、、　１１３　：　２３７−２５１（１９７７）コによるニック翻訳によ って、　：ａ−”ＰＥ　−ｄＣＴＰで標識した。 陽性の遺伝子導入動物−の遺伝子のと数体ゲノム当りのコピーの数はドツトプロ ット分析法によって決定した。ドツトはハイブリッド形成およびオートラジオグ ラフィ後に、ニトロセルロースから切り取り、ハイブリッド形成した放射能を液 体シンチレーションカウンターにより測定した。標準ＤＮＡ試料にハイブリッド 形成した放射能はスポットの数に従い直線的に増加した。手数ケマウスゲノム当 りで３ＸｌＯ＠ＫｂのＤＮＡおよびｐＰｃｂＧＨの６．２にりのＤＮＡ数値を陽 性の動物の導入遺伝子のコピー数の測定に使用した。組込まれた導入遺伝子の制 限フラグメントの大きさはサテンブロッティング法１ｓｏｕｔｈｅｒｎ。 Ｅ、　ＬによるＪ、　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、、　９８　：　５０３〜５１７１に よって分析した。ハイブリッド形成プローブ（第６図）には、ニック翻訳：Ｒｉ ｇｂｙ、　Ｐ、Ｗ、Ｊ、等によるＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１１３　：　 ２３７−２５１（１９７７）］により、あるいは無無作為プライマー法ｊＦｅｉ ｎｂｅｒｇ、　Ａ、Ｐ、等によるＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３２：　 ６−１３（１９８３）］ｊこより、標識した。 キメラＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子の組込みおよび発現の両方に対して陽性であっ たマウスを各導入遺伝子ラインの発展のための装動物として使用した。 導入遺伝子の存在に関して、始めにスクリーニングした４４匹のマウスの中で、 ２匹は組込みに関して陽性であった（＃９および＃３４）。これらの遺伝子導入 マウスからのＤＮＡの分析は、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子が装動物の両方のうち の１個だけの染色体厚で、縦並びで、頭−尾の反復状態で組込まれていることを 示した。ゲノムＤＮＡをＫｐｎＩ（この酵素は遺伝子内の１ケ所を切断する）で 消化させると、第２図に示されているように、装動物＃３４および子孫に関して 、約２７００ｂｐの予想された長さの７ラグメントが得られた。遺伝子は縦並び に、頭−尾配列として存在するので、Ｋｐｎｒで消化すると、ＤＮＡグローブに ハイブリッド形成されている完全ＰＥＰＣＫ／ｇＧＨ遺伝子と同一長さのｆ’Ｊ Ｉｉ！フラグメントの多数のコビイが得られる（第９図）。ゲノムＤＮＡをｐｖ ｕｌ［（この酵素は４つの部位でＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子を切断する）で、制 限酵素消化すると、１．３００ｂｐ、６３５ｂｐおよび３５５ｂｐの予想された サイズの多数のコビイが得られた（最少フラグメントは第９図では識別されない ）。導入遺伝子の縦並びの、頭−尾配列の接合によって作り出されたｐｖｕＩＩ フラグメントは６３５ｂｐ７ラグメントと同一サイズであった。このＫｐｎＩお よびｐｖｕｌｒによる同一パターンはサザンプロット法により分析されＩ；全部 の遺伝子導入マウスで検出され、このことは、装動物およびそれらの子孫におい て、導入遺伝子内部では、転位、欠失または挿入がなかったことを示している。 陽性のマウスにおける導入遺伝子のコビイ数は、ドツトプロット分析法により測 定した。装動物＃９の第一世代子孫は異なるドツトプロットパターンを示した； これらは１〜５コビイ／細胞〜２５〜５０コビイ／Ｂ胞の範囲であった。異なる コピイ数の遺伝子を含有する装動物＃９の第一世代子孫は各ラインの装動物にし た。装動物＃９（そのゲノムは２５コピイ／細胞を含有していた）の子孫である ２匹のへテロ接合体動物間の交配は、出生後の数ヨ閣内に有意の数の子孫の死亡 をもたらした（第１０図）。 これは発生に重要である遺伝子座における、ホモ接合体動物における挿入度異誘 導を示す。装動物＃３４ラインのコビイ数は均一であり、装動物およびＦ１世代 マウスにおいて、２５フビイ／細胞であっＩ；。 血清口のｂＧＨ濃度の測定に我々が使用したＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベ ント検定）は、ビオチニル化された山羊抗ヒトＩｇＧに結合するアルカリ性ホス ７アターゼストレプトアビジンの使用を包含する。結合したアルカリ性ホスファ ターゼの活性は比色検定法により測定することができ、従って放射性標識リガン ドを使用する必要はない。微量滴定板に、初めに、モルモット抗−ｂＧＨを、検 定する試料に加えられるｂＧＨの全部が結合するように、過剰に塗布する。この 塗布された微量滴定板に、血清試料および精製ｂＧＨを加える。次いで、第二の 抗体としてサル抗ｂＧＨを加え、第一の抗体に結合したｂＧＨＯ量に正比例して 定量的に結合させる。第三の抗体として、山羊抗ヒトＩｇＧ（これはサルＩｇＧ を認識する）をビオチンに化学的に結合させる。このストレプトアビジン−酵素 結合物は検＝試薬として使用することができる。この場合に、この結合物はアル カリ性ホスファターゼース）・レプトアビジンである。 結合したアルカリ性ホスファターゼ結合物（これはビオチニル化山羊抗ヒトｒｇ Ｇに結合し、次いでサル抗ｂＧＨに結合する）を基質に供給し、呈色生成物が生 成する。この生成物は、次いでスペクトル光度測定により測定することができる 。この酵素反応は長期インキュベーション時間にわたり線状である。この長期イ ンキュベーションはこの検定法の感度を増大させる。 ＠量適定板に、Ｎａ、ＣＯｓ／ＮａＨＣＯｓ　（ｐＨ９−６）で１：１００に稀 釈したモルモット抗ｂＧＨを塗布し、３７°Ｃで１時間、次いで４℃で一夜にわ たりインキュベートした。この板をリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中の０．１ ％牛血清アルブミンで洗浄し、次いでＰＢＳ中の１０％牛血清アルブミンにより 、３７℃で１時間、「ブロック」した。ＰＢＳ９の１％牛血清アルブミンで稀釈 しＩ；真正ｂＧＨを既知量で含有する標準試料および血清試料を加え、３７℃で １４間インキユベートシ、次いで前記のとおりに洗浄した。ＰＢＳｃ４：Ｉの１ ％牛血清アルブミンで１　：　１０．０００に稀釈したサル抗ｂＧＨを加え、３ ７℃で１時間、インキュベートした。ＰＢＳ中の１％牛血清アルブミンでｌ　： 　２．０００に稀釈した、ビオチニル化山羊抗ヒトｂＧＨを加え、３７℃で１時 間インキュベートし、次いで前記のとおりに洗浄した。ＰＢＳ中の１％牛血清ア ルブミンで１　：　２．５０００に稀釈した、アルカリ性ホス７アターゼースト レプトアビジン結合物を加え、３７℃で１時間、インキュベートし、次いで前記 のとおりに洗浄した。ＰＢＳ田の１％牛血清アルブミンで１　：　２．５００に 稀釈した、アルカリ性ホスファターゼ−ストレプトアビジン結合物を加え、３７ ℃で１時間インキュベートし、次いで前記のとおりに洗浄した。アルカリ住不ス ７アターゼ基質としてＰＢＳヲの１％牛血清アルブミンで１　ｍｇ／ｍＱに稀釈 したｐ−ニトロフェニルホスフェートを加え、３７℃で４５分貨インキュベート し、色の発現を加速しｊ；。この板をＰｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒスペクトル光度 計で１時間および５時間読み取った。 我々は、肝臓および腎臓における内在ＰＥＰＣＫの特異的発現の根拠となるＰＥ ＰＣＫ遺伝子のｆＺ作用因子が、これらの遺伝子導入マウスのゲノム内に組込ま れたキメラ遺伝子のプロモーター／調節ドメインを形成している、５′〜フラン キング配列の４６０ｂｐ内に存在することが判った。これらの動物に８けるＰＥ ＰＣＫ／ｂＧＨの発現の組織特異性を測定するために、種々の組織甲のＲＮＡレ ベルを分析した（第５′５）。 ＲＮＡはＣ？＋ｉｒｇｖｉｎ、　Ｊ、Ｍ、等によるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 　２４　：　５２９４−５２９９（！９７９）に記載の方法に基本的に従い、Ｌ ａｍｅｒｓ、　Ｗ、Ｊ、によるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 Ｘ国、７９　：　５１３７−５１４１（１９８２）によって少し修正して、マウ ス組織から抽出した。総ＲＮＡ　（２０ｕｇ）は１％寒天、１８％ホルムアルデ ヒドゲル上で２０ｍ１Ｊ　ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸Ｎ　ａ　−Ｉ　Ｍ！Ｊ　Ｅ　Ｄ 　Ｔ　Ａを用いる電気泳動によって分離した。 ＲＮＡ試料は上記ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢ａＮａ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で８０℃にお いて５分間、変性させた。このＲＮＡ試料を上記ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸Ｎａ、１ ｍＭ　ＥＤＴＡ中で８０℃において５分間、変性させた。このＲＮＡ試料は、上 記ＭＯＰＳ緩衝液、３％ホルムアルデヒドおよび０．１％ＳＤＳ中で８０℃にお いて５分間、変性させた。電気泳動緩衝液は２０ｍＭ　ＭＯＰＳ、　５ｍＭ酢！ ！Ｎａ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、８．１％ホルムアルデヒドであった。 電気泳動の後に、ＲＮＡを２０ＸＳＳＣ中のｒＧｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕ ｓＪにｌ接に移した。移転が完了した後に、３分間の紫外部光露光により、この ＲＮＡをｒＧｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　ＰｌｕｓＪ膜に架橋させ、次いで８０℃で ２時間焼いた。このＲＮ　Ａを、第６図に示されているように、ｐＰＣｂＧＩ（ キメラ遺伝子のニック翻訳（ＩＸＩＯ’ｃｐｍ／ｍＱ）　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　７ ラグメントにハイブリッド形成させた。 予備ハイブリッド形成溶液およびハイブリッド形成溶液は両方ともに、５０％ホ ルムアルデヒド、０．２Ｍ　Ｎ　ａ　ｃ　１　ｓ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７ ，５）、１０％デキストランスルフェート、０．１ビロリン酸ナトリウム、１％ ＳＤＳ、０．２％牛血清アルブミン、０．２％フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）　（分 子量４００．０００）　、０．２％ＰＶＰ　（分子量４０．０００）およびＱ、 １ｍｇ／ｍ１２サケ精巣ＤＮＡよりなるものであった。３６時間のハイブリッド 形成の後に、濾液を２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで２回、室温において５分間、 洗浄し、次いで２ｘｓｓｃ、ｏ。 １％ＳＤＳで２亘１．４２℃で３０分間、洗浄した。 ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子の成熟ＲＮ　Ａ転写産物は約ＩＫｂであり、他方、内 在＝ｐＥｐｃＫのｍＲＮＡは約２　、８　Ｗｂである。 Ｃｉｍｂａｌａ、　Ｍ、Ａ、Ｊ、等によるＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７　： 　７６２９−７６３６（１９８２）。 ノーザン分析用に使用したプローブはキメラＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ８よび内在性Ｐ ＥＰＣＫの両方とハイブリッド形成する。 第５叉に示されているように、血清ｂＧＨを含有する遺伝子導入動物をこの発現 の組織特異性に関して試験すると、これらはと臓において高レベルの発現を示し た。第５ヌのパネルＡむよびパネルＢ（列１）に示されているように、ｐＰＣｂ ＧＨプローブにハイブリッド形成したｉ、ＯＫｂに強いバンドが存在する。 この導入遺伝子はパネルＡでマウスの腎臓でも発現された；腎臓は外５−ｅ？Ｅ ＰｃＫが発現するもう一つの組織である。パネルＢでは、動物の腎臓においては 、検出できるＰＥＰＣＫ／ｂＧＨｍＲＮＡは見い出されなかった。ここでは、低 レベルのｂＧＨが発現されたが、これはノーザン分析法の感度における限界によ るものと考えられる。しかしながら、低発現性動物の腎臓における導入遺伝子の 発現は、ランダムプライミングにより標識された午成長示ルモンｃＤＮＡプロー ブを使用して検ヒされている。 これらの発見にもとづき、我々は肝臓および腎臓における発現に必要な配列が４ ６０ｂｐＰＥＰＣＫ７ラグメントに存在し、そしてこの各へテロ接合体マウスラ インにおけるキメラＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子が組込まれる染色体部位がこの導 入遺伝子の組ｌｉ＆峙異世発現を千渉しないものと結論した。この遺伝子を含有 するが、測定できる血清ｂＧＨレベルを示さない、別の血統のマウスをｂＧＨ峙 異的ｒｎＲＮＡに関して検定した場合には、検査した組織のいずれにも、ｂ　Ｇ 　Ｈｍ　ＲＮ　Ａは存在しなかった。高レベルでｂＧＥ（を発現する遺伝子導入 マウスは同性のそれらの貝腹仔のサイズの約１．５〜２倍であった（第３ズおよ び表１）。このこと；＝、これらの動物によって産生される成長だルモンが竺物 学的に活亡であり、そして異所部位である肝臓８；び腎臓で正しく作用し、この ホルモンをここで産生したことを示してしる。 表二：　ＰＥ？ＣＫ／’：＋ＧＨ遺伝子含有道云子導入マウスの雪質。 と数体ゲノム肖りの？Ｅ？ＣＫ／ｂＧＨのフピイ数をドツトプロ７７に；り測定 した。コビイ数標準として、１．５．１０．１５．２５．５０８よび１００のコ ピー数等価で、プラスミドｐＰＣＧＨを使用しｌ；。定量のために、ドツトはハ イブリッド形成および万一トラン２グラフイの後に、ニトロセルロースフィルタ ーから切り取り、ハイブリッド形成しているプローブの量を液体シンチレーショ ンカウンターにより測定した。血清９のｂＧＨ濃度は巧料および方法に関して後 記されているとおりに測定した。成長率は遺伝子導入マウスの体重を、同室の寛 腹仔の品々体重で割算することによって計算した。 表１ ＰＥ？ＣＫ／ｂＧＨｂＧＨ マウス　生別　コピー数／細胞　ｎｇ／血清ｌｌ１ｒｌ　成長比率２−ＩＭ　５ 　０　’：、０ ２−２　Ｍ　５　０　！、０ ２−６　７　２３　５００　Ｌ７ ２−７　７　５　ｉｏｏ　２．０ ００１−２　Ｍ　２５　０　ｉ、０ ０〇ニー３　Ｍ　５０　２．３００　ユ、５００２−：　Ｍ　、　２５　５００ 　１．６０ｉ−Ｉ　Ｍ　２５　４００　ｉ、３ ０１４　Ｍ　２５０　１．０ ０１−５　Ｍ　２５　０　１．０ ０’、−７Ｆ　２５　０　！、０ ０２−２　Ｍ　２５　３００　１．４ ０２−２　Ｍ　２５　８　１．０ ０２−４　”　２５　０　１．０ ０２−５　Ｆ　２５　０　１．０ ０３−ＩＭ　２５　４３　ｉ、０ ０３−２　Ｍ　２５　３８　１．０ ０３−４　Ｍ　２５　０　１．０ ０３−５　Ｍ　２５　３５０　１−４ ０３−６　Ｍ　２５　３００　１．５ ０３−７　Ｆ　２５　０　！、０ ｂＧＨＲＮＡに笑する別のスズライジングメカニズムが午下垂体＠織で竺じるこ とが知られている［Ｈａｍｐｓｏｎ、　Ｆ、に、等による？ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　ｓｃｉ、、　”Ａ”Ａ、　８４　：　２６７３−２６７７Ｇ９ ８７年）］。 ｂＧＨｍＲＮＡのうちの低％（０，：％）はｂＧＨ遺伝子のイントロンＤを含有 下る。エクソン５の最初の５０個のヌクレオチットを通してのオープン　リーデ ィングフレームとして統〈イントロンＤ０′）内包。この変化した遺伝子産物の 生理学的意味は知られていない。遺伝子導入マウスの数種の異なる組織からの全 ＲＮＡをｂＧＨイントロンＤ配列だけよりなるプローブとハイブリッド形成した 場合には、１．３ｋｂＲＮ　Ａのバンドが肝臓でだけ検＝された。すなわち、こ のｂＧＨスプライシングの別のプロセスはまた、遺伝子導入マウスで生起するが 、これはこれらの遺伝子導入マウスの？Ｆ臓でも生起することから、下垂体に特 異的ではない。 これらの動物におけるキメラＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子の発現のレベルに係る格 別の変化は食餌の変更によって竺じｌ；。この研究で使用された２種の合成食Ｗ ｌ：Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ２　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎから入手した。高次本化物食餌はショ猾８１　、５％、カゼイン１２．２％、 ＤＬ−メチアニン０．３％、綿寅油４％、醸造酵母２％、８よびミネラル　ミッ クスニビタミンΔ％を含有した。 高タンパク質食餌はカゼイン６４％、σ−１５胞栄養繊維２２％、植物油１１％ 、醸造酵母２％およびミネラルミックス士ビタミン１％を含有した。マウスにこ れらの食餌を与え、バは適時に飲ませた。− 遺伝子導入マウスを２４時￥ｉＷｔ食させ、次いで高次本化物（８１゜５％）、 低タンパク質（！２．５％）食餌を与えた。各動物の血済宇のｂＧＨレベルは３ ２０ｎｇ　ｂ　ＧＨ／血清ｍαから１４ｎｇｂＧＨ／血清ｍ０に低下した。高次 本化物食餌を高タンパク質（６１％）で炭本化物を含まない食餌ととり替えた場 合には、血清ｂＧＨレベルは１週間後に、１４ｎｇ　ｂ　Ｇ　Ｈ／ｒｎＱから４ ３０ｎｇ／ｍａに高められた（第４３）、低レベルでｂＧＨを発現した遺伝子導 入マウスは食餌における二〇らの変更と関連した、側−のパターンの発現を示し ｔ二。 高次７”−イ’＋物食餌は、血清中のインシュリンのレベルを増加さぜ、ＰＥ？ ＣＫの合成を抑制し、従って遺伝子転写を３１害する二Ｇｒａｎｎｅｒ、　Ｄ、 等によるＮａｔｕｒｅ　３０５　：　５４９−５５１（１９８３乞）Ｅ　、　Ｐ コＰＣＫ　ｍＲＮＡの羊減期は３０分（４４，４５）にすぎないので、高次本化 物食事の後の特異的ｍＲＮＡ合成レベルの減少は肝ＰＥＰＣＫ合成の急速な低下 をもたらす。 高次本化物食餌を７ミ間与えｊ；後には、被験遺伝子導入マウスの血清甲のｂＧ Ｈレベルは、２４時賀の飢餓の後の同一動物に見い巳されるレベルの５％より少 なくまで減少した。引続いて、タンパク質６４％を含有する食餌を与えると、僅 かに７ヨ後に、血清’ＤＧＨの３０倍の誘発が得られた。宿主動物の食餌内容に おける変化に対するＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ導入還伝子の、この格別で比較的急速な 応答は、ＰＥ？ＣＫプロモーター／調節域が肝臓における発現に対して、結合構 造遺伝子を巨標とする効果的な手段を提供する。すなわち、その発現は動物の食 餌を単純に変えることによって調節される。 ＰＲＰＣ：（／ｂＧＨ遺伝子遺伝合口されているＰＥＰＣＫプロモーターの４６ ０ｂｐに存在するｃＡＭＦ’調節ドメインが遺伝子導入マウスで機能するか否か を確認するＩ；めに、動物に、３０分の２　ｑで３互、：３ｔ２　ｃ　ＡＭ　Ｐ 　８よびテオフィリンを腹疫内投与した。９０分の時点で、動物の尾静脈から採 血し、その血清をｂＧ：（に関して試験した。ｂＧＨの血清レベルは、第１互の ｃＡＭ？注射の後の９０分以内に２〜３倍増加した（第４又）。導入遺伝子の組 込みに関して陽性であるが、その発現に関しては陰左である動物は、Ｂｔ４ｃＡ ＭＰの投与によってｂＧＨの発現が誘発されなかった。すなわち、ｂＧＨを発現 するキメラＰＥＰＣＫ　／　’Ｄ　Ｇ　Ｈ遺伝子を含有する遺伝子導入動物はｃ ＡＭＰ’によるその発現の調節に必要な乞Ｚ作用世配列を含有する。 遺伝子導入動物におけるＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子のＢｔ、　ｃＡＭＰの投与に 対する応答の迅速世はまた、この環状ヌクレオチアがラットの肝臓におけるＰＥ ＰＣＫ遺伝子の転写を２０分以内に８倍まで増加させるということを証明した、 我々の前述の研究から予想されることである：、Ｌａｍｅｒｓ、　Ｗ、Ｊ、等に よるＰｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　％５．７９　：　５ｉ３７−５１４！（１ ９８２年）：。キメラＰＥＰＣＫ／ｂＧＨキメラ遺伝子の構築に使用されたＰＥ ＰＣＫプロモーター／調節域の区分（−４５０／　＋　７３）は−１０７／−７ ９賀の域にｃＡＭＰｔｌ１節天子を含有する二５ｈｏｒｔ、　Ｊ、Ｌ等によるＢ ｉｏｌ。 Ｃ：Ｉｅｍ、　２６ｉ　：　９７２１−９７２６（１９８６年）３゜この因子は 、鶏のシトゾール型ＰＥＰＣＫに係る遺伝子のプロモーター／調節域にも存在す るコア配列ＣＴＴＡＣＧＴＣＡＧＡＧＧを含有する二Ｒｏｄ、　Ｙ。 等に；るＪ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩ！１．２５９　：　１５６０９−２５６ｉ ４（１９８４年）］。この調調節子は、それ自体のプロモーターを含有する異種 遺伝子にｃ　Ａ　Ｍ　？　５受左を付与し、レトロウィルスによるトランスフェ クションにより　：Ｓ：Ｉｏｒｔ、　ＬＭ、等によるＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 ２６ｉ　：　９７２！〜９７２６（１９８６年）：、または感染により、これが 導入される種々のタイプの細胞内で機能することが証明された。我々の発見は、 導入遺伝子が、次の様相で、すなわちその組ｌｉ＆特異士発現ばかりでなく、； Ｉ；正常な染色体位置にある天然の遺伝子の発現を制御する司−ホルモンによっ て調節される遺伝子の能力を保存する様相で、宿主ＬｌＮＡ口に組込まれること を示している。 キメラ？Ｅ、’Ｃ：（／ｂＧＨ遺伝子の組込みおよび発現の異なるパターンが遺 伝子導入マウスのラインで見い出された。約２５ｎｇ／血清ｍＱでｂＧＥを発現 する親動物＃３４は、この親動物の遺伝子細胞の全部における導入遺伝子の存在 と一致して、予想のメンデルの二写で、遺伝子を子孫に伝えｊ；。しかしながら この子孫は、親動物と均等なコピー数を有するけれども、検出できるレベルのｂ ＧＨを発現しなかった。このことはまた、遺伝子導入動物における他の遺伝子に 関しても報告されている〔？ａ　１　ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ，Ｄ、等によるＣｅ１ｌ 　２９　：　７０１＝７！０（１９８２年）〕。ＰＥＰＣＫ／ｂ　（、Ｈ遺伝子 の組込みおよび発現に関して陽性であった親動物＃９はモザイクであった。この 親動物の子孫のうち、５０％より充分に少ない動物は導入遺伝子を含有しており 、この遺伝子に対して場右の動物の口の若千はまた、それを発現するが、他は発 現しなかった。ペテロ接合体であるが、導入遺伝子を発現しない、２″！ＳのＦ １動物（動物＃９の子孫）を交配させると、ｂＧＨを発現するホモ接合体動物が 産生された（データは示されていない）。親動物＃９からは、高レベル（３００ 〜２．３００ｎｇ／血清ｍα）でｂＧＨを発現するＦ１動物とロレベル（４０〜 ｉｏｏｎｇ／血清ｚ＋２）でｂＧＨを発現するＦ１動物と低レベル（ｉ〜１０ｎ ｇ／血清ｍｌ）でｂＧＨを発現するＦ１動物とが産生された。この遺伝子の発現 レベルはコピー数とは厳密には関係しなかっ！；（表１）。 遺伝子導入ラインの一つのセグメントを第１０！に基又として示した。ここに示 されているように、親動物Ｔ　ｇ　［ＯＰ　ＣＧＨＥ９　（＃９）は遺伝子的に モザイクであり、高レベルでｂＧＨを発現した。高レベルの発現を示し、成長増 加が２倍である１四のＦ１雄動物を選び、高レベルの成長ホルモンを発現する動 物の遺伝子導入ラインを始めた。ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子は高発現体Ｆ１雄か らＦ２世代に伝えられた。しかしながら、導入遺伝子を含有する動物の全部がｂ ＧＨを発現するものではなく、コピー数は同一であっても、その発現レベルは異 なる。 Ｆ２世代では、雌にニーコピー数の遺伝子がそれらのゲノムに組込まれたにもか かわらず、雌に比較して有意に多くの雄が高レベルで’ＤＧＨを発現下る（遺伝 子導入雄では２５匹ＣＦ１１匹であるのに対し、選云子導入雌では２！四口１匹 である）。 食頷およびＴルモンにより誘発されるＰＥＰＣＫプロモーター／調節域の急左応 答さおよび肝臓および腎臓におけるその組織特異的発現は、−この動物を、対象 の種々の構造遺伝子の巨標をこれらの組織にあてるための理想的道具にする。遺 伝子導入動物の食餌の原本化物含有量を変えることによって、構造遺伝子の発現 レベルを広範戸にわたり変えることもできる。ＰＥ？ＣＫ遺云子は正常には出生 まで発現しないので、発育田の胎児は結合しｌ；構造遺伝子からの高レベルのタ ンパク質にさらされない。このことは、胎児の正常な発育を壬渉する潜在能力を 有するＧＨの；うな尽ルモンの場合に、明らかに有利である。我々は、このｘｊ Ｊ期の一連の英検から発生した動物の正常な繁殖能力に注＝した。Ｐ三？ＣＫレ ギュロンロのこの組織特異！エレメントは、それ自体のプロモーターを含有する 異種遺伝子の発現を肝臓に向けるために使用することもできるべきである。 高レベル（０，５〜２．３ｕｇ／血清ｍｆｆ）のｂＧＨを発現する遺伝子導入マ ウスは、この導入遺伝子を発現しないそれらの司腹仔のサイズの２倍に成育した （第３又の成長曲線参照）。この変更された成長パターンにもかかわらず、これ らの動物は良好な健康を有し、かつまた繁殖釣に治世であった。しかしながら我 々は、高レベルおよび低レベルのｂＧＨ遺伝子発現レベルを有するマウスが両方 ともに、キメラＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子を発現しないマウスに二較して、イン シュリン投与に対してより敏感であることに気付いた。導入遺伝子を含有するが 、これを発現しないマウスは、正常な対照動物より以上には敏感ではない。遺伝 子導入動物に対する低濃度（０，０５Ｕ／ｋｇ）のインシュリンの投与は、グル コース栄養源の不存在の下では致死的であった。 成長ホルモンタンパク質を注射した豚の性能特質を模倣する表現型を有する遺伝 子導入豚を竺産するためにＰＥＰＣＫ−ｂＧＨｉ伝子を含有する２、８キロベー ス（ｋｂ）線状フラグメントの約４００コピーを豚の受精卵の竺殖核甲に注入し た。千五十七個（１０５７）の卵に注射し、３３四の！調養育豚に移し入れた： これらの豚のうちの２２２！！はそれらの妊娠を保持し、１１２個の注入卵から 竺きて竺よれた新竺児を得た。 これらの動物に組込；れたＰＥＰＣＫ−ｏＧＨ遺云子配列の大体の数はドツトハ イブリッド形成法によって測定した。場左の動物は１〜２００コピー／細胞の範 戸のコピー数を有する組込み配列を含有することが証明された。１７匹の遺伝子 導入動物は、それらの循環血清内で、格別のレベルのと成長ホルモンタンパク質 を示し、その濃度は、ラジオイムノ検定法お；びＥＬＩＳＡｓ定法により測定し て、）　ｎｇ／ｍＱ〜２００ｎｇ／ｍＱの範囲であった。 これらの動物のうちの２匹（＃ユ１および＃４４）におけるｂＧＨ遺伝子の組込 みおよび発現の詳細な分析を以下に示す。 豚の尾から８ｅしたゲノムＤＮＡをＥｃｏＲｌ、Ｋｐｎｌ、ＰｓｔＩお；び？ｖ ｕｌＩで消化させた。消化したＤＮＡを、ラッ；ｐＥｐｃｘ遺伝子の−５４７− ＋７３のＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩ［フラグメント（これは「ランダムプライミング 」によって標識されている）とハイブリッド形成させｊ；。ゲノムＤＮＡのＥｃ ｏＲ工消化によって、１記プローブとハイブリッド形成した２、８ｋｂフラグメ ントを得た。これはその導入遺伝子が豚＃１２８よび＃４４の宿主ゲノム内に組 込まれＩ；縦並びの反復員位として存在することを示した。この尊入選伝子内に は４つの内部Ｐｖｕ１１部位が存在する；これらの部位のうちの３つはＢ　ａ　 ｍ−ＨニーＢ　ｇ１ゴグローブとハイブリッド形成する＊　７４０ｋｂ〜５２０ ｋｂの予想されｔ；内部７ラグメントが両動物からのゲノムＤＮＡ田に見い出さ れた。縦並びの反復単位間の接合部に存在する第３の７ラグメン

【は７４０ｂり 内部フラグメントと周一サイズである。両方の動物において、導入遺伝子は縦並 びの反復巣位として存在し、これらの；で、遺伝子のコピーの若モは、ＫｐｍＩ ３よびｐｓｔ！で消化した後に竺じる制限フラグメントにより示されるように、 進角きになる。導入遺伝子の頭−尾、尾−頭反復単位は消化後に、５．０スｂフ ラグメントを竺じ、導入遺伝子の頭反復単位Ｃ；、Ｋｐｎｒで消化した後に、５ ．０Ｋｂ−ｙラグメントを生じる。 これは、ＢａｍＨＩ−ＢｇｌｌＩ　ＤＮＡプローブと、２つの位置でハイブリッ ド形成する。豚＃１１および豚＃４４の両方がらのゲノムＤＮＡは、Ｋｐｒｒｉ で消化させると、　５．０Ｆｔｂフラグメントを生じたａ　Ｐ　Ｓ　ｔ　１によ る消化は、この導入遺伝子が逆向きにされｔ；場合に、グローブとその２つの位 置でハイブリッド形成する１、；ｉｂの７ラグメンｋを竺じるべきである。豚＃ ４４がものＤＮＡは？ｓｔ工消化に；すｉ、２スｂ７ラグメントを竺じグニ。こ れはＸ接する頭−頭反復嵐位の存在と一致する。１．７Ｋｂ７ラグメントは外３ ％ＰＥＰＣＫフラグメントであり、これはＢａｍＨＩ−８ｇ１Ｍグローブとハイ ブリッド形成する。豚＃】１からのＤ”ＪＡｆ？ｓ　ｔ　Ｉと消化させた場合に は、豚＃４４に見い呂されｆ：１−２Ａ’＊７ラグメントではなく、１．７：（ ｂフラグメントを見い已した。さらに、この動物には、４．ＯＫｂの７ラグメン トが存在した。 これ（＝、この動物内の導入遺伝子のコピーにおけるＰｓｔ−工部位の欠失を示 している。 詳細な：ｎＲＮＡレベルでの組織特異性発現の分析は豚＃１１または他の遺云子 導入豚で行わなかったが、これは我々が世能研究８よび繁殖研究に対してそれら の竺存可能士を保有することを望んだからであり、他方、豚＃４４はこの百的の ために犠牲にしｌ；。 豚＃４４０Ｅ臓、腎臓、肺臓、牌臓および腸がら単離しｆ；ＲＮＡを、ＢａｍＨ ４お；びＰｓｔＩにょるＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子の’？Ｊｊ　”！エンドヌク レアーゼ消化により生成したＤＮＡの５′−天端標識した７ラグメントとハイブ リッド形成した後に、Ｓ１ヌクレアーゼ消化させた。さらに、司−のＰＥＰＣＫ ／ｂＧＨキメラ遺伝子を含有し、＞５００ｎｇ／血清レベルでｂＧＨを発現する 遺伝子導入マウスからのＲＮＡを分析した。Ｂ　ａｍＨＩ−ＰｓｔＩプローブの 邦３っｐ７ラグメントは、検介した他の豚組織からのＲＮＡにＪってで！＝なく 、豚評臓がらのＲＮＡに；って、ヌクレアーゼ消化から保護しｌ；。従って、Ｐ ＥＰＣＫ遺伝子からの５″−７ランキング配列の４６０ｂｐを遺伝子導入動物の 結合ｂＧＨ構造遺伝子の組織特異性発現にむけることができる。 ＰＥＰＣＫは２７１１期には、補色動物種の肝臓、腎臓の皮質で発現される；し かしながら、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨｍＲ，ＮＡは豚＃４４の肝臓にだけむけること ができる。これに対して、計度および腎臓の両方にｍＲＮＡが存在する遺伝子導 入マウスにおいては、肝ｆｆｍＲＮＡ対腎臓ｍＲＮＡの比工は外米ＰＥＰＣＫ　 ｍＲＮＡに見い出される比厘よりも低いｊＭｅ　１ｓｎｅｒ　、　Ｈ等にょるＢ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４４　：　４１２−４２５（１９８５）Ｌこれは 、ＥｃｏＲｌ−Ｂｇｌ−ＩＩ７ラグメント以外の別の配列が腎臓における導入遺 伝子の充分な発現に必要であることを示している。Ｓ１ヌクレア一ゼ分析はまた 、原註のＰＥＰＣＫ／ｂＧＨキメラ遺伝子が転写の正しい開始部位を使用するこ とを示している。何故ならば、予想のサイズの７ラグメント（１３３ｂｐ）は保 護されているからである。 その血清口にｂ　Ｇ　Ｈ２００ｎｇ／ｍＱを含有することが、二重ラジオイムノ 検定およびＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定に；って証明された豚＃１１を、その遺伝子導入 されていない雄の司腹仔（＃ｉ２）と。同様の食餌計画の下においた。食餌：体 重増加比率および背口の脂肪の測定値を９咬した。食餌：体重増加比率は、遺伝 子導入されていない対照ｌ：、：咬して、ＰＥＰＣＫ／ｂＧＨ遺伝子導入豚＃１ １において格別に減りした（制限食餌供給条件−に３０％の減少）。 豚＃１１および＃１２を、それぞれ約４５日間の２回の連続期間にわたり二重し た。動物には、同期間の間、１６％粗タンパク質の石版の仕上げ胴料を与えた。 これらの豚は、適時の飼蜂供給期間（期間１）の場合には、５０〜７５眩の体重 を有し、１２５ヨ令であった。これらの動物の食餌を第二期覧口は、２．８ｋｇ 飼料／ヨに制限しｔ；。 表２ 適時賃料供給　霊水供給８１１限 豚＃１１　豚＃１２　豚＃１１　豚＃１２品均−ヨ体重 増加（ｋｇ）　２．０　！、２　０．８　０．５食４ｆＸ：体重 増加　３．８　４．２　３゜５５．３ 最も顕著な発見は、豚＃１１の体脂肪が、対照に二重して劇的に減りしたことで あった。第１１ｃＥのデータは、遺伝子導入豚（＃　：　ｉ　）が、彼の貝腹仔 の対照に比較して、扁−食餌供給計蚤にわたり、２／２少ない背口の脂肪の蓄積 を示し！こことを示している。これらの結果は、外米成長ホルモンを投与した豚 に見い＝される成長および骨格構造の変化に比較して、好；しいことである：Ｃ ｈｕｎｇ、　Ｃ，Ｓ、等によるＪ、　Ａｒ＋ｉｍａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　６０ 　：　１ｉ８〜二３０（ｉ９８５）；　ＥＬｈｅｒｔｏｎ、　Ｔ、Ｄ、等による Ｊ、　Ａｎｉｍａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　６３：　１３８９−１３９９（ｉ９８ ６）；　Ｍａｃｈｌｉｎ、　Ｌ、Ｊ、によるＪ、　Ａｎｉｍａｌ　５ｃｉｅｎｃ ｅ。 ３５　：　７９４〜７９９（ｉ９７２）：。重大なことに、成熟して出竺したＰ Ｅ？ＣＫ／ｂＧＨ遺伝子導入豚では、いずれにも異常あるいは病気は見い巳され なかった。これらの動物はまた、正常な性欲を示し、繁殖的に健全であるように 見做された。 これらの英検は、適当に調節された場合に、牧畜動物の生殖紀胞うインロに導入 された遺伝子が動物の左能および牧畜業の経済士に対して、きわ立った、明白な 効果を有することができることを証明している。最近数年の間に、マウスにおけ る研究によって、導入遺伝子の発現は時間および組織の選択の結果として調節で きることが証明されている［Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ，Ｄ、等によるＣｅ１１． ４１　：　３４３−３４５（１９８５）〕、これらの原則を適用すると、不発明 のＰＥＰＣＫプロモーター／調節エレメントを使用することによって、赤身の内 生産物を生成する遺伝子導入した豚のラインを製造することができ、経済効率（ 飼料二体重増加比率）が増大される。このことはｊｙｅ亘Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａ ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅが最近に、過度の動物士脂肪の摂取がｘ３ において食餌父連疾掴の最も重大な一天であると報告していることから、豚肉製 品を食する者の健康に対して朗確な効果をもたらすものと言うことができる：Ｃ ａ１１．　Ｄ、Ｌ−等によるＤｅｓｉｇｎｉｎｇ　Ｆｏｏｄｓ　：　Ａｎｉｍａ ｌ？ｒｏｃ！ｕｃｔ　０ｐｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍａｒｋｅｔｐｌａｃｅ 、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｉ１Ｃ。 ｕｎｃｉｌ、　１８〜６２（１９８８）：。 ！Ｉｉ乳動物肝臓における糖新生 」ｉ ＦＪＧ、３ 年令（日数） ７口 均ｂＧＨ／ｍｌ　二ｍ μ３　ｂＧＨ／ｍｌ　血清　ホールド　インダクノジンＡ、　Ｂ。 ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、　９ 補正書の写しく翻訳文）提出書［特許法第１８４条の８コ平均背中の月旨月方（ ｍｍ〕 請求の範囲 ’　１．＃ｔ−ＰＥＰＣＫｍ！！ｅ−７１：６ＭＴ、！６ようｌ：　Ｍ　！　＊ 　ｈ　？、：　Ｐ。 ＰＣＫプロモーターを担持する細胞の１個または２個以上を含ことを特徴とする 製造方法。 ７．ベクターを１個または２個以上の胚細胞中に微量注入することによって導入 し、この胚を完全動物にまで発育させる、請求項６の方法。 ８、上記ベクターがレトロライリスである、請求項６の方法。 ９、上記ベクターを胎児腹腔中に注入し、これにより肝細胞に対する前駆体であ る細胞の１個または２個以上をベクターによってトランスフェクションを行い、 その発生の後に、この遺伝子を肝細胞中に保有させる、請求項８の方法。 １０、遺伝子欠失を有する動物の処置方法であって、その発現がこの欠失を補正 するのに必要である遺伝子を上記動物中に導入することを含み、この遺伝子がＰ ＥＰＣＫプロモーターに作動できるように結合されている、処置方法。 １１、遺伝子導入動物から採った哺乳動物細胞で非−ＰＥＰＣＫポリペプチドを 産生する方法であって、上記細胞を、ＰＥＰＣＫプロモーターに作動できるよう に結合されている非−ＰＥＰＣＫ構造遺伝子で形質転換し、この細胞を適当な培 養培地中で培養し、次いで上記遺伝子による上記ポリペプチドの発現を、刺激に よって誘発することを含む方法。 １２、プロモーターを、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐにより、あるいは細胞によ、り代謝され た場合に、高い細胞内レベルでｃ　Ａ　Ｍ　Ｐを生じる物質により、刺激する、 請求項１１の方法。 １３、細胞が肝細胞である、請求項１２の方法。 １４、動物中に非−ＰＥＰＣＫポリペプチドを産生ずる方法であつて、非−ＰＥ ＰＣＫ構造遺伝子が作動できるようにＰＥＰＣＫプロモーターが結合された１個 または２個以上の細胞の存在によって特徴付けられた動物を用意し、この遺伝子 を発現するようにこれらの細胞を誘発し、これによって上記ポリペプチドを産生 ずる方法。 １６、発現を、タンパク質を増加するか、または炭水化物を減少させた食餌を動 物に与えることによって増加させる、請求項１請求項１８の方法。 １８、ＰＥＰＣＫプロモーターに作動出来るように結合されている非−ＰＥＰＣ Ｋ遺伝子を担持する細胞の１個または２個以上を有する遺伝子導入動物における 、非−ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を調節する方法であって、上記細胞中のＰＰＰＣ Ｋプロモーターが第一刺激への応答性と第二刺激への応答性とで異なるレベルの 活性を有し、第一および第二の環境的刺激に上記動物をおき、これによって結合 されている非−ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を調節する方法。 ！９９発現を、タンパク質が増加しているか、または炭水化物が減少しているこ とを特徴とする食餌を動物に与えることによって増加させる、請求項１８の方法 。 ２０、発現を、炭水化物が増加しているか、またはタンパク質がて減少させる、 請求項１８の方法。 ２１’、（ａ）発現の増加が望まれる場合には、タンＩくり質対炭水化物の比率 の高い食餌を動物に与え、そして（ｂ）発現の減少が望まれる場合には、タンパ ク質対炭水化物の比率の低い食餌を動物に与える、ことをさらに包含する、請求 項１８の方法。 ２２、発現を、炭水化物が実質的に欠けている食餌を動物に与えることによって 、増加させる、請求項１８の方法。 ２３、食餌が少なくとも約５０％のタンパク質を特徴する請求項２２の方法。 ２４、食餌が少なくとも約７０％の炭水化物を特徴する請求項２１の方法。 ２５、出生後にだけ実質的に発現する遺伝子のプロモーターを担持する細胞の１ 個または２個以上を有し、このプロモーターが天然では結合されていない遺伝子 に作動できるように結合されている、人間以外の遺伝子導入動物。 ２６、上記プロモーターが誘発性である、請求項２５の動物。 ２７、上記プロモーターが高タンパク質および低炭水化物により誘発性である、 請求項２６の動物。 ２８、上記プロモーターがＰＥＰＣＫプロモーターである、請求項２７の動物。 ２９、遺伝子導入動物において、実質的に出生後にだけポリペプチドを産生させ る方法であって、このポリペプチドは上記動物中に出生前に存在する遺伝子によ りコードされるものであり、この方法は、遺伝子導入動物中で上記ポリペプチド の発現を刺激することを包含し、この動物は上記遺伝子が欠失している粗動物の 細胞の１個または２個以上を、ベクターにより、出生前に形質転換することによ り、直接に、または間接的に上記遺伝子を受入れた動物であり、このベクターは 出生後にだけ本質的に正常に発現する第二の遺伝子のプロモーターに作動できる ように結合された上記遺伝子を有するものであり、そしてこの遺伝子導入動物は その遺伝子を保有する改質された粗動物またはその子孫の一種である、産生方法 。 ３０、プロモーターがＰＥＰＣＫプロモーターである、請求項２９の方法。 ３４、発現が組織特異性である、請求項２１の方法。 ３５、発現が主として肝臓である、請求項３４の方法。 ３６、上記遺伝子がホルモンを特徴とする請求項１の動物。 ３７、上記遺伝子が成長ホルモンを特徴とする請求項３６の動物。 ３８、上記遺伝子がチロイド放出性ホルモンを特徴とする請求項３６の動物。 ３９、上記遺伝子がＰＥＰＣＫ以外の酵素を特徴とする請求項１の動物。 ４０゜非−ＰＢＰＣＫ構造遺伝子に作動できるように結合されているＰＥＰＣＫ プロモーターを含有するキメラＤＮＡ分子。 ４１、肝ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐレベルに影響を及ぼす食餌を動物に与えることによって 発現を調節し、上記細胞が肝細胞である、請求項１８の方法。 ４２．上記遺伝子によってコードされるポリペプチドの成熟動物発現対胎児発現 の比率が少なくとも１０：ｌである、請求項１の動物。 ４３、当該プロモーターに対して外来である遺伝子に作動できるように結合され ているプロモーターを担持する細胞の１個または２個以上を含有し、上記遺伝子 の下における成熟動物発現対胎児発現の比率が少なくともｌＯ：１である、人間 以外の遺伝子導入動物。 ４４、転写の誘発に際して、上記遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの転写比 率が、メタロチオネイン　プロモーターに結合させた場合の、この遺伝子により コードされるｍ　ＲＮ　Ａの転写比率の少なくとも約４倍である、請求項４３の 動物。 ４５、上記プロモーターの下における遺伝子の発現が動物の食餌の調節によって 制御される、請求項１Ｏの動物。 ４６、ベクターを、インビトロで細胞中に導入し、この細胞を次いで、この細胞 を増殖することができる動物中に導入する、請求項６の方法。 ４７、異種遺伝子を動物の肝細胞中に導入する方法であって、動物に対して異種 の遺伝子を担持するレトロライリス　ベクターを用意し、このベクターを胎児段 階の動物の腹腔内に注入し、次いで動物をその胎児段階から発育させることを包 含する方法。 ４８、上記遺伝子がＰＥＰＣＫプロモーターに作動できるように結合されている 、請求項４７の方法。 ４９、レトロライリス　ベクターが複数欠失性である、請求項４７の方法。 ５０、第一および第二の環境的刺激間の差違が、食餌において動物に提供された ホルモンレベルでの差違ではない、請求項１８の方法。 ５１、上記非−ＰＥＰＣＫポリペプチドが動物の主として肝臓中で産生されるも のである、請求項１４の方法。 手続補正書動剣 平成２年１１月７日

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．非ＰＥＰＣＫ構造遺伝子に作動できるように結合されたＰＥＰＣＫプロモー ターを担持する細胞の１個または２個以上を含有する、人間以外の遺伝子導入動 物。
2. ２．上記細胞が生殖ライン細胞を含む、請求項１の動物。
3. ３．上記細胞が動物の選ばれた組織または臓器に属するものである、請求項１の 動物。
4. ４．上記細胞が選ばれた条件の下で、遺伝子を発現するものである、請求項１の 動物。
5. ５．上記動物が出生後に上記細胞で上記遺伝子を発現できるが、出生前には、こ のような発現を実質的にすることができないものである、請求項１の動物。
6. ６．食餌タンパク質および炭水化物を制御することによって調節されている導入 非−ＰＥＰＣＫ構造遺伝子を有する、人間以外の遺伝子導入動物の製造方法であ って、（ａ）非−ＰＥＰＣＫ構造遺伝子に、作動できるように結合しているＰＥ ＰＣＫプロモーターを用意し、キメラ発現ユニットを形成し、 （ｂ）このキメラ発現ユニットを、上記動物種の細胞内で複製できるベクター中 に入れてクローン化し、次いで（ｃ）このベクターを上記細胞中に導入し、上記 遺伝子導入動物内で、または上記遺伝子導入動物中に入れることにより、上記細 胞の増殖を促進させる； ことを特徴とする製造方法。
7. ７．上記ベクターを１個または２個以上の胚細胞中に微量注入することによって 導入し、この胚を完全動物にまで発育させる、請求項６の方法。
8. ８．上記ベクターがレトロウイルスである、請求項６の方法。
9. ９．上記ベクターを胎児腹腔中に注入し、これにより、肝細胞に対する前駆体で ある細胞の１個または２個以上をベクターによってトランスフェクションを行な い、その発生の後に、この遺伝子を肝細胞中に保有させる、請求項８の方法。
10. １０．遺伝子欠失を有する動物の処置方法であって、その発現がこの欠失を補正 するのに必要である遺伝子を上記動物中に導入することを含み、この遺伝子がＰ ＥＰＣＫプロモーターに作動できるように結合されている、処置方法。
11. １１．哺乳動物細胞で非−ＰＥＰＣＫポリペプチドを産生する方法であって、上 記細胞を、ＰＥＰＣＫプロモーターに作動できるように結合されている非−ＰＥ ＰＣＫ構造遺伝子で形質転換し、この細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで 上記遺伝子による上記ポリペプチドの発現を、上記プロモーターの刺激によって 誘発することを含む方法。
12. １２．プロモーターを、ｃＡＭＰにより、あるいは細胞により代謝された場合に 、高い細胞内レベルでｃＡＭＰを生じる物質により刺激する、請求項１１の方法 。
13. １３．細胞が肝細胞である、請求項１２の方法。
14. １４．細胞が遺伝子導入動物の細胞である、請求項１１の方法。
15. １５．発現を、タンパク質対炭水化物の比率が高い食餌を動物に与えることによ って増加させる、請求項１４の方法。
16. １６．発現を、タンパク質を増加するか、または炭水化物を減少させた食餌を動 物に与えることによって増加させる、請求項１４の方法。
17. １７．発現を、細胞をｃＡＭＰにさらすことによって増加させる、請求項１２の 方法。
18. １８．ＰＥＰＣＫプロモーターに作動出来るように結合されている非ＰＥＰＣＫ 遺伝子を担持する細胞の１個または２個以上を有する遺伝子導入動物における、 非−ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を調節する方法であって、ＰＥＰＣＫプロモーター が応答性にするような体験条件が上記細胞にもたらす環境的刺激に上記動物をお くことを包含する方法。
19. １９．発現を、タンパク質が増加しているか、または炭水化物が減少しているこ とを特徴とする食餌を動物に与えることによって増加させる、請求項１８の方法 。
20. ２０．発現を、炭水化物が増加しているか、またはタンパク質が減少しているこ とを特徴とする食餌を、動物に与えることによって減少させる、請求項１８の方 法。
21. ２１．（ａ）発現の増加が望まれる場合には、タンパク質対炭水化物の比率の高 い食餌を動物に与え、そして（ｂ）発現の減少が望まれる場合には、タンパク質 対炭水化物の比率の低い食餌を動物に与える、 ことをさらに包含する、請求項１８の方法。
22. ２２．発現を、炭水化物が実質的に欠けている食餌を動物に与えることによって 、増加させる、請求項１８の方法。
23. ２３．食餌が少なくとも約５０％のタンパク質を含有する、請求項２２の方法。
24. ２４．食餌が少なくとも約７０％の炭水化物を含有する、請求項２１の方法。
25. ２５．出生後にだけ実質的に発現する遺伝子のプロモーターを担持する細胞の１ 個または２個以上を有し、このプロモーターが天然では結合されていない遺伝子 に作動できるように結合されている、人間以外の遺伝子導入動物。
26. ２６．上記プロモーターが誘発性である、請求項２５の動物。
27. ２７．上記プロモーターが高タンパク質３よび低炭水化物により誘発性である、 請求項２６の動物。
28. ２８．上記プロモーターがＰＥＰＣＫプロモーターである、請求項２７の動物。
29. ２９．遺伝子導入動物において、実質的に出生後にだけポリペプチドを産生させ る方法であって、このポリペプチドは上記動物中に出生前に存在する遺伝子によ りコードされるものであり、この方法は、遺伝子導入動物中で上記ポリペプチド の発現を刺激することを包含し、この動物は上記遺伝子が欠失している親動物の 細胞の１個または２個以上を、ベクターにより、出生前に形質転換することによ り、直接に、または間接的に上記遺伝子を受入れた動物であり、このベクターは 出生後にだけ本質的に正常に発現する第二の遺伝子のプロモーターに作動できる ように綜合された上記遺伝子を有するものであり、そしてこの遺伝子導入動物は その遺伝子を保有する改質された親動物またはその子孫の一種である、産生方法 。
30. ３０．プロモーターがＰＥＰＣＫプロモーターである、請求項２９の方法。
31. ３１．人間以外の遺伝子導入動物であって、第二の遺伝子のプロモーターに作動 できるように結合されている、第一の遺伝子を有する細胞の１個または２個以上 を含有し、上記細胞中のこの第一の遺伝子の発現が組織特異性である、遺伝子導 入動物。
32. ３２．組織が肝臓である、請求項３１の動物。
33. ３３．プロモーターがＰＥＰＣＫプロモーターである、請求項３２の動物。
34. ３４．発現が組織特異性である、請求項２１の方法。
35. ３５．発現が主として肝臓である、請求項３４の方法。
36. ３６．上記遺伝子がホルモンをコードする、請求項１の動物。
37. ３７．上記遺伝子が成長ホルモンをコードする、請求項３６の動物。
38. ３８．上記遺伝子がチロイド放出性ホルモンをコードする、請求項３６の動物。
39. ３９．上記遺伝子がＰＥＰＣＫ以外の酵素をコードする、請求項１の動物。
40. ４０．非ＰＥＰＣＫ構造遺伝子に作動できるように結合されているＰＥＰＣＫブ ロモ−ターを含有するキメラＤＮＡ分子。
41. ４１．肝ｃＡＭＰレベルに影響を及ぼす食餌を動物に与えることによって発現を 調節し、上記細胞が肝細胞である、請求項１８の方法。
42. ４２．上記遺伝子によってコードされるポリペプチドの成熟動物発現対胎児発現 の比率が少なくとも１０：１である、請求項１の動物。
43. ４３．当該プロモーターに対して外来である遺伝子に作動できるように結合され ているプロモーターを担持する細胞の１個または２個以上を含有し、上記遺伝子 の下における成熟動物発現対胎児発現の比率が少なくとも１０：１である、人間 以外の遺伝子導入動物。
44. ４４．転写の誘発に際して、上記遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの転写比 率が、メタロチオネインプロモーターに結合させた場合の、この遺伝子によりコ ードされるｍＲＮＡの転写比率の少なくとも約４倍である、請求項４３の動物。
45. ４５．上記プロモーターの下における遺伝子の発現が動物の食餌の調節によって 制御される、請求項１０の動物。
46. ４６．ベクターを、インビトロで細胞中に導入し、この細胞を次いで、この細胞 を増殖することができる動物中に導入する、請求項６の方法。
47. ４７．異種遺伝子を動物の肝細胞中に導入する方法であって、動物に対して異種 の遺伝子を担持するレトロウイルスベクターを用意し、このベクターを胎児段階 の動物の腹腔内に注入し、次いで動物をその胎児段階から発育させることを包含 する方法。
48. ４８．上記遺伝子がＰＥＰＣＫプロモーターに作動できるように結合されている 、請求項４７の方法。
49. ４９．レトロウイルスペクターが複製欠失性である、請求項４７の方法。