JPH03500484A - Ｌ‐アミノ酸およびアミノ酸アミドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ−アミノ酸およびアミノ酸アミドの製造方法〔産業上の利用分野〕 本発明は、請求の範囲に記載された、Ｌ−アミノ酸およびアミノ酸アミドの製造 方法に関する。

醇による製造方法は公知である（ヨーロッパ特許出願公開第２３２１４号入これ らの公知方法では、α−アミノニトリルをＬ−アミノ酸に加水分解するが、Ｄ形 のα−アミノニトリルは加水分解されないかまたはたんにＤ−アミ゛）酸アミｒ に加水分解されるにすぎない。

〔発明を達成するための手段〕

ところで、特定の微生物はＬ−アミノ酸アミドアミダーゼを有するだけでなく、 さらにＤ−アミノ酸アミ′ドをり、、Ｌ−アミノ酸アミドに２セミ化するアミノ 酸アミドラセマーゼをも有することが判明した。従って、の発見は専門家にとり 困難でない。通常のスクリーニング方法を用いて糧々の微生物を、該微生物がＤ −アミノ酸アミｒｔ−Ｌ−アミノ酸に変換する能力を有するか否かｔ−調べる。

この能力を顕著な程度に有する公知微生物は笑験によれば、アルスロバクタ−（ ＡｒｔｈｒＯ’ｂａＣｔｅｒ　）　８１）、、　ＡＴＣＣ３１６５２およびコリ ネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔａｒｉｕｍ　）　ａ、ｐ、、　ＡＴＣＣ ３１６６２である。

さらに、α−アミノニトリルをアミノ酸アミドに変える能力を有し、その際核酸 アミｒをさらに加水分解することもない微生物が存在することが見出された。

土壌サンプルから、’Ｄ、Ｌ−ｆｆ−アミノーβ−７エ二ルｆロピオニトリルを フェニルアラニンに分解する能力を有する微生物が単離された。

この微生物は次の分類学的特性を有する：コロニーの形態　円形、平滑な縁部 半透明、粘液状 細胞形態　不動性短桿状 長さ１．５〜２．５μｍ、 ＠１μｍ グラム染色性　グラム陰性 チトクロームー〇−オキシダーゼ　陰性クエン酸利用　陽性 硝酸塩からの亜硝酸塩　陰性 ７オゲス・プロスカラエル反応　陰性 メチルレッド　陰性 インドール生成　陰性 つ°レアーゼ　陽性 Ｈ２Ｓ生成　陰性 糖利用　グルコースから酸、 サッカロース、フジクト マンニット、グリセリン からは酸生成せず、ガス 生成なし この微生物は、その形態学的および生理学的特性に基づき、ベルディ（Ｂｅｒｇ ｅｙａ　）の同定ａ菌学マニュアシ ルの基準により、ア２ネトバクター争カルコアセチクス（Ａｃ１ｎθｔｏｂａｃ ｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ　）と決定された。

こ（Ｄ微生物はＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニシン（ＭＮＮＧ 　）により変異され、Ｄ、Ｌ−α−アミノニトリルをただり、Ｌ−アミ７ノ酸ア ミｒの段階まで加水分解する能力を有するアミダーゼ不含変異体を単離した。こ の変異体は、ゝ　ドイツチェン・デムＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒ ｇａｎｉｓｍｅｎ　）　’において、ＤＳＭ３８７５なる番号で寄託された。

Ｂｐ、　ＡＴＣＣ３１６５２またはコリネバクテリウムａｐ。

ＡＴＣＣ３１６６２を用いて、Ｄ、Ｌ〜α−アミノニトリルをＬ−アミノ酸に１ 副産物Ｄ−アミノ酸アミドが残留することなしに加水分解することが可能である 。

本発明方法を周込て合成することのできるアミノ酸は、たとえばホッペ・ディシ ー（Ｈｏｐｐθ−８ｅｙｌｅｒ　）の生化学専門誌（’　Ｚ、　Ｐｈｙｅｉｏｌ 　Ｃｈｅｍ、　’　）、第５４８巻（，１９６７年）第２５６頁〜第２６１頁に 記載されたアミノ酸ならびにその誘導体であり、これらのものにおいては場合に より式■による基Ａ中に存在するヒドロキシ基、チオール基、アミノ基およびカ ルボキシル基は適当な保護基によって封釦されている。

かかるアミノ酸は、その工莱的利用可能性に関して、基Ａが請求の範囲第４項に 記載されたものを表わす、本発明による合成法の望ましい目的物である。

適当なアルキル基Ａとしては、たとえばメチル基、エチル基、プロピル基、１− メチルエチル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルゾロピル基、１ ．１−ジメチルエチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、３−メチルブチル 基またはヘキシル基が挙げられる。殊に望ましいアルキル基Ａは、最高６個の炭 素原子を有するもの、たとえば目的物アラニンのメチル基、バリンの１−メチル エチル基、ロイシンの２−メチルゾロピル基、インロイシンの１−メチルプロピ ル基またはα−７ミノ酪酸のエチル基である。

アルキルＭＡは場合によりヒドロキシ基、メルカプト基、アミン基またはカルボ キシル基によって置換されていてもよい（その際モノ置換アルキル基が望ましｌ 、−、）か、または酸素原子（とくに１個）、炭素原子（とくに１個または２個 ）または硫黄原子（とくに１個〕によって中断されてｂてもより０ヒドロキシ基 またはメルカプト基によって置換されてｂるアルキル基としては、セリンのヒド ロキシエチル基、トレオニンの１−ヒドロキシエチル基、システィンのメルカプ トメチル基、ホモシスティンの２−メルカプトエチル基およびβ−チオバリンの １−メルカプト−１−メチル−エチル基がと（に挙げられる。硫黄原子によって 中断されたアルキル基Ａとしては、メチオニンの２−メチルチオエチル基が挙げ られる。置換基としてアミノ基を有するアルキル基Ａは、たとえばα、γ−ジア ミノ酪酸の２−７ミノエチル基、オルニチンの３−アミノプロピル基およびリシ ンの４−７ミノプチル基である。カルボキシル基によって置換されたアルキル基 Ａは、たとえばグルタミン酸の２−カルボキシエチル基ジル基または３〜インド リルメチル基Ａとしては、たと１−ｊ４−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキ シフェニルメチル基および５−ヒドロキシ−６−インドリルメチル基が挙げられ る。

本発明は、請求項１に記載された、一般式］で示されるα−アミノ−ニトリルか ら一般式Ｉで示されるＬ−アミノ酸の製造方法、ならびに請求項２に記載された 一般式■で示されるアミノ酸アミドの製造方法および請求項３に記載されたこれ らアミドからのＬ−アミノ酸の製造方法に関する。

これらの方法を実施するために使用される微生物は、適当な培養基中で通気、液 内培養で、通常使用される培養条件下に培養される。次いで、培養物に基質（と が達成されるまで発酵させる。

適当な基質溶媒は、たとえば水、メタノール、エタノール、グリコールモノメチ ルエーテル、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドである。

最適の基質濃度、基質添加時間および発酵時間は、使用される基質の構造および 使用される発酵条件の梅類に依存する。これらの大きさは、微生物による発酵の 際に一般に必要であるように、個々の場合に、専門球に周知であるような予備試 験によって確かめねばならない。発酵の間、発酵液のめ値は７．５〜１０の阻値 に調節される。

他面において、培養された微生物をたとえば濾過または遠心分離によって培地か ら分離し、基質の発酵を単離された細胞物質を用い休止細胞法で実施することも 可能でありかつ目的物の強い極性のためにしばしばさらに、本発明方法は固定化 微生物を用いて非常に良好に実施しうろことが期待される。

微生物を非変性ポリマーに埋設することによる微生ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ ｎｔ　’　；　１９７８年；　ｓ、ｐ、　ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ、Ｏ＋ｘａ ｐ１ａｎ　’　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＫｎＺ７ｍＯＩＯｇ７　“。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｆＭ　４’　４巻、１ ９７６年、およびＢｏ　Ｍａｔｔｈｉａｓｓｏｎ　’工ｍｍｏ’ｂｉｌｉｓｅｄ 　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄＯｒｇｎｅｌｌｓ　’、ＣＲＣＰｒｅｓｓ工ｎｃ、、　Ｂ ｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆ１ｏｒｉ＋ｉａ第１および第２巻）。

適当な固定化物および推定ニ アルギン酸塩ベースの微生物固定化物 これは、微生物をアルギン酸ナトリウム０．５〜５重量％を含むプレポリマー水 溶液に懸濁させ、この懸濁液を温度５〜４０℃で攪拌下に、アルミニウム塩また はとくにカルシウム塩（たとえば塩化カルシウム）の０．０１〜０．４モル水溶 液に加えることによって製造される。

カラデナンベースの微生物固定化物 これはたとえば、微生物を２５〜５０℃に加熱した。

０．１〜１．０重量％の力５ダナン水溶液に懸濁させ、溶液をデル状になるまで 放冷し、デルを機械的に粉砕し、次いでカリウム塩（たとえば塩化カリウム）の ０．２〜２．０重量％水溶液中で固化することによって製造される。

キトサンベースの微生物固定化物 これはたとえば、微生物を２０〜４０°Ｃに加熱した、０．５〜１３％のプロト ン化（ｐＨ４，５〜５．５に調節され０．０１〜１モル／ｌを有する〕を滴加す ることによって製造することができる。

請求項１による本発明方法は、微生ｖＪを順次にまたは同時に式■で示されるα −アミノニトリルに作用させるようにして実施することができる。異なる微生物 を同時に基質に作用させる場合には、アシネトバクタ−・カルコアンチクムおよ びアル／ロバフタ−Ｂｐ、ないしはコリネバクテリウムａｐ、の細胞ヲ１：２〜 １：２０の割合で互いに混合するのが有利である。

〔実施例〕

例　１ ａ）クエン酸三ナトリウム　ｏ、ｏ　ｓ　ｇリン酸水素二カリウム　０．３５　 ｇ 硫酸マグネシウム７水和物　ｏ、ｏ　ｉ　、ｐプロピオン酸アミド　ｏ、ｉ　ｙ を含有する滅菌培地１００Ｊｌｊ′ｔ−有する５　００　ｍｌのエルレンマイヤ ーフラスコに、アシネトバクタ−φカルコアセチクムＤＳＭ　３８７５の培養物 を接種し、６０℃で２０時間１８０　ｒ、ｐ、ｍ、で振と５する。

次いで、細胞を遠心分離し、ｐＨ７，０の０．１モル−リン酸カリウム緩衝液２ ０１ｎｌ中に再懸濁させる。

ｂ）クエン酸三ナトリウム　ｏ、ｏ　ｓ　ｇリン酸水素二カリウム　０．３５． ９ リン酸二水素カリウム　０．１！１Ｍ 硫酸マグネシウム７水和物　ｏ、ｏ　ｉ　ｙ硫酸アンモニウム　０．１ｙ を含有する滅菌栄養液を含有する５　００１ｎｌのエルレンマイヤーフラスコに 、アル２０バクターｓｐ、　ＡＴＣＣ３１６５２を接種し、３０℃で２０時間１ ８０　ｒ、ｐｏｍ。

で振と５する。次いで、細胞を遠心分離し、ＦＪ″１７の０．１モル−リン酸カ リウム緩衝液２Ｑｍｌ中に再懸濁させる。

Ｃ）アシネトバクタ−・カルコアセチクムＤＳＭ　３８７５の細胞懸濁液（上記 ａ）により製造）０．５ｎｌを、アル／ロバフタ−，ｓｐ、　ＡＴＣＣ３１６５ ２の細胞Ｍ濁液（上記ｂ）により製造＞０．５ｎｌと混合し、Ｄ、Ｌ−α−アミ ノ−β−フェニルゾロビオニトリル２Ｉｎ９を加え、３０℃で４４間攪拌する。

得られる反応混合物を薄層クロマトダラフイーにかげ、Ｌ−およびＤ−アミノ酸 オキシダーゼとの反応によってそのアミノ酸含量を定量する。このものは、Ｌ− フェニルアラニア１．２ｍ９にの代りにコリネバクテリウムＳ］）、　ＡＴＣＣ ３１６６２を使用して、Ｄ、Ｌ−α−アミノ−β−フェニルプロピオニトリル２ ｍ９に変換し、分析により反応混合物中に一フェニルアラニンは検出不可能であ る。

ａ）例１ｂの条件下で、アル２０バクターｓｐ、　ＡＴＣＣ３１６５２の培養物 ｉｏｏｍｚを培養する。得られる細胞を遠心分離し、０．１モルのリン酸カリウ ム緩衝液１００ｍ／に再懸濁させる。

ｂ）細胞懸濁液５　ｍｌ　Ｉｃ　Ｄ−フェニルアラニンアミＹ５ｍ９に加え、６ ０°Ｃで４時ｒＢＪ攪拌する。反応混合物中に、Ｌ−フェニルアラニン２．１１ ｎ９が検出可能である力＼Ｄ−フェニルアラニンは検出不可能である。

例　４ 例１ｂの条件下で、コリネバクテリウムｓｐ、　ＡＴＣＣ３１６６２の培養物１ ００ｍ１を培養する。得られる細胞を遠心分離し、０．１モルのリン酸カリウム 緩衝液に再懸濁させる。

ｂ）ＭＷ懸濁液５ゴにＤ−フェニルアラニンアミド５ｒｎ９を加え、３０℃で４ 時間攪拌する。反応混合物中に、Ｌ−フェニルアラニン１．８ｍ９が検出可能で あるが、例３の条件下で、Ｄ、Ｌ−）リプドアアンアミド５■を変換し、Ｌ−ト リプトファン１．５りが生成するが、Ｄ−）リプトファンは生成しない。

例　６ 例４の条件下で、Ｄ、Ｌ−）リフトファンアミド５ダを変換し、ジ−トリプトフ ァン１．３ｍ９が生成するが、Ｄ−）ＩＪシト７アンは生成しない。

例　７ 例３の条件下で、Ｄ、Ｌ−ロイシンアミド５ｍ９’ｆｃ変換し、Ｌ−ロイシン２ ．２りが生成するが、Ｄ−ロイシンは生成しない。

例　８ 例４の条件下で、Ｄ、Ｌ−ロイシンアミド５１ｎ９’を変換し、Ｌ−ロイシフ２ ．４ｍ９が生成するが、Ｄ−ロイシンは生成しない。

例　９ 例３の条件下で、Ｄ、Ｌ−アラニンアミドラ変換し、Ｌ−アラニンが生成するが 、Ｄ−アラニンは生成しない。

例１０ 例４の条件下で、Ｄ、Ｌ−アラニンアミドを変換し、Ｌ−アラニンが生成するが 、Ｄ−アラニンは生成しないＯ 例１１ 例３の条件下で、Ｄ、Ｌ−バリンアミドを変換し、Ｌ−バリンが生成するが、Ｄ −バリンは生成しない口例１２ 例４の条件下で、Ｄ、Ｌ−バリ／アミドを変換し、Ｌ−バリンが生成するが、Ｄ −バリンは生成しない。

例１３ 例３の条件下で、Ｄ、Ｌ−メチオニンアミドを変換し、Ｌ−メチオニンが生成す るが、Ｄ−メチオニンは生成しない。

例１４ 例４の条件下で、Ｄ、Ｌ−メチオニンアミｒ″ｆ、変換し、Ｌ−メチオニンが生 成するが、Ｄ−メチオニンは生成しない。

例１５ Ｄ、Ｌ−α−アミノ−β−フェニル−プロピオニトリル５■を、アセトバクタ一 番カルコアセチクスＤＳＭ３８７５の細胞懸濁液Ｃ例１ａにより製造）を用いて 変換し、薄層クロマトグラフィー分析によればり、Ｌ−フェニルアラニンアミド ４■が生成する。

例１６ 例１５の条件下で、Ｄ、Ｌ−アミノフェニルアセトニトリルを変換し、Ｄ、Ｌ− フェニルグリシンアミドが生成する。

トリルを変換し、Ｄ、Ｌ−アラニンアミドが生成する。

例１８ 例１５の条件下で、Ｄ、Ｌ〜α−アミノ吉草酸ニトリルを変換し、Ｄ、Ｌ−バリ ンアミドが生成する。

例１９ 例１５の条件下で、Ｄ、Ｌ−α−アミノ−β−メチル吉草酸ニトリルを変換し、 Ｄ、Ｌ−インロイシンアミドが得られる。

例２０ 例１５の条件下で、アミノアセトニトリルを変換し、グリシンアミドが得られる 。

国際調査報告 国際調査報告 ＤＥ　８９００２３２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中Ａはアミノ酸分子の残基を表わ す〕で示されるＬ−アミノ酸を、一般式ＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中Ａは上記のものを表わす〕で 示されるＤ，Ｌ−α−アミノニトリルから製造する方法において、α−アミノニ トリルをアシネトバクター・カルコアセテクスＤＳＭ３８７５の培養物を用いて 発酵させ、得られる一般式ＩＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）〔式中Ａは上記のものを表わす〕 で示されるＤ，Ｌ−アミノ酸アミドをアミノ酸アミドラセマーゼおよびＬ−アミ ノ酸アミドアミダーゼの微生物の培養物を用いて変換することを特徴とするＬ− アミノ酸の製造方法。 ２．一般式ＩＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）〔式中Ａはアミノ酸の残基を表わ す〕で示されるアミノ酸アミドの製造方法において、一般式ＩＩ：▲数式、化学 式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中Ａは上記のものを表わす〕で示されるα− アミノニトリルを、アシネトバクター・カルコアセチクスＤＳＭ３８７５を用い て発酵させることを特徴とするアミノ酸アミドの製造方法。 ３．一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中Ａはアミノ酸の残基を表わす〕 で示されるＬ−アミノ酸の製造方法において、一般式ＩＩＩ：▲数式、化学式、 表等があります▼（ＩＩＩ）〔式中Ａは上記のものを表わす〕で示されるＤ，Ｌ −アミノ酸アミドまたはＤ−アミノ酸アミドを、アミノ酸アミドラセマーゼおよ びし−アミノ酸アミドアミお−ゼを有する微生物の培養物を用いて変換すること を特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。 ４．アミノ酸分子の残基Ａが場合によりヒドロキシ基、メルカプト基、ハロゲン 原子、アミノ基またはカルボキシル基により置換されおよび／または酸素原子、 窒素原子または硫黄原子によって中断されている、最大１２個の炭素原子を有す るアルキル基、４−イミダゾリルメチル基、もしくは場合によりヒドロキシ基に よつて置換されたフエニル基、ベンジル基または３、インドリルメチル基を表わ す請求項１から３までのいずれか１項によるＬ−アミノ酸またはＤ，Ｌ−アミノ 酸アミドの製造方法。 ６．アミノ酸アミドラセマーゼおよびＬ−アミノ酸アミドアミダーゼを含有する 微生物として菌種アルスロバクターｓｐ．ＡＴＣＣ３１６６２またはコリネバク テリウムｓｐ．ＡＴＣＣ３１６６２を使用する請求項１、３および４項記載のＬ −アミノ酸の製造方法。